Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

The Power of Simplicity: Søpindsvin embryoner som Published: February 16, 2017 doi: 10.3791/55113
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

Summary

Denne video artikel beskriver en enkel in vivo metode, der kan anvendes til systematisk og effektivt karakterisere bestanddele af komplekse signalveje og regulerende net i mange hvirvelløse embryoer.

Introduction

Gen regulatoriske netværk (GRNs) og signaltransduktionsveje etablere den rumlige og tidsmæssige ekspression af gener under fosterudviklingen, der anvendes til at bygge det voksne dyr krop plan. Celle-til-celle signaltransduktionsveje er væsentlige komponenter af disse regulatoriske netværk, som giver de midler, hvormed celler kommunikerer. Disse cellulære interaktioner etablere og forfine udtryk for regulatoriske og differentiering gener i og mellem de forskellige områder under embryogenese 1, 2. Interaktioner blandt udskilles ekstracellulære modulatorer (ligander, antagonister), receptorer, og co-receptorer styrer aktiviteterne i signaltransduktionsveje. Et udvalg af intracellulære molekyler transducerer disse input resulterer i ændret genekspression, division, og / eller formen af ​​en celle. Mens mange af de vigtigste molekyler, der anvendes ved de ekstracellulære og intracellulære niveauer i de store veje erkendt, er det et ufuldstændigt kendskab i vid udstrækning skyldes kompleksiteten af ​​individuelle signalveje. Desuden forskellige signalveje ofte interagere med hinanden enten positivt eller negativt på den ekstracellulære, intracellulære, og transkriptionelle niveau 3, 4, 5, 6. Vigtigere er de centrale komponenter i signaltransduktionsveje stærkt konserveret i alle metazoiske art og, bemærkelsesværdigt, fleste af de store signalveje udfører ofte lignende udviklingsmæssige funktioner i mange arter, når man sammenligner organismer fra nært beslægtede phyla navnlig 7, 8, 9, 10, 11.

Studiet af signalering under udvikling er en skræmmende opgave i enhver organisme, og derer flere væsentlige udfordringer for at studere signalveje i de fleste deuterostom modeller (hvirveldyr, hvirvelløse chordater, hemichordates og pighuder): 1) I hvirveldyr der er et stort antal mulige ligand og receptor / co-modulator interaktioner, intracellulære transduktion molekyler, samt potentielle interaktioner mellem forskellige signalveje grund af kompleksiteten af genomet 12, 13, 14; 2) Den komplekse morfologi og morfogenetiske bevægelser hos hvirveldyr ofte gøre det vanskeligere at fortolke funktionelle interaktioner i og blandt signaltransduktionsveje; 3) Analyser i de fleste ikke-pighuder hvirvelløse deuterostom modelarter er begrænset af korte vinduer af gravidity med undtagelse af nogle tunicate arter 15, 16.

Detsøpindsvin embryo har nogle af de ovennævnte begrænsninger og tilbyder mange enestående kvaliteter til at udføre en detaljeret analyse af signaltransduktionsveje in vivo. Disse omfatter følgende: 1) Den relative enkelhed af søpindsvin genomet reducerer antallet af mulige ligand, receptor / co-receptor og intracellulære transduktion molekyle væsentligt interaktioner 17; 2) GRNs styrer specifikation og mønster af kim lag og større embryonale akser er veletablerede i søpindsvin embryoner, medvirken i forståelsen af de lovgivningsmæssige sammenhæng med celle / område modtager signalerne 18, 19; 3) Mange signaltransduktionsveje kan studeres mellem spaltnings- og gastrula stadier tidlige når embryoner består af et enkelt lag epitel hvis morfologi er lettere at analysere; 4) Molekylerne omfatterd i signalveje i søpindsvin let manipuleret; 5) Mange søpindsvin er den drægtige i 10 til 11 måneder om året (f.eks Strongylocentrotus purpuratus og Lytechinus variegatus).

Her præsenteres en metode til systematisk og effektivt karakterisere komponenter af signalveje, der angiver og mønster territorier i søpindsvin embryoner at illustrere de fordele, som en række hvirvelløse modelsystemer tilbyder i studiet af komplekse molekylære mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gennemløb Morpholino Design Strategy High

  1. Identificer et gen (er) af interesse (f.eks kandidat gen tilgang, cis-regulatoriske analyse, RNAseq og / eller proteom differential skærme).
  2. Brug genomisk, transkriptom, og genekspression data om hyppigt opdaterede hjemmesider (fx SpBase http://www.echinobase.org 20 og S. purpuratus Genome Søg http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) for at fastslå, at Spatiotemporal udtryk profil overlapper den udviklingsmæssige mekanisme pågældende. Hvis ingen ekspression data er tilgængelige, derefter generere qPCR primere og / eller en antisense in situ probe til at vurdere genekspression mønster.
  3. Efter bestemmelse af rumlige og tidsmæssige udtryk mønster, få DNA-sekvensen fra de genomiske websteder.
    1. Til generering oversættelse-blokerende morpholino oligonukleotider, opnå sekvens of 5'un-translaterede region (5 'UTR) direkte opstrøms fra initieringskodonet fra udtrykt sekvens tag (EST) databaserne på SpBase eller S. purpuratus Genome Søge websites. Hvis denne information ikke er tilgængelig for genet af interesse, derefter udføre 5 'RACE.
    2. At designe en splejsning-blokerende morpholino, søge efter den genomiske sekvens, herunder exons og introns ved hjælp af stillads BLASTN værktøj i SpBase eller S. purpuratus Genome søgeværktøj.
  4. Brug oligonukleotidet Design Website http://oligodesign.gene-tools.com for at udforme den ønskede 25 basepar morpholino sekvens.
    1. For en translationel-blokerende morpholino, bruge mRNA-sekvensen fra 5 'til 3' som kilden til translationel målsekvens. Indbefatter 5 'UTR-sekvens (ca. 70 nukleotider opstrøms for transkriptionsstartsitet) plus 25 baser af kodningsområdet (nedstrøms for startstedet) med startkodonet markerede with parentes (ATG).
    2. For en splejsning-blokerende morpholino, vælg intron-exon eller exon-intron-grænsen sekvens og omfatter 50 baser (25 baser af exon sekvens og 25 baser af intronsekvens) omkring grænseområderne. Scan genomet med morpholino-sekvens for at verificere, at sekvensen er unik.

2. mikroinjektion af morpholino Oligonucleotider

  1. Forbered 3 mM stamopløsninger af morpholino oligonukleotider ved tilsætning af 100 pi nuclease-frit vand til 300 nmol morpholino hætteglas.
    BEMÆRK: Brug ikke DEPC behandlet vand for ophvirvling fordi diethylpyrocarbonat kan beskadige morpholino.
  2. For første rekonstituering tur ned hætteglasset indeholdende bestanden oligonukleotid opløsningen i 30 sekunder ved fuld hastighed (14.000 - 16.000 xg), kortvarigt vortex, varme ved 65 ° C i 5 til 10 min, kortvarigt vortex, og holde morpholino lager ved stue temperatur i mindst 1 time. Morpholino stamopløsning s opbevares fra -20 ° C til + 4 ° C.
  3. Forbered injektionsopløsning indeholdende morpholino oligonukleotider i den ønskede koncentration. Denne opløsning indeholder sædvanligvis 20% glycerol eller 125 mM KCI som en bærer og 15% FITC-dextran (fluoresceinisothiocyanat dextran 10.000 MW 2,5 mg / pl stamopløsning). FITC-dextran og andre fluorescerende dextrankonjugater anvendes rutinemæssigt til at identificere injicerede embryoner ved epifluorescens-mikroskopi. Opbevar injektionsopløsninger ved -20 ° C.
  4. Opvarm morpholino opløsning ved 65 ° C i en varmeblok eller vandbad i mindst 2 - 5, min.
  5. Kort fortalt dreje morpholino opløsningen i 30 sekunder ved fuld hastighed (14.000 - 16.000 xg), vortex i 1 min og centrifugeres ved fuld hastighed (14.000 - 16.000 xg) i mindst 10 min.
  6. Ilæg injektionsnåle med morpholino løsning. For en detaljeret mikroinjektion protokol se Stepicheva og Song, 2014 21 og Cheers og Ettensohn, 2004"> 22.

3. Fiksering og In Situ protokol ved 24 timer efter befrugtningen (HPF) i S. purpuratus Embryoner

BEMÆRK: Denne protokol er modificeret fra Arenas-Mena et al. , 2000 23 og Sethi et al. 2014 24.

  1. fiksering
    1. Tilføj flere dråber af fiksativ (se nedenfor) til brønde, der indeholder embryoner, bland forsigtigt ved pipettering, og give dem mulighed for at bosætte sig. Fjern fiksativ opløsning, og derefter blandes embryoner med yderligere to 180 pi vaske med fiksativ.
      BEMÆRK: Det er vigtigt blandes grundigt embryonerne under vaskene ved forsigtig pipettering op og ned adskillige gange. I modsat fald kan sænke signal-støj-forholdet.
    2. Lad embryoner at fastsætte i anden fiksativ vask i 50 minutter til 1 time ved stuetemperatur (RT) i 4% elektronmikroskopi kvalitet paraformaldehyd bestående af 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1% Tween-20, og kunstig seawater (ASW). Gør denne løsning frisk hver gang for de bedste resultater. Desuden for at lette og af praktiske embryoner fikseret i 96-brønds plader.
      1. For 20 ml fiksativ brug 5 ml 16% paraformaldehyd, 15 ml ASW, 200 pi 1 M MOPS pH 7,0, og 20 pi Tween-20.
    3. Vask 5 gange ved stuetemperatur med 180 pi MOPS vaskebuffer bestående af 0,1 M MOPS, pH 7,0, 0,5 M NaCl og 0,1% Tween-20 i mindst 5 min eller indtil embryoner falde til bunden af ​​brønden. Igen, det er vigtigt blandes grundigt embryonerne i vaskepufferen ved forsigtigt at pipettere op og ned flere gange. MOPS vaskebuffer kan bruges til 2 dage ved 4 ° C.
      1. For 40 ml MOPS vaskebuffer brug 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 32 ml dH2O, og 40 pi Tween-20.
      2. Faste embryoner kan opbevares ved 4 ° C i 2 dage.
        BEMÆRK: Hvis lagring faste embryoner længere, tilsæt derefter 0,2% natriumazid i MOPS vaskebuffer for at forhindre bakterievækst.
  2. Pre-hybridisering
    1. Aspirer MOPS vaskebuffer og tilsæt 180 pi af en 2: 1-forhold mellem MOPS vaskebuffer til hybridiseringsbuffer, bland embryoner i opløsningen ved forsigtig pipettering flere gange, og inkuberes i mindst 20 minutter ved stuetemperatur. Hybridiseringsbuffer består af 70% formamid, 0,1 M MOPS, pH 7,0, 0,5 M NaCl, 1 mg / ml BSA og 0,1% Tween-20.
      1. For 40 ml hybridiseringspuffer brug 4 ml 1 M MOPS pH 7,0, 4 ml 5 M NaCl, 4 ml dH2O, 0,04 g BSA og 40 pi Tween-20. Vortexes grundigt, tilsættes 28 ml formamid, og vortex igen.
    2. Fjern 2: 1-forhold mellem MOPS vaske og hybridiseringsbetingelser buffere og tilsæt 180 pi af en 1: 2-forhold af MOPS vaskebuffer til hybridiseringsbuffer, bland embryoner i opløsningen, og der inkuberes i mindst 20 minutter ved stuetemperatur.
    3. Før probehybridisering forsigtigt blande embryoner i 100 - 150 pi hybridiseringspuffer. Inkuber embryoer ved 50 ° C i mindst 1h.
      BEMÆRK: Inkubering embryoer natten er acceptabel. Før inkubering, forsegle brøndene med en klæbefolie med henblik på at forhindre fordampning.
  3. Hybridisering
    1. I et separat rør tilføje 0,1-0,3 ng / pi probe og 500 ug / ml gær tRNA i hybridiseringsbuffer, derefter vortex forsigtigt for at skabe probe opløsning. Gær-tRNA tilsættes til probeopløsningen at mindske ikke-specifik binding af det anti-sense-probe. Forvarm denne opløsning til 50 ° C, og aspirat hybridiseringspuffer.
    2. Bland præhybridiseret embryoner i 100 pi af sonden opløsning, forsegle med en klæbefolie, og hybridisere ved 50 ° C i 2 til 7 dage afhængig af proben (den foxq2 sonde kan inkuberet i 2 dage).
      BEMÆRK: Inkubationstider vil variere baseret off sonden. Nogle gener udtrykt ved lave niveauer kræver op til en 7-dages inkubation. Plader med 96 brønde kan placeres i et fugtigt kasse som forsikring mod fordampning hvis ADHESive ark undlader at forsegle korrekt.
    3. Vask 5 gange ved 50 ° C med 180 pi frisk gjort MOPS vaskebuffer i i alt 3 timer. Derefter vaskes 3 gange (15 min) med 180 pi MOPS vaskebuffer ved stuetemperatur. Husk at blande embryoer ind i vaskebuffer hver gang ved forsigtigt at pipettere flere gange.
  4. antistof Inkubation
    1. Aspirer MOPS vaskebuffer og blandes embryoner i 180 pi blokeringspuffer bestående af 10% normalt fåreserum og 5 mg / ml BSA i MOPS vaskebuffer og inkuberes i mindst 45 minutter ved stuetemperatur eller 4 ° C natten over.
    2. Fjern blokerende buffer, og derefter blandes embryoner i blokerende buffer indeholdende en 1: 1.500 fortynding af alkalisk phosphatase-konjugeret anti-digoxigenin antistof fortyndet i blokeringsbuffer. Inkuber natten over ved stuetemperatur i en forseglet plade for at undgå fordampning. BEMÆRK: Lad ikke antistof på længere end natten over.
    3. Vask embryoner 6 gange (5 min, eller indtil embryoner drop) i MOPS vaskebuffer ved stuetemperatur. Embryoner kanopbevares natten over ved 4 ° C.
  5. In situ udvikling
    1. Vask embryoner 3 gange (10 min) ved stuetemperatur med frisk gjort pH 9,5 puffer bestående af 0,1 M Tris pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM Levamisol, og 0,1% Tween-20.
      1. For 20 ml pH 9,5 buffer brug 2 ml 1 M Tris pH 9,5, 400 uL 5M NaCI, 1 ml 1 M MgCl2, 20 pi Tween-20, 16,6 ml dH2O, og 0,0048 g Levamisol.
    2. Inkuber embryoer ved 37 ° C i farvningsbuffer beskyttet mod lys. Farvning puffer består af 10% dimethylformamid, 4,5 pi / ml 4-Nitro blue tetrazolium chlorid (NBT), og 3,5 pi / ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (BCIP) i frisk gjort pH 9,5 puffer .
      1. For 1 ml farvning puffer anvendes 100 pi dimethylformamid, 4,5 pi NBT, og 3,5 pi BCIP.
    3. Stop alkalisk phosphatase reaktionen ved vask 3 til 5 gange i MOPS vaskebuffer. Reaktionen with den foxq2 proben tager typisk 30 min til 1 time. Nogle prober kan have brug inkubation natten over ved enten stuetemperatur eller 4 ° C.
    4. Bland embryoner i en opløsning af 70% MOPS vask og 30% glycerol. Den glycerol tilvejebringer et brydningsindeks nødvendig til mikroskopi. Embryoner kan opbevares i denne opløsning i flere uger. Forsegl pladerne med plast paraffin for at forhindre fordampning.
  6. Forberedelse Slide og billedoptagelse
    1. Forbered et dias ved at arrangere tre små strimler af dobbeltklæbende tape til en trekant med små huller mellem strips over på et dias.
    2. Overfør embryonerne i 70% MOPS vask og 30% glycerol løsning til centrum af trekanten og dække med et dækglas.
    3. Forsegl dækglasset ved at påføre et lag af neglelak omkring kanterne af dækglasset.
    4. Capture billeder ved hjælp af en forbindelse lysmikroskop med en 20X objektiv og en vedhæftet kamera.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I havet urchin embryo har vi vist, at 3 forskellige Wnt signalering grene (Wnt / β-catenin, Wnt / JNK, og Wnt / PKC) 4, 25 samvirker til dannelse af et Wnt signalering netværk, der styrer anterior-posterior (AP) mønsterdannelse. En af de vigtigste konsekvenser af disse signaleringsbegivenheder er, at den oprindelige udtrykkes bredt anterior neuroectoderm (ANE) GRN bliver begrænset til et lille område omkring den forreste pol ved begyndelsen af gastrulation (24 HPF i S. purpuratus). Disse resultater indikerer, at Wnt / β-catenin signalering forhindrer ANE genaktivering i den bageste halvdel af embryonet ved 32-celle stadiet. Derefter denne vej relæer et signal til den ikke-kanoniske Wnt / JNK-signalvejen, der gradvis ned regulerer ANE GRN i den forreste halvdel af embryoet mellem 60-celle stadiet og tidlig gastrulation. Endelig er en tredje ikke-kanoniske Wnt pathway, Wnt / PKC, antagoniserer Wnt / JNK-signalvejen og forhindrer det i at eliminere ANE specifikation omkring den forreste pol (figur 1A) 4.

Vi bruger den Spatiotemporal ekspression af foxq2 at analysere for aktiviteten af hver af de Wnt signaling grene under AP mønsterdannelse, fordi det er en af de første to gener aktiveret i ANE GRN og det er let vurderes ved in situ hybridisering på grund af sin robuste ekspression 26. Hvis en enkelt Wnt signalering filial er forstyrres, så der er klare udtryk fænotyper, der angiver hvilken vej er involveret: 1) I mangel af Wnt / β-catenin signalering en bred maternel reguleringsmekanisme (figur 1A) aktiverer foxq2 udtryk i hele embryo (fig 1BB); 2) I mangel af Wnt / JNK signalering foxq2 udtrykkes i heleden forreste halvdel af embryoet (fig 1BC), men det er stadig nedreguleret i den bageste halvdel på grund af aktiviteten af Wnt / β-catenin signalering (figur 1A); I mangel af Wnt / PKC signalering foxq2 ekspression helt nedreguleret hele embryoet (fig 1Bd), fordi Wnt / β-catenin og Wnt / JNK signalveje er opreguleret 4, 25. Vi har således udviklet et assay, som vi har kaldt foxq2 transkriptionel udlæsning, som, når det kombineres med vores systematiske arbejdsgang (figur 2), giver os mulighed for effektivt at identificere og teste, om et gen af interesse er involveret i en eller flere af Wnt signalering filialer.

Brug af metode og foxq2 udlæsning system, der præsenteres her, har vi identificeret flere formodede ekstracellulære eller intracellulære MolecESTEMMELSER sandsynligvis involveret i Wnt netværk regulerer AP akse specifikation, hvoraf fire er vist i figur 3. Embryoner injiceret med morpholinos formål at knockdown ekspressionen af enten transkriptionsfaktoren, ATF2, eller det udskilte ekstracellulære Wnt modulator, Wif-1, viste en udvidelse af foxq2 ekspression mod bageste pol af embryoet på tidlige gastrulation stadier (figur 3A - C ). Disse resultater efterligne fænotyper observerede når medlemmer af Wnt / JNK signalvej er slået ned 4, 25, hvilket tyder på, at de er medlemmer af denne signalering gren, der er nødvendig for at nedregulere ANE GRN udtryk i den forreste halvdel af embryoet. I modsætning hertil blev foxq2 ekspression elimineret, når vi slået ned ekspressionen af transkriptionsfaktoren, NFAT (figur 3D), og det udskilte ekstracellulære modulator, sFRP3 / 4 (fig 3E),antyder, at disse molekyler er involveret i Wnt / PKC pathway, som er nødvendig til at antagonisere nedregulering af ANE GRN af Wnt / JNK signalering. Baseret på disse hurtigt opnåede resultater er vi nu i stand til at udføre mere detaljerede funktionelle analyser, der vil placere disse faktorer inden for udvikling Wnt signalering netværk involveret i GRN, der regulerer AP mønster i søpindsvin embryo.

figur 1
Figur 1. Model for AP Specifikation og mønster i søpindsvin og foxq2 Transcriptional udlæsning System. (A) Den gradvise nedregulering af ANE GRN til et område omkring den forreste stang af Wnt signalering netværk beskrevet i teksten og i 4, 9. (B) A transcriptional udlæsning, der viser foxq2 udtryk i de angivne Wnt pathway knockdowns (KO). Scale bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. En Eksperimentel Flow Diagram til Effektiv Wnt Network Analysis i søpindsvin Embryo. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. signaltransduktionsmolekyler involveret i Wnt Network Governing AP Axis Specifikation og mønster Identificeret Brug af foxq2 Transcriptional udlæsning System. (A, B, C) morpholino knockdowns tyder på, at en intracellulær signalering modulator, ATF2, og secerneres ekstracellulært modulator, Wif-1, er potentielle spillere i Wnt / JNK-signalvejen. (A, D, E) Knockdown eksperimenter indikerede, at NFAT, en intracellulær signalering modulator, og sFRP3 / 4, et udskilt Wnt signalering modulator, er involveret i Fzl1 / 2/7-PKC signalering. Scale bar = 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden præsenteres her er et eksempel, der illustrerer styrken i at bruge embryoner med mindre genomisk og morfologisk kompleksitet end hvirveldyr at forstå signalering transduktionsveje og GRNs for grundlæggende udviklingsmæssige mekanismer .. Mange laboratorier anvender lignende analyser i den tidlige søpindsvin udvikling at dissekere signalveje, der er involveret i andre celleskæbne specifikation hændelser (f.eks Notch, Hedgehog, TGF β, og FGF-signalering) 27, 28, 29, 30, 31. Disse søpindsvin undersøgelser har afsløret mange interessante og nye signalsystemer mekanismer, og mange aspekter af disse signaler mekanismer, der styrer tidlig søpindsvin udvikling synes at være bevaret blandt deuterostomes 9, 27, 30 <sup>, 31, 32. Vigtigere er det, har udforskningen af udviklingsmæssige biologi utraditionelle metazoiske embryoner oplevet en stigning i de seneste år, og mange af disse dele karakteristika med søpindsvin embryoner i den tidlige udvikling 9, 15, 16, 33. Således metoden præsenteres her kunne vid udstrækning anvendes til studiet af signaltransduktionsveje i mange af disse organismer under tidlig udvikling.

Alle teknikker, der anvendes til at banke ned genekspression kan potentielt producere off-target vælte effekter. Morpholinoer har vist sig at være en bemærkelsesværdig effektiv gen perturbation metode i søpindsvin embryoner i vid udstrækning, fordi fællesskabet udfører streng kontrol at afhjælpe bekymring for, at knockdown fænotype er uspecifik. Disse grundlæggende kontrol analyser kan være modified og anvendes på andre Knockdown teknikker (dvs. skarpere / Cas9). Kontrollen er: 1) Omhyggelig dosis-respons-assays udføres med hver morpholino indtil ≥ 80% af injicerede embryoer viser defekt fænotype og / eller markør genekspression; 2) morpholinoer kasseres, hvis de forårsage alvorlige udviklingsmæssige forsinkelser eller endda døden ved moderate koncentrationer. Disse fænotyper er sandsynligvis skyldes toksiske ikke-tilsigtede virkninger; 3) Mindst to morpholinoer, der er designet til at målrette forskellige bindingssteder bruges til at bekræfte Knockdown fænotyper; 3) missense morpholinoer injiceres; 4) morpholino fænotyper reddes ved indføring mRNA for målgenet i morpholino knockdown embryoner; 5) Når rådighed, hele mount antistof farvning analyser bruges til at vise, at morpholino knockdowns forhindrer translation af genet af interesse. Det er vigtigt at bemærke, at søpindsvin samfund bruger mindst fire arter for funktionelle studier, afhængigt af, hvor forskerne er placeret. I most tilfælde til vores viden, de forskellige morpholinos bruges til at banke ned ortologer har genereret lignende fænotyper i hver art (f.eks se disse funktionelle undersøgelser af Nodal signalering 34, 35, 36, 37). Disse resultater argumentere overbevisende, at vores strenge eksperimenter kontrol kraftigt vælge for de morpholinoer der producerer on target knockdown effekter.

Et andet vigtigt aspekt af denne metode er at omhyggeligt identificere de transkriptionelle mål, der mest sandsynligt direkte aktiveres af signalvejen under overvejelse. Det eksempel, som vi giver her er tilfældigt, fordi Spatiotemporal aktivering af signalveje og nedregulering af et robust udtrykt gen, foxq2, forekomme tidligt i udviklingen og de GRNs for kim lag og akse specifikation i søpindsvin embryo er godt-Etableret. Således en indlysende begrænsning ved denne metode er, at det i mange tilfælde kan være nødvendigt at knockdown aktiviteten af ​​en bestemt signalvej under senere stadier af udvikling og inden for specifikke områder. Der er flere allerede tilgængelige teknologier, der kan bruges til at overvinde disse begrænsninger (f.eks foto-morpholinoer, Skarpere / Cas9 38, FACseq), selv i ikke-traditionelle model embryoner, der ikke er modtagelige for genetisk manipulation. I mange tilfælde kan det ikke være muligt at identificere et kandidat-gen nedstrøms for en signalvej af interesse, og hvis Spatiotemporal ekspression så let vurderes som foxq2, som har en bemærkelsesværdig høj signal-til-støj-forhold. Det er almindeligt at finde gener med meget lavere signal-til-støj-forhold. Hvis et andet gen er forhindret i en bestemt analyse, derefter in situ probe genereret for genet af interesse bør være så lang som muligt. Generelt anvendelse af prober længere end 1.000 basepars øger signalet og reducerer støjen i kolorimetrisk og fluorescerende in situ-assays.

Når det transkriptionelle assay, der angiver, hvor og hvornår den signaltransduktionsvejen af ​​interesse signalering er etableret, det næste vigtige skridt er at bestemme både den rumlige og tidslige udtryk for de formodede regulatoriske faktorer involveret i den udviklingsmæssige mekanisme under undersøgelse. Differential skærm og / eller qPCR data er vigtige redskaber, men de kan være misvisende. Bekræftelse med hele mount in situ hybridisering, at genet af interesse udtrykkes inden for det område, hvor signalvejen er aktiv forhindrer spild af tid og ressourcer. Desuden er disse data tillader forudsigelser, der skal foretages om genet regelarkitektur, der underretter de mere detaljerede analyser, der vil følge, når de involverede er identificeret med denne første analyse (figur 2) spillere. Vi præsenterer en simple kolorimetrisk assay i denne protokol; dog kan fluorescerende in situ hybridisering (FISH) også anvendes til at visualisere flere fluorescerende prober samtidigt, hvilket muliggør forbedret rumlig opløsning inden for det område af interesse samt konfokal mikroskopi 24. Desuden kan FISH parres med antistoffarvning at identificere post-translationelle modifikationer og / eller hvor signalvejen af interesse er aktiv 24.

Der er to vigtige skridt i den protokol, som ofte overses. Den ene er fremstillingen af ​​morpholino oligonukleotid opløsning. Det er vigtigt at opvarme morpholino opløsning ved 65 ° C i 2 minutter til 5 minutter og at centrifugere det ved fuld hastighed i mindst 10 min før læsning injektionsnålene. Disse trin er afgørende, når det morpholino stamopløsningen opbevaret ved -20 ° C, fordi morpholino oligonukleotider kan udfælde fra opløsningen ved lav temperamentturer og spinding af opløsningen forhindrer injektionsnålene i at blive tilstoppet af partikler. Et andet kritisk aspekt at overveje, er, at embryoner bør blandes grundigt ind i de forskellige løsninger i alle trin af fiksering og in situ hybridisering protokoller. I vores hænder, bliver signalet reduceres og / eller baggrunden er øget, hvis denne enkle trin ikke udføres.

Måske er det vigtigste aspekt af den metode, der præsenteres her, er, at det giver mulighed for effektive funktionelle analyser af store sæt af potentielle signaltransduktionsmolekyler genereret af næste generation transcriptomics og proteomics. Når disse indledende funktionelle analyser bekræfter en gruppe af regulatoriske faktorer er involveret i en vej af interesse, den næste udfordring er at bruge etablerede analyser (f.eks funktionelle knockdowns, detaljerede multi-farvede hele mount in situ; biokemiske interaktioner) for at vurdere, hvordan de passer ind den extracelluLAR, intracellulære, og transkriptionelle niveauer af signaltransduktionsvejene involveret i en særlig udviklingsproces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

Tags

Developmental Biology søpindsvin neuroectoderm mønster Wnt signaltransduktion anterior-posterior deuterostom evolution gen regulatoriske netværk high throughput,
The Power of Simplicity: Søpindsvin embryoner som<em&gt; I Vivo</em&gt; Developmental modeller til undersøgelser Complex celle-til-cellesignalering netværksinteraktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Range, R. C.,… More

Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter