Summary
Bu iletişim kuralı transgenik fareler hücre özgü floresan işaretleri ifade intravital görüntüleme açıklar. İntravital görüntüleme implante edilebilir windows üzerinden süreçlerin mikroskobik görselleştirme mümkündür kullanarak yaşayan hayvanlarda yüksek çözünürlüklü gözlemler için non-invaziv bir yöntem sağlar. Bu yöntem boyuna işlemleri incelemek özellikle kullanışlıdır.
Abstract
Tümör ve tümör gemi geliştirme gibi tedavi, tümör yanıt son derece dinamik biyolojik işlemlerdir. Histoloji statik bilgi sağlar ve genellikle doğru yorumu için yeterli değildir. İntravital değerlendirme, hangi süre içinde bir süreç takip eder ilave ve sık sık beklenmedik bilgiler sağlar. Transjenik hayvanlar hücrenin özgü işaretleri ve canlı hücre izleyiciler, ilerleme-e doğru görüntüleme cihazları ve çeşitli görüntüleme chambers gelişimi ifade oluşturma ile intravital mikroskobu daha iyi anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir biyolojik süreçleri. Bu kağıt bir tümör gemi geliştirme ve tedavi edici etkileri soruşturma için deneysel tasarım kayma ve zamansal bir şekilde açıklar. Bu ayarı kullanarak, gemi geliştirme, ipucu hücre ve Lümen oluşumu, kan akımı, ekstravazasyonu, kurulan vasküler yatağın ve vasküler imha aşaması görselleştirildiği takip ve. Ayrıca, tedavi edici etkileri, intratumoral kader ve kemoterapötik bileşikler lokalizasyonu da izlenebilir.
Introduction
Vitro çalışmalar yüksek çözünürlüklü Kinetik görüntüleme işlemleri etkinleştirmek iken, vitro deney değerlendirme doğru bağlam içinde etkinleştirmez. Örneğin, tümör hücreleri arasındaki etkileşimin stromal bölmeleri veya ilaç dağıtım ve dağıtım bir tümör içine bir kültür tabağına okudu olamaz. Hayvan modelleri bu nedenle insan fizyolojisi ve patoloji taklit etmek için kullanılır. Ancak, süreçler, bir hücre altı çözünürlükte özellikle boyuna görüntüleme meydan okuyor. Moleküler görüntüleme yöntemleri, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gibi tek foton emisyon tomografi (SPECT) ve Pozitron emisyon tomografisi (PET), ama-sizlik çekmek-çözünürlük iyi penetrasyon derinliği var veya anatomik yapıları göstermek başarısız hesaplanır. Optik görüntüleme yüksek çözünürlüklü sağlar ve yapıları görüntüleme sağlar, ancak en az penetrasyon1' e tarafından yoksul eşlik ediyor. Uygulama penceresi ile birlikte intravital mikroskobu, bir sırt gibi teknolojileri skinfold odası veya karın pencere, yüksek çözünürlüklü görüntü vivo içinde2,3,4için sağlar. O boyuna görüntüleme için saatler günler, üzerinde görüntüleme işlemleri (Örneğin, görüntülü doku hücre-hücre etkileşimleri) doğru bağlamda ve optik sınırları çözünürlüklerde bırakmak ve farklı avantajlar, bu teknoloji vardır Gelişmiş confocal ve multiphoton mikroskoplar.
Hücre veya protein özel floresan etiketlerle Transjenik hayvanlar getirilmesi bir bolluk içinde vivo ve ex vivo Hollow'a için olanaklar açar. İçin örnek, hücre-hücre etkileşimleri, proteinleri ve manipülasyon veya tedavi yanıtı okudu bu kullanarak vivo içinde 5,6,7,8modelleri. Önemlisi, yerleştirin yer ve zaman belirlenen uygun görüntüleme ekipman ve metodoloji ile. Burada, intravital mikroskobu değiştirilmiş bir implante tümör enjekte edilebilir ajanları ile birlikte endotel bir işaretleyici ifade hayvanların sırt deri kıvrım pencere odası sunulur.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Hollanda kanunları uyarınca yapılmış ve protokolleri Komitesi, hayvan deney tarafından Erasmus MC, Rotterdam, Hollanda kabul edildi.
1. alıcı fare
- Transgenik fareler doğduğunda hayvanlar için Standart prosedürler9kullanarak uygun genotip ekran.
Not: Bu makale, şirket içinde geliştirilen bir eNOStag-GFP satır9 ve satın alınan bir ROSA-mTmG (stok 007676)10 çizgi alınan verileri sunulmaktadır. - Bu 12 hafta yaşında veya daha büyük olan ve 20 g fare kullanın.
2. donör fare
Not: Dorsal penceredeki implantasyon için bir tümör parçası bir transgenik olmayan donör hayvandan elde edilir. Tümör türüne bağlı olarak, normal (ile syngeneic tümörler) veya immünyetmezligi (xenografts) fareler kullanılır.
- Kültür şişeler 37 ° C ve % 5 CO2uygun takviyeleri ile bir ortamda tümör hücreleri büyümek.
- Orta hücre şişeler kaldırmak, bir kez 1 x PBS ile yıkayın ve % 0.25 tripsin kullanarak hücre bağlantısını kesin.
- Tripsin hücre kültür orta ekleyerek devre dışı bırakın. Hücreleri toplamak, 1200 x g 5 min için de aşağı spin ve Pelet PBS 5 mL resuspend.
- Ölü hücreleri lekeleri hücre süspansiyon trypan mavi, 20 µL ile 20 µL sulandırmak. Bir hemasitometre kullanarak canlı ve ölü hücreleri saydırmak; ölü hücreleri % 10 geçmemelidir.
- Hücreleri yeniden vasıl 1200 x g 5 min için spin ve hücre Pelet buz gibi PBS resuspend, verimli 1 milyon hücre başına 100 µL. ameliyathane için buzda hücreleri taşıma.
- İsoflurane/O2kullanarak hayvan anestezi. Oksijen açmak ve 0.5 mL/dak ayarla % 3 isoflurane Buharlaştırıcı akışına ayarlayın. Birkaç dakika sonra anestezi odasında fareyi getirin.
Not: stres en aza indirmek kullanıma hazır olduğundan emin olmak için odası Prefill. -
Fare yatıştırıcı, 37 ° C'de muhafaza ameliyat Isıtma masasının hayvan getirmek ve burun anestezi burun konisi yerleştirin.
- Not: footpad tutam tepki vermiyor belirtildiği zaman hayvan düzgün sakinleştirici aldı.
- Enjeksiyon yeri daha iyi görmek için fareyi tıraş. 0.5 mL insülin kullanarak aşılamak; hücre 100 µL fare kanat enjekte ve geliştirmek bir tümör sağlar.
- Servikal çıkık, kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış anestezi altında tarafından hayvan ötenazi. Mikro makas ve forseps kullanarak, Cilt Tümörü konumda kesmiş ve tümör incelemek. Tümör PBS ile Petri kabına koyun. Mikro makas ve forseps, tümör yaklaşık 1 mm3 (şekil 1A-a) parçalara kesilmiş kullanarak.
Not: Donör fare tümör yeterli malzeme vermek için yeterince büyük olmalıdır, ancak büyük, nekrotik tümörlerde kaçınılmalıdır. Çoğu tümörler için bir ortalama çapı 10 mm yeterlidir.
3. pencere odası implantasyonu
- Aseptik koşullar altında tüm yordamları gerçekleştirin. Otoklav odası malzemeleri (şekil 1B) ve cerrahi aletler (şekil 1A).
Not: Burada, 1.1 g, toplam ağırlığı ile kullanılan pencere odası polieter eter keton (göz), MRI bir ışık, sentetik malzeme ile uyumlu yapılır. GÖZ 3.4-fold literatürde bu windows için yaygın olarak kullanılan titanyum daha hafiftir. Bu çoğu kimyasal dayanıklıdır, hareketsiz bağışıklık tepkileri kışkırtmak değil ve sağlam. Bu pencere Ayrıca tasarım için daha önce yayımlanmış windows karşılaştırıldığında küçüktür. Bu pencere göstermek tam kapasite ile donatılmış fare hareket, tırmanmak ve kilo kıyaslanabilir bir pencere odası olmadan fareler için. Hayvan üstünde belgili tanımlık pencere ısırabilir miyim çünkü sentetik windows biraz daha kısa sürebilir göre titanyum windows için; Ancak, onlar yapmak ve are ucuz kolaydır. Bu belirli windows şirket içinde yapılır ve istek üzerine elde edilebilir. - Bir anestezi odasında inhalasyon anestezi (Yani, isoflurane/O2) kullanarak alıcı fare sakinleştir. 37 ° C'de muhafaza ısıtılmış ameliyat masasına fare getirmek ve burun anestezi burun konisi yerleştirin (bkz. Adım 2.6). Göz kuruluğu önlemek için merhem uygulamak.
- Tüm geri tıraş ve saç temizleme jeli uygulayarak tüylerden. Kendine iyi bak bütün jel dikkatle el sıcak musluk suyu ile hayvan durulama tarafından kaldırılır. Hayvan kuru ve % 70 etanol ile cildinizi temizleyin.
Not: Tıraş yordamı da pencere implantasyon önceki gün yapılabilir. Krem bu cilt tahrişine neden olabilir gibi el-ılık su ile iyice kaldırılması gerekir. - Fare omurga Merkezi satırında simetrik TMMOB konumlandırma emin olmak için bir işaretleyici ile işaretleyin. Fareyi yeniden konumlandırmak, cilt olarak katlanan bir pozisyon merkezi hattı kullanarak bir kapak içine çekin ve flep ortasına kavramak. Öyle ki çerçeve en az 2 mm merkezi hattı ve daire pencere görünüm alanının bir marker ile cilt üzerinde aşağıdaki konuma yerleştirin.
- Bir neşter tutucu/bıçak boyutu 15 ve mikro makas kullanarak, çizilmiş dairesel çizgi boyunca cilt kaldırın. Temel fasya zarar vermemeye dikkat et.
Not: Bu pencere görünüm alanı içinde tümör nakledilen odasının oluşturur. - Yüksel deri kıvrım ve delik çapı deri yoluyla, bir görünüm alanı (şekil 1A-b) her iki tarafında 1 mm yumruk için bir kulak zımba kullanın.
Not: Bu pencere çerçeveleri birlikte düzeltmek iki civatalar için delikleri vardır. - Cıvata (1B-a rakamlar, 1B-c) kullanarak özel yapım ön odası çerçevesini yerleştirin ve arka çerçeve (şekil 1B-b) cıvata üzerinde konumlandırın. Fındık (şekil 1B-d) cıvata arka karede yerleştirin.
Not: Bu kilitleri odaları birlikte karşı düzeltmek için kullanılan deri kıvrım ve daha sonra mikroskop altında değerlendirme sırasında odası hareketsiz için kullanılır. - Deri 2-3 mm kare üst yukarıda çekin ve transplantable pencere görünüm alanının odası alan eşleştiğinden emin olun. Deliklerden iki küçük dikiş (şekil 1B, siyah ok) çerçevenin üst kısmında yer 23 G iğneler. Fındık cıvata üzerinde mikro tornavida (şekil 1A-c) ve fındık hareketsiz için sıkma bir iğne bağı ile sıkın.
Not: Cilt etrafında cıvataları, açılmıyor sağlamak için önlemler almak ve çok fazla sıkın değil. - İğne dikiş, çerçeveler cilt karşı düzeltmek için üst, başlangıç ile değiştirin. 5 çift dikiş delikler (şekil 1B, beyaz ok) çerçeve için bunu.
- Arka pencere odasının ortaya çıkarmak için fare açmak. Dolgu cam kalın bir parça 10 mm çapında ve kalınlığı 0.55 mm (şekil 1B-e) ve sonra 12 mm (şekil 1B-f) standart bir cam ile yer. Bunlar istinat ring (şekil 1B-g) ile arka-odası çevreyi güvenlik altına alın.
Not: Dolgu cam alanı arasında fasya ve görüntüleme için kullanılan ön pencerede açmak için engel olur. - Pencere görünüm alanının içinde tümör takılı bir 1 mL şırınga steril %0,9 ile doldurarak hidrat NaCl. Bu görünümü alanını düşmeye birkaç damla izin. Steril pamuklu bahşiş aşırı serum kaldırın.
- Fasya, 25 G iğne ucu ile kullanarak 1 mm3 tümör parçası (şekil 1A-a) bir 90 ° açıyla (şekil 1A-b) bükülmüş alacak kadar büyük bir cep oluşturun. İğne bağı veya Kelly forseps kullanarak, tümör parçanızı transplantable pencere görünüm alanının ortasında cebinde ekleyin.
- Pencere görünüm alanı, 12 mm ve istinat yüzük standart bir cam ile kapatın.
Not: Bir hava kabarcığı oluşabilir, ancak saat içinde kaybolur.
4. öncesi ve sonrası bakım hayvan
- İlaç için ağrı kesici (Yani, 0,05 mg/kg buprenorfin), kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış subkutan yönetmek. Fareyi anestezi altında bir Isıtma lambası kurtarmak izin verir.
- Pencere taşıyan fareler tek tek bir kafes ve 32 ° C ve üstü % 50 nem ayarla klimalı odasında yerleştirin. Su şişeleri üzerinde belgili tanımlık kafes-kaçağı önlemek için bunları yerleştirmeden önce çevre sıcaklığında olduğundan emin olun. Kafes ve engelsiz hareketi ve gıda ve su erişime izin ver zenginleştirme kullanın.
Not: Bu pencere odası çok iyi tolere edilir, fareler normal bir davranış göstermektedir. Bireysel konut hasar diğer fareler tarafından neden pencere Odası'na, ve yüksek sıcaklık/nem soğutma engeller aşağı ve susuzluktan deri kıvrım. - Fareyi çiğnenmiş kapalı dikişler, gevşek cıvata/fındık veya kırık cam için düzenli olarak kontrol edin. Hemen onarım ve ne zaman bu olmak yerine. Hafif malzemeden yapılmış bir kapak pencere korumak için kullanılabilir.
5. intravital görüntüleme
Not: Bu yordam, multiphoton mikroskop ve uygun kontrol yazılımı kullanılır. Burada, mikroskoplar ile sağlanan yazılım paketleri kullanılır. Prensipte, mikroskop ile gelir ve mikroskop kontrol ve görüntüleri yakalama içindir herhangi bir yazılım paketi olacak Süiti bu amaç.
- Sistem üzerinde geçiş: PC/mikroskop, confocal kontrol ünitesi, iktidara lazer güç ve lazer emisyon. Örneğin, ile bu bilgisayar yazılımı, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı başlatmak ve mikroskop tablo (1E-a şekil ve 1E-c) "tablosunu başlatmak." tıklayarak başlatmak Sistem üzerinde geçiş ve mikroskop, xy-tablo, z-konumlandırma ve görüntü yakalama denetlemek PC etkinleştirme moduna ayarlayın.
- Floresan ışığı (şekil 1E-b) geçin.
Not: Bu parlak alanıyla birlikte göz resimlerle Floresans değerlendirmek için kullanılır. - Özel yapım, ısı kontrollü platformunda geçiş (şekil 1 C-c; tartışma daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır) 37 ° C'de ayarla
- İsoflurane/O2 (şekil 1E-d) kullanarak anestezi birimi geçin. Anestezi tüp mikroskop Sahne Alanı'nda (şekil 1 C-e) bağlayın. Kelepçe bir xy-anestezi burun parça düzeltmek için Sahne Alanı'nda yükleyin.
- Tümör gemi geliştirme aşamasında kurmak için hayvan önceden değerlendirmek; Bu tümör büyüme hızına bağlıdır, ancak bireysel fareler arasında değişebilir.
- Bir anestezi odasında inhalasyon anestezi (isoflurane/O2) kullanarak fare sakinleştirici (bkz. Adım 2.6).
- Hayvan mikroskop sahnede monte ısı kontrollü platformda yer; Bu ne zaman o anestezi hayvan aşağı soğutma engeller. Fare burun anestezi koni içinde bulunduğundan emin olun ve değerlendirme 5 dk uzun sürer eğer göz merhem uygulamak.
Not: 1s uzun bir değerlendirme için % 2'ye isoflurane akışını azaltmak. - Odası cıvata (şekil 1 C-b, tam ok) odası bir ısmarlama odası tutucu (şekil 1 C-a) düzeltmek için kullanın. Bu tutucu (şekil 1 C-d, kesikli ok) ısıtmalı platformu (şekil 1 C-c) canı cehenneme.
Not: Bu arada hala özgürce nefes hayvan izin verirken pencere görünüm alanı hareket aktarımında engel olur. - Su bulanık görüntü ve girişim enkazı cam dışarıdan gelen önlemek için batırılmış pamuk bahşiş ile cam pencere görünüm alanının temizlemek emin olun. Platform ve fare mikroskop Sahne Alanı'nda (şekil 1 d) yerleştirin.
Not: dikkat çekmek kuyruk platform ve mikroskop sahne arasında sıkışmış değil. - Görsel olarak bir 10 X objektif lens, alan parlak ve floresan ışığı kullanarak tümör gemi geliştirme aşaması kontrol edin.
Not: Floresan damarları odakta olması gerekir ve kan akışı parlak alanını kullanarak görünür olması gerekir. Zaman damarlara açıkça görülüyor, tümör gemi geliştirme aşamasında değerlendirin. Örneğin, erken başlangıçlı angiogenez ipucu hücreleri veya zaten kurulmuş damarlara ilaç dağıtım için büyüme ile bulunup bulunmadığını belirler. Aynı hayvan tekrar değerlendirilebilir ve tümör geliştirme devamlı bir süreçtir. Birkaç aşamada tek bir tümör aynı anda görülebilir.- Damarlara üzerinde odaklanmak, hayvan Sahne Alanı'ndan kaldırmak mümkün değildir zaman fare yeniden elde etmek ve hayvan geri klimalı bir uzayda yer ver. Daha sonra yeniden denetleyin. Fare değerlendirme için hazır olduğunda, aşağıda açıklanan işleme devam edin.
- Confocal lazerler ve "Lazer" tıklayarak kontrol paneli ve "Ctrl" Masası'ndaki yapılandırma sekmesinde geçiş
Not: Bu lazer gücü düşük, beyazlatma, doku ve duyarlilik ısıtılması önlemek için özellikle Argon lazer için ayarlamak için tavsiye edilir. Denetim Masası için kişisel tercihleri ayarlayabilirsiniz. Birden çok fluorophores kullanarak intravital görüntüleme için aşağıdaki ayarları uygulamak için tavsiye edilir: "kazanç, 100 dönüş, V akıllı" "akıllı ofset, sende, başına % 10" "zoom, orta," "X konumuna, orta," "Y konumu, orta," ve "Z konum, sıra başına 100 µm." Görüntüleme önce gürültü en aza indirmek ve sinyal-gürültü oranı en iyi duruma getirmek için mahsup hesabı ayarlayın. Confocal zoom fonksiyonu için daha yüksek bir büyütme objektif lens değiştirmek olmadan sağlar. X, Y ve Z kontrolü ilgi alanları bulmak gereklidir. Kene doku değerlendirilir intravital mikroskopi için Z-konumlandırma sıra başına yaklaşık 100 µm olmalıdır. - "Alma" Al sekmesini tıklatın ve değişmek belgili tanımlık koyma için: "Satın alma modu XYZ veya XYZT," "Format (512 x 512 ya da 1024 x 1024)" ve "Speed (400 Hz veya 200 Hz)." "Pinhole"'ı tıklatın ve 1 havadar birimine ayarlayın. "Çift yönlü X"'ı tıklatın.
Not: görüntüleri en iyi duruma getirmek için lazer gücü, kazanç ve iğne deliği arasında bir denge, hangi tartışmaya anlatılan vurdu olmak. - Değerlendirirken birden çok fluorophores, select "sıralı tarama" ve "çerçeveler" arasındaki taşma payı tartışmada belirttiğim aracılığıyla, önlemek için. "Satır ortalama 4" seçin ses iyi bir azalma elde etmek için.
Not: diğer flüoresan işaretler, içsel Floresans transgenik hayvan mevcut bağlı olarak, gibi dextrans, Höchst, FITC-BSA, floresan chemotherapeutics/veya istenen konsantrasyonu % 0,9 NaCl olabilir içinde seyreltilmiş nano tanecikleri yönetilen ve tümör değerlendirildi. Bunlar kuyruk veya penil ven yoluyla enjekte edilir. - "Deney" Al sekmesini tıklatın ve "yeni" yeni bir veri tabanı yapmak için seçin.
- Hayvan kullanarak değerlendirmek, araştırma soru üzerinde bağlı olarak, 10 X, 20 X veya 40 X objektif lens. Vizörün değerlendirmek için bir pozisyon bulmak.
Not: Bir NA mümkün, Kuru objektifler nispeten uzun bir çalışma mesafe ve yapmak değil lüzum daldırma sıvı gibi yüksek kuru lens kullanmak en iyisidir. Tartışmada, su-daldırma objektif lens kullanımı söz ediliyor. - Hızlı canlı bir tarama uygun kazanç ve ofset dozun engellemek ve sinyal-gürültü oranı en iyi duruma getirmek için bulmak için kullanın. Ayrıca, sırasında ve nicel karşılaştırma gerekirse deneyler arasında aynı görüntüleme ayarlarını korumak.
Not: Optimum görüntüleme için daha fazla konuları tartışmaya belirtilmiştir. XYZ konumu ve zoom kontrol panelini kullanarak canlı tarama sırasında sonlandırılmış olur. - Bir Z-yığın yapmak için "Z-yığın" Al sekmesini yapmak bir hızlı Z-Z-pozisyon Denetim Masası've başında ve sonunda tarama "Begin µm" ve "Son µm." tıklayarak Tara öğesini seçin İğne deliği boyutu için ilgili Z-adım boyutunu ayarlayın.
- "Start" tıklayarak çekim
Not: intravital mikroskobu hakkında herşey gibi kinetik ve bu nedenle dinamik süreçler gözlenen, bir görüntü elde etmek için gerekli zamanı arasında bir uzlaşma ve biyolojik süreçlerin hız yapılması gerekir. Genel olarak, çözünürlüğü ne kadar yüksekse, daha floresan kanal are inceden inceye gözden geçirmek ve daha büyük tarama alanı, daha fazla piksel görüntü /. Daha kalın Z-yığınlar artık görüntüleme vakit çevirmek. Artık bu görüntüleme vakit hareketi eserler olasılığını artırır ve yansıma doku zarar görebilir. Ayrıca, belirli floresan etiketleri tarama ağartma ve lazer güç ve birikmiş boya konsantrasyonu etkilenir toksisite neden olduğunu unutmayın. - Z-yığın taramadan sonra "maksimal projeksiyon"'ı tıklatarak hızlı bir şekilde değerlendirilebilir. Z-yığın veri Bankası'otomatik olarak kaydedilir ve yeniden adlandırılabilir.
6. veri analizi
- Özgün Araştırma soru bağlı olarak, veri analizi için ImageJ5, Matlab11veya Amira, gibi çeşitli yazılım programları kullanın. Doğru analiz çok önemlidir.
Representative Results
Ana intravital görüntüleme invaziv araya hücresel süreçler boyuna görselleştirme özniteliğidir. Bunun için Transjenik hayvanlar ilgi hücrelerde bünye veya indüklenebilir floresan işaretçisi ifade kullanılmaktadır. Şekil 2 floresan etiketleri eNOStag-yeşil flüoresan protein (GFP)9 ve Rosa-mTmG fare satırları10ifadesi gösterilmektedir. ENOStag-GFP şirket içinde kesilmiş eNOS gen GFP için etiket olarak kullanılarak üretilmiş bir fare çizgidir. Önemlisi, eNOS yüksek endotel hücrelerinde ifade edilir ve GFP sinyal açıkça th eGolgi ve hücresel membran (şekil 2A) görülür. Rosa mTmG fareler iki renkli floresan membran hedefli Cre muhabir gen var. Bu hat mTomato floresan yaygın hücrelerdeki ve Cre hücrelerdeki recombinase ifade mGFP ifade eder ve büyük ölçüde soy izleme için kullanılır. Bir tümör parça transgenik olmayan bir verici nakledilen gibi kırmızı Floresans stromal tümör bölgelerinde tarafından ağırlıklı olarak gösterilir (Örneğin, zarda vasküler hücre, hücre, dolaşan kan hücreleri sızmış ve tümör ilişkili fibroblastlar (şekil 2B)).
Damar oluşumu sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu eğitim için mükemmel bir model gelişen retina12,13yaşında. Ayrıca, tümör gemi büyüme prensip olarak retina gemi geliştirme için benzer Kinetik bir süreçtir. Ancak, tümör damarları organizasyon eksikliği de tümör sürekli remodeling gibi tümör ilişkili damarlara öyle. Tüm gemi gelişimin sık sık aynı tümör aynı anda bulunabilir gibi bu avantajları tümör anjiogenik model olarak kullanırken sahip olabilir. Bunlar tümör (şekil 2C); un bozukluklarına bir parçası haline büyüyen bir endotel çimlenme açık içerir hasarlı gemileri (şekil 2B); ve kurulan bir vasküler yatağın (şekil 2E-ben) ile olgun, dallı gemiler (Şekil 2E-II). Ancak, anjiogenik endotel hücreleri de bu gibi yerlerde bulunabilir. Anjiogenik uyaranlara tarafından uyardığında, endotel hücre filopodia (Şekil 2E-III) dışarı çıkar ve bu filopodia tarama ve yön geçişe (Şekil 2E-IV) kullanarak bir ipucu hücreye ilerletebilirsiniz. Bu ipucu hücre tümör interstitium geçirir ve SAP hücre bölünmesi tarafından takip edilir. Bir tek ipucu endotel hücre birkaç filopodia genişletilmesi, geri çeker ve herhangi bir zamanda yenileme vardır ve intravital mikroskobu (2F rakam) kullanılarak izlenebilir.
İkinci olarak, intravital mikroskobu kullanılabilir Lümen oluşumu bir anjiogenik ön belirlemek için kan akışı boyunca tümör ve ekstravazasyonu. Zaten-günümüz içsel floresan sinyallerini bağlı olarak hayvan, farklı floresan bileşikler yönetilebilir. Kan akışı ve ekstravazasyonu Höchst, floresan dextrans veya FITC-BSA kullanarak görüntülenmeyecektir. Kan akışı ve parçacık ekstravazasyonu genişletilmiş çalışmaları için uzun dolaşım fluorescently etiketli pegile nano tanecikleri 100 nm-ebilmek var olmak kullanılmış. Bu nano tanecikleri hazırlanması hakkında ayrıntılar için bkz: bir önceki yayın5. Bu bileşiklerin istihdam şekil 3' te gösterilmiştir. Rosa mTmG fare endotel ucu hücrelerinde tümör doku istila açıkça görülebilir. Fonksiyonel kan akımı vasküler tüpler Lümen içinde sistemik enjekte nano tanecikleri mor floresan tarafından gösterilmiştir (şekil 3A-ben). Nano tanecikleri yakından bir Lümen (Şekil 3A-II) SAP hücre alanında oluşumu gösteren endotel ipucu hücreleri ulaşmak. Sistemik yönetilen chemotherapeutics teslimini tümör interstitium ulaşmak için işlevsel bir damarlara üzerinde bağlıdır ve şekil 3B'de gösterildiği gibi enjekte edilebilir ajanlar, onların boyutunu bağımsız alanları tahrip gemiler ile nüfuz değil, sıkıştırılmış gemiler, ya da kan staz ile gemi.
Çoğu organlar, endotel astar kan ve temel alınan doku arasında işlevsel bir bariyer oluşturur ve molekülleri geçit sıkı bir şekilde düzenlenmiştir. Damarlara tümör ilişkili, ancak, bulky olduğu bilinmektedir ve gözenek boyutu kesme büyük ölçüde tümör tipi14tarihinde bağlıdır. Floresan Birleşik dextrans farklı boyutları ile kan akımı, geçirgenliği ve ekstravazasyonu değerlendirmek için enjekte edilebilir. Höchst (615 Da) hızla tümör dokusu içine dağılır ve çevredeki hücreleri tarafından alınır (şekil 3 c-ben). Kısa bir süre sonra enjeksiyon, dextran 10 KDa (şekil 3CII) ve 2 MDa (Şekil 3 C-III) kanda bulunur. Ancak, 10 KDa de bir özellik olan endotel astar daha küçük molekülleri, geçirgenliği gösteren tümör interstitium görülür dextran tümör gemiler için atfedilen. sonra enjeksiyon (Şekil 3 C-IV), 10 KDa kan akışı (Şekil 3 C-V) ve dextran 2MDa floresan yoğunluğu temizlenir dextran 40dakika de (Şekil 3 C-VI) düşmüştür. Ancak, büyük dextrans geçirgenliği bu zaman dilimi içinde büyük moleküllere eksikliği gösteren tümör interstitium içinde bulunamadı.
Onun son derece Proliferasyona, nekrotik ve un bozukluklarına alanları ile tümör patofizyolojisi tümör anjiogenik model olarak kullanırken oldukça bilgilendirici olabilir. Ancak, bu etkili tedavi ve araştırma için bir sorun oluşturur. Tümör ilişkili damarlara heterojen türdeş olmayan bir dağıtım tüm alanlarda uyuşturucu ücretsiz15bırakarak yönetilen ilaçların neden olur. İlaç dağıtım geliştirmek için çeşitli stratejiler uygulanan15,16,17, olabilir ve tedavi edici ilerleme intravital bu tasarım kullanılarak incelenebilir. Tümör ilişkili damarlara ilaç teslim17geliştirmek için vazoaktif aracıları kullanarak manipüle edilebilir. Doxil ile birlikte vazoaktif bir ajan olarak tümör nekrozis alfa (TNF) kullanarak tümör gemi işleme sonuçlarını, doksorubisin, kapsüllenmiş liposomal formülasyonu kemoterapötik ajan olarak sunulan bu el yazması5', 18 , 19. dextrans aksine, birkaç saat, yoksa kan dolaşımını20gün dolaşmaya pegile nano tanecikleri yapılır.
Daha önce belirtildiği gibi tümör alan araştırma soru bağlı olarak doğru tümör alanları tanımlamak için önceden taranmış olabilir. Uyuşturucu kader fonksiyonel damarlara alanları zaten hasarlı damar Yataklı (veri gösterilmez) karşı olan bölgelerde değerlendirilebilir. Sitotoksik müdahale olmadan kemoterapötik ajanlar kaderi araştırmak için nano tanecikleri ile terapötik ajan olarak aynı oluşturma modeli uyuşturucu olarak kullanılabilir. ENOStag-GFP hayvan bu nano tanecikleri ile tedavi edilen damar yolu yapıldı ve 24 saat sonra görüntüsü. Nano tanecikleri ile tümör interstitium içine en az ekstravazasyonu damarlara hala mevcut (şekil 4A-ben). Ancak, nano tanecikleri TNF ile birlikte idare zaman ekstravazasyonu intratumoral ilaç dağıtım artan dolaşımına (Şekil 4A-II), tümör interstitium gözlendi. Yüksek çözünürlüklü objektif lensler kullanarak, bir bileşik hücre içi lokalizasyonu, burada Höchst yeşil endotel hücreleri ve tümör interstitium (şekil 4B) hücrelerinin nükleer konumunu tarafından gösterildiği gibi kabul edilebilir. Ayrıca, doksorubisin gibi birçok kemoterapötik ajanlar DNA ile intercalate gibi bu bileşiklerin lokalizasyonu değerlendirilebilir. Doksorubisin kırmızı floresan özellikleri vardır ve nanocarrier Örneğin, ile tetramethylindotricarbocyanine perklorat (yaptım) olarak etiketlenmiş. ENOStag-GFP hayvan Doxil ile serum enjekte edildi-TNF ile birlikte yaptım ve görüntüleri tedaviden sonra 24 h alınmıştır. Doxil-extravasated dışında kan damarları ve çekilmiş tümör doku çevreleyen tarafından yukarı (şekil 4 c-ben). Tek tek hücreleri (Şekil 4 C-II) daha ayrıntılı bir değerlendirme yayımlanan doksorubisin hücre çekirdeğinde gözlendi Ise taşıyıcı sitoplazma içinde bulunabilir gösterdi.
Şekil 1: deri kıvrım odası ve ekipman kurulumu yordam için gerekli aletleri, dorsal. (A)tümör parçaları (a) ve cerrahi aletler implantasyon için gerekli. Standart olmayan bir kulak zımba (b), mikro tornavida (c) ve (d) bükülmüş bir iğne araçlardır. (B) sırt deri kıvrım pencere odası. Ön (a) ve (b) penceresi arka (ok: dikiş için delik; ok ucu: için cıvata delikleri), 2 cıvata (c), 2 fındık (d), (e), 2 kapak gözlük (f) ve yüzükler (g) istinat 2 1 doldurucu cam. Ayrıca, yüzük olmadan kanca (beyaz ok ucu) istinat gerektiğinde kullanılabilir. (C) özel odası tutucu (A), civatalar için odası odası tutucu (b), ısı kontrollü platformu (c), cıvata odası sahibine platformu (d) güvenlik altına almak için ve anestezi ile sahibi tüp (e). (D) hayvan odası tutucu platform monte. B16BL6 tümör (ok) penceresi görünümü alanında görünür. (E) ekipman intravital değerlendirme için gerekli. Bilgisayar görüntüleme ve mikroskop kontrol yazılımı (bir), standart Floresan ışık (b) ve mikroskop. Bir multiphoton confocal kullanılan (c) anestezi ünitesi (d) olan oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: transgenik hayvanların iç Floresans. Tüm resimler burada gösterilen 50 ila 70 µm kalınlığında arasında Z-yığın projeksiyonları vardır. (A)eNOSGFP-etiket satırı GFP Golgi (yıldız işareti) ve endotel hücrelerinin hücre zarı (ok) ifade edilir. Ölçek çubuğu = 100 µm. (B) Intratumoral ifade mTomato Rosa-mTmG doğrultusunda ağırlıklı olarak damar hücreleri (ok) ve kan hücreleri (yıldız işareti) hücre membran bulundu. Ölçek çubuğu 100 µm. (C) A projeksiyon büyüyen anjiogenik paravan un bozukluklarına tümör içine =. Ölçek çubuğu 100 µm. (D) A projeksiyon bölümü kurulmuş ve hasarlı gemileri (yıldız işareti) ile tümör =. (E) olgun kene gemiler (EII); gösterilen kurulan tümör damarlara (EI) bir projeksiyon anjiogenik endotel ipucu hücreleri ile filopodia (EIII, ok ucu); ve olgun bir gemi, içinden tek bir endotel hücre interstitium bir filopodium (EIV, ok ucu) genişletir. Ölçek çubuğu = 100 µm. filopodia (F) hareketi takip için 1 h. Her 15 dakikada bir Z-yığın çekildi; En fazla bir projeksiyon burada sunulmaktadır. Filopodia (beyaz ok), genişletme durgun (=), geri (kırmızı ok) veya hatta tamamen yok olan (-). Ölçek çubuğu 25 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: ekstravazasyonu ve kan akışını göstermek için enjekte edilebilir etiket yönetim. (A) A Rosa mTmG fare mor floresan nano tanecikleri ile enjekte ve bir Z yığını bir işgal ipucu hücre açık 10 dk sonra (AI) alınmıştır. En endotel lahanası fonksiyonel Lümen (bütün, ok) gösteren bir projeksiyon. Nadiren endotel lahanası akışı olmadan (bütün, ok ucu) görülebilir. Ölçek çubuğu = 250 µm. (B) bu Z-yığın projeksiyon gösterir bir tahrip tümör gemi alan bir eNOStag-GFP hayvan tedavi (BI) önce. Hayvan nano tanecikleri (mor, BII) ve Höchst (mavi, Bill) ile enjekte ettiler. Nano tanecikleri ve Höchst yok edilmiş alanlarda, toz hücre artıkları hala GFP ifade tarafından belirtilen ulaşmıyor. Ölçek çubuğu 250 µm bir eNOStag-GFP fare ile farklı boyutlarda iki dextrans enjekte. (C) = (kırmızı Dextran 2 MDa =; mor dextran 10 = KDa) ve Höchst (mavi 615 Da =), ve tek-uçak resimleri burada sunulmaktadır. 10 dakika sonra enjeksiyon, kan ve ekstravazasyonu varlığı aynı resimde görülmektedir. Höchst hemen kan damarları dışında extravasates ve çevreleyen hücreleri (CI) tarafından alınır. Dextran 10 KDa (CII) kaplar ve tümör interstitium görülebilir. Dextran 2 damarlarının MDa (CIII) bulunabilir. 40 dakika sonra enjeksiyon (CIV) Dextran 10 KDa kan (CV) kaybolur ve Dextran 2 MDa floresan yoğunluğu da azalmış (CVI) oldu. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: kemoterapötik ajanlar kaderi soruşturma. (A) eNOStag-GFP hayvan nano tanecikleri ile tedavi damardan oldu ve daha sonra 24 h görüntüsü. Nano tanecikleri damarlarının, hala en az ekstravazasyonu tümör interstitium (AI) ile mevcuttur. Nano tanecikleri TNF ile birleştirildiğinde, ekstravazasyonu tümör interstitium (bütün) kan akışından görülmektedir. Ölçek çubuğu = 250 µm. (B) kullanma yüksek çözünürlüklü lens, endotel sitoplazma (yeşil) ve tek bir hücre çekirdeği (mavi) tanınması. Ölçek çubuğu = 50 µm. (C) eNOStag-GFP hayvan enjekte damar yolu ile Doxil-TNF ile birlikte yaptım ve görüntüleri daha sonra 24 h alınmıştır. Burada, Doxil ekstravazasyonu-mi tümör içine gemiler dışarı açık (CI) interstitium olduğunu. Tek tek hücreleri (CII) daha ayrıntılı bir şekilde değerlendirilmesi (kırmızı) yayımlanan doksorubisin hücre çekirdeğinde (ok ucu) görülmektedir Ise mor taşıyıcı (ok), sitoplazma içinde bulunabilir gösterir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Tümör ve tümör gemi geliştirme gibi tümör tedavi edici etkileri, son derece dinamik süreçler olduğu için intravital değer biçmek zaman ve mekansal bağımlı bir şekilde bu süreçlerin doğru bir değerlendirme yapmak için zarif bir araçtır. Canlı hücre işaretleri, transgenic hayvanları yaratılması ve görüntüleme yöntemleri ilerleme artan durumu ile intravital görüntüleme ve daha popüler hale geliyor. Histoloji hala düzenli olarak kullanılır ve işaretleri çok sayıda hücreleri ve yapıları belirlemek için kullanılabilir olsa da, doku kesit dezavantajları dinamik süreçler soruşturma zaman vardır. Doku diseksiyon, yalnızca statik bilgileri sağlayan gereklidir; fiksasyon doku kalitesi etkiler; ve dilimleme hücresel etkileşimlerin zarar verir. Ayrıca, dinamik süreçler araştıran, doku diseksiyon noktalarda farklı ve sık sık tahmin ediliyor, zaman-hayvanlar büyük miktarda gerektirir. İntravital görüntüleme ile farklı oyuncuların uygun konumlandırma uzay ve zaman içinde mümkün hale aynı hayvan XYZ mekansal boyutları ve zaman fazladan bir boyut değerlendirilebilir. Bu nedenle, en iyi zaman Puan kaçırmayın ve deneme kullanılan hayvan sayısı önemli ölçüde azalır. İkinci olarak, intravital değerlendirme ile kurulan zaman penceresi doku çıkarma optimize etmek için yaygınlaştırılması. Üçüncü olarak, istenen gemi büyüme aşamasında intravitally tespit ve bir bütün-mount doku lekeli.
Bu el yazması bahsedilen intravital tasarım deri kıvrım odası modeli ve özel multiphoton confocal mikroskop Transjenik hayvanlar bir floresan etiketinde endotel hücreleri, değiştirilmiş bir dorsal ifade bir birleşimini kullanır.
Endotel hücreleri angiogenez sırasında aşamaları21,22 numarası üzerinden gidin ve bu aşamaların bir tümör genellikle aynı anda görülebilir. ENOSTag-GFP fare satırını kullanarak, tek tek endotel hücreleri takip edilmesi ve hatta filopodia dinamiği izlenebilmektedir. Bu nedenle intravitally gemi geliştirme eğitim için iyi bir model olduğunu. Zaten mevcut iç etiketleri bağlı olarak enjekte edilebilir floresan ajanlar Lümen oluşumu, kan akımı, ekstravazasyonu ve kan temizleme değerlendirmek için kullanılabilir. Fare sürekli olarak en fazla 5 saat için görüntüsü. Bir hayvan uzun vadeli değerlendirilmesi mümkün olduğunu hayvanın anestezi ile ilgili çeşitli önlemler alındığında, hangi oldu daha önce23açıklanan. Bu araştırma kanser üzerinde duruldu gibi tümör doku veya hücreleri implante edildi. Ancak, biz de ayaktarakları ve embriyonik akciğerleri ile deney. Birkaç hafta sonra regrow cilt başlar ancak, doku altında eğitim büyüme hızının, hangi-ebilmek var olmak yavaş büyüyen tümör ya da dokular ile ilgili bir sorun sınırlayıcı olduğunu.
Doğrulama aşamasında sırt deri kıvrım pencere odası önemli ölçüde güncellenmiştir klasik modeli4' e göre. Çerçeveler autoclavable sentetik malzemeden inşa edilir ve hafif ve küçük, büyük pencere-görünüm alanı ile. (Şekil 1Bg, beyaz ok ucu) istinat halka kanca yalnızca yüzüğü kolay kaldırılması için kullanılır. Bunlar görüntüleme ile müdahale hizmetli yüzük kanca olmadan kullanılabilir. Cilt çok fazla gevşeme bu modelde, oluşmaz uzatılmaz ve enfeksiyonlar çok nadir görülür. Bu değişiklikler hayvan rahatsızlık azaltmak ve hayvan yordam önemli ölçüde iyileştirmek. Ayrıca, metal parçalar MRI24kullanarak tümörü Imaging zaman kolayca kaldırılabilir.
Herhangi bir mikroskop intravitally görüntü dorsal kabul edilebilir deri kıvrım chambers. Ana şartı mikroskop sahne ve objektif lens arasındaki kullanılabilir alan olduğunu. Görüntüleme etkileyen önemli bir hareket yönüdür. Hareket eserler önlemek için mikroskop tabloda (tüm ekler çıkarıldıktan sonra) uyan ve fare destekleyen bir platform kullanılmalıdır. Anestezi altında ve serbestçe fare nefes izin iyidir olduğunda fare zaptetmek gerekli değildir. Ancak, pencerenin en uygun görüş alanı fiksasyonu veren platform üzerine civatalı olduğunu (Yani, tümör ile pencere odaya görünür). Platform olarak hayvan Isıtma için kullanılan bir elektronik Isıtma yastığını kullanarak ısıtılır. Özellikleri istek üzerine temin edilebilir ve bu platform şirket içinde yapıldı. Yüksek çözünürlüklü bir objektif lens hücre içi işlemler değerlendirirken bir zorunluluktur ve sitoplazma ile çekirdek arasında ayırımcılık olanak sağlar. Ama nispeten uzun iyi optik çözünürlük (yüksek NA) konik bir lens kullanımı çalışma mesafesi (tercihen 2 mm veya üzeri) önerilir. Görüntülemede penetrasyon derinliği ve etiketleri floresan yoğunluğu kısıtlamadır. Ayrıca, photobleaching, fototoksisite ve doygunluk görüntüleme sırasında kaçınılmalıdır.
Burada, entegre bir confocal multiphoton ve confocal mikroskop kullanılmıştır. Confocal ters bir mikroskop multiphoton dik, iken. Dik bir mikroskop su-daldırma lenslerin kullanımı kolay avantajdır. Bu lensler yüksek NA ve uzun bir var bir (Örneğin, 20 veya 40 X) yüksek büyütmede bile çalışma mesafesi. Özellikle, çeşitli şirketler tarafından satılan bir 20 X NA 1.0 su-daldırma lens almak için tavsiye edilir. Daldırma objektifler kullanıldığında, objektif lens ve daldırma sıvı 37 ° C'ye ısıtılmış gerektiğini, unutmayın En iyi görüntü için en uygun confocal ayarlarını kullanmak için tavsiye edilir (Yani, iğne deliği 1 havadar ünitesinde, lazer güç mümkün, kazancı çok yüksek düşük (özellikle kazanç gürültü tanıtır varsa), satır en fazla ve hiçbir taranmasını ortalama hızda). Dozun, doygunluk ve yoğunluklarda fark görüntü arasında veri kalitesi tehlikeye. Doygunluk ve overexposure önlemek için önerilir. Bu görüntüleri farklı kazanç değerlerinde elde etme tarafından atlatılabilir. Kazanç değişen görüntü parlaklığını değiştirmek için en kolay yoludur. Gerekirse, lazer güç ayarlanabilir. Görüntü kalitesini standartlaştırmak için slaytlar bir sabit floresan yoğunluğu ile kullanılabilir. Bir görüntü kalitesi bile mikroskop en iyi şekilde ayarlandığında, pencere odası ve doku kalitesi ile büyük ölçüde belirlenir akılda tutmak gerekir
Aynı anda birden çok floresan işaretleri tarama yaparken kanama-bir fluorophore bir başka kanalda algılanır aracılığıyla, kaçınılmalıdır. Taşma payı üzerinden en az örtüşen spectra ile fluorophores bir arada kullanarak ve ardışık çerçeveler arasında tarama kaçının. Burada sunulan görüntüleri 3 sıralı taramaları kullanarak tarandı (parça 1: GFP, DID veya fluor647 ile 488 ve 633 lazer; Tam2: rodamine, Doxil veya mTomato ile 543 lazer; ve izlemek 3: Höchst 405 lazer ile).
Çeşitli aşamalarında tümör gemi geliştirme, ipucu hücre dinamiği, lumen oluşumu, ekstravazasyonu ve vasküler hasar değerlendirme imkanı burada gösterilir. ENOStag-GFP satırını kullanarak, tümör alanları tahrip vasküler yatak hala GFP ifade toz hücresel artıklar tarafından kolayca algılanır. Enjekte edilebilir temsilcisi bu alanlarda, akış eksikliği gösteren algılandı. Kemoterapötik ajanlar yönetilen anlamına gelir bu alanlarda da erişemeyecektir. Ancak, gemi imha de tedavi edici bir sonuç olabilir. Ön arıtma gemi imha için kontrol etmek için tümör, ön değerlendirme doğru tedavi değerlendirmek için bir ön koşul ve kolayca bu deneysel tasarım kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Olanakları intravital mikroskobu kullanılabilir bir bolluk olduğunu ve ayrıntılı tartışma bu yayın kapsamý dýþýndadýr. Kısa bir fikir vermek için mümkün chemotherapeutics birikimi üzerine çalışmalar tümör dokusu, gemiler (Örneğin, gemiler, dalları ve kavşak sayısı) ve kan akımı, hücre-hücre etkileşimleri geliştirme uygulamaları, hedefleme ve hücre içi işleme, aynı zamanda yukarıda belirtilen ve burada gösterilen örnekler hücre. Analiz Floresans üzerinde dayalı olarak şiddeti dalgalanmalar pencere veya doku kalitesi nedeniyle dikkat. Tümör doku nispeten kalın olduğu için Ayrıca, Floresans yukarıdan veya uçak görünümünün altında görüntü sinyali etkiler. Sayısal görüntü analizi objektif ölçümleri ile birleştirmek en iyisidir. Örneğin, uyuşturucu konsantrasyonlarda ilgilenen varsa, tümör doku penceresinden sonra intravital mikroskobu kaldırmak ve uyuşturucu confocal görüntüleri ile karşılaştırmak için HPLC ile kullanarak içerik belirlemek.
Tümör yanıt değerlendirilmesi de bu modeli kullanan, ancak bazı önlemler ile gerçekleştirilebilir. Birini tümörler de içe, deri içine büyümeye gerçekleştirmek gerekir. Penetrasyon tüm tümör kapsayacak şekilde derin ise 3D ölçümler yapılabilir. Böyle bir durumda far-red boyalar kullanılır. Pencere odası olarak burada bir cilt ortamda tümörler ile fırsatlar açıklanan ve pencereyi bir sıcaklık biraz daha normal fare vücut ısısı düşük tutar işaret etmek önemlidir. Bu nedenle, bu deri kıvrım pencere odası tümörleri ile dorsal intravital çalışmalar onaylamak için şu mikro çevresel ortamda çalışmak en iyisidir. Önemlisi, dorsal deri kıvrım odası Kinetik süreç ve mekanizmaları, terapi iyileştirilmesi için bir vesile olarak sağlayan içgörü sunuyor. Ayrıca, biodistribution ve dozları hakkında ilave bilgi elde edilebilir. Klasik, bu biodistribution çalışmalar tümörü taşıyan hayvanlar tedavi ve ilaç alımı ölçmek için tümörleri/organ dissekan gerçekleştirilir. İntravital bu modeli kullanarak, bir ilaç (Yani, damar içi, intratumoral, hücre içi veya nükleer) intratumoral konumunu5,25,26sağlanabilir. Sadece, ama aynı zamanda zaman pencere-in-fırsat en optimum alımı için ortaya uyuşturucu konumudur.
Bu makalede açıklanan deneysel tasarım kullanarak, parametrelerin geniş bir zamansal ve mekansal ortamda değerlendirilebilir. Özellikle, işte bu intravital mikroskobu tümör gemi geliştirme ve terapötik yanıt dinamikleri önemli anlayışlar sağlar göstermektedir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Rien van Haperen ve Rini de Crom kendi geliştirme ve eNOSTag-GFP satırının, Joost A.P. Rens hayvan çalışmaları ile onun teknik yardım için ve hayvan hademe onların yardım için bağış için teşekkür etmek istiyorum. Kullanılan mikroskobu İmkanları, Erasmus optik görüntüleme Merkezi parçasıdır ve personel İKT Hizmetleri için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada hibe DDHK 2000-2224 "Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek", "Vereniging Trustfonds" Erasmus Üniversitesi Rotterdam ve Hollanda Kanser Derneği tarafından desteklenen ve biz onların cömert bağış komisyonlarında üye teşekkür.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
| PBS | |||
| Window frames | Costum made | ||
| Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
| Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
| Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
| Eye ointment | |||
| Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
| Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
| insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
| Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
| Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
| Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
| Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
| Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
| 0.9% NaCl | |||
| Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
| Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
| Window holder | Costum made | ||
| tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
| Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
| Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
| LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
| LAS AF Software | Leica |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14, 406-418 (2014).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), pdb prot5452 (2010).
- Palmer, G. M., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters. Nat. Protocols. 6, 1355-1366 (2011).
- Seynhaeve, A. L., et al. Tumor necrosis factor alpha mediates homogeneous distribution of liposomes in murine melanoma that contributes to a better tumor response. Cancer Res. 67, 9455-9462 (2007).
- Schiffelers, R. M., et al. Ligand-targeted liposomes directed against pathological vasculature. J Liposome Res. 12, 129-135 (2002).
- Straetemans, T., et al. T-cell receptor gene therapy in human melanoma-bearing immune-deficient mice: human but not mouse T cells recapitulate outcome of clinical studies. Hum Gene Ther. 23, 187-201 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- van Haperen, R., et al. Functional expression of endothelial nitric oxide synthase fused to green fluorescent protein in transgenic mice. Am J Pathol. 163, 1677-1686 (2003).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Manzoor, A. A., et al. Overcoming limitations in nanoparticle drug delivery: triggered, intravascular release to improve drug penetration into tumors. Cancer Res. 72, 5566-5575 (2012).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5, 1518-1534 (2010).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. , e50546 (2013).
- Hobbs, S. K., et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4607-4612 (1998).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Koning, G. A., Eggermont, A. M., Lindner, L. H., Hagen, ten, L, T. Hyperthermia and thermosensitive liposomes for improved delivery of chemotherapeutic drugs to solid tumors. Pharm Res. 27, 1750-1754 (2010).
- Seynhaeve, A. L., Eggermont, A. M., ten Hagen, T. L. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 13, 3034-3045 (2008).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109, 442-448 (2004).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., ten Hagen, L. T. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16, 667-674 (2005).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Bergers, G., Benjamin, L. E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat Rev Cancer. 3, 401-410 (2003).
- Eilken, H. M., Adams, R. H. Dynamics of endothelial cell behavior in sprouting angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22, 617-625 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. , e50088 (2013).
- van Vliet, M., et al. MR angiography of tumor-related vasculature: from the clinic to the micro-environment. Radiographics. 25, Suppl 1. S85-S97 (2005).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic thermosensitive liposomes: a novel dual targeted heat-triggered drug delivery approach for endothelial and tumor cells. Nano Lett. 13, 2324-2331 (2013).
- Li, L., et al. Improved intratumoral nanoparticle extravasation and penetration by mild hyperthermia. J Control Release. 167, 130-137 (2013).
