Summary
Denna video artikeln beskriver en enkel in vivo metod som kan användas för att systematiskt och effektivt karaktärisera komponenter i komplexa signaleringsvägar och regulatoriska nätverk i många ryggradslösa embryon.
Introduction
Genreglerande nät (GRNs) och signaltransduktionsvägar fastställa den rumsliga och tidsmässiga uttryck av gener under embryonal utveckling som används för att bygga det vuxna djuret kropp plan. Cell till cell signaltransduktionsvägar är viktiga komponenter i dessa regulatoriska nätverk, vilket ger det sätt på vilket celler kommunicerar. Dessa cellulära interaktioner etablera och förbättra uttrycket av regulatoriska och differentierings gener i och mellan de olika områdena under embryogenes 1, 2. Interaktioner mellan utsöndrade extracellulära modulatorer (ligander, antagonister), receptorer och co-receptorer kontrollera verksamheten i signaltransduktionsvägar. Ett sortiment av intracellulära molekyler omvandlar dessa ingångar leder till förändrad genexpression, division, och / eller formen av en cell. Medan många av de viktiga molekyler som används vid de extracellulära och intracellulära nivåer i de stora vägar ärkänd, är det en ofullständig kunskap beror till stor del på komplexiteten i enskilda signaleringsvägar. Dessutom har olika signalvägar samverkar ofta med varandra, antingen positivt eller negativt på den extracellulära, intracellulära och transkriptions nivåer 3, 4, 5, 6. Viktigt är de centrala delarna av signaltransduktionsvägar högkonserverade i alla flercelliga arter, och anmärkningsvärt, de flesta av de stora signalvägar utför ofta likartade utvecklingsfunktioner i många arter när man jämför organismer från närbesläktade provinsar i synnerhet 7, 8, 9, 10, 11.
Studien av signalering under utveckling är en svår uppgift i en organism, och därfinns flera stora utmaningar för att studera signalvägar i de flesta deuterostomer modeller (ryggradsdjur, ryggradslösa chordates, svalgsträngsdjur och tagghudingar): 1) I ryggradsdjur finns det ett stort antal möjliga ligand och receptor / co-modulator interaktioner, intracellulära överföringsmolekyler, samt potentiella interaktioner mellan olika signalvägar på grund av komplexiteten av genomet 12, 13, 14; 2) Den komplexa morfologi och morfogenetiska rörelser hos ryggradsdjur ofta göra det svårare att tolka funktionella interaktioner i och bland signaltransduktionsvägar; 3) Analyser i de flesta icke-Echinoderm ryggradslös deuterostomer modellarter begränsas av korta fönster gravidity med undantag för vissa manteldjursarter 15, 16.
Desjöborre embryot har få av de ovannämnda begränsningarna och erbjuder många unika egenskaper för att utföra en detaljerad analys av signaltransduktionsvägar in vivo. Dessa innefattar följande: 1) Den relativa enkelhet sjöborre genomet minskar signifikant antalet möjliga ligand, receptor / co-receptor och intracellulära transduktionen molekyl interaktioner 17; 2) De GRNs styr specifikation och mönstring av grodden lager och stora embryonala axlar är väl etablerade i sjöborre embryon, medhjälp i förståelsen av regelverket ramen för cell / område som tar emot signalerna 18, 19; 3) Många signaltransduktionsvägar kan studeras mellan tidiga klyvnings och gastrula steg när embryona består av ett enda lager epitel vars morfologi är lättare att analysera; 4) Molekylerna involverard i signalvägar i sjöborrar lätt manipuleras; 5) Många sjöborrar är gravid i 10 till 11 månader om året (t.ex. Strongylocentrotus purpuratus och lytechinus variegatus).
Här presenterar vi en metod för att systematiskt och effektivt karaktärisera komponenter av signalvägar som anger och mönster områden i sjöborre embryon för att illustrera de fördelar som flera ryggradslösa modellsystem erbjuder i studiet av komplexa molekylära mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hög genomströmning morfolino Design Strategy
- Identifiera en gen (er) av intresse (t.ex. kandidatgen tillvägagångssätt, cis-regulatoriska analys RNAseq och / eller proteomik differential skärmar).
- Använd iskt, transcriptomic och genuttryck data tillgängliga på ofta uppdaterade webbplatser (t.ex. SpBase http://www.echinobase.org 20 och S. purpuratus Genome Sök http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) för att fastställa att Spatiotemporal uttrycksprofilen lappar med utvecklingsmekanismen i fråga. Om inget uttryck uppgifter finns tillgängliga, sedan generera qPCR primers och / eller en antisens in situ sond för att bedöma genuttrycket.
- Efter bestämning av rumsliga och tidsmässiga uttrycksmönster, erhålla DNA-sekvensen från de genomiska webbplatser.
- För generering av översättningsblockerande morpholino oligonukleotider, få sekvens of 5 'un-translaterade regionen (5' UTR) direkt uppströms från initieringskodonet från expressed sequence tag (EST) databaser tillgängliga på SpBase eller S. purpuratus Genome Sök webbplatser. Om denna information inte är tillgänglig för genen av intresse, utför 5 'RACE.
- Att utforma en skarv-blockerande morfolino, söka efter genomsekvensen inklusive exonerna och intron använder ställningen BLASTN verktyget i SpBase eller S. purpuratus Genome sökverktyget.
- Använd oligonukleotiden utforma webbplatsen http://oligodesign.gene-tools.com för att utforma den önskade 25 baspar morfolino sekvens.
- För en translationsblockerande morfolino, använda mRNA-sekvensen från 5 'till 3' som källa för translationell målsekvensen. Inkluderar den 5 'UTR-sekvensen (ca 70 nukleotider uppströms om transkriptionsstartplatsen) plus 25 baser av kodande region (nedströms om startstället) med startkodonet markant with parentes (ATG).
- För en skarv-blockerande morfolino väljer intron-exon eller exon-intron gränssekvens och innefattar 50 baser (25 baser av exon sekvens och 25 baser av intronsekvens) kring gränsområdena. Skanna genomet med morpholino sekvensen för att kontrollera att sekvensen är unik.
2. Mikroinjektion av morfolino oligonukleotider
- Förbereda 3 mM förrådslösningar av morpholino oligonukleotider genom att tillsätta 100 mikroliter av nukleasfritt vatten i 300 nmol morfolino flaskan.
OBS: Använd inte DEPC behandlat vatten för resuspension eftersom dietylpyrokarbonat kan skada morfolino. - För första beredning spinn ner flaskan med aktie oligonukleotiden lösning under 30 s vid full hastighet (14.000 - 16.000 xg), kort virvel, värme vid 65 ° C under 5 till 10 minuter, kort virvel, och hålla morpholino lager på rummet temperatur i minst 1 h. Morfolino stamlösning s lagras från -20 ° C till 4 ° C.
- Bereda injektionslösning innehållande morpholino oligonukleotider vid den önskade koncentrationen. Denna lösning innehåller vanligtvis 20% glycerol eller 125 mM KCl som bärare och 15% FITC-dextran (fluoresceinisotiocyanat dextran 10.000 MW 2,5 mg / l stamlösning). FITC-dextran och andra fluorescerande dextran konjugat används rutinmässigt för att identifiera injicerade embryon genom epifluorescensmikroskopi. Butiksinjektionslösningar vid -20 ° C.
- Värm morpholino lösningen vid 65 ° C i ett värmeblock eller vattenbad under minst 2-5 min.
- snurra kort morpholino lösning under 30 s vid full hastighet (14.000 - 16.000 xg), vortex under 1 minut och centrifugera vid full hastighet (14.000 - 16.000 xg) under minst 10 minuter.
- Ladda injektionsnålar med morpholino lösning. För en detaljerad mikroinjektion protokoll se Stepicheva och Song, 2014 21 och Skål och Ettensohn 2004"> 22.
3. Fixering och In Situ protokoll vid 24 timmar efter befruktning (HPF) i S. purpuratus Embryon
OBS: Detta protokoll är modifierad från Arenas-Mena et al. , 2000 23 och Sethi et al. 2014 24.
- Fixering
- Tillsätt flera droppar av fixativ (se nedan) till brunnar innehållande embryon, blanda försiktigt genom pipettering, och tillåta dem att sedimentera. Ta bort fixeringslösning, och sedan blanda embryon med två ytterligare 180 mikroliter tvättar av fixativ.
OBS: Det är viktigt att blanda embryon under tvättar genom försiktig pipettering upp och ned flera gånger. Underlåtenhet att göra detta kan sänka signalbrusförhållandet. - Lämnar embryona för att fixera i den andra fixativ tvätt för 50 min till 1 h vid rumstemperatur (RT) i 4% elektronmikroskopi grade paraformaldehyd som består av 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20, och artificiell seawater (ASW). Gör denna lösning nytt varje gång för bästa resultat. Dessutom, för lätthet och funktionellt embryon fixeras i 96-brunnsplattor.
- För 20 ml fixativ användning 5 ml 16% paraformaldehyd, 15 ml ASW, 200 mikroliter 1 M MOPS pH 7,0, och 20 mikroliter Tween-20.
- Tvätta 5 gånger vid RT med 180 mikroliter av MOPS tvätta buffert bestående av 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl och 0,1% Tween-20 under åtminstone 5 min eller tills embryon sjunka till botten av brunnen. Återigen är det viktigt att noggrant blanda de embryon i tvättbufferten genom att försiktigt pipettera upp och ned flera gånger. MOPS tvättbuffert kan användas i 2 dagar vid förvaring i 4 ° C.
- För 40 ml MOPS tvättbuffert användning 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH 2 O, och 40 mikroliter Tween-20.
- Fasta embryon kan lagras vid 4 ° C under 2 dagar.
OBS: Om lagring av fasta embryon längre, lägg sedan till 0,2% natriumazid i MOPS tvättbuffert för att förhindra bakterietillväxt.
- Tillsätt flera droppar av fixativ (se nedan) till brunnar innehållande embryon, blanda försiktigt genom pipettering, och tillåta dem att sedimentera. Ta bort fixeringslösning, och sedan blanda embryon med två ytterligare 180 mikroliter tvättar av fixativ.
- Pre-hybridisering
- Aspirera MOPS tvättbuffert och tillsätt 180 | il av en 2: 1-förhållande av MOPS tvättbuffert i hybridiseringsbuffert, blanda embryon i lösningen genom försiktig pipettering flera gånger, och inkubera under åtminstone 20 min vid RT. Hybridiseringsbuffert består av 70% formamid, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA och 0,1% Tween-20.
- För 40 ml hybridiseringsbuffert användning 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH 2 O, 0,04 g BSA, och 40 mikroliter Tween-20. Blanda väl genom skakning, tillsätt 28 ml formamid och virvel igen.
- Ta bort 2: 1 förhållande av MOPS tvätta och hybridiserings buffertar och tillsätt 180 | il av en 1: 2 förhållande av MOPS tvättbuffert i hybridiseringsbuffert, blanda embryon i lösningen, och inkubera under åtminstone 20 min vid RT.
- Innan probhybridisering blanda försiktigt embryon i 100 - 150 mikroliter av hybridiseringsbuffert. Inkubera embryon vid 50 ° C under minst enh.
OBS: Inkubation embryon natten är acceptabelt. Före inkubering, försegla brunnarna med en klisterfolie för att förhindra avdunstning.
- Aspirera MOPS tvättbuffert och tillsätt 180 | il av en 2: 1-förhållande av MOPS tvättbuffert i hybridiseringsbuffert, blanda embryon i lösningen genom försiktig pipettering flera gånger, och inkubera under åtminstone 20 min vid RT. Hybridiseringsbuffert består av 70% formamid, 0,1 M MOPS pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA och 0,1% Tween-20.
- hybridisering
- I ett separat rör till 0,1-0,3 ng / mikroliter av sond och 500 mikrogram / ml jäst-tRNA i hybridiseringsbuffert, sedan vortex försiktigt för att skapa sondlösning. Jäst tRNA sättes till sondlösningen för att minska icke-specifik bindning av antisenssond. Förvärma denna lösning till 50 ° C, och aspirera hybridiseringsbuffert.
- Blanda pre-hybridiseras embryon till 100 mikroliter av sondlösningen, förslut med en klisterfolie, och hybridisera vid 50 ° C under 2 till 7 dagar beroende på sonden (kan foxq2 proben inkuberas i 2-dagar).
OBS: Inkubationstider varierar beroende av sonden. Vissa gener som uttrycks vid låga nivåer kräva upp till en 7-dagars inkubation. 96 brunnar kan placeras i en fuktighetslåda som en försäkring mot avdunstning om Adhesive arket låter att försegla ordentligt. - Tvätta 5 gånger vid 50 ° C med 180 mikroliter av nybakade MOPS tvättbuffert för totalt tre timmar. Sedan, tvätta 3 gånger (15 min) med 180 mikroliter av MOPS tvättbuffert vid RT. Kom ihåg att blanda embryon i tvättbufferten varje gång genom att försiktigt pipettera flera gånger.
- antikropp Inkubation
- Aspirera MOPS tvättbuffert och blanda embryon i 180 | il av blockeringsbuffert bestående av 10% Normal fårserum och 5 mg / ml BSA i MOPS tvättbuffert och inkubera under åtminstone 45 min vid RT eller 4 ° C över natten.
- Avlägsna blockerande buffert och sedan blanda embryon till blockerande buffert innehållande en 1: 1500 utspädning av alkaliskt fosfatas-konjugerad anti-digoxigenin antikropp utspädd i blockeringsbuffert. Inkubera över natten vid RT i en förseglad plattan för att undvika avdunstning. OBS: Låt inte antikropp på längre än över natten.
- Tvätta embryon 6 gånger (5 min eller tills embryon tappar) i MOPS tvättbuffert vid RT. embryon kanlagras över natten vid 4 ° C.
- In situ utveckling
- Tvätta embryon 3 gånger (10 min) vid RT med nyligen gjorda pH 9,5 buffert bestående av 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM levamisol, och 0,1% Tween-20.
- För 20 ml pH 9,5-buffert användning 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 | il 5 M NaCl, 1 ml 1 M MgCl2, 20 | il Tween-20, 16,6 ml dH 2 O och 0,0048 g Levamisol.
- Inkubera embryon vid 37 ° C i färgning buffert skyddad från ljus. Färgning buffert består av 10% dimetylformamid, 4,5 mikroliter / ml 4-Nitro blue tetrazoliumklorid (NBT), och 3,5 pl / ml 5-brom-4-klor-3-indolyl-fosfat (BCIP) i nyligen gjorda pH 9,5 buffert .
- För en ml färgningsbuffert använder 100 mikroliter dimetylformamid, 4,5 mikroliter NBT, och 3,5 mikroliter BCIP.
- Stoppa alkaliskt fosfatas reaktionen genom tvättning tre till fem gånger i MOPS-tvättbuffert. Reaktions with foxq2 sonden tar normalt 30 minuter till en timme. Vissa prober kan behöva inkubation över natten vid antingen RT eller 4 ° C.
- Blanda embryon i en lösning av 70% MOPS tvätt och 30% glycerol. Glycerolen ger ett brytningsindex som är nödvändiga för mikroskopi. Embryon kan lagras i denna lösning under flera veckor. Försegla plattorna med plast paraffin för att förhindra avdunstning.
- Tvätta embryon 3 gånger (10 min) vid RT med nyligen gjorda pH 9,5 buffert bestående av 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM levamisol, och 0,1% Tween-20.
- Glaspreparering och bild fånga
- Förbered en bild genom att arrangera tre små remsor av dubbelhäftande tejp i en triangel med små luckor mellan remsor på en bild.
- Överför embryon i 70% MOPS tvätt och 30% glycerollösning till centrum av triangeln och täck med ett täckglas.
- Täta täck genom att applicera ett lager av nagellack runt kanterna på täckglas.
- Fånga bilder med hjälp av en förening ljusmikroskop med en 20X objektiv och en bifogad kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I sjöborre embryot har vi visat att 3 olika Wnt signalering grenar (Wnt / β-catenin, Wnt / JNK, och Wnt / PKC) 4, 25 samverkar för att bilda ett Wnt signaleringsnätet som styr anterior-posterior (AP) mönstring. En av de viktigaste konsekvenserna av dessa signaleringshändelser är att den ursprungliga brett uttryckt främre neuroectoderm (ANE) GRN blir begränsad till ett litet område runt den främre stolpen i början av gastrulation (24 HPF i S. purpuratus). Dessa resultat indikerar att Wnt / β-catenin signalerings förhindrar ANE genaktivering i den bakre halvan av embryot genom 32-cellstadiet. Därefter vidarebefordrar denna väg en signal till den icke-kanoniska Wnt / JNK-signaleringsvägen som successivt nedreglerar ANE GRN i den främre hälften av embryot mellan 60-cellstadiet och tidig gastrulation. Slutligen, en tredje icke-kanoniska Wnt pathway, Wnt / PKC, motverkar Wnt / JNK signalvägen och hindrar den från att eliminera ANE specifikation runt den främre stolpen (Figur 1A) 4.
Vi använder Spatiotemporal uttryck av foxq2 att analysera aktiviteten hos var och en av Wnt signalerings grenar under AP mönstring, eftersom det är en av de första två gener aktiveras i ANE GRN och det är lätt bedömas genom hybridisering in situ på grund av dess robusta uttryck 26. Om någon enskild Wnt signalering gren störs, då det finns tydliga uttryck fenotyper som visar vilken väg är involverad: 1) I avsaknad av Wnt / β-catenin signalerar en bred moderns regleringsmekanism (Figur 1A) aktiverar foxq2 uttryck i hela embryot (Figur 1BB); 2) I avsaknad av Wnt / JNK signal foxq2 uttrycks i heladen främre halvan av embryot (Figur 1BC), men det är fortfarande ner regleras i den bakre halvan på grund av aktiviteten hos Wnt / β-catenin signalering (Figur 1A); I avsaknad av Wnt / PKC signalering foxq2 uttryck helt nedregleras hela embryot (Figur 1Bd), eftersom Wnt / β-catenin och Wnt / JNK signalvägar är upp regleras 4, 25. Därför har vi utvecklat en analys som vi har benämnt foxq2 transkriptionsavläsningssystemet som, i kombination med vårt systematiska arbetsflöde (Figur 2), ger oss möjlighet att på ett effektivt sätt identifiera och testa om en gen av intresse är inblandad i en eller flera av Wnt signalering grenar.
Använda metoden och foxq2 avläsningssystem som presenteras här har vi identifierat flera förmodade extracellulära eller intracellulära Molecduler sannolikt inblandade i det Wnt nätverk som reglerar AP-axeln specifikation, fyra av vilka presenteras i figur 3. Embryon som injicerats med morpholinos avsedda att knockdown uttrycket av antingen transkriptionsfaktorn, ATF2, eller det utsöndrade extracellulära Wnt modulator, Wif-1, visade en expansion av foxq2 uttryck mot bakre polen av embryot vid tidiga gastrulation stadier (fig 3A - C ). Dessa resultat efterliknar fenotyper observerats när medlemmar av Wnt / JNK signalväg slås ned 4, 25, vilket tyder på att de är medlemmar i denna signalering gren som är nödvändig för att nedreglera ANE GRN uttryck i den främre delen av embryot. Däremot var foxq2 expression elimineras när vi slog ner expressionen av transkriptionsfaktorn, NFAT (Figur 3D), och det utsöndrade extracellulära modulator, sFRP3 / 4 (figur 3E),vilket tyder på att dessa molekyler är inblandade i Wnt / PKC-vägen som är nödvändig för att antagonisera nedreglering av ANE GRN av Wnt / JNK signalering. Baserat på dessa snabbt uppnådda resultat vi nu kan utföra mer detaljerade funktionella analyser som kommer att placera dessa faktorer inom den framväxande Wnt signalering nätverk som deltar i GRN som styr AP mönstring i sjöborre embryot.
Figur 1. Modell för AP Specifikation och mönstring i sjöborre och foxq2 transkriptionsavläsningssystemet. (A) Den progressiva nedreglering av ANE GRN till ett område runt den främre stolpen av signalnätverket Wnt beskrivs i texten och i 4, 9. (B) En transcriptional avläsningssystem visar foxq2 uttryck i de angivna Wnt pathway knockdowns (KO). Skalstreck = 20 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. En Experimental flödesschema för effektiv Wnt Network Analysis i sjöborre Embryo. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. signaltransduktion molekyler som är involverade i Wnt Network ECB AP Axis Specifikation och mönstring identifieras med foxq2 transkriptionsavläsningssystemet. (A, B, C) morfolino knockdowns tyder på att en intracellulär signalering modulator, ATF2, och utsöndrad extracellulär modulator, Wif-1, är potentiella spelare av Wnt / JNK-signaleringsvägen. (A, D, E) knockdown experiment indikerade att NFAT, en intracellulär signalering modulator, och sFRP3 / 4, en utsöndrad Wnt signalering modulator, är involverade i Fzl1 / 2/7-PKC signalering. Skalstreck = 20 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som presenteras här är ett exempel som illustrerar kraften i att använda embryon med mindre iska och morfologiska komplexitet än ryggradsdjur att förstå signalering överföringsvägar och GRNs styr grundläggande mekanismer utvecklings .. Många labb använder liknande analyser under tidigt sjöborre utveckling dissekera signalvägar som är involverade i andra cell öde specifikation händelser (t.ex. Notch, Hedgehog, TGF β, och FGF signalering) 27, 28, 29, 30, 31. Dessa sjöborre studier har visat många intressanta och nya signaleringsmekanismer och många aspekter av dessa signalerings mekanismer som styr tidigt sjöborre utveckling verkar vara konserverade bland deuterostomes 9, 27, 30 <sup>, 31, 32. Viktigt har utforskning av utvecklingsbiologi av icke-traditionella flercelliga embryon sett en ökning under de senaste åren, och många av dessa aktie egenskaper med sjöborre embryon under tidig utveckling 9, 15, 16, 33. Således kunde den metod som presenteras här i stor utsträckning för att studera de signaltransduktionsvägar i många av dessa organismer under tidig utveckling.
Alla tekniker som används för att slå ner genuttryck kan potentiellt producera off-target slå ner effekter. Morpholinos har visat sig vara en anmärkningsvärt effektiv gen störningsmetod i sjöborre embryon till stor del på grund av att samhället utför rigorösa kontroller för att lindra oro för att den knockdown fenotypen är ospecifik. Dessa grundläggande kontrollanalyser kan vara modified och tillämpas på andra knockdown tekniker (dvs. skarpare / Cas9). Kontrollerna är: 1) Noggrann dos respons analyser utförs med varje morpholino tills ≥ 80% av injicerade embryon visar defekt fenotyp och / eller markörgenen uttryck; 2) Morpholinos kasseras om de orsakar svåra försenad utveckling eller till och med död vid måttliga koncentrationer. Dessa fenotyper är sannolikt på grund av giftiga off-target effekter; 3) Minst två morpholinos som är utformade för att rikta olika bindningsställen används för att bekräfta knockdown fenotyper; 3) missense morpholinos injiceras; 4) morfolino fenotyper räddas genom att införa mRNA för målgenen i morfolino knockdown embryon; 5) När de är tillgängliga hela montera antikropp färgning analyser används för att visa att morfolino knockdowns förhindra translation av genen av intresse. Det är viktigt att notera att sjöborre samhället använder minst fyra arter funktionella studier, beroende på var forskare finns. i most fall till vår kunskap, de olika morpholinos används för att slå ner ortologer har genererat liknande fenotyper i varje art (till exempel se dessa funktionella studier på Nodal signalering 34, 35, 36, 37). Dessa resultat argumenterar övertygande att våra rigorösa kontrollexperiment väljer starkt för de morpholinos som producerar på mål Knockdown effekter.
En annan viktig aspekt av denna metod är att noggrant identifiera de transkriptionella mål som mest sannolikt påverkas direkt av den signalväg som beaktas. Exemplet som vi ger här är slumpartad, eftersom Spatiotemporal aktivering av signalvägar och nedreglering av en kraftigt uttryckt gen, foxq2 förekommer tidigt i utvecklingen och GRNs styr GRODDBLAD och axeln specifikation i sjöborre embryot är väl-Etablerade. Således är en uppenbar begränsning av denna metod att det i många fall kan det vara nödvändigt att knockdown av aktiviteten hos en specifik signalväg under senare stadier av utveckling och inom specifika områden. Det finns flera tekniker som nu finns tillgängliga som kan användas för att övervinna dessa begränsningar (t.ex. foto morpholinos, skarpare / Cas9 38, FACseq) även i icke-traditionella modellen embryon som inte mottagliga för genetisk manipulation. I många fall är det kanske inte möjligt att identifiera en kandidatgen nedströms av en signalväg av intresse och vars spatiotemporal uttryck lika lätt bedömas som foxq2, som har en anmärkningsvärt hög signal-till-brus-förhållande. Det är vanligt att hitta gener med mycket lägre signal-till-brusförhållanden. Om en annan gen är inte tillgänglig för en speciell analys, då den in situ sonden genereras för genen av intresse bör vara så lång som möjligt. I allmänhet, med hjälp av prober som är längre än 1000 baspars signifikant ökar signalen och minskar bruset i kolorimetriska och fluorescerande in situ-analyser.
När transkriptions analys som visar var och när signaltransduktionsvägen av intresse signalering är etablerad, är nästa viktiga steg för att bestämma både den rumsliga och tidsmässiga uttryck av de förmodade reglerande faktorer som är inblandade i utvecklingsmekanismen under utredning. uppgifter Differential skärm och / eller qPCR är viktiga verktyg, men de kan vara missvisande. Bekräfta med hela montera in situ hybridisering att genen av intresse uttrycks inom det territorium där signalväg är aktiv förhindrar ett slöseri med tid och resurser. Dessutom är dessa data kan prognoser göras om reglerings arkitektur genen, som kommer att informera mer detaljerade analyser som kommer att följa när aktörerna identifieras med denna inledande analys (Figur 2). Vi presenterar en simple kolorimetrisk analys i detta protokoll; Men, kan fluorescent in situ hybridisering (FISH) också användas för att visualisera flera fluorescerande prober samtidigt, vilket möjliggör förbättrad spatial upplösning inom territorium ränta samt konfokalmikroskopi 24. Dessutom kan FISH paras ihop med antikroppsfärgning att identifiera posttranslationella modifieringar och / eller där signalväg av intresse är aktiv 24.
Det finns två viktiga steg i protokollet som ofta förbises. En är framställningen av morpholino oligonukleotiden lösning. Det är viktigt att värma morpholino lösning vid 65 ° C under 2 minuter till 5 minuter och centrifugera det vid full hastighet under minst 10 minuter innan du laddar injektionsnålar. Dessa steg är viktiga när morpholino stamlösningen förvaras vid -20 ° C på grund morpholino oligonukleotider kan utfällas från lösningen vid låg humörrer och spinning av lösningen förhindrar injektionsnålarna från att sättas igen av partiklar. En annan kritisk aspekt att beakta är att embryon skall blandas noggrant in i de olika lösningarna under varje steg av fixering och in situ hybridisering protokoll. I våra händer, är signalen reduceras och / eller bakgrunden ökas om denna enkla steg inte utförs.
Den kanske viktigaste aspekten av den metod som presenteras här är att det möjliggör effektiva funktionella analyser av stora mängder potentiella signalöverföringsmolekyler som genereras av nästa generations transkriptomik och proteomik. När dessa inledande funktionella analyser bekräftar en grupp av reglerande faktorer är inblandade i en väg av intresse, är nästa utmaning att använda etablerade analyser (t.ex. funktionella knockdowns, detaljerad flerfärgade hela montera in situ, biokemiska interaktioner) för att bedöma hur de passar in den extracellular, intracellulär, och transkriptionella nivåer av de signaltransduktionsvägar involverade i en särskild utvecklingsprocess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino | Gene Tools LLC | Customized | More information at www.gene-tools.com |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) | Invitrogen, Life Technologies | D1821 | Make 25 mg/mL stock solution |
| Paraformaldehyde 16% solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| MOPS | Sigma Aldrich | M1254-250G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 23336-0010 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 47671-1L-F | |
| Yeast tRNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| Normal Goat Serum | Sigma Aldrich | G9023-10mL | |
| Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody | Roche | 11 093 274 910 | |
| Tetramisole hydrochloride (levamisole) | Sigma Aldrich | L9756-5G | |
| Tris Base UltraPure | Research Products Internationall Corp | 56-40-6 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 7786-30-3 | |
| BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate | Roche | 11 383 221 001 | |
| 4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) | Roche | 11 383 213 001 | |
| Dimethyl Formamide | Sigma Aldrich | D4551-500mL | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541-5KG | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma Aldrich | M7506-2KG | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016-500G |
References
- Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
- Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
- Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
- Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
- Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
- Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
- Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
- Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
- Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
- Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
- Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
- Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
- Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
- Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
- Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
- Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
- Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
- Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
- Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
- Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
- Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
- Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
- Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
- Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
- Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
- Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
- Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
- Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
- Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
- Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
- Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
- Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).
