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Developmental Biology

La puissance de la simplicité: Sea Urchin Embryons comme Published: February 16, 2017 doi: 10.3791/55113

Summary

Cet article vidéo détaille un simple dans la méthode in vivo qui peut être utilisé pour caractériser systématiquement et efficacement les composants de voies de signalisation complexes et les réseaux de régulation dans de nombreux embryons d' invertébrés.

Introduction

réseaux de gènes de régulation (GRNS) et voies de signalisation établissent l'expression spatiale et temporelle des gènes au cours du développement embryonnaire qui sont utilisés pour construire le plan corporel de l'animal adulte. Cell-à-cellule des voies de transduction du signal sont des composants essentiels de ces réseaux de régulation, en fournissant les moyens par lesquels les cellules communiquent. Ces interactions cellulaires établir et affiner l'expression des gènes de régulation et de différenciation dans et entre les différents territoires pendant l' embryogenèse 1, 2. Les interactions entre les modulateurs sécrétées extracellulaires (ligands, des antagonistes), des récepteurs et co-récepteurs contrôlent les activités des voies de transduction du signal. Un assortiment de molécules intracellulaires transduction ces entrées résultant de l'expression altérée du gène, la division et / ou la forme d'une cellule. Bien que plusieurs des molécules clés utilisés aux niveaux extracellulaires et intracellulaires dans les principales voies sontconnu, il est une connaissance incomplète due en grande partie à la complexité des voies de signalisation individuelles. En outre, les différentes voies de signalisation interagissent souvent entre eux de façon positive ou négative au extracellulaire, intracellulaire, et les niveaux de transcription 3, 4, 5, 6. Fait important, les composants de base de voies de signalisation sont hautement conservées dans toutes les espèces de métazoaires, et, fait remarquable, la plupart des grandes voies de signalisation exercent souvent des fonctions de développement similaires dans de nombreuses espèces lorsque l'on compare les organismes de phyla étroitement liés , en particulier 7, 8, 9, 10, 11.

L'étude de la signalisation au cours du développement est une tâche ardue dans tout organisme, et il yPlusieurs défis importants pour l' étude des voies de signalisation dans la plupart des modèles deutérostomes (vertébrés, chordés invertébrés, hémichordés et échinodermes): 1) Chez les vertébrés , il y a un grand nombre de possibles ligand et les interactions récepteur / co-modulateurs, des molécules de transduction intracellulaire, ainsi que les interactions possibles entre les différentes voies de signalisation en raison de la complexité du génome 12, 13, 14; 2) La morphologie complexe et mouvements morphogénétiques chez les vertébrés font qu'il est souvent plus difficile d'interpréter les interactions fonctionnelles et entre les voies de transduction du signal; 3) Les analyses de la plupart des espèces modèles invertébré deutérostomien non échinodermes sont limitées par de courtes fenêtres de gravidity à l'exception de certaines espèces de tuniciers 15, 16.

leoursin embryon a quelques - unes des limitations mentionnées ci-dessus et offre de nombreuses qualités uniques pour effectuer une analyse détaillée des voies de transduction du signal in vivo. Ceux - ci sont les suivantes: 1) La relative simplicité du génome de l' oursin réduit de manière significative le nombre de possible ligand, un récepteur / co-récepteur et la molécule de transduction intracellulaire interactions 17; 2) Les GRNS contrôlant la spécification et la structuration des couches germinales et les grands axes embryonnaires sont bien établis dans les embryons d'oursins, d' aider à la compréhension du contexte réglementaire de la cellule / territoire recevant les signaux 18, 19; 3) De nombreuses voies de transduction du signal peuvent être étudiés entre les étapes de clivage et gastrula lorsque les embryons sont constitués d'un seul épithélium stratifié dont la morphologie est plus facile à analyser; 4) Les molécules comportentd dans les voies dans les oursins sont facilement manipulables de signalisation; 5) De nombreux oursins sont gravides pendant 10 à 11 mois par an (par exemple Strongylocentrotus purpuratus et Lytechinus variegatus).

Ici, nous présentons une méthode pour caractériser systématiquement et efficacement les composants des voies de signalisation qui précisent et territoires de modèle dans les embryons d'oursins pour illustrer les avantages que plusieurs systèmes de modèles d'invertébrés offrent dans l'étude des mécanismes moléculaires complexes.

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Protocol

1. Stratégie de conception morpholino Throughput haut

  1. Identifier un gène (s) d'intérêt (par exemple , l' approche de gène candidat, l' analyse des cis-régulatrices, et RNA-seq ou écrans différentiels / protéomique).
  2. Utilisez génomique, transcriptomique, et des données d'expression génique disponibles sur les sites Web fréquemment mis à jour (par exemple SpBase http://www.echinobase.org 20 et S. purpuratus Genome Recherche http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) pour déterminer que le profil d'expression spatiotemporelle chevauche avec le mécanisme de développement en question. Si aucune donnée d'expression est disponible, puis générer des amorces qPCR et / ou un antisens sonde in situ pour évaluer le profil d'expression génique.
  3. Après avoir déterminé le modèle spatial et temporel d'expression, d'obtenir la séquence d'ADN à partir des sites web génomiques.
    1. Pour générer des oligonucléotides morpholino traduction-bloquant, d'obtenir la séquence of la «région non traduite (5 '5 UTR) directement en amont du codon d'initiation de la balise de séquence exprimée (EST) des bases de données disponibles sur SpBase ou S. purpuratus Genome recherche des sites Web. Si cette information est indisponible pour le gène d'intérêt, puis effectuer 5 'RACE.
    2. Pour concevoir un morpholino d'épissure de blocage, la recherche de la séquence génomique comprenant les exons et les introns en utilisant l'outil échafaudage blastn dans SpBase ou S. purpuratus Genome outil de recherche.
  4. Utilisez le site Web oligonucléotide conception http://oligodesign.gene-tools.com afin de concevoir la séquence paire morpholino 25 de base désirée.
    1. Pour une translation morpholino-blocage, en utilisant la séquence d'ARNm de 5 'à 3' comme source de la séquence cible de la traduction. Inclure la séquence 5 'UTR (environ 70 nucléotides en amont du site de début de transcription) plus de 25 bases de la région (en aval du site de départ) de codage avec le codon de départ wi marquéème parenthèse (ATG).
    2. Pour un morpholino d'épissure de blocage, sélectionnez intron-exon ou d'une séquence de frontière exon-intron et comprennent 50 bases (25 bases de séquence exon et 25 bases de séquence d'introns) autour des régions limitrophes. Scanner le génome avec la séquence morpholino pour vérifier que la séquence soit unique.

2. La micro-injection de morpholino oligonucleotides

  1. Préparer 3 mM solutions des oligonucléotides morpholino en ajoutant 100 pi d'eau sans nucléase dans le 300 nmol morpholino flacon.
    NOTE: Ne pas utiliser l'eau traitée DEPC pour la remise en suspension, car le pyrocarbonate de diéthyle peut endommager le morpholino.
  2. Pour la première rotation de reconstitution sur le flacon contenant la solution mère d'oligonucléotide pendant 30 s à pleine vitesse (14.000 - 16.000 xg), vortex brièvement, de la chaleur à 65 ° C pendant 5 à 10 min, vortex brièvement, et de garder le morpholino stock à la chambre température pendant au moins 1 h. Morpholino solution stock s sont stockés de -20 ° C à +4 ° C.
  3. Préparer une solution injectable contenant oligonucleotides morpholino, à la concentration souhaitée. Cette solution contient habituellement 20% de glycérol ou de KCl 125 en tant que support et 15% FITC-Dextran (isothiocyanate de fluorescéine dextrane 10.000 MW 2,5 mg / uL solution mère). FITC-Dextran et d'autres conjugués dextrane fluorescents sont utilisés en routine pour identifier les embryons injectés par microscopie à épifluorescence. Magasin solutions d'injection à -20 ° C.
  4. Chauffer la solution morpholino à 65 ° C dans un bloc chauffant ou un bain d'eau pendant au moins 2 - 5 min.
  5. En bref tourner la solution morpholino pendant 30 s à pleine vitesse (14.000 - 16.000 xg), vortex pendant 1 min et centrifuger à pleine vitesse (14.000 - 16.000 xg) pendant au moins 10 min.
  6. Charger les aiguilles d'injection avec la solution morpholino. Pour un protocole de microinjection détaillée s'il vous plaît voir Stepicheva et Song 2014 21 et Acclamations et Ettensohn 2004"> 22.

3. Fixation et In Situ Protocole à 24 h post-fécondation (HPF) dans S. purpuratus Embryons

NOTE: Ce protocole est modifié de Arenas-Mena et al. 2000 23 et Sethi et al. 2014 24.

  1. Fixation
    1. Ajouter quelques gouttes de fixateur (voir ci-dessous) à des puits contenant des embryons, mélanger doucement par pipetage, et leur permettre de se déposer. Retirer la solution de fixateur, puis mélanger les embryons avec deux lavages supplémentaires 180 uL de fixateur.
      NOTE: Il est important de bien mélanger les embryons pendant les lavages par pipetage doux monter et descendre plusieurs fois. Ne pas le faire peut réduire le rapport signal sur bruit.
    2. Laissez les embryons à fixer dans le second lavage de fixateur pendant 50 min à 1 h à température ambiante (RT) dans 4% de paraformaldehyde de qualité en microscopie électronique consistant en mM MOPS 10 pH 7,0, 0,1% de Tween-20, et artificielle seawater (ASW). Faire de cette solution fraîche chaque fois pour de meilleurs résultats. En outre, pour la facilité et l'aspect pratique des embryons sont fixés dans des plaques à 96 puits.
      1. Pour 20 ml de fixatif utiliser 5 ml 16% de paraformaldehyde, 15 ml ASW, 200 pi de 1 M de MOPS à pH 7,0, et 20 pi de Tween-20.
    3. Laver 5 fois à température ambiante avec 180 pi de tampon MOPS lavage consistant en 0,1 M de MOPS à pH 7,0, 0,5 M de NaCl et 0,1% de Tween-20 pendant au moins 5 minutes, ou jusqu'à ce que des embryons tomber au fond du puits. Encore une fois, il est important de bien mélanger les embryons dans le tampon de lavage par pipetage doucement monter et descendre plusieurs fois. tampon de lavage MOPS peut être utilisé pendant 2 jours si elle est conservée à 4 ° C.
      1. 40 ml de MOPS tampon de lavage utilisé 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 32 ml dH 2 O, et 40 pi de Tween-20.
      2. Embryons fixes peuvent être conservés à 4 ° C pendant 2 jours.
        NOTE: Si le stockage des embryons fixes plus, puis ajouter de l'azoture de sodium à 0,2% en MOPS tampon de lavage pour empêcher la croissance bactérienne.
  2. Préhybridation
    1. Aspirer le MOPS tampon de lavage et ajouter 180 ul d'un rapport de 2: 1 de MOPS tampon de lavage au tampon d'hybridation, mélanger les embryons dans la solution par pipetage doux à plusieurs reprises, et incuber pendant au moins 20 min à température ambiante. un tampon d'hybridation est constitué de 70% de formamide, 0,1 M de MOPS à pH 7,0, 0,5 M de NaCl, 1 mg / ml de BSA et 0,1% de Tween-20.
      1. Pour 40 mL utilisation du tampon d'hybridation 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml de NaCl 5 M, 4 ml dH 2 O, 0,04 g de BSA, et 40 pi de Tween-20. Bien mélanger par tourbillonnement, ajouter 28 ml de formamide, et le vortex à nouveau.
    2. Retirez le rapport 2: 1 de MOPS laver et les tampons d'hybridation et ajouter 180 ul d'un rapport 1: 2 de MOPS tampon de lavage au tampon d'hybridation, mélanger les embryons dans la solution, et incuber pendant au moins 20 min à température ambiante.
    3. Avant hybridation de sonde mélanger délicatement les embryons dans 100 - 150 pi de tampon d'hybridation. Incuber les embryons à 50 ° C pendant au moins 1h.
      NOTE: L'incubation des embryons nuit est acceptable. Avant l'incubation, sceller les puits avec une feuille adhésive afin d'éviter l'évaporation.
  3. Hybridation
    1. Dans un tube séparé ajouter 0,1 à 0,3 ng / pl de sonde et 500 pg / ml d'ARNt de levure dans un tampon d'hybridation, puis doucement vortex pour créer une solution de sonde. ARNt de levure est ajoutée à la solution de la sonde pour réduire la liaison non spécifique de la sonde anti-sens. Préchauffer cette solution à 50 ° C et le tampon d'hybridation aspirat.
    2. Mélanger les embryons pré-hybridés dans 100 ul de la solution de sonde, sceller avec une feuille adhésive, et hybrident à 50 ° C pendant 2 à 7 jours en fonction de la sonde (la sonde foxq2 peut être mis à incuber pendant 2 jours).
      NOTE: Les temps d'incubation peuvent varier en fonction de la sonde. Certains gènes exprimés à des niveaux faibles nécessitent jusqu'à une incubation de 7 jours. plaques à 96 puits peuvent être placés dans une boîte d'humidité comme une assurance contre l'évaporation si les ADHESfeuille ive ne parvient pas à sceller correctement.
    3. Laver 5 fois à 50 ° C avec 180 pi de MOPS fraîchement préparé le tampon de lavage pour un total de 3 h. Ensuite, laver 3 fois (15 min) avec 180 pi de MOPS tampon de lavage à température ambiante. Rappelez-vous de mélanger les embryons dans le tampon de lavage à chaque fois par un léger pipetage plusieurs fois.
  4. Anticorps incubation
    1. Aspirer le MOPS tampon de lavage et mélanger embryons dans 180 pi de tampon de blocage constitué de 10% sérum normal de mouton et 5 mg / ml de BSA dans MOPS tampon de lavage et incuber pendant au moins 45 min à température ambiante ou à 4 ° C pendant la nuit.
    2. Retirer le tampon de blocage, puis mélanger les embryons dans un tampon de blocage contenant une dilution à 1: 1500 d'anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcaline diluée dans un tampon de blocage. Incuber une nuit à température ambiante dans une plaque scellée pour éviter l'évaporation. NOTE: Ne laissez pas l'anticorps sur plus d'un jour.
    3. Laver les embryons 6 fois (5 min ou jusqu'à ce que les embryons tombent) dans MOPS tampon de lavage à température ambiante. embryons peutêtre stocké pendant une nuit à 4 ° C.
  5. Dans le développement in situ
    1. Laver les embryons 3 fois (10 min) à température ambiante avec fraîchement préparée , pH 9,5 tampon constitué de Tris 0,1 M pH 9,5, 100 mM de NaCl, 50 mM de MgCl2, 1 mM de lévamisole, et du Tween-20 à 0,1%.
      1. Pour 20 ml de tampon pH 9,5 utiliser 2 ml de Tris 1 M pH 9,5, 400 ul de NaCl 5 M, 1 ml de 1 M de MgCl2, 20 pi de Tween-20, 16,6 ml dH 2 O et 0,0048 g lévamisole.
    2. Incuber les embryons à 37 ° C dans un tampon de coloration à l'abri de la lumière. un tampon de coloration est constitué de 10% de dimethyl formamide, 4,5 ul / ml de 4-nitro tétrazolium (NBT) et 3,5 ul / ml de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) dans fraîchement préparé le tampon à pH 9,5 .
      1. Pour 1 ml de tampon de coloration en utilisant 100 ul dimethylformamide, 4,5 ul de NBT et 3,5 ul BCIP.
    3. Arrêter la réaction de la phosphatase alcaline par lavage 3 à 5 fois dans MOPS tampon de lavage. La réaction wie la sonde foxq2 prend généralement 30 min à 1 h. Certaines sondes peuvent avoir besoin d'une nuit d'incubation soit à la température ambiante ou à 4 ° C.
    4. Mélanger les embryons dans une solution de 70% de lavage MOPS et 30% de glycérol. Le glycérol fournit un indice de réfraction nécessaire pour la microscopie. Les embryons peuvent être conservés dans cette solution pendant plusieurs semaines. Sceller les plaques avec de la paraffine en plastique pour éviter l'évaporation.
  6. Préparation de diapositives et de capture d' image
    1. Préparer une diapositive en organisant trois petites bandes de ruban adhésif double face dans un triangle avec de petits écarts entre les bandes sur une lame.
    2. Transférer les embryons dans le lavage de MOPS 70% et une solution de glycérol à 30% au centre du triangle et couvrir avec une lamelle.
    3. Sceller la lamelle en appliquant une couche de vernis à ongles sur les bords de la lamelle.
    4. Capture d'images à l'aide d'un microscope optique composé avec un objectif 20X et une caméra attachée.

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Representative Results

Dans l'embryon d'oursin , nous avons montré que 3 différents de signalisation Wnt branches (Wnt / β-caténine, Wnt / JNK et Wnt / PKC) 4, 25 interagissent pour former un réseau de signalisation Wnt qui régit antéro-postérieur (AP) patterning. Une des conséquences les plus importantes de ces événements de signalisation est que la large exprimé neurectoderme antérieure (ANE) GRN initial devient restreint à un petit territoire autour du pôle antérieur par le début de la gastrulation (24 HPF dans S. purpuratus). Ces résultats indiquent que la signalisation Wnt / β-caténine empêche l'activation génique ANE dans la moitié postérieure de l'embryon par l'étape 32 cellules. Ensuite, cette voie relaie un signal vers la voie de signalisation Wnt / JNK non canonique qui régule progressivement jusqu'à l'ANE GRN dans la moitié antérieure de l'embryon entre le stade 60 cellules et gastrulation précoce. Enfin, un troisième pathwa Wnt non canoniquey Wnt / PKC, antagonise la voie de signalisation Wnt / JNK et l' empêche d'éliminer les spécifications ANE autour du pôle antérieur (figure 1A) 4.

Nous utilisons l'expression spatiotemporelle de foxq2 pour doser l'activité de chacune des branches de signalisation Wnt pendant AP patterning , car il est l' un des deux premiers gènes activés dans le GRN ANE et il est facilement évalué par hybridation in situ en raison de son expression robuste 26. Si Wnt branche individuelle de signalisation est perturbée, alors il y a des phénotypes d'expression clairs qui indiquent la voie est impliquée: 1) En l'absence de Wnt / signalisation un large mécanisme de régulation de la mère (figure 1A) β-caténine active l' expression de foxq2 dans l'ensemble embryon (figure 1Bb); 2) En l'absence de Wnt / JNK foxq2 signalisation est exprimée tout au longla moitié antérieure de l'embryon (figure 1BC), mais elle est toujours régulée vers le bas dans la moitié postérieure due à l'activité de signalisation Wnt / β-caténine (figure 1A); En l'absence de Wnt / PKC foxq2 signalisation expression est complètement en bas réglementé dans tout l'embryon (Figure 1Bd), parce que le Wnt / β-caténine et les voies de signalisation Wnt / JNK sont jusqu'à réglementés 4, 25. Ainsi, nous avons développé un test que nous avons appelé le système de lecture de la transcription de foxq2 qui, lorsqu'il est combiné avec notre flux de travail systématique (Figure 2), nous permet d'identifier de manière efficace et tester si un gène d'intérêt est impliqué dans un ou plusieurs des Wnt branches de signalisation.

En utilisant le système de méthodologie et foxq2 lecture présentée ici, nous avons identifié plusieurs molec extracellulaire ou intracellulaire putativeules probablement impliqué dans le réseau Wnt régissant la spécification de l' axe AP, dont quatre sont présentés à la figure 3. Les embryons injectés avec morpholinos conçus pour knockdown l'expression soit du facteur de transcription, ATF2, ou le modulateur Wnt extracellulaire sécrété Wif-1, a montré un accroissement de l' expression de foxq2 vers le pôle postérieur de l'embryon à un stade de gastrulation précoces (figure 3A - C ). Ces résultats imitent les phénotypes observés lorsque les membres de la voie / de signalisation JNK Wnt sont assommés 4, 25, ce qui suggère qu'ils sont membres de cette branche de signalisation qui est nécessaire pour réguler à la baisse l' expression ANE GRN dans la moitié antérieure de l'embryon. En revanche, l' expression de foxq2 a été éliminé quand on assommés l'expression du facteur de transcription, NFAT (figure 3D), et le modulateur extracellulaire sécrété sFRP3 / 4 (figure 3E),ce qui suggère que ces molécules sont impliquées dans la voie Wnt / PKC qui est nécessaire pour antagoniser la régulation négative de l'ANE GRN par la signalisation Wnt / JNK. Sur la base de ces résultats obtenus rapidement, nous sommes maintenant en mesure d'effectuer des analyses fonctionnelles plus détaillées qui placeront ces facteurs au sein de l'évolution du réseau de signalisation Wnt impliquée dans la GRN qui régit AP patterning dans l'embryon d'oursin.

Figure 1
Figure 1. Le modèle pour des spécifications AP et Patterning dans le Sea Urchin et foxq2 transcriptionnelle Système de lecture. (A) La régulation progressive vers le bas de l'ANE NRG à un territoire autour du pôle antérieur par le réseau de signalisation Wnt en détail dans le texte et en 4, 9. (B) un transcriptional Système de lecture montrant l' expression de foxq2 dans les passes rabattues de la voie Wnt indiquées (KO). Barre d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Un diagramme de flux expérimental pour l' analyse des réseaux efficaces Wnt dans le Embryo Sea Urchin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3. Signal transduction molécules impliquées dans le réseau Wnt administration AP Spécifications Axis et Patterning identifiés à l' aide de la foxq2 transcriptionnelle Système de lecture. Rabattues (A, B, C) morpholino suggèrent qu'un modulateur de signalisation intracellulaire, ATF2, et un modulateur extracellulaire sécrété Wif-1, sont des joueurs potentiels de la voie de signalisation / JNK Wnt. (A, D, E) , des expériences ont indiqué que knockdown NFAT, un modulateur de la signalisation intracellulaire et sFRP3 / 4, un modulateur de la signalisation Wnt sécrétée, sont impliqués dans Fzl1 / de signalisation 07/02-PKC. Barre d'échelle = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

La méthodologie présentée ici est un exemple qui illustre le pouvoir d'utiliser des embryons avec une complexité moins génomique et morphologique que les vertébrés à comprendre les voies de signalisation de la transduction et GRNS régissant les mécanismes de développement fondamentaux .. De nombreux laboratoires utilisent des tests similaires au début du développement de l'oursin à disséquer le voies impliquées dans d' autres événements de spécification du destin cellulaire de signalisation (par exemple , Notch, Hedgehog, TGF β, et la signalisation FGF) 27, 28, 29, 30, 31. Ces études d'oursins ont révélé de nombreux mécanismes de signalisation intéressante et novatrice, et de nombreux aspects de ces mécanismes de signalisation qui régissent le développement de l' oursin de mer au début semblent être conservée parmi deuterostomes 9, 27, 30 <sup>, 31, 32. Fait important, l'exploration de la biologie du développement des embryons de métazoaires non traditionnels a connu une augmentation au cours des dernières années, et beaucoup de ces caractéristiques d'actions avec des embryons d'oursins au début du développement 9, 15, 16, 33. Ainsi, la méthodologie présentée ici pourrait être largement appliquée à l'étude des voies de transduction du signal dans un grand nombre de ces organismes au début du développement.

Toutes les techniques utilisées pour abattre l'expression du gène peut potentiellement produire hors cible abattre les effets. Morpholinos se sont avérés être une méthode de perturbation génétique remarquablement efficace dans les embryons d'oursins en grande partie parce que la communauté effectue des contrôles rigoureux pour atténuer les préoccupations que le phénotype knockdown est non spécifique. Ces essais de contrôle de base peuvent être modified et appliquée à d' autres techniques knockdown (ie CRISPER / cas9). Les commandes sont: 1) des essais dose-réponse sont exécutées avec soin avec chaque groupe morpholino jusqu'à ce que ≥ 80% des embryons injectés présentent un phénotype défectueux et / ou l'expression du gène marqueur; 2) Morpholinos sont rejetées si elles causent des retards de développement graves, voire mortelles, à des concentrations modérées. Ces phénotypes sont probablement dus effets toxiques hors-cible; 3) au moins deux morpholinos qui sont conçus pour cibler des sites de liaison différents sont utilisés pour confirmer les phénotypes knock-down; 3) on injecte morpholinos faux-sens; 4) morpholino phénotypes sont secourus par l'introduction de l'ARNm du gène cible dans des embryons knockdown morpholino; 5) Lorsque disponibles, toute la montagne des tests d'anticorps de coloration sont utilisés pour montrer que les passes rabattues morpholino empêchent la traduction du gène d'intérêt. Il est important de noter que la communauté d'oursin utilise au moins quatre espèces pour des études fonctionnelles, selon l'endroit où sont situés les scientifiques. En mocas st, à notre connaissance, les différents morpholinos utilisés pour abattre les orthologues ont généré des phénotypes similaires dans chaque espèce (voir par exemple ces études fonctionnelles sur Nodal de signalisation 34, 35, 36, 37). Ces résultats soutiennent de façon convaincante que nos expériences de contrôle rigoureuses sélectionner fortement pour les morpholinos qui produisent des effets sur la cible knockdown.

Un autre aspect important de cette méthode est d'identifier soigneusement les cibles transcriptionnelles qui sont les plus susceptibles directement activés par la voie de signalisation à l'étude. L'exemple que nous fournissons ici est fortuite, car l'activation spatiotemporelle des voies de signalisation et de la régulation négative d'un gène robuste exprimé, foxq2, se produisent tôt dans le développement et les GRNS régissant la couche de germe et la spécification de l' axe dans l'embryon d'oursin sont bien-établi. Ainsi, une limitation évidente de cette méthodologie est que dans de nombreux cas, il peut être nécessaire de knockdown l'activité d'une voie de signalisation particulière au cours des étapes ultérieures du développement et à l'intérieur des territoires spécifiques. Il existe plusieurs technologies actuellement disponibles qui peuvent être utilisées pour surmonter ces limitations (par exemple photo-morpholinos, Crisper / cas9 38, FACseq) , même dans des embryons de modèles non traditionnels qui ne se prêtent pas à la manipulation génétique. Dans de nombreux cas , il peut ne pas être possible d'identifier un gène candidat en aval d'une voie de signalisation d'intérêt dont l' expression spatiotemporelle est aussi facilement évaluée comme foxq2, qui a un rapport remarquablement élevé signal-bruit. Il est fréquent de trouver des gènes avec des rapports beaucoup plus faible signal-bruit. Si un autre gène est indisponible pour un dosage particulier, alors la sonde in situ généré pour le gène d'intérêt devrait être aussi longue que possible. En général, en utilisant des sondes de plus de 1000 paires de basess augmente considérablement le signal et réduit le bruit dans colorimétriques et fluorescent dans des essais in situ.

Une fois le test de transcription qui indique où et quand la voie de transduction du signal d'intérêt est la signalisation est établie, la prochaine étape importante est de déterminer à la fois l'espace et l'expression temporelle des facteurs de régulation putatifs impliqués dans le mécanisme de développement à l'étude. données d'écran et / ou QPCR différentiel sont des outils importants, mais ils peuvent être trompeuses. Confirmation avec support toute hybridation in situ que le gène d'intérêt est exprimé dans le territoire où la voie de signalisation est actif empêche une perte de temps et de ressources. En outre, ces données permettent de faire des prédictions sur l'architecture réglementaire des gènes, qui informera les analyses plus détaillées qui vont suivre une fois que les joueurs impliqués sont identifiés avec ce dosage initial (Figure 2). Nous présentons un simple de dosage colorimétrique dans ce protocole; Cependant, l' hybridation fluorescente in situ (FISH) peut également être utilisé pour visualiser plusieurs sondes fluorescentes en même temps, permettant une meilleure résolution spatiale sur le territoire d'intérêt ainsi que la microscopie confocale à 24. En outre, FISH peut être couplé avec la coloration des anticorps pour identifier les modifications post-traductionnelles et / ou lorsque la voie de signalisation d'intérêt est actif 24.

Il y a deux étapes critiques du protocole qui sont souvent négligés. Le premier est la préparation de la solution morpholino oligonucléotide. Il est important de chauffer la solution morpholino à 65 ° C pendant 2 min à 5 min et à centrifuger à pleine vitesse pendant au moins 10 min avant le chargement des aiguilles d'injection. Ces étapes sont essentielles lorsque la solution morpholino de stock est conservé à -20 ° C en raison des oligonucléotides morpholino peuvent précipiter à partir de la solution à faible humeurtures et le filage de la solution évite que les aiguilles d'injection d'être obstrué par des particules. Un autre aspect essentiel à considérer est que les embryons doivent être soigneusement mélangés dans les différentes solutions au cours de chaque étape de la fixation et dans les protocoles d'hybridation in situ. Dans nos mains, le signal est réduit et / ou du fond est augmentée si cette étape simple n'a pas été effectuée.

Peut-être l'aspect le plus important de la méthodologie présentée ici est qu'il permet des analyses fonctionnelles efficaces de grands ensembles de molécules potentielles de transduction de signal générées par prochaines transcriptomique de génération et de la protéomique. Une fois ces analyses fonctionnelles initiales confirment un groupe de facteurs de régulation sont impliqués dans une voie d'intérêt, le prochain défi est d'utiliser des dosages établis (par exemple les passes rabattues fonctionnelles; détaillées multicolores ensemble de montage in situ; interactions biochimiques) pour évaluer la façon dont ils se situent dans le extracellular, intracellulaire, et les niveaux de transcription des voies de transduction du signal impliquées dans un processus de développement particulier.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

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References

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Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

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