Summary
Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.
Abstract
Tumor en tumor vaartuig ontwikkeling, evenals de tumor reactie op therapeutiek, zijn hoogdynamische biologische processen. Histologie statische informatie en is vaak niet voldoende voor een correcte interpretatie. Intravital evaluatie, waarin een proces wordt gevolgd in de tijd, worden extra en vaak onverwachte informatie. Met de oprichting van transgene dieren uiting van cel-specifieke markers en levende cel verklikstoffen, verbeteringen aan beeldvormende apparatuur en de ontwikkeling van verschillende beeldvormende kamers, intravital microscopie is uitgegroeid tot een belangrijk instrument om beter te begrijpen biologische processen. Dit witboek beschrijft een proefopzet voor het onderzoek van tumor vaartuig ontwikkeling en therapeutische effecten in een ruimtelijke en temporele wijze. Met behulp van dit setup, worden de fase van het vaartuig ontwikkeling, vorming van tip-cel en lumen, doorbloeding, extravasation, een gevestigde vasculaire bed en vasculaire vernietiging gevisualiseerd en gevolgd. Therapeutische effecten, intratumoral het gedrag en de lokalisatie van chemotherapeutische stoffen kunnen bovendien ook worden gevolgd.
Introduction
In vitro studies kunnen weliswaar high-resolution kinetische beeldvorming van processen, in vitro experimenten evaluatie in de juiste context niet ingeschakeld. Bijvoorbeeld, kan niet de interactie van tumorcellen met stromale compartimenten of drug delivery en distributie binnen een tumor bestudeerd worden in een plaat van de cultuur. Dierlijke modellen worden daarom gebruikt om na te bootsen de menselijke fysiologie en pathologie. Echter is de longitudinale beeldvorming van processen, met name bij een subcellular resolutie uitdagend. Moleculaire beeldvorming methoden, zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI), single-photon emission berekend tomografie (SPECT) en positron emissie tomografie (PET), hebben goede doordringing diepten maar onvoldoende resolutie of falen om te illustreren van anatomische structuren. Optische beeldvorming biedt hoge resolutie en maakt de beeldvorming van structuren, maar het vergezeld gaat van armen minimale penetratie1. De toepassing van intravital microscopie in combinatie met venster kamer technologieën, zoals een dorsale huidplooien of abdominale venster, zorgt voor hoge resolutie beeldvormende in vivo2,3,4. Deze technologie heeft duidelijke voordelen, omdat het zorgt voor longitudinale beeldvorming over uren en zelfs dagen, voor beeldvorming van processen in de juiste context (bijvoorbeeld cel-cel-interacties in de verbeelde weefsel), en resoluties op de optische grenzen van geavanceerde confocale en multiphoton microscopen.
De invoering van transgene dieren met cel - of eiwit-specifieke fluorescerende labels opent een overvloed aan mogelijkheden voor in vivo en ex vivo experimenten. Voor aanleg, cel-cel interacties, de productie van eiwitten en het antwoord op manipulatie of therapie kunnen bestudeerd worden modellen in vivo met behulp van deze5,6,7,8. Nog belangrijker is, plaatst u plaats en tijd kunnen worden bepaald met de juiste beeldvormende apparatuur en methodologie. Hier, de intravital microscopie van dieren uiting van een endothelial marker in combinatie met injecteerbare agenten in een tumor geïmplanteerd in een gemodificeerde dorsale huidplooien venster kamer wordt gepresenteerd.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met Nederlands recht, en protocollen werden goedgekeurd door de Commissie van dier experimenten van het Erasmus MC, Rotterdam, Nederland.
1. de ontvangende muis
- Wanneer de transgene muizen zijn geboren, de dieren voor de juiste genotype met behulp van standaardprocedures9scherm.
Opmerking: In dit manuscript, gegevens verkregen uit een eNOStag-GFP lijn9 intern ontwikkeld en een gekochte ROSA-mTmG (stock 007676)10 lijn worden gepresenteerd. - Muizen die 12 weken of ouder zijn en die zijn boven 20 g te gebruiken.
2. donor muis
Opmerking: Een fragment van de tumor voor inplanting in de dorsale venster wordt verkregen uit een niet-transgene donordier. Afhankelijk van het type van de tumor, worden normaal (met syngeneic tumoren) of immunodeficiëntie (xenografts) muizen gebruikt.
- De tumorcellen in een medium met de juiste supplementen in cultuur kolven op 37 ° C en 5% CO2groeien.
- Verwijder het medium van de cel kolven, spoel één keer met 1 x PBS en loskoppelen van de cellen met behulp van 0,25% trypsine.
- Inactivering van de trypsine door toevoeging van cel kweekmedium. Verzamelen van de cellen, spin down bij 1.200 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 5 mL PBS.
- Verdun 20 µL van de celsuspensie met 20 µL van trypan blauw, die vlekken dode cellen. Het aantal levende en dode cellen met behulp van een hemocytometer; het aantal dode cellen mag niet meer dan 10%.
- Draaien de cellen opnieuw bij 1.200 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet cel in ijskoude PBS, opbrengst 1 miljoen cellen per 100 µL. vervoer de cellen op het ijs naar de operatiekamer.
- Anesthetize het dier Isofluraan/O2gebruikt. Zet de zuurstof en aanpassen van de stroom aan 0,5 mL/min. aanpassen de Isofluraan vaporizer tot 3%. Na een paar minuten, plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van de verdoving.
Opmerking: Prefill de kamer om ervoor te zorgen dat het klaar is voor gebruik tot een minimum beperken van stress. -
Wanneer de muis is verdoofd, brengen het dier naar de operatietafel van Verwarming, bewaard bij 37 ° C, en plaats van de snuit in de neus van de verdoving.
- Opmerking: Het dier is goed verdoofd bij geen reactie op een snuifje struikrover wordt opgemerkt.
- Scheren van de muis om de injectieplaats beter te visualiseren. Enten met behulp van een 0,5 mL insuline spuit; injecteren van 100 µL van cellen in de flank van de muis en toestaan dat een tumor te ontwikkelen.
- Het dier door cervicale dislocatie onder verdoving door uw institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurde euthanaseren. Met behulp van micro schaar en pincet, opengesneden de huid op de plaats van de tumor en het ontleden van de tumor. Zet de tumor in een petrischaal met PBS. Met behulp van micro schaar en pincet, snijd de tumor in fragmenten van ongeveer 1 mm3 (figuur 1A-a).
Opmerking: De tumor van de muis van de donor moet groot genoeg zijn om voldoende materiaal, maar grote, necrotisch tumoren moeten worden vermeden. Voor de meeste tumoren volstaat een gemiddelde diameter van 10 mm.
3. de inplanting van de kamer van de venster
- Voer alle procedures onder aseptische condities. Autoclaaf de chirurgische instrumenten (figuur 1A) en de kamer materialen (figuur 1B).
Opmerking: De zaal van de venster gebruikt hier, met een totaal gewicht van 1,1 g, bestaat uit polyether ether keton (PEEK), een lichte, synthetische materialen die MRI is compatibel. PEEK is 3.4-fold lichter dan titanium, die meestal in de literatuur voor deze windows gebruikt wordt. Het is bestand tegen de meeste chemicaliën, inert, doet niet immuun reacties uitlokken en stevig. Dit venster is ook kleiner in ontwerp in vergelijking met eerder gepubliceerde windows. Muizen uitgerust met dit venster Toon volledige capaciteit van beweging kunnen klimmen en gewichtstoename vergelijkbaar met muizen zonder een venster kamer. Omdat het dier in het venster bijten kan, synthetische windows kunnen duren een beetje korter in vergelijking met titanium windows; echter, zij zijn eenvoudig te maken en zijn goedkoop. Deze bijzondere windows zijn gemaakt in-house en op verzoek kunnen worden verworven. - Verdoven de ontvangende muis met behulp van inhalatie anesthetica (dat wil zeggen, Isofluraan/O2) in een zaal van de verdoving. Breng de muis aan de verwarmde operatietafel bewaard bij 37 ° C en plaats van de snuit in de neus van de anesthesie (zie stap 2.6). Toepassing oog zalf Voorkom droogheid.
- Het haar uit de gehele terug door het scheren en het toepassen van haargel verwijdering verwijderen. Zorg dat alle gel wordt verwijderd door spoelen het dier zorgvuldig met hand-warm leidingwater. Droog het dier en reinigen van de huid met 70% ethanol.
Opmerking: De procedure scheren kan ook eergisteren venster implantatie. De crème moet grondig worden verwijderd met hand-warm water omdat dit kan leiden tot irritatie van de huid. - Mark de middenlijn op de rug van de muis met een marker om ervoor te zorgen de symmetrische plaatsing van de kamer. Verplaatsen van de muis, trek de huid in een klep met behulp van de middenlijn een opvouwbare positie en begrijpen van het midden van de klep. Positie van het venster zodanig dat de bovenkant van het frame ten minste 2 mm onder de middenlijn en de cirkel het weergavegebied van het venster op de huid met een marker is.
- Met behulp van een scalpel houder/lemmet grootte van 15 en micro schaar, verwijder de huid langs de getekende cirkelvormige lijn. Wees voorzichtig niet te beschadigen van onderliggende fascia.
Opmerking: Dit maakt het weergavegebied van het venster van de kamer waarin de tumor is getransplanteerd. - Trek de huidplooien en gebruik een oor-perforatie om punch gaten 1 mm in diameter via de huid, een aan beide zijden van het weergavegebied (figuur 1A-b).
Opmerking: Dit zijn de gaten voor twee bouten vast de kozijnen samen te stellen. - Plaats het frame van de op maat gemaakte voorste kamer met behulp van bouten (cijfers 1B-een 1B-c) en plaats het terug frame (figuur 1B-b) op de bouten. Plaats de noten (figuur 1B-d) op het frame met de bouten op de achterste.
Opmerking: Deze bouten worden gebruikt om te herstellen van de kamers samen tegen de huidplooien en worden later gebruikt om te immobiliseren van de zaal tijdens de beoordeling onder de Microscoop. - Trek de huid 2-3 mm boven de bovenkant van de frames en ervoor te zorgen dat het weergavegebied transplanteerbaar venster komt overeen met de kamer gebied. Plaats 23 G naalden door de twee gaatjes van de kleine hechtdraad (figuur 1B, zwarte pijl) aan de bovenkant van het frame. Draai de moeren op de bouten met een micro schroevendraaier (figuur 1A-c) en een klemmen naald houder te immobiliseren van de noten.
Opmerking: Neem voorzorgsmaatregelen om ervoor te zorgen dat de huid niet rond de bouten draait, en niet teveel doen draai. - Vervang de naalden met hechtingen, vanaf de bovenkant, de frames tegen de huid vast te stellen. Doe dit voor de 5 paren van hechtdraad gaten (figuur 1B, witte pijl) in het frame.
- Draai de muis om de achterkant van de zaal van het venster weer te geven. Plaats een dik stuk vuller glas met een diameter van 10 mm en een dikte van 0.55 mm (figuur 1B-e) en dan een standaard dekking glas van 12 mm (figuur 1B-f). Beveilig deze met een borgring (figuur 1B-g) op het gebied van de rug-kamer.
Noot: De vuller glas voorkomt dat ruimte te openen tussen de fascia en het venster aan de voorzijde, die wordt gebruikt voor imaging. - Hydrateren het weergavegebied van de venster waarin de tumor wordt ingevoegd door het invullen van een spuit van 1 mL met steriele 0.9% NaCl. Laat een paar druppels te vallen op dit gebied. Verwijder overtollige zoutoplossing met een steriele katoen-tip.
- In de fascia, maken een zak groot genoeg is om te houden de 1 mm3 tumor fragment (figuur 1A-a) met behulp van een 25 G naald met haar tip is gebogen onder een hoek van 90 ° (figuur 1A-d). Voeg het fragment van de tumor in het midden van het weergavegebied transplanteerbaar venster met behulp van een naald houder of Kelly pincet in deze zak.
- Sluit het venster weergavegebied met een standaard dekking glas 12 mm en een borgring.
Opmerking: Een luchtbel kan vormen, maar het zal verdwijnen binnen uur.
4. voorbereiding en nazorg van het dier
- Geneesmiddelen voor de verlichting van de pijn (dat wil zeggen, 0,05 mg/kg buprenorfine) subcutaan door uw institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurde beheren. Laat de muis om te herstellen van anesthesie onder een lamp van verwarming.
- Plaats venster dragende muizen individueel in een kooi of in een klimaat-gecontroleerde kamer tot 32 ° C en boven 50% vochtigheid. Zorg ervoor dat de flessen water op omgevingstemperatuur zijn alvorens hen te plaatsen op de kooi ter voorkoming van lekkage. Kooien en verrijking, die het mogelijk maken van vrij verkeer en toegang tot voedsel en water gebruiken.
Opmerking: Als dit Parlement venster zeer goed verdragen wordt, muizen Toon normaal gedrag. Individuele huisvesting voorkomt schade aan de kamer van de venster veroorzaakt door andere muizen, en de hoge temperatuur/luchtvochtigheid voorkomt dat de cooling down en uitdroging van de huidplooien. - Controleren de muis regelmatig voor gekauwd-off hechtingen, losse bouten/moeren of gebroken cover glas. Onmiddellijk herstellen en vervangen wanneer dit gebeurt. Een cover gemaakt van licht materiaal kan worden gebruikt ter bescherming van het venster.
5. intravital Imaging
Opmerking: In deze procedure een multiphoton Microscoop en de passende controle-software worden gebruikt. Hier, worden softwarepakketten die van de microscopen voorzien waren gebruikt. In principe, elke software-pakket dat wordt geleverd met een microscoop en is bedoeld voor Microscoop controle en het vastleggen van de beelden zal suite dit doel.
- Zet het systeem: PC/Microscoop, macht aan confocal regeleenheid, laser van macht, en laser emissie. Bijvoorbeeld met deze software, start de software en het initialiseren van de Microscoop tabel (figuur 1E-a en 1E-c) door te klikken op "initialiseren tabel." Zet het systeem en stel deze in op de modus inschakelen van de PC om te controleren de Microscoop, xy-tabel, z-positionering en Fotolader.
- De tl-licht (figuur 1E-b) worden ingeschakeld.
Opmerking: Dit wordt gebruikt ter beoordeling van de fluorescentie beelden door het oculair samen met heldere veld. - Zet het op maat gemaakte, temperatuurgevoelig platform (Figuur 1 C-c; in de discussie meer in detail beschreven) ingesteld bij 37 ° C.
- Schakel het apparaat van de verdoving Isofluraan/O2 (figuur 1E-d) gebruikt. Monteer de verdoving buis in het werkgebied van de Microscoop (Figuur 1 C-e). Installeer een klem op het xy-podium de verdoving snuit stuk vast te stellen.
- Vooraf beoordelen het dier vast te stellen van de fase van de ontwikkeling van de vaartuigen van de tumor; Dit hangt af van de snelheid van de tumorgroei, maar dit kan variëren tussen individuele muizen.
- Verdoven de muis met behulp van inhalatie anesthetica (Isofluraan/O2) in een zaal van de anesthesie (zie stap 2.6).
- Plaats het dier op het platform temperatuurgevoelig gemonteerd op de Microscoop fase; Dit voorkomt de afkoeling van het dier wanneer het is verdoofd. Controleer of dat de snuit van de muis zich bevindt in de anesthesie-kegel en oog zalf van toepassing indien de evaluatie langer dan 5 min duurt.
Opmerking: Voor een evaluatie die langer dan 1 uur, verklein de Isofluraan stroom naar 2%. - Gebruik de bouten van de kamer om te repareren (Figuur 1 C-b, volledige pijl) de kamer op een op maat gemaakte kamer houder (Figuur 1 C-a). Schroef deze houder (Figuur 1 C-d, onderbroken pijl) naar het verwarmde platform (Figuur 1 C-c).
Opmerking: Deze combinatie voorkomt bewegingsartefacten in het weergavegebied van het venster terwijl u het dier om vrij te ademen. - Zorg ervoor dat het glas van het weergavegebied van het venster schoon met een katoenen tip ondergedompeld in water om een onscherp beeld en interferentie uit puin op de buitenkant van het glas te voorkomen. Plaats het platform en de muis in het werkgebied van de Microscoop (Figuur 1 d).
Opmerking: Zorg dat de staart niet vast komen te tussen het platform en het stadium van de Microscoop zitten doet. - Controleer visueel het ontwikkelingsstadium tumor vaartuig met behulp van een 10 X objectief helder-veld en TL-licht.
Opmerking: TL schepen moeten worden in focus en de bloedstroom moet zichtbaar met heldere veld. Wanneer de therapieën duidelijk gezien wordt, evalueren de ontwikkelingsfase tumor vaartuig. Bijvoorbeeld, bepalen of er early-onset angiogenese met de groei van tip cellen of een reeds gevestigde therapieën voor drug delivery. Hetzelfde dier kan opnieuw worden geëvalueerd, en als de tumor ontwikkeling is een continu proces. Verschillende fasen kunnen worden waargenomen in een enkelvoudige tumor op hetzelfde moment.- Wanneer het niet mogelijk te concentreren op de therapieën, het dier uit het werkgebied verwijderen, laat u de muis herstellen, en plaats het dier terug in een klimaat-gecontroleerde ruimte. Controleer het later opnieuw. Wanneer de muis klaar voor evaluatie is, doorgaan met de hieronder beschreven.
- Inschakelen van de confocal lasers en het Configuratiescherm door te klikken op "Laser" en "Ctrl panel" in het tabblad Configuratie
Opmerking: Het is aanbevolen om de kracht van de laser laag, met name voor de Argon laser, om te voorkomen dat bleken, de verwarming van het weefsel en photodamage ingesteld. Het bedieningspaneel kan worden ingesteld op persoonlijke voorkeuren. Voor intravital geschikt zijn met behulp van meerdere fluorophores is het aanbevolen om de volgende instellingen toe te passen: "offset, 10% per beurt"smart winst, 100 V per beurt"smart" "zoom, middellange," "X positie, middellange," "Y-positie, medium," en "Z-positie, 100 µm per beurt." Pas de verschuiving om te minimaliseren van het lawaai en het optimaliseren van de signal-to-noise verhouding vóór imaging. De confocal zoom-functie zorgt voor een hogere vergroting zonder de objectieven. X-, Y- en Z-besturingselement is noodzakelijk om te zoeken op het gebied van belang. Voor intravital microscopie moet Z-positionering ongeveer 100 µm per beurt als teek weefsel wordt geëvalueerd. - Klik op "Overname" in het tabblad ophaal en de instelling te wijzigen: "Overname modus XYZ of XYZT," "Format (512 x 512 of 1024 x 1024)", en "Snelheid (400 Hz of 200 Hz)." Klik op "Gaatje" en stel deze in op 1 luchtige eenheid. Klik op "Bidirectionele X".
Opmerking: Voor het optimaliseren van de beelden, een evenwicht tussen de macht van de laser, winst en pinhole moet worden gevonden, die wordt genoemd in de discussie. - Bij de beoordeling van meerdere fluorophores, selecteer "sequentiële scan" en "tussen frames" te voorkomen bloeden-through, die wordt genoemd in de discussie. Kies "Line Average 4" te verkrijgen van een goede vermindering van het lawaai.
Opmerking: Afhankelijk van de intrinsieke fluorescentie aanwezig in de transgene dieren, andere fluorescente markeringen, zoals dextrans, Hoechst, FITC-BSA, fluorescerende chemotherapeutica en/of nanodeeltjes verdund tot de gewenste concentratie in 0.9% NaCl kan worden beheerd en beoordeeld in de tumor. Deze worden via de staart of penile ader ingespoten. - Klik op "Experiment" in het tabblad ophaal en kies "New" om een nieuwe data base.
- Evalueren van het gebruik van dierlijke, afhankelijk van de onderzoeksvraag, 10 X en 20 X 40 X doelstelling lenzen. Door het oculair, vinden een positie om te evalueren.
Opmerking: Het is het beste te gebruiken droge lenzen met een zo hoog als mogelijk, zo droog lenzen hebben een relatief lange werkende afstand en doen niet noodzaak immersie vloeistof NA. In de discussie, wordt het gebruik van water-onderdompeling objectieven genoemd. - Gebruik een snel live scan om te vinden van de juiste winst en offset ter voorkoming van overmatige blootstelling en voor het optimaliseren van de signal-to-noise verhouding. Ook, zelfde imaging instellingen behouden tijdens en tussen de experimenten als kwantitatieve vergelijking nodig is.
Opmerking: Verdere overwegingen voor optimale imaging worden genoemd in de discussie. De XYZ-positie en zoom kunnen worden afgerond tijdens het live scannen via het bedieningspaneel. - Om een Z-stapel, selecteert u "Z-stack" in de ophaal-tab. zorg een snelle Z-scan met behulp van de Z-positie in het deelvenster Beheer en het begin en einde van de scan instellen door te klikken op "Begin µm" en "Einde µm." Stel de grootte van de Z-stap gerelateerde aan de grootte van het gaatje.
- Vastleggen van de beelden door te klikken op "start".
Opmerking: Zoals intravital microscopie is alles over kinetiek en daarom dynamische processen worden waargenomen, een compromis tussen de tijd die nodig is voor het verwerven van een afbeelding en de snelheid van de biologische processen moet worden gemaakt. In het algemeen, hoe hoger de resolutie, de meer fluorescerende kanalen zijn gescand en hoe groter het scannen field, hoe meer pixels per afbeelding. Dikkere Z-stacks vertalen naar een meer imaging tijd. Een langer imaging tijd verhoogt de kans op bewegingsartefacten en kan leiden tot schade aan het weefsel beeld. Ook worden zich ervan bewust dat bepaalde fluorescerende etiketten scannen veroorzaakt bleken en toxiciteit, die wordt beïnvloed door de macht van de laser en de concentratie van de geaccumuleerde kleurstof. - Na het scannen van de Z-stack kan snel worden geëvalueerd door te klikken op "maximale projectie". De Z-stack wordt automatisch opgeslagen in de database en kan worden hernoemd.
6. de gegevensanalyse
- Afhankelijk van de oorspronkelijke onderzoeksvraag, een van verschillende software-programma's, zoals ImageJ5, Matlab11of Amira, te gebruiken voor data-analyse. Correcte analyse is van cruciaal belang.
Representative Results
Het belangrijkste kenmerk van intravital imaging is de longitudinale visualisatie van cellulaire processen zonder tussenkomst van de invasieve. Voor dit, worden transgene dieren uiting van een constitutief of afleidbare fluorescerende marker in cellen van belang gebruikt. Figuur 2 illustreert de uitdrukking van fluorescerende etiketten in eNOStag-groen fluorescente proteïne (GFP)9 en Rosa-mTmG muis lijnen10. De eNOStag-GFP is een muis-lijn die werd geproduceerd in eigen huis met behulp van een afgeknotte eNOS gen als een tag voor GFP. Bovenal eNOS is sterk uitgedrukt in de endotheliale cellen, en het GFP-signaal is duidelijk te zien in th eGolgi en cellulaire membraan (figuur 2A). Rosa-mTmG muizen hebben een membraan-gerichte twee kleuren fluorescentie Cre verslaggever allel. Deze regel spreekt mTomato fluorescentie in wijdverbreide cellen en mGFP in cellen van Cre recombinase-uiten en enorm voor lineage tracering wordt gebruikt. Als een stuk van de tumor is getransplanteerd van een niet-transgene donor, rode fluorescentie overwegend door stromale delen in de tumor wordt uitgedrukt (bijvoorbeeld in het membraan van vasculaire cellen, cellen, circulerende geïnfiltreerd bloedcellen en tumor-geassocieerde fibroblasten (figuur 2B)).
Vaartuig vorming is strak gereguleerd, en een uitstekend model om te studeren, dit is de ontwikkeling van de retina12,13. Vaartuig tumorgroei is ook een kinetische proces dat is in principe vergelijkbaar met retinal vaartuig ontwikkeling. Echter, tumor vaartuigen gebrek aan organisatie en, zoals een tumor is voortdurend remodeling, zo is de tumor-geassocieerde therapieën. Dit kan zijn voordelen hebben bij het gebruik van de tumor als een angiogenic model, zoals alle stadia van ontwikkeling van het schip kunnen vaak worden gevonden in de dezelfde tumor op hetzelfde moment. Deze omvatten een endothelial gekiemde front groeien tot een un-gevacuoliseerd deel van de tumor (figuur 2C); beschadigde schepen (figuur 2D); en een gevestigde vasculaire bed (figuur 2E-ik) met volwassen, vertakt vaartuigen (Figuur 2E-II). Endotheliale cellen van de angiogenic kunnen echter ook worden gevonden in deze gebieden. Wanneer gestimuleerd door prikkels van de angiogenic, een endothelial cel steekt filopodia (Figuur 2E-III) en kan vooraf in een tip-cel, met behulp van deze filopodia voor scannen en directionele migratie (Figuur 2E-IV). Deze tip-cel worden naar de tumor interstitium gemigreerd en wordt gevolgd door het verdelen van de stengel cellen. Een enkele endothelial tip-cel heeft verschillende filopodia uit te breiden, intrekken en op elk gewenst moment vernieuwen, en kan worden bijgehouden met behulp van intravital microscopie (figuur 2F).
Ten tweede, intravital microscopie kan worden gebruikt om te bepalen van lumen vorming aan de voorzijde van een angiogenic, bloed stroom in de tumor en extravasation. Afhankelijk van de al-heden intrinsieke fluorescerende signalen in het dier, kunnen verschillende fluorescerende stoffen worden toegediend. Doorbloeding en extravasation kunnen worden gevisualiseerd met behulp van Hoechst, fluorescerende dextrans of FITC-BSA. Voor de uitgebreide studies over bloed stroom en deeltjes extravasation, lange omloop fluorescently aangeduid met gepegyleerde nanodeeltjes van 100 nm kan worden gebruikt. Zie voor meer informatie over de voorbereiding van deze nanodeeltjes, een eerdere publicatie5. De werkgelegenheid van deze verbindingen wordt geïllustreerd in Figuur 3. De cellen endothelial tip in een muis Rosa-mTmG kunnen men duidelijk zien invasie van de tumor weefsel. Functionele bloedstroom wordt aangetoond door de paarse fluorescentie van systeemkritisch ingespoten nanodeeltjes in het lumen van vasculaire buizen (figuur 3A-ik). Nanodeeltjes bereiken nauw endothelial tip cellen ter illustratie van de vorming van een lumen in de stengel cel gebied (Figuur 3A-II). De levering van systemisch toegediende chemotherapeutica hangt af van een functionele therapieën om te komen tot het interstitium van de tumor, en zoals blijkt uit figuur 3B, injecteerbare agenten, onafhankelijk van hun grootte, niet gebieden met verwoeste schepen, doen doordringen gecomprimeerde schepen of vaartuigen met bloed stase.
In de meeste organen, het endotheel slijmvlies vormt een functionele barrière tussen het bloed en het onderliggende weefsel, en de passage van de moleculen is strak geregeld. Tumor-geassocieerde therapieën, echter, is bekend om zijn lekkende en poriegrootte licht-donkerscheiding is sterk afhankelijk van de tumor type14. TL-geconjugeerde dextrans met verschillende formaten kunnen worden geïnjecteerd om te beoordelen van de bloedstroom, permeabiliteit en extravasation. Hoechst (615 Da) diffundeert snel in tumor weefsel en is overgenomen door de omringende cellen (Figuur 3 c-ik). Kort na de injectie, dextran van 10 KDa (figuur 3CII) en 2 MDa (Figuur 3 C-III) worden aangetroffen in het bloed. Echter, dextran die 10 KDa ook in het interstitium van de tumor gezien is, met vermelding van de permeabiliteit van het endotheel voering voor kleinere moleculen, die een functie is toegeschreven aan vaartuigen van de tumor. 40 minuten na injectie (Figuur 3 C-IV), dextran 10 KDa wordt gewist uit de bloedstroom (Figuur 3 C-V) en de fluorescerende intensiteit van dextran 2MDa daalden eveneens (Figuur 3 C-VI). Grote dextrans zijn echter niet gevonden in de tumor interstitium, aan te tonen een gebrek aan doorlatend zijn voor grote moleculen binnen dit tijdsbestek.
Pathofysiologie van de tumor, met de zeer delende necrotische en un-gevacuoliseerd gebieden, kunnen heel informatief zijn bij gebruik van de tumor als een angiogenic model. Dit leidt echter een probleem voor effectieve therapie en onderzoek. De heterogeniteit van tumor-geassocieerde therapieën zorgt ervoor dat een heterogene distributie van door de overheid gereguleerde drugs, waardoor hele gebieden drugsvrije15. Ter verbetering van drug delivery, kunnen verschillende strategieën toegepaste15,16,17, en therapeutische progressie kan worden onderzocht met behulp van dit intravital ontwerp. De tumor-geassocieerde therapieën kan worden gemanipuleerd met behulp van vasoactieve agenten om drug delivery17. De resultaten van de tumor vaartuig manipulatie met behulp van tumor necrose alpha (TNF) als een vasoactieve agent in combinatie met Doxil, de ingekapselde Liposomale formulering van Doxorubicine, als een chemotherapeutische agent worden gepresenteerd in dit manuscript5, 18 , 19. in tegenstelling tot dextrans, gepegyleerde nanodeeltjes worden gemaakt voor enkele uren, zoniet dagen, in de bloed omloop20circuleren.
Zoals eerder vermeld kunnen de tumor gebied vooraf gescande te identificeren van de juiste tumor gebieden afhankelijk van de onderzoeksvraag. Lot van de drug kan worden geëvalueerd in gebieden met een functionele therapieën ten opzichte van gebieden met een reeds beschadigde vasculaire bed (gegevens niet worden weergegeven). Om te onderzoeken het lot van chemotherapeutische agenten zonder inmenging van de cytotoxische, nanodeeltjes met dezelfde samenstelling als de therapeutische agent kan worden gebruikt als een drug model. Een eNOStag-GFP dier was behandelde i.v. met deze nanopartikels en beeld 24 h later. Nanodeeltjes waren nog steeds aanwezig in de therapieën, met minimale extravasation in het interstitium van de tumor (figuur 4A-ik). Echter wanneer nanodeeltjes werden toegediend in combinatie met TNF, werd extravasation waargenomen van de bloedstroom in de tumor interstitium (Figuur 4A-II), toenemende intratumoral drug delivery. Met behulp van hoge-resolutie objectieven, kan de intracellulaire lokalisatie van een stof worden herkend, zoals hier wordt weergegeven door de nucleaire locatie van Hoechst in groene endotheliale cellen en cellen van de tumor interstitium (figuur 4B). Bovendien, zoals veel chemotherapeutische agenten, zoals Doxorubicine, afwisseling met DNA, de lokalisatie van deze verbindingen kan worden geëvalueerd. Doxorubicine heeft rode fluorescerende eigenschappen, en de nanocarrier kan worden aangeduid met, bijvoorbeeld, tetramethylindotricarbocyanine perchloraat (deed). Een eNOStag-GFP dier i.v. werd geïnjecteerd met Doxil-deed in combinatie met TNF, en beelden werden genomen 24u na de behandeling. Doxil-extravasated uit de bloedvaten en werd genomen door het omgevende weefsel van de tumor (figuur 4C-ik). Een meer gedetailleerde evaluatie van afzonderlijke cellen (Figuur 4 C-II) is gebleken dat de vervoerder kan worden gevonden in het cytoplasma terwijl vrijgegeven Doxorubicine werd waargenomen in de cellulaire kern.
Figuur 1: instrumenten, dorsal huidplooien kamer, en opstelling van de apparatuur die nodig is voor de procedure. (A) Tumor fragmenten, (a) en chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de innesteling. Atypische instrumenten zijn een oor perforatie (b), een micro schroevendraaier (c), en een gebogen naald (d). (B) Dorsal huidplooien venster kamer. Voorzijde (a) en (b) venster achterzijde (pijl: gaten voor hechtingen; pijlpunt: gaten voor bouten), 2 bouten (c), 2 noten (d), 1 vuller glas (e), 2 glazen cover (f) en 2 behoud van ringen (g). Ook, behoud van de ringen zonder haken (witte pijlpunt) kan worden gebruikt wanneer dit nodig is. (C) op maat gemaakte kamer houder (A), bouten voor de houder van de kamer-te-kamer (b), temperatuurgevoelig platform (c), bouten om de houder van de kamer aan het platform (d), en de houder met de narcose tube (e). (D) dier gemonteerd in de houder van de kamer op het platform. Een B16BL6 tumor (pijl) is zichtbaar in het weergavegebied van het venster. (E) apparatuur die nodig is voor de evaluatie van de intravital. Computer met imaging en Microscoop control software (a), standaard TL licht (b) en de Microscoop. Een multiphoton confocal werd gebruikt (c) met een verdoving eenheid (d). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: intrinsieke fluorescentie van transgene dieren. Alle afbeeldingen die hier worden weergegeven zijn Z-stack projecties tussen 50 en 70 µm dik. (A) de eNOSGFP-tag line, GFP wordt uitgedrukt in het Golgi (sterretje) en de celmembraan (pijl) van endotheliale cellen. Schaal bar = 100 µm. (B) Intratumoral weergave van mTomato in de lijn van de Rosa-mTmG komt overwegend voor in de celmembraan van vasculaire cellen (pijl) en bloedcellen (sterretje). Schaal bar = 100 µm. (C) A projectie van een groeiende angiogenic front in un-gevacuoliseerd tumor. Schaal bar = 100 µm. (D) A projectie van een deel van de tumor met gevestigde en beschadigde schepen (sterretje). (E) een projectie van gevestigde tumor therapieën (EI) tonen volwassen teek vaartuigen (EII); angiogenic tip endotheliale cellen met filopodia (EIII, pijlpunt); en een volwassen vaartuig, waaruit één endothelial cel strekt zich uit een filopodium (EIV, pijlpunt) in het interstitium. Schaal bar = 100 µm. (F) beweging van de filopodia, gevolgd gedurende 1 uur. Elke 15 min, is een Z-stack genomen; een maximale projectie wordt hier gepresenteerd. De filopodia zijn uit te breiden (witte pijl), stagnerende (=), oprollen benodigde (rode pijl), of zelfs volledig verdwijnen (-). Schaal bar = 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: beheer van injecteerbare etiketten om te illustreren extravasation en doorbloeding. (A) A Rosa mTmG muis werd geïnjecteerd met paarse fluorescerende nanodeeltjes, en een Z-stapel een binnenvallende tip cel front werd genomen 10 min later (AI). Een projectie waaruit blijkt dat meest endothelial hebben spruiten een functionele lumen (AII, pijl). Slechts zelden kunnen endothelial spruiten gezien worden zonder stroom (AII, pijlpunt). Schaal bar = 250 µm. (B) deze Z-stack projectie toont een vernietigde tumor vaartuig gebied in een eNOStag-GFP dier voorafgaand aan de behandeling (BI). Het dier werd geïnjecteerd met nanodeeltjes (paars, BII) en Hoechst (blauw, BIII). Nanodeeltjes en Hoechst bereiken geen verwoeste gebieden, aangegeven door gekorrelde cel puin nog GFP uitdrukken. Schaal bar = 250 µm. (C) een eNOStag-GFP-muis werd geïnjecteerd met twee dextrans van verschillende grootte (rood = Dextran 2 MDa; paarse = dextran 10 KDa) en Hoechst (blauw = 615 Da), en één-vliegtuig beelden worden hier gepresenteerd. 10 minuten na de injectie, aanwezigheid in het bloed en de extravasation worden gezien in hetzelfde beeld. Hoechst extravasates bijna onmiddellijk uit de bloedvaten en is overgenomen door de omringende cellen (CI). Dextran 10 KDa (CII) kan worden gezien in schepen en in het interstitium van de tumor. Dextran 2 MDa (CIII) kan worden gevonden in de bakken. 40 minuten na injectie (CIV), Dextran 10 KDa verdwijnt uit het bloed (CV), en de fluorescerende intensiteit van Dextran 2 MDa was ook verminderde (CVI). Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: onderzoek naar het lot van chemotherapeutische agenten. (A) een eNOStag-GFP dier was behandelde i.v. met nanodeeltjes en beeld 24 h later. Nanodeeltjes zijn nog steeds aanwezig in schepen, met minimale extravasation in de tumor interstitium (AI). Wanneer nanodeeltjes worden gecombineerd met TNF, wordt extravasation waargenomen van de bloedstroom in de tumor interstitium (AII). Schaal bar = 250 µm. (B) gebruiken met een hoge resolutie lenzen, het endotheel cytoplasma (groen) en de kern (blauw) van een afzonderlijke cel kunnen worden herkend. Schaal bar = 50 µm. (C) een dier eNOStag-GFP werd geïnjecteerd i.v. met Doxil-deed in combinatie met TNF, en beelden werden genomen 24 h later. Hier, de extravasation van Doxil-deed uit de bloedvaten in de tumor interstitium is duidelijk (CI). Een meer gedetailleerde evaluatie van afzonderlijke cellen (CII) toont aan dat de paarse vervoerder kan worden gevonden in het cytoplasma (pijl), terwijl de vrijgegeven Doxorubicine (rood) is waargenomen in de cellulaire kern (pijlpunt). Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Als de tumor en de tumor vaartuig ontwikkeling, alsmede de therapeutische effecten van de tumor, hoogst dynamische processen zijn, is intravital evaluatie een elegante hulpmiddel te maken van een juiste beoordeling van deze processen in een tijd - en ruimtelijke-afhankelijke manier. Met de toenemende beschikbaarheid van levende cellen markeringen, de oprichting van transgene dieren en de vooruitgang van beeldvormende modaliteiten, wordt intravital imaging steeds meer en meer populair. Hoewel histologie nog steeds regelmatig gebruikt is en een veelheid van markeringen kan worden gebruikt voor het identificeren van de cellen en structuren, heeft weefsel afdelen nadelen bij het onderzoeken van dynamische processen. Weefsel dissectie is vereist, alleen statische informatie; fixatie is van invloed op de kwaliteit van het weefsel; en snijden schade cellulaire interacties. Ook bij het onderzoeken van dynamische processen, nodig weefsel dissectie op verschillende en vaak vermoedelijke, tijd-punten een grote hoeveelheid dieren. Met de beeldvorming van het intravital, kunnen de XYZ ruimtelijke dimensies en de extra dimensie van tijd worden geëvalueerd in hetzelfde dier, waardoor de juiste positionering van de verschillende spelers in ruimte en tijd. Daarom optimale tijdstippen zijn niet gemist, en het dier dat wordt gebruikt per experiment is aanzienlijk verminderd. Ten tweede, het tijd-venster met intravital evaluatie tot stand gebracht kan worden geëxtrapoleerd optimaliseren van weefsel extractie. Ten derde, de gewenste fase van de groei van het schip intravitally geïdentificeerd en gekleurd als geheel-mount weefsel.
Het intravital ontwerp vermeld in dit manuscript gebruikt een combinatie van transgene dieren uiting geven aan een fluorescerende label in de endotheliale cellen, een gewijzigde dorsale huidplooien kamer model, en een speciale multiphoton-confocal microscoop.
Endotheliale cellen doorlopen in een aantal fasen21,22 tijdens angiogenese en deze fasen kunnen vaak tegelijkertijd worden gezien in een tumor. Met behulp van de eNOSTag-GFP muis lijn, afzonderlijke endotheliale cellen kunnen worden gevolgd, en zelfs filopodia dynamics kunnen worden getraceerd. Het is daarom een goed model te bestuderen vaartuig ontwikkeling intravitally. Afhankelijk van de al-heden intrinsieke etiketten, kunnen injecteerbare fluorescerende stoffen worden gebruikt ter beoordeling van lumen vorming, doorbloeding, extravasation en bloed goedkeuring. De muis is continu beeld voor maximaal 5 h. De lange termijn evaluatie van een dier is haalbaar wanneer verschillende voorzorgsmaatregelen met betrekking tot de verdoving van het dier worden genomen, die al eerder beschreven23. Als dit onderzoek zich op kanker richt, werden tumoren weefsels of cellen geïmplanteerd. Echter, wij ook geëxperimenteerd met de middenvoetsbeenderen en embryonale longen. Echter, het groeitempo op jaarbasis van weefsel onder studie is beperken, zoals na een paar weken, de huid begint te regrow, die kan worden een probleem met traag groeiende tumoren of weefsels.
Tijdens de valideringsfase de dorsale die huidplooien venster kamer was aanzienlijk gewijzigd ten opzichte van het klassieke model4. De frames worden geconstrueerd van autoclaaf synthetisch materiaal en zijn licht en klein, met een groot venster-weergavegebied. De haak van de borgring (figuur 1Bg, witte pijlpunt) wordt alleen gebruikt voor het eenvoudig verwijderen van de ring. Vazal ringen zonder haken kunnen worden gebruikt wanneer dit met beeldvorming mengen. De huid is niet te veel, uitgerekt losraken treedt niet op in dit model, en infecties worden slechts zelden gezien. Deze wijzigingen verminderen dier ongemak en verfijnen van de dierlijke procedure aanzienlijk. Ook kunnen de metalen delen gemakkelijk worden verwijderd wanneer de tumor met behulp van MRI24imaging.
Een microscoop kan worden aangenomen op intravitally afbeelding dorsale huidplooien kamers. De belangrijkste vereiste is de beschikbare ruimte tussen het podium van de Microscoop en het objectief. Een belangrijk aspect buikvliesontsteking imaging is beweging. Om te voorkomen dat artefacten van de beweging, moet een platform dat past in de tabel van de Microscoop (na de verwijdering van alle inserts) en ondersteunt de muis worden gebruikt. Het is niet nodig te bedwingen van de muis wanneer het onder verdoving, en is het beter om de muis adem vrij laat. Echter is het venster vastgeschroefd op het platform, waardoor optimale fixatie van het gezichtsveld (dat wil zeggen, de tumor is zichtbaar door het venster kamer). Het platform wordt verwarmd met behulp van een elektronische verwarming pad, zoals gebruikt voor dierlijke Verwarming. Dit platform werd intern, en specificaties kunnen verkregen worden op aanvraag. Een hoge resolutie objectief is een noodzaak bij de beoordeling van de intracellulaire processen en maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen het cytoplasma en de kern. Het gebruik van een taps toelopende lens met een goede optische resolutie (hoge nvt) maar een relatief lange afstand (bij voorkeur 2 mm of hoger) wordt aanbevolen. De beperking in de beeldvorming is de indringingsdiepte en de fluorescerende intensiteit van de etiketten. Bovendien, photobleaching, fototoxiciteit en verzadiging moeten worden vermeden tijdens de beeldvorming.
Hier, werden een geïntegreerde confocal-multiphoton en een confocal microscoop gebruikt. De multiphoton is rechtop, terwijl de confocal een omgekeerde Microscoop is. Het voordeel van een rechtop Microscoop is het gemakkelijk gebruik van water-onderdompeling lenzen. Deze lenzen hebben een hoge nb en een lange afstand, zelfs bij een vergroting van de hoge (bijvoorbeeld 20 of 40 X). Specifiek, is het aanbevolen om het verkrijgen van een 20 X nb 1.0 water-onderdompeling lens, die wordt verkocht door diverse bedrijven. Weet dat wanneer immersie-lenzen worden gebruikt, het objectief en de immersie vloeistof moeten worden verwarmd tot 37 ° C. Voor de beste beelden, het is aanbevolen om optimale confocal instellingen gebruiken (dat wil zeggen, gaatje op 1 luchtige unit, laser macht zo laag als mogelijk, winst niet te hoog (vooral als de winst introduceert ruis), lijnsnelheid op maximum, en geen gemiddeld van scans). Overbelichting, verzadiging, en het verschil in intensiteit tussen afbeeldingen compromis kwaliteit van de gegevens. Het is raadzaam om verzadiging en overbelichting te voorkomen. Dit kan worden omzeild door de afbeeldingen op verschillende winst instellingen ophalen. Het veranderen van de winst is de gemakkelijkste manier om de helderheid van de afbeelding te wijzigen. Indien nodig, kan de kracht van de laser kan worden ingesteld. Om de beeldkwaliteit te standaardiseren, kunnen dia's met een vaste fluorescentie intensiteit worden gebruikt. Men moet houden in het achterhoofd dat zelfs wanneer de Microscoop is optimaal ingesteld, beeldkwaliteit wordt bepaald voor een groot deel door de kwaliteit van de kamer van het venster en weefsel
Wanneer u scant meerdere fluorescente markeringen gelijktijdig, moet bloeden-through, waarin een fluorophore wordt aangetroffen in het kanaal van een andere, worden vermeden. Vermijd bloeden-door met behulp van een combinatie van fluorophores met minimale overlappende spectra en sequentiële scannen tussen frames. De beelden die hier gepresenteerd werden gescand met behulp van 3 sequentiële scans (Track 1: GFP, DID of fluor647 met de 488 en 633 laser; spoor 2: rhodamine, Doxil of mTomato met de 543 laser; en 3 bijhouden: Hoechst met de 405 laser).
De mogelijkheid van de evaluatie van de verschillende stadia van tumor vaartuig ontwikkeling, tip cel dynamics lumen vorming, extravasation en vasculaire schade wordt hier weergegeven. Met behulp van de eNOStag-GFP-lijn, worden tumor gebieden met een verwoeste vasculaire bed gemakkelijk gedetecteerd door gekorrelde cellulaire restjes nog GFP uitdrukken. Geen injecteerbare agent werd ontdekt in deze gebieden, met vermelding van het gebrek aan stroom. Dit betekent dat beheerd chemotherapeutische agenten zullen deze gebieden ofwel niet bereiken. Vernietiging van het schip kunnen echter ook een therapeutische resultaat. Pre beoordeling van de tumor, om te controleren voor voorbehandeling vaartuig vernietiging, is een voorwaarde voor de nauwkeurige therapeutische evaluatie en gemakkelijk kan worden uitgevoerd met behulp van deze proefopzet.
Er is een overvloed aan mogelijkheden waarvoor intravital microscopie kan worden gebruikt, en gedetailleerde discussie valt buiten het bestek van deze publicatie. Een korte om inzicht te geven, omvatten mogelijke toepassingen studies betreffende de accumulatie van chemotherapeutica in tumor weefsel, de ontwikkeling van schepen (bijvoorbeeld het aantal vaartuigen, takken en kruispunten) en doorbloeding, cel-cel interacties, cel richt, en intracellulaire verwerking, alsmede voorbeelden hierboven en hieronder. Als de analyse is gebaseerd op fluorescentie, zich bewust zijn van intensiteit schommelingen als gevolg van de kwaliteit van het venster of weefsel. Zoals tumor weefsel relatief dik is, fluorescentie van boven of onder het vlak van weergave heeft ook een invloed op het signaal in de afbeelding. Het is best om de kwantitatieve beeldanalyse combineren met objectieve metingen. Bijvoorbeeld, indien u interesse hebt in een concentratie die drug, de tumor weefsel te verwijderen uit het venster na intravital microscopie en bepalen van de inhoud te vergelijken met de confocal beelden met HPLC met drug.
De evaluatie van de reactie van de tumor kan worden uitgevoerd als goed met behulp van dit model, maar met enkele voorzorgsmaatregelen. Men moet realiseren dat tumoren ook naar binnen, in de huid groeien. 3D-metingen kunnen worden gemaakt als de penetratie diep genoeg is ter dekking van de hele tumor. In dat geval moeten far-red kleurstoffen worden gebruikt. Het venster kamer als beschreven hier aanbiedingen met tumoren in de omgeving van een huid, en het is belangrijk erop te wijzen dat het venster een temperatuur iets lager dan de lichaamstemperatuur van de normale muis handhaaft. Daarom is het beste om te studeren van tumoren in de juiste micro milieu instelling te bevestigen intravital studies met de dorsale huidplooien venster kamer. Nog belangrijker is, de dorsale huidplooien kamer biedt inzicht in de kinetiek van processen en mechanismen, een instrumentale basis te verschaffen voor de verbetering van de therapie. Ook kan extra informatie over de ook en farmacokinetiek worden verkregen. Klassiek, zijn deze ook studies uitgevoerd door behandeling van tumor-dragende dieren en ontrafeling van tumoren/organen voor het meten van de drug opname. Met behulp van dit intravital model, kan de locatie van de intratumoral van een drug (dat wil zeggen, intravasculaire, intratumoral, intracellulaire of nucleaire) worden verstrekt2625,5,. Niet alleen is de locatie van de drug geopenbaard, maar ook de tijd venster-van-kansen voor de meest optimale opname.
Met behulp van de proefopzet in dit artikel beschreven, kan een groot aantal parameters worden geëvalueerd in een temporele en ruimtelijke omgeving. In het bijzonder hier laten we zien dat intravital microscopie biedt belangrijke inzichten in de dynamiek van tumor vaartuig ontwikkeling en therapeutische respons.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedank Rien van Haperen en Rini de Crom voor hun ontwikkeling en de donatie van de eNOSTag-GFP-lijn, Joost A.P. Rens voor zijn technische hulp bij het dierlijke werk, en de dieren hun begeleiders voor hun hulp. De microscopie installaties maken deel uit van het Erasmus optische Imaging Center, en wij willen de medewerkers van de OIC voor hun dienst bedanken. Deze studie werd ondersteund door DDHK 2000-2224 subsidie van de Nederlandse Cancer Society "Vereniging Trustfonds" Erasmus Universiteit Rotterdam en de "Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek", en wij danken de leden van de commissies voor hun gulle donatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
| PBS | |||
| Window frames | Costum made | ||
| Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
| Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
| Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
| Eye ointment | |||
| Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
| Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
| insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
| Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
| Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
| Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
| Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
| Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
| 0.9% NaCl | |||
| Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
| Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
| Window holder | Costum made | ||
| tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
| Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
| Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
| LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
| LAS AF Software | Leica |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), pdb prot5452 (2010).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Seynhaeve, A. L., et al. Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response. Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).
- Schiffelers, R. M., et al. Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature. J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).
- Straetemans, T., et al. T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies. Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- van Haperen, R., et al. Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice. Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Manzoor, A. A., et al. Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors. Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. , e50546 (2013).
- Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, ten, L, T. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).
- Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).
- Eilken, H. M., Adams, R. H. Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. , e50088 (2013).
- van Vliet, M., et al. MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment. Radiographics. 25, Suppl 1. S85-S97 (2005).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells. Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).
- Li, L., et al. Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia. J Control Release. 167, 130-137 (2013).
