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Developmental Biology

La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni Published: February 16, 2017 doi: 10.3791/55113

Summary

Questo articolo descrive il video di una semplice metodologia vivo che può essere utilizzata per caratterizzare in modo sistematico ed efficiente componenti di vie di segnalazione complessi e reti di regolazione in molti embrioni invertebrati.

Introduction

reti gene regolatore (GRN) e vie di trasduzione del segnale stabiliscono l'espressione spaziale e temporale dei geni durante lo sviluppo embrionale, che vengono utilizzati per costruire il piano di adulti corpo animale. Cell-a-cella trasduzione del segnale sono componenti essenziali di queste reti di regolazione, fornendo i mezzi con cui le cellule comunicano. Queste interazioni cellulari stabilire e perfezionare l'espressione di geni regolatori e differenziazione nei e tra i diversi territori durante l'embriogenesi 1, 2. Le interazioni tra i modulatori secreti extracellulari (ligandi, antagonisti), recettori, e co-recettori controllano le attività delle vie di trasduzione del segnale. Un assortimento di molecole intracellulari transduces questi ingressi conseguente alterata espressione genica, divisione, e / o la forma di una cellula. Mentre molte delle molecole chiave utilizzati ai livelli extracellulari e intracellulari nelle principali vie sononoto, è una conoscenza incompleta dovuto in gran parte alla complessità delle vie di segnalazione individuali. Inoltre, diverse vie di segnalazione spesso interagiscono tra loro positivamente o negativamente al extracellulare, intracellulare e livelli trascrizionali 3, 4, 5, 6. È importante sottolineare che i componenti di base delle vie di trasduzione del segnale sono altamente conservati in tutte le specie metazoi, e, straordinariamente, la maggior parte delle vie di segnalazione spesso svolgono funzioni di sviluppo simili in molte specie quando si confrontano gli organismi da phyla strettamente correlati, in particolare 7, 8, 9, 10, 11.

Lo studio di segnalazione durante lo sviluppo è un compito arduo in qualsiasi organismo, e cisono diverse sfide significative per studiare percorsi di segnalazione nella maggior parte dei modelli deuterostomi (vertebrati, cordati invertebrati, hemichordata, ed echinodermi): 1) Nei vertebrati ci sono un gran numero di possibili ligando e recettore / co-modulatore, molecole di trasduzione intracellulare, così come potenziali interazioni tra diverse vie di segnalazione a causa della complessità del genoma 12, 13, 14; 2) La morfologia complessa e movimenti morfogenetici nei vertebrati spesso rendono più difficile interpretare le interazioni funzionali e tra le vie di trasduzione del segnale; 3) Analisi in maggior parte delle specie modello invertebrato deuterostomi non echinoderma sono limitate da brevi finestre gravidity con l'eccezione di alcune specie tunicate 15, 16.

Ilriccio di mare embrione ha alcune delle limitazioni di cui sopra ed offre molte qualità uniche per l'esecuzione di un'analisi dettagliata delle vie di trasduzione del segnale in vivo. Questi sono i seguenti: 1) La relativa semplicità del genoma riccio riduce significativamente il numero di possibili ligando, recettore / co-recettore e molecola di trasduzione intracellulare interazioni 17; 2) I GRN che controllano la specifica e patterning degli strati germinali e le principali assi embrionali sono ben stabiliti in embrioni di riccio di mare, aiutando la comprensione del contesto normativo della cella / territorio, che riceve i segnali 18, 19; 3) Molti vie di trasduzione del segnale possono essere studiati tra gli stadi scissione e gastrula quando gli embrioni sono costituiti da un singolo strato dell'epitelio la cui morfologia è più facile da analizzare; 4) Le molecole comportanod in vie di segnalazione nei ricci di mare sono facilmente manipolati; 5) Molti ricci di mare sono gravide per 10 a 11 mesi l'anno (ad esempio Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus).

Qui, vi presentiamo un metodo per caratterizzare in modo sistematico ed efficiente componenti delle vie di segnalazione che specificano e territori del modello negli embrioni di riccio di mare per illustrare i vantaggi che diversi sistemi modello invertebrati offrono nello studio dei meccanismi molecolari complessi.

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Protocol

1. Strategia High Throughput Morpholino design

  1. Identificare un gene (s) di interesse (ad esempio, candidato approccio del gene, l'analisi cis-normativo, RNA-Seq e / o schermi differenziali proteomica).
  2. Utilizzare genomica, trascrittomica, e dati di espressione genica disponibili sui siti web aggiornati di frequente (ad es SpBase http://www.echinobase.org 20 e S. purpuratus Genome Ricerca http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) per determinare il profilo di espressione spazio-temporale si sovrappone con il meccanismo di sviluppo in questione. Se non ci sono dati di espressione è disponibile, quindi generare primer qPCR e / o un antisenso sonda situ per valutare il pattern di espressione genica.
  3. Dopo aver determinato il pattern di espressione spaziale e temporale, ottenere la sequenza del DNA dai siti web genomici.
    1. Per la generazione di oligonucleotidi morfolino traduzione di blocco, è necessario ottenere la sequenza of la 'regione non tradotti (5' 5 UTR) direttamente a monte del codone iniziazione da expressed sequence tag (EST) banche dati disponibili sul SpBase o S. purpuratus Genome di ricerca siti web. Se questa informazione non è disponibile per il gene di interesse, quindi eseguire 5 'RACE.
    2. Per progettare un morfolino giunzione di blocco, la ricerca della sequenza genomica compresi gli esoni e introni utilizzando lo strumento patibolo BLASTN in SpBase o S. purpuratus Genome strumento di ricerca.
  4. Utilizzare il sito oligonucleotide progettazione http://oligodesign.gene-tools.com al fine di progettare la base di 25 sequenza di coppia morfolino desiderato.
    1. Per un morfolino traslazionale-blocco, utilizzare la sequenza di mRNA da 5 'a 3' come sorgente di traslazione sequenza bersaglio. Includere il 5 'UTR sequenze (circa 70 nucleotidi a monte del sito di inizio della trascrizione) più 25 basi di regione codificante (a valle del sito di inizio) con l'inizio codone marcato wiesima parentesi (ATG).
    2. Per un morfolino giunzione di blocco, selezionare introne-esone o esone-introne sequenza di confine e comprendono 50 basi (25 basi della sequenza dell'esone e 25 basi di sequenze introne) attorno alle regioni di confine. Scansione genoma con la sequenza morfolino per verificare che la sequenza è unica.

2. Microiniezione di oligonucleotidi Morpholino

  1. Preparare 3 soluzioni madre mm di oligonucleotidi morfolino con l'aggiunta di 100 ml di acqua priva di nucleasi nel morfolino flacone 300 nmol.
    NOTA: Non usare acqua trattata DEPC per la risospensione perché dietilpirocarbonato può danneggiare il morfolino.
  2. Per la prima rotazione ricostituzione lungo il flaconcino contenente la soluzione di riserva oligonucleotide per 30 s alla massima velocità (14.000 - 16.000 xg), vortex brevemente, il calore a 65 ° C per 5 a 10 minuti, vortex brevemente, e mantenere lo stock morfolino in camera temperatura per almeno 1 h. Soluzione morfolino s vengono memorizzati da -20 ° C a + 4 ° C.
  3. Preparare la soluzione iniettabile contenente oligonucleotidi morfolino alla concentrazione desiderata. Questa soluzione di solito contiene il 20% di glicerolo o 125 mm KCl come vettore e il 15% FITC-destrano (fluoresceina isotiocianato destrano 10.000 MW 2,5 mg / ml di soluzione). FITC-destrano e altri coniugati destrano fluorescenti sono abitualmente utilizzati per identificare gli embrioni iniettati mediante microscopia in epifluorescenza. Le soluzioni di iniezione conservare a -20 ° C.
  4. Riscaldare la soluzione morfolino a 65 ° C in un blocco di calore oa bagnomaria per almeno 2 - 5 min.
  5. Brevemente girare la soluzione morfolino per 30 s alla massima velocità (14.000 - 16.000 xg), vortex per 1 minuto e centrifugare a massima velocità (14.000 - 16.000 xg) per almeno 10 minuti.
  6. Caricare i aghi da iniezione con la soluzione morfolino. Per una dettagliata protocollo microiniezione vedere Stepicheva e Song 2014 21 e applausi e Ettensohn 2004"> 22.

3. Fissazione e in situ protocollo a 24 ore post-fecondazione (HPF) a S. purpuratus Embrioni

NOTA: Questo protocollo viene modificato da Arenas-Mena et al. 2000 23 e Sethi et al. 2014 24.

  1. Fissazione
    1. Aggiungere qualche goccia di fissativo (vedi sotto) per pozzetti contenenti gli embrioni, mescolare delicatamente pipettando, e permettere loro di stabilirsi. Rimuovere la soluzione fissativo, e poi mescolare gli embrioni con due ulteriori lavaggi 180 ml di fissativo.
      NOTA: È importante omogeneizzare gli embrioni durante i lavaggi di dolce pipettando su e giù diverse volte. In caso contrario si può abbassare il rapporto segnale-rumore.
    2. Lasciare gli embrioni di fissare nella secondo lavaggio fissativo per 50 minuti a 1 ora a temperatura ambiente (RT) in 4% paraformaldeide microscopia elettronica grade costituito da 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20, ed artificiale seawater (ASW). Rendere questa soluzione fresca ogni volta per ottenere i migliori risultati. Inoltre, per la facilità e praticità embrioni sono fissati in piastre da 96 pozzetti.
      1. Per 20 mL uso fissativo 5 ml 16% paraformaldeide, 15 mL ASW, 200 ml 1 M MOPS pH 7,0, e 20 ml di Tween-20.
    3. Lavare 5 volte a RT con 180 ml di MOPS lavare tampone costituito da 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl e 0,1% Tween-20 per almeno 5 minuti o fino embrioni cadere sul fondo del pozzo. Anche in questo caso, è importante mescolare bene gli embrioni nel tampone di lavaggio pipettando gentilmente su e giù parecchie volte. Il tampone di lavaggio MOPS può essere utilizzato per 2 giorni se conservato a 4 ° C.
      1. Per 40 mL MOPS lavano uso di buffer da 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M di NaCl, 32 mL dH 2 O, e 40 ml di Tween-20.
      2. Embrioni fissi possono essere conservati a 4 ° C per 2 giorni.
        NOTA: Se la memorizzazione di embrioni fisse più, quindi aggiungere lo 0,2% di sodio azide in MOPS tampone di lavaggio per prevenire la crescita batterica.
  2. Pre-ibridazione
    1. Aspirare il MOPS tampone di lavaggio e aggiungere 180 ml di un rapporto di 2: 1 di MOPS tampone di lavaggio in tampone di ibridazione, mescolare embrioni nella soluzione delicatamente pipettaggio più volte, e incubare per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. tampone di ibridazione consiste di 70% formammide, 0,1 M pH 7,0 MOPS, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA e 0,1% Tween-20.
      1. Per 40 mL uso tampone di ibridazione 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M di NaCl, 4 mL dH 2 O, 0,04 g BSA, e 40 ml di Tween-20. Mescolare bene nel vortex, aggiungere 28 ml di formammide, e vortex di nuovo.
    2. Rimuovere il rapporto 2: 1 di MOPS lavare e buffer di ibridazione e aggiungere 180 ml di un rapporto 1: 2 del MOPS tampone di lavaggio in tampone di ibridazione, mescolare embrioni nella soluzione, e incubare per almeno 20 minuti a temperatura ambiente.
    3. Prima sonda di ibridazione mescolare delicatamente embrioni in 100 - 150 ml di buffer di ibridazione. Incubare embrioni a 50 ° C per almeno 1h.
      NOTA: incubazione degli embrioni durante la notte è accettabile. Prima di incubazione, sigillare i pozzetti con un foglio adesivo per evitare l'evaporazione.
  3. ibridazione
    1. In un tubo separato aggiungere 0,1-0,3 ng / ml di sonda e 500 mg / ml di lievito tRNA in tampone di ibridazione, quindi vortice delicatamente per creare soluzione della sonda. tRNA lievito viene aggiunto alla soluzione della sonda di diminuire legame della sonda anti-senso non specifico. Riscaldare questa soluzione a 50 ° C, e il buffer aspirare ibridazione.
    2. Mix embrioni pre-ibridizzati in 100 microlitri della soluzione della sonda, sigillare con un foglio adesivo, e ibridano a 50 ° C per 2 a 7 giorni a seconda della sonda (sonda foxq2 può essere incubato per 2 giorni).
      NOTA: i tempi di incubazione possono variare in base al largo della sonda. Alcuni geni espressi a livelli bassi richiedono fino a un'incubazione di 7 giorni. piastre a 96 pozzetti possono essere collocati in una scatola di umidità come assicurazione contro l'evaporazione se i ADHESScheda ive non riesce a sigillare correttamente.
    3. Lavare 5 volte a 50 ° C con 180 ml di MOPS appena fatto il tampone di lavaggio per un totale di 3 ore. Poi, lavare 3 volte (15 min) con 180 ml di MOPS tampone di lavaggio a temperatura ambiente. Ricordarsi di mescolare gli embrioni nel tampone di lavaggio ogni volta pipettando delicatamente più volte.
  4. incubazione
    1. Aspirare il MOPS tampone di lavaggio e mescolare gli embrioni in 180 ml di tampone di bloccaggio composto da 10% di siero di pecora normale e 5 mg / ml di BSA in MOPS tampone di lavaggio e incubare per almeno 45 minuti a temperatura ambiente o 4 ° C durante la notte.
    2. Rimuovere tampone di bloccaggio e poi mescolare gli embrioni in tampone di bloccaggio contenente una diluizione 1: 1.500 del alcalina anticorpo anti-digossigenina fosfatasi coniugato diluito in tampone di bloccaggio. Incubare per una notte a temperatura ambiente in un piatto sigillato per evitare l'evaporazione. NOTA: Non lasciare anticorpo in più di una notte.
    3. Lavare gli embrioni 6 volte (5 minuti o fino a quando gli embrioni drop) in MOPS tampone di lavaggio a temperatura ambiente. embrioni possonomemorizzare notte a 4 ° C.
  5. Nello sviluppo situ
    1. Lavare embrioni 3 volte (10 min) a temperatura ambiente con fresco tampone a pH 9.5 comprensivi di 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2, 1 mM Levamisolo, e 0,1% Tween-20.
      1. Per 20 mL pH 9.5 utilizzo del buffer 2 ml 1 M Tris pH 9.5, 400 ml 5M NaCl, 1 ml di 1 M MgCl 2, 20 microlitri Tween-20, 16,6 mL dH 2 O, e 0,0048 g Levamisolo.
    2. Incubare embrioni a 37 ° C in tampone colorazione riparo dalla luce. tampone colorazione consiste di 10% dimetilformammide, 4,5 microlitri / ml 4-nitro blu tetrazolio cloruro (NBT), e 3,5 microlitri / ml 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) in appena fatta pH 9,5 tampone .
      1. Per 1 ml di tampone colorazione utilizzare il 100 microlitri dimetilformamide, 4,5 ml NBT, e 3,5 microlitri BCIP.
    3. Arrestare la reazione della fosfatasi alcalina lavando 3 a 5 volte in MOPS tampone di lavaggio. La connessione wi reazioneesimo la sonda foxq2 richiede in genere 30 minuti a 1 ora. Alcune sonde possono avere bisogno di incubazione durante la notte sia a RT o 4 ° C.
    4. Mescolare embrioni in una soluzione di 70% di lavaggio MOPS e 30% glicerolo. Il glicerolo fornisce un indice di rifrazione necessaria per microscopia. Gli embrioni possono essere memorizzati in questa soluzione per diverse settimane. Sigillare le piastre con paraffina di plastica per evitare l'evaporazione.
  6. Preparazione del vetrino e la cattura di immagini
    1. Preparare un vetrino organizzando tre piccole strisce di nastro biadesivo in un triangolo con piccoli spazi tra le strisce su un vetrino.
    2. Trasferire gli embrioni nel lavaggio MOPS 70% e soluzione di glicerolo 30% al centro del triangolo e coprire con coprioggetto.
    3. Sigillare il vetrino mediante l'applicazione di uno strato di smalto intorno ai bordi del vetrino.
    4. Catturare immagini utilizzando un microscopio ottico composto con un obiettivo 20X e una fotocamera collegata.

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Representative Results

Nell'embrione riccio di mare abbiamo dimostrato che 3 diverse di segnalazione Wnt rami (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, e Wnt / PKC) 4, 25 interagiscono per formare una rete di segnalazione Wnt che governa antero-posteriore (AP) patterning. Una delle più importanti conseguenze di questi eventi di segnalazione è che il ampiamente espresso anteriore neuroectoderma (ANE) GRN iniziale diventa limitato ad un piccolo territorio attorno al polo anteriore entro l'inizio del gastrulazione (24 HPF a S. purpuratus). Questi risultati indicano che Wnt segnalazione / β-catenina impedisce l'attivazione del gene ANE nella metà posteriore dell'embrione dallo stadio 32 cellule. Poi, questo percorso trasmette un segnale alla via di segnalazione Wnt / JNK non canonica che regola progressivamente lungo la ANE GRN nella metà anteriore dell'embrione tra la fase 60 celle e gastrulation precoce. Infine, un terzo non canonica pathwa Wnty, Wnt / PKC, antagonizza la Wnt / JNK percorso di segnalazione e gli impedisce di eliminare le specifiche ANE intorno al polo anteriore (Figura 1A) 4.

Usiamo l'espressione spazio-temporale del foxq2 per saggiare per l'attività di ciascuno dei comparti Wnt durante AP patterning perché è una delle prime due geni attivati nel GRN ANE ed è facilmente valutata mediante ibridazione in situ per la sua espressione robusta 26. Se una qualsiasi filiale di segnalazione Wnt individuo è perturbato, poi ci sono chiare fenotipi di espressione che indica quale percorso è coinvolto: 1) In assenza di Wnt / segnalazione di un ampio meccanismo di regolazione materna (Figura 1A) β-catenina attiva espressione foxq2 durante l'intero embrione (Figura 1BB); 2) In assenza di Wnt / JNK foxq2 segnalazione si esprime in tuttametà anteriore dell'embrione (Figura 1BC), ma è ancora giù regolata nella metà posteriore dovuta all'attività di Wnt segnalazione / β-catenina (Figura 1A); In assenza di Wnt / PKC espressione segnalazione foxq2 è completamente regolato verso il basso in tutta l'embrione (Figura 1Bd), in quanto il / β-catenina Wnt e vie di segnalazione Wnt / JNK sono regolati fino a 4, 25. Così, abbiamo sviluppato un metodo che abbiamo definito il sistema di lettura trascrizionale foxq2 che, quando combinato con il flusso di lavoro sistematico (figura 2), permette di identificare e verificare se un gene di interesse è coinvolto in una o più delle Wnt efficiente segnalazione rami.

Utilizzando il sistema di metodologia e foxq2 lettura qui presentati, abbiamo identificato diversi putativo Molec extracellulare o intracellulareORME probabilmente coinvolto nella rete di Wnt che regola specifica asse AP, quattro delle quali sono presentati nella Figura 3. Gli embrioni iniettati con morpholinos progettati per atterramento l'espressione sia del fattore di trascrizione, ATF2, o la extracellulare modulatore Wnt secreto, Wif-1, hanno mostrato un'espansione di espressione foxq2 verso il polo posteriore dell'embrione nelle fasi gastrulazione primi (Figura 3A - C ). Questi risultati imitano i fenotipi osservati quando i membri della via / segnalazione Wnt JNK sono abbattute 4, 25, suggerendo che essi sono membri di questo ramo di segnalazione che è necessario regolamentare le espressioni ANE GRN nella metà anteriore dell'embrione. In contrasto, l'espressione foxq2 stato eliminato quando abbiamo abbattuto l'espressione del fattore di trascrizione, NFAT (Figura 3D), e il modulatore extracellulare secreta, sFRP3 / 4 (Figura 3E),suggerendo che queste molecole sono coinvolte nel pathway Wnt / PKC che è necessario per antagonizzare la regolazione verso il basso della ANE GRN da Wnt segnalazione / JNK. Sulla base di questi risultati ottenuti rapidamente siamo ora in grado di effettuare analisi funzionali più dettagliate che metterà questi fattori all'interno della evoluzione rete di segnalazione Wnt coinvolto nel GRN che governa AP patterning nell'embrione riccio di mare.

Figura 1
Figura 1. Il modello per la AP Specifiche e Patterning nel riccio di mare e il foxq2 Transcriptional Lettura del sistema. (A) La progressiva down regulation della ANE GRN ad un territorio attorno al polo anteriore dalla rete di segnalazione Wnt descritto nel testo e in 4, 9. (B) A transcriptional sistema di lettura che mostra l'espressione foxq2 negli abbattimenti via di Wnt indicati (KO). barra della scala = 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Un diagramma di flusso sperimentale per un efficiente Wnt Network Analysis nell'embrione riccio di mare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. trasduzione molecole segnale coinvolte nel Wnt rete direttivo AP Axis specifica ed il modello identificato con il foxq2 trascrizionale Lettura del sistema. Abbattimenti (A, B, C) Morpholino suggeriscono che un modulatore intracellulare di segnalazione, ATF2, e secreta modulatore extracellulare, Wif-1, sono potenziali giocatori della via / JNK di segnalazione Wnt. (A, D, E) esperimenti atterramento indicato che NFAT, una segnalazione intracellulare modulatore, e sFRP3 / 4, un Wnt segnalazione modulatore secreto, sono coinvolti in Fzl1 / segnalazione 2/7-PKC. barra della scala = 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La metodologia qui presentata è un esempio che illustra il potere di usare embrioni con una minore complessità genomica e morfologica di vertebrati per capire le vie di segnalazione di trasduzione e GRN regolano meccanismi di sviluppo fondamentali .. Molti laboratori stanno utilizzando dosaggi simili durante lo sviluppo precoce riccio di mare a sezionare il coinvolti in percorsi di altri eventi di specifica destino della cellula di segnalazione (ad esempio Notch, Riccio, TGF-β, e la segnalazione FGF) 27, 28, 29, 30, 31. Questi studi riccio di mare hanno rivelato molti meccanismi interessante e nuovo di segnalazione, e molti aspetti di questi meccanismi di segnalazione che regolano lo sviluppo riccio di mare presto sembrano essere conservata tra deuterostomi 9, 27, 30 <sup>, 31, 32. È importante sottolineare che l'esplorazione della biologia dello sviluppo degli embrioni metazoi non tradizionali ha visto un aumento negli ultimi anni, e molte di queste caratteristiche di azioni con embrioni di riccio di mare durante il primo sviluppo 9, 15, 16, 33. Così, la metodologia qui presentata potrebbe essere ampiamente applicato allo studio delle vie di trasduzione del segnale in molti di questi organismi durante lo sviluppo iniziale.

Tutte le tecniche utilizzate per abbattere l'espressione genica può potenzialmente produrre fuori bersaglio abbattere effetti. Morpholinos hanno dimostrato di essere un metodo gene perturbazione notevolmente efficace in embrioni di riccio di mare in gran parte a causa della comunità effettua rigorosi controlli per alleviare le preoccupazioni che il fenotipo atterramento è non specifico. Questi test di controllo di base possono essere modified e applicato ad altre tecniche di atterramento (ad esempio frutta e verdura / Cas9). I controlli sono: 1) analisi dose-risposta Un'attenta vengono eseguiti con ogni morfolino fino ≥ 80% degli embrioni iniettati mostrano fenotipo difettoso e / o l'espressione del gene marcatore; 2) Morpholinos vengono scartati se causano gravi ritardi nello sviluppo o addirittura la morte a concentrazioni moderate. Questi fenotipi sono probabilmente dovuti effetti tossici fuori bersaglio; 3) Almeno due Morpholinos che sono progettati per indirizzare diversi siti di legame sono utilizzati per confermare fenotipi atterramento; 3) Missenso Morpholinos sono iniettati; 4) fenotipi Morpholino vengono tratti in salvo con l'introduzione di mRNA per il gene bersaglio in morpholino atterramento embrioni; 5) Quando disponibili, interi saggi di colorazione degli anticorpi di montaggio sono utilizzati per dimostrare che gli abbattimenti morpholino impediscono traduzione del gene di interesse. E 'importante notare che la comunità riccio utilizza almeno quattro specie per studi funzionali, a seconda di dove si trovano scienziati. in most casi, a nostra conoscenza, le varie morpholinos utilizzati per abbattere i ortologhi hanno generato fenotipi simili in ogni specie (per esempio vedere questi studi funzionali su nodale di segnalazione 34, 35, 36, 37). Questi risultati sostengono in modo convincente che i nostri esperimenti di controllo rigorosi selezionare fortemente per quei Morpholinos che producono effetti sul bersaglio knockdown.

Un altro aspetto importante di questa metodologia è quello di identificare accuratamente i bersagli trascrizionali che sono probabilmente azionati direttamente dal percorso di segnalazione in esame. L'esempio che forniamo qui è casuale, perché l'attivazione spazio-temporale delle vie di segnalazione e la regolazione verso il basso di un gene robusta espresso, foxq2, si verificano nelle prime fasi di sviluppo e le GRN disciplinano foglietto embrionale e le specifiche asse nell'embrione di riccio di mare sono ben-stabilito. Così, un limite evidente di questa metodologia è che in molti casi può essere necessario per abbattere l'attività di un particolare percorso di segnalazione durante le fasi successive di sviluppo e all'interno di specifici territori. Ci sono diverse tecnologie oggi disponibili che possono essere utilizzati per superare queste limitazioni (ad esempio foto-morpholinos, nitide / Cas9 38, FACseq) anche in non tradizionali embrioni modello che non sono suscettibili di manipolazione genetica. In molti casi potrebbe non essere possibile identificare un gene candidato a valle di un percorso di segnalazione di interesse cui espressione spazio-temporale è facilmente valutata come foxq2, che ha un notevolmente alto rapporto segnale-rumore. E 'comune a trovare i geni con rapporti molto più basso segnale-rumore. Se un altro gene non è disponibile per un particolare dosaggio, quindi la sonda in situ generato per il gene di interesse deve essere il più lungo possibile. In generale, utilizzando sonde più lunghe di 1.000 coppie di basis aumenta in modo significativo il segnale e riduce il rumore in colorimetrica e fluorescenti in saggi in situ.

Una volta che il test trascrizionale che indica dove e quando sta segnalando viene stabilita la via di trasduzione del segnale di interesse, il prossimo passo importante è quello di determinare sia il spaziale e l'espressione temporale dei fattori regolatori putativi coinvolti nel meccanismo di sviluppo in fase di studio. dati di schermo differenziale e / o QPCR sono strumenti importanti, ma possono essere fuorvianti. Confermando con tutto monte in ibridazione in situ che il gene di interesse viene espresso all'interno del territorio in cui il percorso di segnalazione è attivo impedisce uno spreco di tempo e risorse. Inoltre, questi dati permettono previsioni da apportare circa l'architettura regolamentare gene, che informerà le analisi più dettagliate che seguiranno una volta che i giocatori coinvolti sono identificati con questa analisi iniziale (Figura 2). Vi presentiamo un sempLe saggio colorimetrico in questo protocollo; tuttavia, ibridazione in situ fluorescente (FISH) può anche essere utilizzato per visualizzare varie sonde fluorescenti contemporaneamente, consentendo una maggiore risoluzione spaziale nel territorio di interesse così come la microscopia confocale 24. Inoltre, il pesce può essere accoppiato con colorazione degli anticorpi per identificare modificazioni post-traslazionali e / o in cui la via di segnalazione di interesse è attiva 24.

Ci sono due passaggi critici nel protocollo che sono spesso trascurati. Uno è la preparazione della soluzione morfolino oligonucleotide. È importante riscaldare la soluzione morfolino a 65 ° C per 2 min per 5 min e centrifugare a piena velocità per almeno 10 minuti prima di caricare gli aghi di iniezione. Questi passaggi sono essenziali quando la soluzione morfolino stock è conservato a -20 ° C a causa oligonucleotidi morfolino possono precipitare dalla soluzione a basso tempraAtures e la filatura della soluzione impedisce gli aghi da iniezione da essere intasato da particolato. Un altro aspetto critico da considerare è che gli embrioni devono essere accuratamente miscelati nelle varie soluzioni in ogni fase della fissazione e nei protocolli di ibridazione in situ. Nelle nostre mani, il segnale è ridotto e / o lo sfondo è aumentata se questo semplice passaggio non viene eseguita.

Forse l'aspetto più importante della metodologia qui presentata è che permette di analisi funzionali efficienti di grandi insiemi di potenziali molecole di trasduzione del segnale generati da trascrittomica prossima generazione e la proteomica. Una volta che queste analisi funzionali iniziali confermano un gruppo di fattori di regolazione sono coinvolti in un percorso di interesse, la prossima sfida è quella di utilizzare dosaggi stabiliti (ad esempio atterramenti funzionali; dettagliata multicolore intero montaggio in situ; interazioni biochimiche) per valutare come si inseriscono in il extracellular, intracellulare, e livelli trascrizionali delle vie di trasduzione del segnale coinvolte in un particolare processo di sviluppo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

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References

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Biologia dello Sviluppo Numero 120 ricci di mare neuroectoderma patterning Wnt trasduzione del segnale antero-posteriore evoluzione deuterostomi reti di regolazione genica throughput elevato,
La forza della semplicità: Sea Urchin embrioni<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelli di sviluppo per lo studio delle cellule cellula-Complex segnalazione di rete Interazioni
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Range, R. C.,More

Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

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