Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar Published: February 16, 2017 doi: 10.3791/55113
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Mississippi State University

Summary

Bu video makalede sistematik ve verimli birçok omurgasız embriyolar karmaşık sinyal yolları ve düzenleyici ağları bileşenleri karakterize etmek için kullanılabilir in vivo metodolojisi basit ayrıntıları.

Introduction

Gen düzenleyici ağları (GRNs) ve sinyal iletim yolları yetişkin hayvan vücut planı oluşturmak için kullanılan embriyonik gelişim sırasında genlerin mekansal ve zamansal ifade kurmak. Hücre-hücre sinyal iletim yolları hücrelerin iletişim hangi araçları sağlayan bu düzenleme ağların temel bileşenleri vardır. Bu hücresel etkileşimler kurmak ve embriyogenez 1, 2 sırasında çeşitli bölgelerde ve arasında düzenleyici ve farklılaşma genlerinin ekspresyonunu rafine. salgılanmış hücre dışı modülatörlerinin (ligandlar, antagonistler), reseptör ve ko-reseptörleri arasındaki etkileşimi sinyal transdüksiyon yollarının aktivitelerini kontrol eder. hücre içi moleküller bir yelpazesine bir hücrenin gen ekspresyonu değişimlerinin, bölme ve / veya şekli ile sonuçlanan, bu giriş çeviren. ana yoldan büyük hücre dışı ve hücre içi seviyede kullanılan anahtar moleküllerinin çoğu, birliktebilinen, tek tek sinyal yollarının karmaşıklığı nedeniyle büyük ölçüde eksik bilgidir. Buna ek olarak, farklı sinyal yolları çoğunlukla dışı, hücre içi de olumlu veya olumsuz ya birbiri ile etkileşim ve transkripsiyon seviyeleri 3, 4, 5, 6. Önemli olarak, sinyal transdüksiyon yollarının ana bileşenleri çok tüm metazoan türlerinde korunan ve özellikle yakından ilgili filumlar organizmaların karşılaştırırken, son derece önemli sinyal yollarının en sık birçok türün içindeki gelişim işlevleri yerine 7, 8, 9, 10, 11.

gelişimi sırasında sinyal çalışma herhangi bir organizmada zor bir görev olduğunu ve oradaomurgalılarda büyük olası ligand ve reseptör / ko-modülatör etkileşimlerinin sayılar, hücre içi iletim molekülleri, hem de orada 1): en ikincil ağızlılar modelleri (omurgalıların omurgasız omurgalılar, yarı sırtipliler ve derisidikenlilerde) 'de sinyal yolları okuyan bazı önemli zorluklar nedeniyle genom 12, 13, 14 karmaşıklığı farklı sinyaller arasındaki etkileşimler; 2) omurgalıların karmaşık morfolojisi ve morfogenetik hareketler genellikle daha zor ve sinyal iletim yollarının arasında fonksiyonel etkileşimleri yorumlamak yapmak; 3) En dışı derisi dikenliler omurgasız ikincil ağızlılar modeli türlerinde Analizleri bazı tunikat türlerinin 15, 16 hariç gravida kısa pencereler ile sınırlıdır.

Deniz kestanesi embriyo yukarıda belirtilen sınırlamaları birkaç vardır ve in vivo sinyal iletim yollarının ayrıntılı bir analiz yapmak için birçok benzersiz niteliklere sahiptir. Bunlar aşağıdakileri içerir: 1), deniz kestanesi genomunun uygulama kolaylığı önemli ölçüde mümkündür ligand, reseptör / co-reseptör ve hücre içi iletim molekülü sayısını azaltır 17 etkileşimi; 2) germ ve büyük embriyonik eksenlerin özellikleri ve desenlendirme kontrol GRNs iyi sinyaller 18, 19 alıcı hücre / topraklarının düzenleyici bağlamında anlamada yardımcı, deniz kestanesi embriyolarda kurulur; Embriyolar olan morfoloji analiz etmek kolay bir tek katmanlı epiteli oluşur zaman 3) Birçok sinyal iletim yolları erken bölünme ve gastrula aşamaları arasında ele alınabilir; 4) molekülleri içerenkolayca manipüle edilir deniz kestanesi sinyal yolları d; 5) Birçok deniz kestanesi 10 ila 11 ay bir yıl (örneğin Strongylocentrotus purpuratus ve Lytechinus variegatus) için gebe edilir.

Burada, sistematik ve verimli bir şekilde belirtmek ve deniz kestanesi embriyolarda desen bölgeleri birkaç omurgasız model sistemler karmaşık moleküler mekanizmaların çalışmada sunduğumuz avantajları göstermek için sinyal yollarının bileşenlerini karakterize bir yöntem mevcut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Yüksek Verimli Morfolino Tasarım Stratejisi

  1. Bir ilgi gen (ler) (örneğin aday gen yaklaşımı, cis-düzenleyici analiz, RNAseq ve / veya proteomik diferansiyel ekranları) belirleyin.
  2. Sık sık güncellenen web sitelerinde mevcut genomik, transkriptomik ve gen ifadesi verileri kullanın (örn SpBase http://www.echinobase.org 20 ve S. purpuratus Genom Arama http: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html) uzaysal ekspresyon profili söz konusu gelişimsel mekanizma ile örtüşmektedir belirlemek için. Resim sentezleme verileri yoksa, o zaman qPCR primerler oluşturur ve / ya da in situ probu bir antisens geni sentezleme modelini değerlendirmek.
  3. uzaysal ve geçici ekspresyon modelini tespit edildikten sonra, genomik web sitelerinden DNA dizisini elde etmek.
    1. çeviri engelleme morfolino oligonükleotitler üretebilmek için, o dizisini eldef 5 'un çevrilmiş bölge (5' UTR) doğrudan yukarı gelen SpBase veya S. purpuratus Genom Arama web sitelerinde mevcut sentezlenmiş dizi etiketi (EST) veritabanlarından başlangıç kodonu. Bu bilgiler ilgi gen için mevcut değilse, o zaman 5 'RACE gerçekleştirin.
    2. , Bir bağlayıcı bloke morfolino tasarım ekson ve SpBase veya S purpuratus Genom ara aracında iskele BLASTN alet intronlar içeren genomik sekans arayın.
  4. istenen 25 baz çifti morfolino dizisini tasarlamak amacıyla, oligonükleotid tasarımı web sitesi http://oligodesign.gene-tools.com kullanın.
    1. bir çeviri-bloke morfolino, translasyon hedef dizinin kaynağı olarak 3 '5' mRNA dizisini kullanır. 5 'UTR sekansını (kopyalama başlangıç ​​sitesinin, akış yukarı yaklaşık olarak 70 nükleotid) artı belirgin wi kodon başlaması ile (başlangıç ​​sitesinin alt) kodlama bölgesi 25 bazlarinci parantez (ATG).
    2. bir bağlayıcı bloke morfolino, intron-ekson veya ekson-intron sınır dizisini ve sınır bölgeleri yaklaşık 50 baz (ekson sekansı 25 bazlar ve intron sekansı 25 bazları) içerir. dizi benzersiz olduğunu doğrulamak için morfolino dizisi ile genom tarayın.

Morfolino oligonükleotidleri 2. Mikroenjeksiyon

  1. 300 nmol morfolino şişenin içine nükleaz içermeyen suyun 100 uL eklenmesiyle morfolino oligonükleotid 3 mM stok çözelti hazırlayın.
    NOT: dietil pyrocarbonate morfolino zarar verebilir, çünkü yeniden süspansiyon için DEPC arıtılmış su kullanmayın.
  2. tam hızda 30 sn için stok oligonükleotid çözeltisi içeren flakon aşağı ilk sulandırma spin için - 5 ila 10 dakika, kısaca vorteks için 65 ° C'de (14,000 16,000 xg), kısaca girdap, ısı ve oda morfolino stok tutmak en az 1 saat boyunca sıcaklığı. Morfolino stok solüsyon s + 4 ° C ile -20 ° C arasında saklanır.
  3. istenilen konsantrasyonda morfolino oligonükleotitler içeren enjeksiyon çözeltisi hazırlayın. Bu çözelti, genellikle% 20 gliserol ya da bir taşıyıcı olarak 125 mM KCI ve 15% (fluorescein isothiocyanate dekstran 10,000 MA 2.5 mg / ml stok çözelti) FITC Dekstran içerir. FITC Dextran ve diğer floresan dekstran konjugatlar rutin Epifloresans mikroskobu ile enjekte edilen embriyolar tanımlamak için kullanılır. -20 ° C'de saklayın enjeksiyon çözümleri.
  4. 5 dakika - en az 2 bir ısı blok ya da su banyosu içinde 65 ° C sıcaklıkta morfolino çözeltisi ısıtılır.
  5. En az 10 dakika boyunca - (16,000 xg 14,000) tam hızda 1 dakika santrifüj için - (16,000 xg 14,000), girdap Kısaca morfolino tam hızda 30 sn için çözüm dönerler.
  6. morfolino çözümü ile enjeksiyon iğneleri yükleyin. Ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü için Stepicheva ve Song 2014 21 ve alkış ve Ettensohn, 2004 bakınız"> 22.

S. purpuratus Embriyolar 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) 3. Sabitleme ve Yerinde Protokol

NOT: Bu protokol Arena-Mena ark değiştirilir. 2000 23 ve Sethi ve arkadaşları. 2014 24.

  1. tespit
    1. , Embriyoları içeren oyuklara (aşağıya bakınız) tespit edici birkaç damla pipetleme yavaşça karıştırın ve bunları oturmasına izin verin. fiksatif çözüm çıkarın ve daha sonra sabitleştirici iki ek 180 uL yıkama ile embriyolar karıştırın.
      NOT: iyice nazik pipetleme yukarı ve aşağı birkaç kez yıkama sırasında embriyoların karıştırmak için önemlidir. Bunu yapmamak sinyal gürültü oranı düşürebilirsiniz.
    2. pH 7.0, 10 mM MOPS oluşan% 4 elektron mikroskobu sınıf paraformaldehid içinde oda sıcaklığında 50 dakika 1 saat süresince ikinci sabitleyici yıkaması (RT) 'de düzeltmek için embriyolar boş,% 0.1 Tween-20 ve yapay seawater (ASW). En iyi sonuçlar için her zaman bu çözüm taze olun. Buna ek olarak, kullanım kolaylığı ve kullanışlılık embriyolar için 96-yuvalı plakalar içinde sabitlenir.
      1. 20 ml sabitleyici kullanım 5 mL% 16 paraformaldehit, 15 ml ASW 200 uL 1 M MOPS pH 7.0, 20 uL Tween-20.
    3. MOPS, 180 uL, oda sıcaklığında 5 kez yıkayın 0.1 M MOPS pH 7.0, 0.5 M NaCI ve Tween-20, en az 5 dakika boyunca ya da embriyolar kadar kuyunun dibine% 0.1 aşağıdakilerden oluşan yıkama tamponu. Yine, iyice hafifçe yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı yıkama tamponu içine embriyolar karıştırmak için önemlidir. 4 ° C'de depolandığında, MOPS yıkama tampon çözeltisi 2 gün için kullanılabilir ° C.
      1. 40 ml MOPS tamponu için 4 mL 1 M MOPS pH 7.0, 4 ml 5 M NaCI, 32 mL DH 2 O ve 40 uL Tween-20 yıkanır.
      2. Sabit embriyolar, 2 gün süreyle 4 o C'de saklanabilir.
        Not: uzun sabit embriyolar depolanması, daha sonra bakteriyel büyümeyi önlemek için yıkama tamponu MOPS,% 0.2 sodyum azit ilave edin.
  2. Ön-hibritleme
    1. MOPS tampon yıkama aspire ve 2 180 mcL: hibridizasyon tampon tampon hafifçe pipetleme birkaç kat çözeltisi içine embriyolar karıştırın ve oda sıcaklığında en az 20 dakika süreyle inkübe yıkama MOPS 1 oranında. Hibridizasyon tamponu% 70 formamit, 0.1 M MOPS pH 7.0, 0.5 M NaCI oluşur, 1 mg / ml BSA ve% 0.1 Tween-20.
      1. 40 ml melezleme tamponu kullanılması 4 mL 1 M MOPS, pH 7.0, 4 ml 5 M NaCI, 4 mL DH 2 O, 0.04 g BSA ve 40 uL Tween-20. , Vorteks ile iyice karıştırın tekrar 28 ml formamid ve vorteks ekleyin.
    2. MOPS yıkama ve melezleştirme tamponları 1 oranında ve 1: 180 uL ekleyin: 2 çıkarın hibridizasyon tampon tampon çözeltisi içine embriyolar karıştırın ve oda sıcaklığında en az 20 dakika süreyle inkübe yıkama MOPS 2 oranında.
    3. hibridizasyon tamponu 150 ul - prob hibridizasyon nazikçe 100 içine embriyolar karıştırın önce. en az 1, 50 ° C de inkübe embriyolarh.
      NOT: gecede embriyolar Hazırlanıyor kabul edilebilir. saatliğine inkübe edilmeden önce, buharlaşmayı önlemek için, bir yapışkan tabaka ile kuyu mühür.
  3. melezleme
    1. prob çözeltisi oluşturmak için yavaşça, hibridizasyon tamponu içinde girdap 0.3 prob ng / ml ve 500 ug / ml maya tRNA - Ayrı bir tüp içinde 0.1 ekleyin. Maya tRNA, anti-sens probunun özel olmayan bağlanmayı azaltmak için prob çözeltisi ilave edilir. Bu, 50 ° C'ye kadar çözeltisi ve aspire hibridizasyon tamponu önceden ısıtın.
    2. Prob çözeltisi 100 uL içine önceden hibridize embriyolar karıştırın bir yapışkan tabaka ile sızdırmaz ve prob bağlı olarak 2 ile 7 gün boyunca 50 ° C'de hibridize (foxq2 prob 2-gün inkübe edilebilir).
      NOT: İnkübasyon süreleri sonda kapalı göre değişir. düşük seviyelerde sentezlendiği bazı genler 7 günlük bir inkübasyon gerektirmez. 96 oyuklu plakalar ADHES halinde buharlaştırma karşı sigorta bir nem kutu yerleştirilebilirive sayfası düzgün mühür başarısız olur.
    3. taze MOPS 180 uL, 50 ° C de 5 kez yıkayın 3 saatlik bir toplam yıkama tamponu. Daha sonra, MOPS uL oda sıcaklığında yıkama tamponu 180 ile 3 kez (15 dakika) yıkanır. yıkama içine embriyolar hafifçe birkaç kez pipetleme her zaman tampon karıştırmak unutmayın.
  4. Antikor Kuluçka
    1. MOPS tampon yıkama aspire ve% 10 normal koyun serumunda ve 5 mg içeren bloke edici tampon içinde 180 uL embriyolar karıştırın / tampon ve gece boyunca oda sıcaklığında en az 45 dakika veya 4 ° C'de inkübe edin yıkama MOPS mL BSA.
    2. bloklama tamponunu çıkarın ve sonra 1 içeren bloke edici tampon içinde embriyolar karıştırın blokaj tamponunda seyreltilmiş alkalin fosfataz-konjuge edilmiş anti-digoksijenin antikoru ile 1500 seyreltme. Buharlaşmayı önlemek için sızdırmaz kılınmış bir plaka, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir. NOT: gecede daha uzun üzerinde antikor bırakmayın.
    3. embriyolar 6 kez yıkayın (5 dk ya da embriyolar damla kadar) MOPS oda sıcaklığında tamponu yıkayın. embriyolar can4 ° C'de gece boyunca saklanır.
  5. In situ gelişmede
    1. 0.1 M Tris pH 9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM Levamizol oluşan taze pH 9.5 tamponu ile oda sıcaklığında embriyolar 3 kere (10 dakika) yıkanır ve% 0.1 Tween-20.
      1. 20 ml pH 9.5 tampon kullanım için 2 mL 1 M Tris pH 9.5, 400 uL 5 M NaCl, 1 mL, 1 M MgCl2, 20 uL Tween-20, 16.6 mi DH 2 O ve 0.0048 gr Levamisole.
    2. ışıktan koruyarak lekeleme tampon maddesi, 37 ° C 'de embriyolar inkübe edin. Lekeleme tampon maddesi,% 10, dimetil formamid oluşur, 4.5 ul / ml 4-Nitro Mavi tetrazolyum klorid (NBT) ve taze yapılmış, pH 9.5 tampon maddesi içinde 3.5 ul / ml 5-bromo-4-kloro-3-indolil-fosfat (BCIP) .
      1. lekeleme tampon maddesi ile 1 mL, 100 uL, dimetil formamid, 4.5 mL NBT ve 3.5 uL BCIP kullanın.
    3. MOPS 3 ile 5 kez yıkanarak alkalin fosfataz reaksiyonu durdurun yıkama tamponu. reaksiyon wifoxq2 probu tipik olarak 1 saat 30 dakika sürer inci. Bazı Probes RT ya da 4 ° C'de ya da gece boyunca inkübasyon gerekebilir.
    4. % 70 MOPS yıkama ve% 30 gliserol çözeltisi içine embriyolar karıştırın. gliserol mikroskopi için gerekli bir kırılma indeksine sağlar. Embriyolar birkaç hafta boyunca bu çözelti içinde saklanabilir. buharlaşmasını önlemek için plastik parafin ile plakaları Seal.
  6. Slayt hazırlama ve görüntü yakalama
    1. Bir slayt üzerine şeritler arasındaki küçük boşlukları olan bir üçgen içine çift taraflı bant üç küçük şeritler düzenleyerek bir slayt hazırlayın.
    2. üçgenin merkezinde% 70 MOPS yıkama ve% 30 gliserol çözeltisi içinde embriyo transferine ve bir lamel ile kaplayın.
    3. Örtücü camın kenarları, yaklaşık oje tabakası uygulayarak lamel mühür.
    4. 20X objektif ve ekli kamera ile bir bileşik ışık mikroskobu kullanarak görüntüleri yakalayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deniz kestanesi embriyo biz 3 farklı Wnt sinyal dalları (Wnt / β-katenin, Wnt / JNK ve Wnt / PKC) 4, 25 etkileşim ön-arka (AP) desenlendirme yöneten bir Wnt sinyal ağı oluşturmak için olduğunu göstermiştir. Bu sinyal olayların en önemli sonuçlarından biri, ilk geniş ifade ön nöroektoderm (ANE) GRN gastrulasyon başında (S. purpuratus 24 hpf) tarafından ön direğin etrafında küçük bir bölgede snrlandrlr olmasıdır. Bu sonuçlar, Wnt / β-katenin 32 hücreli aşamada embriyonun arka yarısında ANE geninin aktivasyonu önlediğini göstermektedir. Sonra, bu yolun gittikçe aşağı 60-hücreli evre ve erken gastrulasyon arasındaki embriyonun ön yarısında ANE GRN düzenleyen olmayan kanonik Wnt / JNK sinyal yolunun bir sinyal röleleri. Son olarak, üçüncü bir standart olmayan Wnt pathway Wnt / PKC, sinyal yolu Wnt / JNK antagonize ve ön direğin etrafında (Şekil 1A) ANE özellikleri ortadan önler 4.

Bunun ANE GRN aktif ilk iki genlerden biri olduğu için AP desen içinde Wnt sinyal dalların her birinin aktivitesi için tahlil foxq2 arasında uzaysal bir ifade kullanmak ve kolayca nedeniyle güçlü bir ifade in situ olarak melezleşme ile değerlendirildi 26. Tek tek Wnt sinyal dalı bozulur, daha sonra dahil olduğu yolu gösterir açık bir sentezleme fenotipleri vardır: 1) geniş bir anne düzenleyici mekanizması (Şekil 1A) sinyal Wnt / β-katenin yokluğunda tüm embriyo boyunca foxq2 ekspresyonunu aktive (Şekil 1BB); 2) Wnt / JNK sinyal foxq2 yokluğunda boyunca ifade edilirembriyo (Şekil 1bc) ön yarısı, ama yine de aşağı nedeniyle Wnt / β-katenin sinyal (Şekil 1A) aktivitesi için arka yarısında düzenlenmiştir; Wnt / β-katenin ve sinyal yollarının Wnt / JNK kadar 4, 25 düzenlenir, çünkü Wnt / PKC sinyal foxq2 ifade yokluğunda sonuna kadar embriyo (Şekil 1BD) boyunca düzenlenmiştir. Böylece, bizler sistematik iş akışı (Şekil 2) ile kombine edildiğinde, bize verimli bir şekilde tanımlamak ve ilgi bir gen bir veya Wnt daha fazla yer olup olmadığını test etmek için izin verir foxq2 transkripsiyonel okuma sistemi olarak adlandırdığı bir tahlil geliştirdik dalları sinyalizasyon.

Burada sunulan yöntem ve foxq2 okuma sistemi kullanarak, biz birkaç farazi dışı ya da hücre içi Molec belirledikules olasılıkla Şekil 3'te sunulmuştur dördü AP ekseni özellikleri düzenleyen Wnt ağında yer alan. Transkripsiyon faktörü, ATF2 veya salgılanan ekstraselüler Wnt modülatör ya ifadesini, Wif-1 demonte şekilde tasarlanmış morpholinos enjekte Embriyolar, erken gastrulasyon aşamasında embriyo arka kutbuna doğru foxq2 ifade bir genişleme gösterdi (Şekil 3A - C ). Bu sonuçlar onlar aşağı embriyonun ön yarısında ANE GRN ifadesini düzenlemek için gerekli olan bu sinyal şube üyeleri düşündüren, Wnt / JNK sinyal yolunun üyeleri aşağı 4, 25 çaldı zaman gözlenen fenotipleri taklit. Bunun aksine, foxq2 sentezleme Bu transkripsiyon faktörü, NFAT (Şekil 3D) ekspresyonunu nakavt elimine edildi ve salınan hücre dışı modülatörü sFRP3 / 4 (Şekil 3E),bu moleküller, Wnt / JNK sinyal ane GRN aşağı regülasyonu antagonize etmek için gerekli olan Wnt / PKC iletimine dahil olduğunu göstermektedir. Bu hızla elde edilen sonuçlara dayanarak şimdi deniz kestanesi embriyo AP desenlendirme yöneten GRN dahil gelişen Wnt sinyal ağı içinde bu faktörleri yerleştirir daha detaylı fonksiyonel analizleri yapmak mümkün.

Şekil 1
Şekil 1. AP Şartname ve Desenlendirme Deniz Kestanesi ve foxq2 transkripsiyonel Okuma Sistemi Modeli. (A) 9, metinde ve 4 ayrıntılı Wnt sinyal ağı tarafından ön direğin etrafına topraklarına ANE GRN aşağı ilerici düzenlenmesi. (B) Transkripsiyonelbelirtilen Wnt yolunun knockdowns (KO) foxq2 ifadesini gösteren l okuma sistemi. Ölçek çubuğu 20 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Deniz Kestanesi Embriyo Verimli Wnt Ağ Analizi 2. Deneysel Bir Akış Şeması Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Wnt Ağ Yönetim AP Eksen Şartnamede ve Desenlendirme ilgilendim Şekil 3. Sinyal İletimi Moleküller kullanma Belirlenen foxq2 transkripsiyonel Okuma Sistemi. (A, B, C), Morfolino knockdowns bir hücre içi sinyal modülatörü, ATF2 ve salgılanan hücre dışı modülatörü, Wif-1, Wnt / JNK sinyal yolunun, potansiyel oyuncu olduğunu düşündürmektedir. (A, D, E) yok etme deneyleri NFAT, hücre içi bir sinyal modülatörü ve sFRP3 / 4, bir salgılanmış Wnt sinyal modülatörü, Fzl1 / 2/7-PKC sinyal rol oynadığını göstermiştir. Ölçek çubuğu 20 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sunulan metodoloji .. Birçok laboratuvar incelemek için erken deniz kestanesi gelişimi sırasında benzer deneyleri kullanan temel gelişimsel mekanizmaları düzenleyen sinyalizasyon iletim yollarını ve GRNs anlamak için omurgalılar daha az genomik ve morfolojik karmaşıklığı ile embriyoları kullanılarak gücünü gösteren bir örnektir diğer hücre kaderi şartname olaylarda yer alan sinyal yolları (örn Notch, Kirpi, TGF β, ve FGF sinyal) 27, 28, 29, 30, 31. Bu deniz kestanesi çalışmaları ikincil ağızlılar 9, 27, 30 <arasında korunacak erken deniz kestanesi gelişimi yöneten pek çok ilginç ve yeni sinyal mekanizmalarını ve bu sinyal mekanizmaların birçok açıdan görünür ortaya koymuştursup>, 31, 32. Önemlisi, geleneksel olmayan metazoan embriyoların gelişimsel biyoloji araştırma erken gelişme 9, 15, 16, 33 sırasında son yıllarda artış ve deniz kestanesi embriyolar ile bu pay özelliklerinin pek çoğuna gördü. Bu nedenle, burada sunulan yöntem yaygın erken gelişimi sırasında bu organizmaların pek çok sinyal iletim yollarının çalışmaya uygulanabilir.

gen ifadesini yıkmak için kullanılan tüm teknikler potansiyel hedef dışı etkiler yıkmak üretebilir. toplum titiz kontroller demonte fenotip non-spesifik olduğu endişelerini hafifletmek için gerçekleştirir, çünkü morpholinos büyük ölçüde deniz kestanesi embriyolarda derece etkili bir gen pertürbasyon yöntemi olduğu kanıtlanmıştır. Bu temel kontrol deneyleri m olabilirdeğişmemiş ve diğer demonte tekniklerle uygulanan (yani keskin / Cas9). kontrol: 1) dikkatli doz tepkisi analizleri enjekte edilen embriyoların ≥% 80 bozuk fenotip ve / veya marker geni ekspresyonu gösterir kadar her morfolino ile gerçekleştirilir; onlar orta konsantrasyonlarda ağır gelişimsel gecikmeler ve hatta ölüme neden oluyorsa 2) morpholinos atılır. Bu fenotipler zehirli hedef dışı etkileri nedeniyle muhtemeldir; 3) farklı bağlanma sahasına hedeflemek için tasarlanmış en az iki morpholinos demonte fenotipleri teyit etmek için kullanılır; 3) Missens morpholinos enjekte edilir; 4) Morfblino fenotipleri morfolino demonte embriyolara hedef genin için mRNA tanıtarak tarafından kurtarıldı; 5) mevcuttur, bütün montaj antikor boyama deneyleri bu morfolino knockdowns, ilgi konusu genin çevirisi bilmek göstermek için kullanıldığı zaman. Deniz kestanesi toplum bilimciler bulunduğu yere bağlı olarak fonksiyonel çalışmalar için en az dört tür kullanır dikkat etmek önemlidir. most olgu, bildiğimiz kadarıyla, çeşitli morpholinos (örneğin 34, 35, 36, 37 sinyal NODAL bu fonksiyonel çalışmalar bakınız) her tür benzer fenotipleri oluşturmuş ortologlarını yıkmak için kullanılır. Bu sonuçlar bizim titiz kontrol deneyleri kuvvetle üzerinde hedefe demonte etkiler üretmek bu morpholinos seçmek inandırıcı savunuyorlar.

Bu yöntemin diğer önemli yönü dikkatlice büyük olasılıkla doğrudan göz altında sinyal yolunun aktive edilir transkripsiyonel hedefleri tespit etmektir. Sinyal yollarının zamanmekansal aktivasyonu ve sağlam ifade genin aşağı regülasyonu, foxq2, geliştirme erken ortaya çıkar ve deniz kestanesi embriyoda germ tabakası ve eksen şartname düzenleyen GRNs iyi çünkü biz burada sağlayan örnek, tesadüfi değildir-established. Bu nedenle, bu yöntemin belirgin bir kısıtlama Pek çok durumda, gelişme sonraki aşamalarında spesifik bölgeleri içinde, belirli bir sinyal yolunun aktivitesini demonte için gerekli olmasıdır. Bu sınırlamaları aşmak için kullanılabilecek artık mevcut çeşitli teknolojiler vardır (örneğin foto-morpholinos, Sebzelik / Cas9 38, FACseq) hatta genetik manipülasyon için uygun değildir geleneksel olmayan bir model embriyoların içinde. Pek çok durumda, uzaysal ekspresyon kolayca oldukça yüksek bir sinyal-gürültü oranına sahip foxq2 olarak değerlendirilir ilgi konusu bir sinyal yolunun ırmak aday geni tespit etmek mümkün olmayabilir. Çok daha düşük bir sinyal-gürültü oranına sahip genleri bulmak için yaygındır. Diğer bir gen, belirli bir deney için mevcut değilse, o zaman ilgili genin in situ üretilen prob mümkün olduğu kadar uzun olması gerekir. 1000 baz çifti daha uzun genel kullanarak sondalar içindes ölçüde sinyalini artırır ve in situ deneylerinde kolorimetrik ve floresan gürültüyü azaltır.

nerede ve ilgi sinyal iletim yolu kurulur sinyalizasyon zaman, bir sonraki önemli adım mekansal ve çalışma kapsamında gelişimsel mekanizmasında yer alan varsayılan düzenleyici faktörler, geçici olarak hem belirlemektir gösterir transkripsiyonel tahlil kez. Diferansiyel ekran ve / veya QPCR verileri önemli araçlardır, ancak yanıltıcı olabilir. Ilgi gen sinyal yolu aktif sınırları içinde ifade edildiğini in situ hibridizasyon bütün montaj ile onaylama zaman ve kaynak israfı önler. Buna ek olarak, bu veriler, tahminler, bu ilk deneyde (Şekil 2) ile tanımlanır ilgili oyuncu sonra takip edecek daha detaylı analizler bilgilendirecektir gen düzenleyici mimarisi ile ilgili yapılacak izin verir. Bir ahmak sunuyoruzle bu protokolde kolorimetrik; Ancak, in situ hibridizasyon (FISH) floresan de ilgi sınırları içinde gelişmiş uzaysal çözünürlük yanı sıra konfokal mikroskopi 24 için izin aynı anda birden fazla flüoresan millerini görselleştirmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, FISH post-translasyonel modifikasyonlar belirlemek için antikor boyama ile eşleştirilmiş olabilir ve / veya ilgi sinyal yolu 24 aktif olduğu.

çoğu zaman göz ardı edilmektedir protokolde iki kritik adımlar vardır. Bir morfolino oligonükleotid çözeltisi hazırlanmasıdır. 5 dk için 2 dakika süreyle 65 ° C 'de morfolino çözeltisi ısı ve enjeksiyon iğneleri yüklemeden önce en az 10 dakika boyunca tam hızda bu santrifüj önemlidir. morfolino oligonükleotitler, düşük tav çözeltiden çökelebilir için morfolino stok çözeltisi, -20 ° C'de depolanır Bu adımlar gereklidiraküler ve çözümün eğirme partiküller tarafından tıkanmış olmaktan enjeksiyon iğneleri engeller. Dikkate alınması gereken diğer kritik bir yönü embriyo iyice tespit her aşamada ve in situ hibridizasyon protokolleri, çeşitli çözümler karıştırılabilir olmasıdır. Bizim ellerde, sinyal azalır ve / veya bu basit adımı gerçekleştirilmez ise arka artar.

Belki de, burada sunulan yöntemin en önemli özelliği yeni nesil transkriptomik ve proteomik tarafından oluşturulan muhtemel sinyal iletim molekülleri geniş ürün setlerinin etkin bir şekilde işlev analizi için izin vermektedir. Onlar nasıl uyum değerlendirmek için bu ilk işlevsel analizler ilgi yoluna katılan düzenleyici faktörlerin bir grup doğruladıktan sonra, bir sonraki zorluk kurulan tahlilleri (biyokimyasal etkileşimler; in situ detaylı, çok renkli bütün montaj gibi fonksiyonel knockdowns) kullanmaktır ekstraselülerlar, hücre içi ve belirli bir gelişim sürecinde yer alan sinyal transdüksiyon yollarının transkripsiyonel seviyeleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 120 deniz kestanesi nöroektoderm desenleme Wnt sinyal iletimi ön-arka ikincil ağızlılar evrim gen düzenleyici ağları yüksek verimlilik,
Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Range, R. C.,… More

Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter