Summary
Este artigo de vídeo detalha uma simples em metodologia in vivo que pode ser utilizado para caracterizar de forma eficiente e sistematicamente componentes de vias de sinalização complexas e redes reguladoras em muitos embriões de invertebrados.
Introduction
redes de genes reguladores (GRNs) e vias de transdução de sinal estabelecer a expressão espacial e temporal dos genes durante o desenvolvimento embrionário que são usados para construir o plano de adulto corpo do animal. Célula-a-célula vias de transdução de sinal são componentes essenciais destas redes reguladoras, que proporciona os meios pelos quais as células comunicam. Estas interacções celulares estabelecer e aperfeiçoar a expressão de genes reguladores e diferenciação dentro e entre os vários territórios durante a embriogênese 1, 2. Interações entre os moduladores secretadas extracelulares (ligantes, antagonistas), receptores e co-receptores controlar as atividades de vias de transdução de sinal. Uma variedade de moléculas intracelulares transduz estas entradas resultando na expressão alterada do gene, divisão, e / ou a forma de uma célula. Enquanto muitas das moléculas-chave utilizadas nos níveis extracelulares e intracelulares nas vias principais sãoconhecido, é um conhecimento incompleto, devido em grande parte à complexidade das vias de sinalização individuais. Além disso, diferentes vias de sinalização, muitas vezes interagem uns com os outros, positivamente ou negativamente na extracelular, intracelular, e os níveis de transcrição de 3, 4, 5, 6. É importante ressaltar que os principais componentes de vias de transdução de sinal são altamente conservadas em todas as espécies de metazoários, e, curiosamente, a maioria das principais vias de sinalização, muitas vezes executar funções de desenvolvimento semelhantes em muitas espécies quando se comparam os organismos de filos intimamente relacionados, em especial, 7, 8, 9, 10, 11.
O estudo da sinalização durante o desenvolvimento é uma tarefa difícil em qualquer organismo, e hávários desafios significativos para estudar vias de sinalização na maioria dos modelos deuterostomia (vertebrados, cordados invertebrados, hemichordates, e equinodermes): 1) Em vertebrados há um grande número de possíveis ligandos e as interacções receptor / co-moduladores, moléculas de transdução intracelular, bem como potenciais interacções entre diferentes vias de sinalização, devido à complexidade do genoma de 12, 13, 14; 2) A morfologia complexa e movimentos morfogenéticos em vertebrados muitas vezes tornam mais difíceis de interpretar as interações funcionais em e entre vias de transdução de sinal; 3) As análises na maioria dos não-equinodermos espécie modelo de invertebrados deuterostomia são limitados por janelas curtas de gravidity com exceção de algumas espécies de tunicados 15, 16.
oouriço-do-mar embrião tem algumas das limitações acima mencionadas e oferece muitas qualidades únicas para a realização de uma análise detalhada das vias de transdução de sinal in vivo. Estes incluem o seguinte: 1) A relativa simplicidade do genoma do ouriço-do-mar reduz significativamente o número de possíveis do ligando, do receptor / co-receptor e molécula de transdução intracelular interacções 17; 2) Os GRNs que controlam a memória descritiva e modelação das camadas germinativas e grandes eixos embrionários são bem estabelecida em embriões de ouriço-do-mar, auxiliando na compreensão do contexto regulamentar da célula / território receber os sinais 18, 19; 3) Muitas vias de transdução de sinal podem ser estudadas entre as fases de clivagem e de gástrula inicial quando embriões consistem de um único epitélio em camadas cuja morfologia é mais fácil de analisar; 4) As moléculas envolvemd nas vias de sinalização nas ouriços do mar são facilmente manipulados; 5) Muitas ouriços do mar estão grávidas de 10 a 11 meses por ano (por exemplo, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus).
Aqui, apresentamos um método para caracterizar de forma sistemática e eficiente componentes das vias de sinalização que especificam e territórios padrão em embriões de ouriço-do-mar para ilustrar as vantagens que vários sistemas modelo de invertebrados oferecem no estudo dos mecanismos moleculares complexas.
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Protocol
1. Rendimento Morpholino Estratégia de alto design
- Identificar um gene (s) de interesse (por exemplo, abordagem do gene candidato, análise de cis-regulatórias, RNA-Seq e ou telas diferenciais / proteômica).
- Use genômica, transcriptomic, e dados de expressão de genes disponíveis em sites atualizados com freqüência (por exemplo SpBase http://www.echinobase.org 20 e S. purpuratus Genome Pesquisa http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) para determinar se o perfil de expressão espaço-temporal sobrepõe-se com o mecanismo de desenvolvimento em questão. Se não houver dados disponíveis expressão é, em seguida, gerar iniciadores qPCR e / ou um anti-sentido na sonda in situ para avaliar o padrão de expressão do gene.
- Depois de determinar o padrão de expressão espacial e temporal, obter a sequência de DNA a partir dos sites genômicos.
- Para a geração de oligonucleótidos morfolino-tradução de bloqueio, obter sequência óf a "região não-traduzida (5 '5 UTR) directamente a montante do codão de iniciação de expresso Sequence Tag (EST) bases de dados disponíveis no SpBase ou S. purpuratus Genoma sites de busca. Se esta informação não está disponível para o gene de interesse, em seguida, executar 5 'RACE.
- Para projetar um morfolino-blocking emenda, procure a seqüência genômica incluindo os exons e introns usando a ferramenta de andaime BLASTN em SpBase ou S. purpuratus Genome ferramenta de busca.
- Use o site oligonucleotídeo concepção http://oligodesign.gene-tools.com a fim de projetar a sequência par morfolino 25 base desejada.
- Para um bloqueio de morfolino-translacional, utilizar a sequência de ARNm a partir de 5 'para 3' como a fonte da sequência alvo de translação. Incluir sequência a 5 'UTR (cerca de 70 nucleótidos a montante do sítio do início da transcrição), mais 25 bases da região de codificação (a jusante do local de início) com o codão de iniciação Wi acentuadath parênteses (ATG).
- Para um bloqueio de morfolino-splicing, seleccionar intrão-exão ou uma sequência de fronteira exão-intrão e incluem 50 bases (25 bases da sequência de exão e 25 bases da sequência do intrão) em torno das regiões de fronteira. Digitalizar o genoma com a sequência morfolino para verificar que a sequência é única.
2. A microinjecção de morfolino oligonucleótidos
- Prepare 3 soluções de mM dos oligonucle�idos morfolino pela adição de 100 mL de água livre de nuclease para dentro do frasco morfolino 300 nmol.
NOTA: Não use DEPC água tratada para a re-suspensão porque dietilpirocarbonato pode danificar o morfolino. - Para a primeira rotação reconstituição sobre o frasco contendo a solução de oligonucleótido durante 30 s à velocidade máxima (14000 - 16000 xg), vortex brevemente, aquece-se a 65 ° C durante 5 a 10 min, vortex brevemente, e manter o estoque morfolino no quarto temperatura durante pelo menos 1 h. solução de morfolino s são armazenados de -20 ° C a 4 ° C.
- Preparar a solução de injecção contendo oligonucleótidos morfolino na concentração desejada. Esta solução normalmente contém 20% de glicerol ou KCl 125 mM como um transportador e 15% de FITC-Dextrano (isotiocianato de f luoresceina de dextrano 10.000 MW de 2,5 mg Solução de estoque / mL). outros conjugados de dextrano fluorescente FITC-Dextrano e são rotineiramente usadas para identificar embriões injectados por microscopia de epifluorescência. soluções para injecção armazenar a -20 ° C.
- Aquece-se a solução de morfolino a 65 ° C num bloco de aquecimento ou banho de água, durante pelo menos 2-5 minutos.
- Resumidamente girar a solução de morfolino por 30 s em velocidade máxima (14000 - 16000 xg), vortex durante 1 min e centrifuga-se a toda a velocidade (14.000 - 16.000 xg) durante pelo menos 10 min.
- Coloque as agulhas de injecção com a solução morfolino. Para um protocolo de microinjeção detalhadas, por favor consulte Stepicheva e Song, 2014 21 e Felicidades e Ettensohn de 2004"> 22.
3. Fixação e in situ Protocolo às 24 horas pós-fertilização (hpf) em S. purpuratus Embriões
NOTA: Este protocolo é modificado a partir Arenas-Mena et al. , 2000 23 e Sethi et ai. De 2014 24.
- Fixação
- Adicione algumas gotas de fixador (veja abaixo) para poços contendo embriões, misture delicadamente por pipetagem, e permitir-lhes para resolver. Remover a solução fixadora, e, em seguida, misturar embriões com duas lavagens de 180 ul adicionais de fixador.
NOTA: É importante para misturar completamente os embriões durante as lavagens por pipetagem suave para cima e para baixo várias vezes. Não fazer isso pode reduzir a relação sinal-ruído. - Deixar os embriões para fixar na segunda lavagem fixador durante 50 min a 1 h à temperatura ambiente (TA) em paraformaldeído grau de microscopia electrónica de 4% que consiste em MOPS 10 mM, pH 7,0, 0,1% de Tween-20, e artificial seawateR (ASW). Faça esta solução fresca de cada vez para obter melhores resultados. Além disso, para facilidade e praticidade embriões foram fixados em placas de 96 poços.
- Para 20 mL de utilização fixador 5 mL de 16% de paraformaldeído, 15 mL ASW, 200 mL 1 M de MOPS pH 7,0, e 20 uL de Tween-20.
- Lavar 5 vezes à temperatura ambiente com 180 ul de MOPS tampão de lavagem consistindo em MOPS 0,1 M pH 7,0, NaCl 0,5 M e 0,1% de Tween-20 durante pelo menos 5 min ou até que os embriões cair para o fundo do poço. Mais uma vez, é importante para misturar bem os embriões para o tampão de lavagem cuidado pipetando para cima e para baixo várias vezes. MOPS tampão de lavagem pode ser utilizado para 2 dias se armazenado a 4 ° C.
- Para 40 mL de MOPS lavar utilização tampão 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 mL de 5 M de NaCl, 32 mL de dH2O e 40 ul de Tween-20.
- Embriões fixos pode ser armazenado a 4 ° C durante 2 dias.
NOTA: Se o armazenamento de embriões fixos mais, em seguida, adicionar 0,2% de azida de sódio em MOPS tampão de lavagem para impedir o crescimento bacteriano.
- Adicione algumas gotas de fixador (veja abaixo) para poços contendo embriões, misture delicadamente por pipetagem, e permitir-lhes para resolver. Remover a solução fixadora, e, em seguida, misturar embriões com duas lavagens de 180 ul adicionais de fixador.
- Pré-hibridação
- Aspirar as MOPS tampão de lavagem e adicionar 180 uL de uma proporção de 2: 1 de tampão de lavagem para MOPS tampão de hibridação, mistura embriões para dentro da solução por pipetagem suave várias vezes, e incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. tampão de hibridação constituída por formamida a 70%, MOPS 0,1 M pH 7,0, NaCl 0,5 M, 1 mg / mL de BSA e 0,1% de Tween-20.
- Para 40 mL de tampão de hibridação utilização 4 ml de MOPS 1 M pH 7,0, 4 mL de NaCl 5 M, 4 mL de dH 2 O, 0,04 g de BSA, e 40 uL de Tween-20. Misture bem num vórtice, e adicionar 28 ml de formamida, e novamente vórtice.
- Remover a relação de 2: 1 de MOPS lavar e tampões de hibridação e adicionar 180 uL de uma proporção de 1: 2 de MOPS tampão de lavagem de tampão de hibridação, mistura embriões para dentro da solução, e incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente.
- Antes de hibridação com sonda de misturar suavemente embriões em 100 - 150 ul de tampão de hibridação. Incubar os embriões a 50 ° C durante pelo menos 1h.
NOTA: A incubação de embriões durante a noite é aceitável. Antes da incubação, os poços de selar com uma folha adesiva, a fim de evitar a evaporação.
- Aspirar as MOPS tampão de lavagem e adicionar 180 uL de uma proporção de 2: 1 de tampão de lavagem para MOPS tampão de hibridação, mistura embriões para dentro da solução por pipetagem suave várias vezes, e incuba-se durante pelo menos 20 min à temperatura ambiente. tampão de hibridação constituída por formamida a 70%, MOPS 0,1 M pH 7,0, NaCl 0,5 M, 1 mg / mL de BSA e 0,1% de Tween-20.
- hibridização
- Num tubo separado adicionar 0,1-0,3 ng / mL de sonda e 500 ug / mL de ARNt de levedura em tampão de hibridação, seguida de vórtice suavemente para criar solução de sonda. ARNt de levedura é adicionada à solução de sonda para diminuir a ligação não específica da sonda anti-sentido. Pré-aqueça esta solução a 50 ° C e tampão de hibridação aspirado.
- Misture embriões pré-hibridados em 100 mL da solução de sonda, selar com uma folha adesiva, e hibridar a 50 ° C durante 2 a 7 dias dependendo da sonda (sonda foxq2 podem ser incubadas durante 2 dias).
NOTA: Os tempos de incubação varia com base fora da sonda. Alguns genes expressos em níveis baixos requerer até um período de incubação de 7 dias. placas de 96 poços pode ser colocado em uma caixa de umidade como um seguro contra a evaporação se os ADHESfolha ive não selar corretamente. - Lavagem de 5 vezes a 50 ° C com 180 ul de MOPS recém-preparadas tampão de lavagem para um total de 3 h. Em seguida, lavar 3 vezes (15 min) com 180 uL de tampão de MOPS lavar à TA. Lembre-se de misturar os embriões para o tampão de lavagem a cada vez com cuidado pipetando várias vezes.
- incubação de anticorpos
- Aspirar as MOPS tampão de lavagem e misturar embriões em 180 uL de tampão de bloqueio que consiste em 10% soro de ovelha normal e 5 mg / mL de BSA em MOPS tampão de lavagem e incubar durante pelo menos 45 min à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.
- Remover o tampão de bloqueio e, em seguida, misturar embriões em tampão contendo um bloqueio 1: 1500 de diluição de anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina diluído em tampão de bloqueio. Incubar durante a noite à temperatura ambiente numa placa selada para evitar a evaporação. NOTA: Não deixe de anticorpos em mais do que durante a noite.
- Lavar embriões 6 vezes (5 min ou até que os embriões gota) em MOPS tampão de lavagem à temperatura ambiente. embriões podemser armazenado durante a noite a 4 ° C.
- No desenvolvimento in situ
- Lavar os embriões 3 vezes (10 min) à temperatura ambiente com tampão acabado de fazer pH 9,5 constituído por Tris 0,1 M pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM, Levamisol 1 mM e 0,1% de Tween-20.
- Para 20 mL de tampão de pH 9,5 utilização 2 mL de 1 M de Tris pH 9,5, 400 ul de NaCl 5 M, 1 mL de 1 M de MgCl2, 20 uL de Tween-20, 16,6 ml de dH2O, e 0,0048 g Levamisol.
- Incubar os embriões a 37 ° C em tampão de coloração protegida da luz. Tampão de Coloração consiste de 10% de dimetil formamida, 4,5 mL / mL de 4-nitro cloreto de azul de tetrazólio (NBT) e 3,5 uL / mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) em recém-feitos tampão de pH 9,5 .
- Para 1 mL de tampão de coloração utilizar 100 mL de dimetilformamida, 4,5 mL de NBT e BCIP 3,5 mL.
- Parar a reacção com fosfatase alcalina de lavagem de 3 a 5 vezes em tampão MOPS lavar. O wi reaçãoth da sonda foxq2 tipicamente leva cerca de 30 min a 1 h. Algumas sondas podem necessitar de incubação durante a noite a RT, quer ou 4 ° C.
- Misture embriões em uma solução de lavagem de MOPS 70% e 30% de glicerol. O glicerol proporciona um índice de refracção necessárias para microscopia. Os embriões podem ser armazenados nesta solução por várias semanas. Selar as placas com parafina de plástico para evitar a evaporação.
- Lavar os embriões 3 vezes (10 min) à temperatura ambiente com tampão acabado de fazer pH 9,5 constituído por Tris 0,1 M pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM, Levamisol 1 mM e 0,1% de Tween-20.
- Preparação da lâmina e captura de imagem
- Prepare um slide, organizando três pequenas tiras de fita dupla face em um triângulo com pequenos intervalos entre as tiras numa lâmina.
- Transferir os embriões na lavagem MOPS 70% e solução de glicerol a 30% para o centro do triângulo e cobrir com uma lamela.
- Selar a lamela por aplicação de uma camada de unha polonês em torno das arestas da lamela.
- Capturar imagens usando um microscópio composto luz com um objetivo 20X e uma câmera acoplada.
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Representative Results
No embrião ouriço-do-mar temos demonstrado que 3 diferentes sinalização Wnt ramos (Wnt / β-catenina, Wnt / JNK, e Wnt / PKC) 4, 25 interagem de modo a formar uma rede de sinalização de Wnt que governa ântero-posterior padronização (AP). Uma das consequências mais importantes destes eventos de sinalização é que a GRN inicial amplamente expressa neuroectoderma anterior (ANE) torna-se restrita a um pequeno território ao redor do pólo anterior, no início de gastrulação (24 hpf em S. purpuratus). Estes resultados indicam que a sinalização de Wnt / β-catenina impede a activação do gene ANE na metade posterior do embrião por a fase de 32 células. Em seguida, esta via transmite um sinal para a via de sinalização Wnt / JNK não canónicas que progressivamente para baixo regula a ANE GRN na metade anterior do embrião entre a fase 60-célula e a gastrulação precoce. Finalmente, uma terceira pathwa Wnt não-canônicay, Wnt / PKC, antagoniza o Wnt / JNK via de sinalização e impede-o de eliminar especificação ANE em torno do pólo anterior (Figura 1A) 4.
Utilizamos a expressão espaço-temporal de foxq2 de ensaio para a actividade de cada um dos ramos de sinalização Wnt durante AP padronização porque é um dos dois primeiros genes activados no GRN ANE e é facilmente avaliadas por hibridização in situ por causa da sua expressão robusta 26. Se qualquer ramo de sinalização Wnt indivíduo é perturbado, então existem fenótipos expressão clara que indicam que via está envolvida: 1) Na ausência de Wnt / β-catenina sinalizando uma ampla mecanismo regulador materna (Figura 1A) activa a expressão foxq2 ao longo de todo o embrião (Figura 1BB); 2) Na ausência de Wnt / JNK foxq2 sinalização é expressa em todaa metade anterior do embrião (figura 1BC), mas ainda é regulada negativamente na metade posterior devido à actividade de sinalização de Wnt / β-catenina (Figura 1A); Na ausência de Wnt / PKC expressão foxq2 sinalização é completamente regulada para baixo ao longo do embrião (figura 1BD), porque o / β-catenina Wnt e Wnt / JNK vias de sinalização são regulados para cima 4, 25. Assim, temos desenvolvido um ensaio que temos chamado o sistema de leitura transcricional foxq2 que, quando combinado com o nosso trabalho sistemático (Figura 2), permite-nos identificar eficiente e testar se um gene de interesse está envolvida em um ou mais dos Wnt sinalização ramos.
Usando o sistema de metodologia e de leitura foxq2 aqui apresentada, foram identificados vários Molec extracelular ou intracelular putativaULES provavelmente envolvidos na rede de Wnt que rege especificação eixo AP, quatro dos quais são apresentados na Figura 3. Os embriões injectados com morpholinos concebidos para knockdown da expressão quer do factor de transcrição, ATF2, ou o modulador de Wnt extracelular segregada, Wif-1, mostraram um aumento da expressão foxq2 para o pólo posterior do embrião em fases gastrulação início (Figura 3A - C ). Estes resultados imitar os fenótipos observados quando os membros da via / sinalização JNK Wnt são derrubadas 4, 25, sugerindo que eles são membros deste ramo de sinalização que é necessário para regular negativamente a expressão ANE GRN na metade anterior do embrião. Em contraste, a expressão foxq2 foi eliminada quando derrubado a expressão do factor de transcrição, NFAT (Figura 3D), e o modulador extracelular segregada, sFRP3 / 4 (Figura 3E),sugerindo que estas moléculas estão envolvidas na via Wnt / PKC que é necessário para antagonizar a regulação para baixo da ANE GRN por sinalização de Wnt / JNK. Com base nestes resultados rapidamente obtidos agora somos capazes de realizar análises funcionais mais detalhados que colocarão esses fatores dentro da rede de sinalização Wnt evoluindo envolvido no GRN que governa AP padronização no embrião ouriço-do-mar.
Figura 1. O Modelo de Especificação AP e padronização na ouriço do mar e do foxq2 transcricional Leitura Sistema. (A) A regulação progressiva para baixo da ANE GRN a um território em torno do pólo anterior pela rede de sinalização Wnt detalhada no texto e em 4, 9. (B) Um transcriptionaG sistema de leitura que mostra a expressão foxq2 nas knockdowns via Wnt indicados (KO). Barra de escala = 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Um Experimental Diagrama de Fluxo para Eficiente Wnt Análise de Redes no embrião Sea Urchin. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Transdução de Sinal moléculas envolvidas na Administração AP Especificação Axis Wnt rede e padronização identificados utilizando o foxq2 transcricional Leitura Sistema. Knockdowns (A, B, C) morfolino sugerem que um modulador de sinalização intracelular, ATF2, e modulador extracelular segregada, Wif-1, são potenciais jogadores da via / JNK sinalização Wnt. (A, D, E) knockdown experiências indicaram que a NFAT, um modulador de sinalização intracelular, e sFRP3 / 4, um modulador de sinalização Wnt segregada, estão envolvidos na sinalização Fzl1 / 2/7-PKC. Barra de escala = 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A metodologia aqui apresentada é um exemplo que ilustra o poder de usar embriões com menos complexidade genômica e morfológica de vertebrados para compreender as vias de transdução de sinalização e GRNs regem mecanismos de desenvolvimento fundamentais .. Muitos laboratórios estão usando ensaios semelhantes durante o desenvolvimento do ouriço-do-mar cedo para dissecar o vias envolvidas em outros eventos de especificação destino de sinalização celular (por exemplo, Notch, Hedgehog, TGF-β, e FGF sinalização) 27, 28, 29, 30, 31. Estes estudos ouriço-do-mar têm revelado muitos mecanismos de sinalização nova e interessante, e muitos aspectos destes mecanismos de sinalização que regulam o desenvolvimento de ouriço do mar no início parecem ser conservados entre deuterostomes 9, 27, 30 <sup>, 31, 32. É importante ressaltar que a exploração da biologia do desenvolvimento de embriões de metazoários não tradicionais tem visto um aumento nos últimos anos, e muitas dessas características share com embriões de ouriço do mar durante o desenvolvimento precoce 9, 15, 16, 33. Assim, a metodologia aqui apresentada poderia ser amplamente aplicada ao estudo das vias de transdução de sinal em muitos desses organismos durante o desenvolvimento precoce.
Todas as técnicas utilizadas para derrubar a expressão do gene pode potencialmente produzir fora do alvo derrubar efeitos. Morpholinos provaram ser um método de perturbação gene extraordinariamente eficaz em embriões de ouriço-do-mar, em grande parte porque a comunidade realiza controlos rigorosos para aliviar as preocupações de que o fenótipo knockdown não é específica. Estes ensaios básicos de controle pode ser modificado e aplicado a outras técnicas de knockdown (isto é, mais nítidas / Cas9). Os controlos são: 1) os ensaios de resposta à dose cuidadosa são realizadas com cada morfolino até ≥ 80% dos embriões injectados mostram fenótipo defeituoso e / ou a expressão do gene marcador; 2) Morpholinos são descartados se eles causam atrasos no desenvolvimento graves ou mesmo a morte em concentrações moderadas. Estes fenótipos são provavelmente devido efeitos tóxicos fora do alvo; 3) Pelo menos dois morpholinos que são projetados para atingir locais de ligação diferentes são usados para confirmar fenótipos knockdown; 3) missense morpholinos são injectados; 4) fenótipos morfolino são resgatados através da introdução de mRNA para o gene alvo em morfolino knockdown embriões; 5) Quando, ensaios de coloração de anticorpos de montagem integrais disponíveis são usados para mostrar que knockdowns morfolino evitar que a tradução do gene de interesse. É importante notar que a comunidade de ouriço-do-mar utiliza pelo menos quatro espécies para estudos funcionais, dependendo de onde os cientistas estão localizados. em mocasos do st, a nosso conhecimento, as várias morpholinos usado para derrubar as orthologs geraram fenótipos semelhantes em cada uma das espécies (por exemplo, ver esses estudos funcionais em Nodal sinalização 34, 35, 36, 37). Estes resultados argumentar de forma convincente que as nossas experiências de controlo rigorosos seleccionar fortemente para aqueles morpholinos que produzem efeitos no alvo knockdown.
Outro aspecto importante desta metodologia é identificar cuidadosamente os alvos de transcrição que são mais provável diretamente ativados pela via de sinalização em consideração. O exemplo que nós fornecemos aqui é fortuita, pois a ativação espaço-temporal das vias de sinalização e regulação para baixo de um gene robustamente expressa, foxq2, ocorrem no início do desenvolvimento e os GRNs regem camada germinativa e especificação eixo no embrião ouriço do mar estão bem-established. Assim, obviamente uma limitação desta metodologia é que, em muitos casos, pode ser necessário para a actividade knockdown de uma via de sinalização particular durante as fases posteriores de desenvolvimento e nos territórios específicos. Existem várias tecnologias agora disponíveis que podem ser usados para ultrapassar estas limitações (por exemplo foto-morfolinos, Crisper / Cas9 38, FACseq) mesmo em embriões modelo não-tradicionais, que não são passíveis de manipulação genética. Em muitos casos, pode não ser possível identificar um gene candidato para baixo fluxo de uma via de sinalização de interesse, cuja expressão espaço-temporal é tão facilmente avaliada como foxq2, que tem uma proporção extremamente elevada de sinal-para-ruído. É comum para encontrar genes com rácios muito mais baixos de sinal-para-ruído. Se um outro gene não está disponível para um determinado ensaio, em seguida, in situ da sonda gerada para o gene de interesse deve ser tão longo quanto possível. Em geral, usar sondas com mais de 1.000 pares de basess aumenta significativamente o sinal e diminui o ruído colorimétrico e em ensaios in situ fluorescente.
Uma vez que o ensaio de transcrição que indica onde e quando a via de transdução de sinal de interesse é a sinalização é estabelecida, o próximo passo é importante para determinar tanto a espacial e a expressão temporal dos factores reguladores putativos envolvidos no mecanismo de desenvolvimento em estudo. dados da tela e / ou QPCR diferencial são ferramentas importantes, mas elas podem ser enganadoras. Confirmando com toda montagem de hibridação in situ que o gene de interesse é expressa no território em que a via de sinalização está ativo impede um desperdício de tempo e recursos. Além disso, estes dados permitem previsões a serem feitas sobre a arquitetura reguladora do gene, que irá informar as análises mais detalhadas que se seguirão uma vez que os jogadores envolvidos são identificados com este ensaio inicial (Figura 2). Nós apresentamos uma simple ensaio colorimétrico neste protocolo; No entanto, hibridação in situ fluorescente (FISH) também pode ser usado para visualizar várias sondas fluorescentes ao mesmo tempo, permitindo a resolução espacial aumentada no território de interesse, bem como microscopia confocal 24. Além disso, o peixe pode ser emparelhado com coloração de anticorpos para identificar modificações pós-traducionais e / ou em que a via de sinalização de interesse é activa 24.
Há duas etapas críticas do protocolo que são muitas vezes esquecidos. Um deles é a preparação da solução de oligonucleótido morfolino. É importante para aquecer a solução de morfolino a 65 ° C durante 2 minutos para 5 minutos e centrifugar-lo à velocidade máxima durante pelo menos 10 min antes de carregar as agulhas de injecção. Estes passos são essenciais quando a solução estoque é morfolino armazenado a -20 ° C, porque os oligonucleótidos de morfolino pode precipitar a partir da solução a partir têmperaAtures e a fiação da solução impede que as agulhas de injecção de ser obstruído por partículas. Outro aspecto crítico a considerar é que os embriões devem ser cuidadosamente misturados em várias soluções durante cada etapa do processo de fixação e em protocolos de hibridização in situ. Nas nossas mãos, o sinal é reduzido e / ou o fundo é aumentada se este passo simples não é efectuada.
Talvez o aspecto mais importante da metodologia aqui apresentada é que ele permite a análise funcional eficiente de grandes conjuntos de potenciais moléculas de transdução de sinal gerado por transcriptómica de nova geração e proteoma. Uma vez que estas análises funcionais iniciais confirmam um grupo de fatores de regulação estão envolvidos em uma via de interesse, o próximo desafio é usar ensaios estabelecidas (por exemplo knockdowns funcionais; detalhada multi-colorido todo de montagem in situ; interações bioquímicas) para avaliar como eles se encaixam o extracelluLar, intracelular, e os níveis de transcrição das vias de transdução de sinais envolvidos num processo de desenvolvimento particular.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino | Gene Tools LLC | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) | Invitrogen, Life Technologies | D1821 | Make 25 mg/mL stock solution |
| Paraformaldehyde 16% solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254-250G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 23336-0010 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 47671-1L-F | |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| Normal Goat Serum | Sigma Aldrich | G9023-10mL | |
| Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody | Roche | 11 093 274 910 | |
| Tetramisole hydrochloride (levamisole) | Sigma Aldrich | L9756-5G | |
| Tris Base UltraPure | Research Products Internationall Corp | 56-40-6 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 7786-30-3 | |
| BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate | Roche | 11 383 221 001 | |
| 4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) | Roche | 11 383 213 001 | |
| Dimethyl Formamide | Sigma Aldrich | D4551-500mL | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541-5KG | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016-500G |
References
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