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自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

Published: January 18, 2017 doi: 10.3791/55119
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 4, 3, 5, 6, 1, 4, 1,7, 1
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

我々は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）ベースの読み出しを用いてタンパク質相互作用をアッセイするための自動化された蛍光寿命イメージング（FLIM）を利用するオープンソースの高含有量分析（HCA）装置を提示します。このopenFLIM-HCAの楽器のためのデータ取得がマイクロマネージャーとデータ分析で書かれたソフトウェアによって制御されFLIMfitで行われています。

Introduction

アッセイ化合物ライブラリーへの薬物の発見1で自動化された高含有量分析（HCA）の使用の増加は、siRNAライブラリーの表現型スクリーン用の系統的な研究、 例えば 、のための自動化された画像化実験に向けた生命科学基礎研究の動向によって補完されます。自動化されたHCAはまた、典型的には、従来の顕微鏡で画像化した細胞の料理の数十と手動の実験で実施されてきた小規模な生物学的研究のためにますます重要になってきています。視野数百〜数千をアッセイし、分析する能力によって付与される統計的検出力は、オペレータバイアスを排除し、しばしば助けることができる画像データ取得と大量のサンプルアレイの分析の自動化（「生物学的ノイズ」を含む）は、実験ノイズの平均化を可能にしますこのような収集中IRFのプロファイルの変化として系統誤差の発生を検出するために利用することができます。蛍光ベースのアッセイ広く市販されているほとんどのHCA計装相対的分布と標識されたタンパク質の共局在をマッピングするために、1つ以上のスペクトルチャネルに蛍光強度イメージングをフィーチャーして、HCAに実装されています。それらは、タンパク質相互作用、例えば 、強力な定量的な読み出しを、提供しているが、このような蛍光寿命イメージング（FLIM）、偏光異方性画像と時間分解蛍光異方性イメージングなど、より洗練された蛍光イメージングモダリティは、広く市販HCA機器に利用されません。ここでは、HCAのための自動顕微鏡でFLIMを実装するオープンソースのアプローチを提示します。

蛍光寿命は、励起/検出効率、およびscatteの影響により、異なる分子種を区別するため、またはフルオロフォアの局所分子環境を探索するために使用することができ、本質的に比例分光読み出しを提供し、フルオロフォアの濃度に非感受性でありますリングとサンプル吸収2。蛍光寿命測定は、単一のスペクトル・チャネルにすることができるのでさらに、彼らは、キャリブレーションなしで異なる機器とサンプルとの間の直接比較です。これらは、生物学的プロセス及び病態の本質的な読み出しを提供するために、いくつかの細胞代謝産物、脂質、および細胞外マトリックス成分を含む内因性蛍光団に適用することができます。こうしてラベルフリーFLIMセル3,4内の代謝変化をマッピングすることができ、幹細胞の分化5,6およびコラーゲン足場7の成長を監視するために適用されています。我々は最近、FLIM HCAは、自己蛍光8を利用して細胞代謝の自動ラベルフリーアッセイに使用することができることを実証しました。しかし、より一般的には、蛍光寿命測定及びFLIMはしばしばantibodieに結合された色素を使用して、細胞コンパートメントを染色する色素を使用して実装、特定の生体分子を標識する外因性蛍光団に適用されます特定のタンパク質に結合された遺伝的に発現し、フルオロフォアを使用して固定された細胞内の特定のタンパク質を標的、またはs。蛍光寿命は、その物理的または化学的環境を感知する蛍光プローブの強固な定量的読み出しを提供するために使用することができます。例については、染料は、細胞膜9または細胞粘度10の局所脂質相を感知するために配備されており、遺伝的に発現した蛍光タンパク質ベースのバイオセンサーはIP3 11、PIP2 12およびカルパイン13として含むまたはシグナル伝達分子の細胞濃度を報告するために開発されています例えば、カルシウム14,15、カリウム16と塩化17とイオン。

多くのこのようなバイオセンサは、バイオセンサの配座の変化の読み出しを提供するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）18,19を利用します 。 「ドナー」および「アクセプター」フルオロフォア間のFRETが近距離直接双極子 - 双極子相互作用を介して起こりますそのためにフルオロフォアは、典型的には約10ナノメートル未満で分離されています。したがってFRETの検出は、適切に標識されたタンパク質の近接を示し、したがって、結合またはオリゴマーなどのタンパク質-タンパク質相互作用20を読み出すための手段を提供する-のいずれかの生の経時変化の測定で固定された細胞又は動的イベントにおけるエンドポイントとして細胞。または切断- -ドナーおよびアクセプターフルオロフォアの両方を有する適切な分子構築物を標識することにより、そのコンフォメーション変化を読み出すことも可能であるFRETの変化を介して、構築物、これは、多くのバイオセンサ21の基礎です。 FRET効率の測定は、ドナー - アクセプター距離とFRETを受けたドナーフルオロフォアの人口割合に関する情報を提供することができます。したがって、FRETベースのイメージング技術は、細胞シグナル伝達は、22を処理し解明するために、例えば 、空間及び時間における分子相互作用をマッピングし、定量するために使用することができます。オートマットるこのようなイメージング技術は、経路またはシグナル伝達ネットワークの読み出しに基づいて、ハイスループットアッセイを提供することができます。

HCAでは、最も一般的に実装されたFRET読み出しは、ドナー強度に対する受容体の比率の変化がマッピングされているスペクトルのレシオメトリックイメージング、です。このアプローチは容易に実装されているが-と多くの市販のマルチウェルプレートリーダーで利用可能です-定量的スペクトル分解FRET測定は、システム23のスペクトル応答のキャリブレーションを必要とします。これは、スペクトルアクセプターのブリードスルーと直接励起だけでなく、機器およびサンプル（インナーフィルター効果）の伝送特性に起因するスペクトルのクロストークが含まれています。原則的に、これは、いずれかのドナーのみまたはアクセプタのみで標識されている追加の「コントロール」サンプルの測定を伴います。

このようなスペクトルレシオメトリックFRET測定から、 効果的なFRET効率（実際のFRET効率とFRETingドナー/アクセプター分子の画分の生成物）は、ドナーとアクセプター分子24の相対的な割合と共に得ることができます。スペクトルレシオメトリックFRETは、しばしば、ドナー/アクセプターの化学量論は、既知であると仮定することができる単分子FRETバイオセンサーと共に使用されます。用量応答曲線を得るために、 例えば 、FRETingドナーおよびアクセプターの集団の画分を決定するために、実際のFRET効率の知識が必要とされます。これは、既知の特性を有する正のFRETの対照試料を測定することによって、またはそのような受容退色またはFLIMように、FRET効率を測定するための別の方法を使用することによって得ることができます。

蛍光寿命の読み出しを使用して、FRETが検出され、単独のドナー発光の測定によって定量化することができる - スペクトル較正さらに対照試料の必要性を除去します。したがって、FLIM FRETの読み出しは、機器間で比較することができます異なるサンプル間-ライブ疾患モデルの内視鏡検査またはトモグラフィー25からのデータは、細胞ベースのアッセイの測定に対してベンチマークすることを可能にします。 FRETing非FRETingドナー集団、FRET効率および集団の画分に応じた適切な多指数減衰モデルにドナー蛍光の減衰プロファイルを適合させることによって、原理的には、さらなる測定することなく直接得ることができます。これらの重要な利点は、しかし、スペクトル分解強度イメージングよりピクセルあたりより多く検出された光子を必要とFLIMのコストで来る - 通常、光子の数百人は、単一指数減衰モデルとするときにフィットする際に10％の生涯決意の精度を達成するために必要とされます複雑な（多指数減衰）モデルへのフィッティング蛍光減衰プロファイルは、検出された光子の数は数千人に増加を必要としました。これは、従来のviのフィールド当たりの秒の数百に長い取得時間（数十につながっていますEW）FLIMのために、時間を用いて、特にときにレーザ走査型顕微鏡で順次画素獲得で実装単一光子計数（TCSPC）の相関。より高い励起強度を用いて画像形成速度を増加させる試みは、有意な光退色および/または毒性をもたらすことができます。一緒に適切な商業的に利用可能な機器やソフトウェアツールの欠如で、これは、創薬や数百ビューのフィールドの数千には、撮像されるべきであるシステム生物学のためのHCAで利用されることからFLIMを妨げてきました。レーザ走査TCSPC FLIMは、それが共有するレシオメトリックイメージング28のスペクトルと同様、撮像速度に到達することができ、定常状態の偏光分解蛍光異方性画像27で「ヒット」の識別に続く第二の測定のための自動化されたマルチウェルプレート、顕微鏡26に実装されています多くの利点と欠点。蛍光異方性の画像化は、減少を利用しますFRETの存在下でのアクセプターの蛍光異方性でもクロストーク（アクセプターの例えば、直接励起）スペクトルに敏感です。これは、偏光クロストークを考慮してキャリブレーションを必要としFRET効率の直接測定を提供していません。

HCAのためのFLIMの利点を実現するために、我々は、画像取得のスピードと技術へのより広いアクセスの問題に対処するために取り組んできました。ここでは、模範FRETベースのアッセイと一緒に、以下に記載されている自動化された迅速なFLIMマルチウェルプレートリーダーを実装するために利用することができるオープンソースのソフトウェアとハ​​ードウェアコンポーネントの完全なリストを提供します。我々のアプローチ29では、FLIMは起因するシングルビーム走査TCSPCより速いイメージング速度及び低い光退色を提供することができ、図1に示されているゲーティング光学イメージインテンシファイア（GOI）を用いて広視野時間依存性画像化を使用して実現されています並列ピクセルINTERRogation。私たちのopenFLIM-HCAの機器は、（サンプルの明るさに応じて）ピクセルあたり数百の光子を検出FLIMデータを取得するだけで数秒を必要とする、教師なしFLIMを提供することができます。 、ビューの前のフィールドからのサンプルを移動するために、取得の設定を調整し、焦点に試料を維持するのに必要な時間と組み合わせて、これは、典型的には、図25,28の視野あたり〜10秒のマルチウェルプレートの捕捉時間をもたらします。光学的切片は、準広視野ニプコー（「回転ディスク」）スキャナ30を使用して実施することができます。

FLIMデータ分析のために、我々は急速に従来のPCワークステーション上のマルチウェルプレートのFLIMデータセットを分析することができ、プラグインOMERO 32のためであるFLIMfit 31と呼ばれるオープンソースのソフトウェアツールを開発しました。 FLIMfitは Oで複雑なモデルに適合させるためにFLIMデータを有効にする（1.2節で説明）グローバル解析機能を提供しますしたがって、必要な検出された光子の数、サンプル画像取得時間の光曝露を低減する、蛍光寿命成分が画像または関心領域（ROI）を横切って不変であると仮定して画素当たり数100の光子をNLY。標準的なデスクトップPC上でFLIMfitを実行している、のFOVの数百人を含むデータセットを分析するために計算時間の秒だけ10秒を必要とします。したがって、FLIMデータ収集と分析の両方は、HCAのための実用的な時間スケールで行うことができます。

openFLIM-HCAのハードウェア

FLIMのHCAの当社の実装では、6つの主要なコンポーネントを含む：（ⅰ）光学オートフォーカス機能付き蛍光顕微鏡のフレームと、 （ⅱ）電動（XYZ）顕微鏡ステージ。 （iii）の励起用レーザ光源。 （iv）のゲート付き光学増圧器（GOI）、遅延発生器とカメラと広視野時間ゲートFLIMシステム。 （V）データ収集及び分析および（VI）ニポウディスクスキャナ用コンピュータ光学的切片イメージングのためのユニットは、フォーカスライトの外に抑制することができます。カバースリップまたは培養培地から細胞質の蛍光または背景からの寄与によって圧倒され得る細胞原形質膜におけるFRETバイオセンサーから、 例えば、弱い信号を撮像する際に重要であり得ます。時間ゲートFLIMデータは、超短パルス励起放射線で試料を照射GOIの光電陰極に蛍光発光を撮像し、時間遅延の設定範囲のGOIの蛍光体のCCDの一連の画像を取得することによって取得されます励起パルスの到着後の光増倍ゲート。励起後の時間ゲート遅延が増加するにつれて、蛍光シグナルが減少するように見られ、CCDで取得された時間ゲート蛍光強度の一連の画像は、視野内のすべてのフルオロフォアの減衰プロファイルを分析するために必要なデータセットを形成します。 GOIのゲーティングは、励起パルスに同期されますそして、CCDの取得の一連のため、励起パルスの時間ゲートの相対的な遅延は、所望の範囲にわたって値を増加させる一連に設定されています。この同期は「高速遅延ボックス」（1ピコ秒刻みで20ナノ秒に遅延を提供する）と、25ピコ秒の最小ステップで遅延を提供する「粗遅延ボックス」を含む遅延発生器を使用して達成されます。

FLIMのために、励起は任意の超高速レーザーによって提供することができます。便宜のために、我々は、典型的には、適切な励起放射線が異なるバンドパスフィルタを用いて電動フィルタホイールを使用して、任意のフルオロフォアのために選択することが可能な可視スペクトルにわたってピコ秒パルスの可変を提供するファイバレーザ励起スーパコンティニューム光源を使用します。一般的に、我々は40または60 MHzの繰り返し率でパルスをサンプルで〜100-200μWの平均電力を使用します。このような励起パワーはまた、周波数倍増に基づいて、超高速レーザ源によって提供することができますモードロックチタンドープサファイアレーザー。 〜100 psの下の励起パルスの持続時間は、ほとんどの実験のために十分であることに注意してください。中性密度フィルターを備えた第二電動フィルタホイールは、励起強度を調節するために使用されます。安全性と利便性のために、励起放射線は、シングルモード光ファイバを介して送達されてもよいです。広視野FLIMおよび光学切片FLIMのための構成は、それぞれ図2及び3に示されています。使用される正確なコンポーネントの詳細については、openFLIM-HCAのwiki 33を参照してください。現在のパーツリストのコピーは、補足資料に記載されています。

広視野FLIMのため、励起放射線はできるだけ均一に全視野を照明するために必要とされます。このために我々はDIFの面で、時間平均に10から50 Hzでレーザースペックルを回転させて、ホログラフィック「トップハット」の拡散に励起レーザビームを向けます定着器は、顕微鏡対物レンズの後焦点面に結像されます。顕微鏡の出力ポートからの蛍光像を冷却科学CCD（チップサイズ10.2ミリメートル×8.3 mm）で、センサ上に結像されるGOIの光電陰極と、GOI（活性領域の対角線18 mm）での蛍光体の上に中継されます0.7の倍率を提供するカメラレンズのペアを使用して、カメラ。システムは、RS232プロトコルを使用して計測器にインターフェースされている標準的なPCによって制御されます。また、Arduinoのマイクロプロセッサは、CCDカメラはFLIMデータを取得し、スペクトル的にフィルタリングさスーパーコンティニュームの平均電力を測定するために使用されるフォトダイオードからの信号を記録する場合を除いて閉鎖される励起光路中にシャッターを制御するために使用され励起源。光学切片化FLIMは、励起レーザ放射は、Sとして、ニポウディスクスキャナユニットに直接接続され、シングルモード偏波保持光ファイバに結合されています図3にhown。ニプコースキャナ部から出力蛍光画像は、GOIの光電陰極上に中継され、システムの残りの部分は、広視野FLIMの場合と同じです。

openFLIM-HCAソフトウェア

データ収集ソフトウェアは、 マイクロマネージャー 34に書き込まれます。これは、自動的に測定中の焦点を維持し、励起および発光フィルターホイールおよびダイクロイックチェンジャを制御するために、任意のFOVのタイムコースを取得するために、プレートのウェルを画像化される順序を変更するオプションを含む完全HCAデータ取得機能を提供します自動化された多色画像化のために。強度に基づいて、 例えば 、自動的に基準に従って後続のFLIMの取得に適しのFOVの位置を特定し、記録するために、蛍光強度の「プレスキャン」取得を実行することも可能です。 FLIM HCAデータはシリーズとして保存することができますTIFFファイルの、OME-TIFFファイル（ すなわち 、FOVあたり1）のシリーズとして、またはマルチウェルプレートから全てのデータを組み込んで、単一のOME-TIFFファイルとして。さらに詳しい情報やマイクロマネージャーソフトウェアの詳細な説明はopenFLIM-HCAのwiki 33で見つけることができます。

データ解析ソフトウェアは、OMERO画像データ管理プラットフォーム32のために、オープンソースMATLABベースのクライアントを31 FLIMfit、 図4に示すように、OMEROサーバから、またはコンピュータディスクからFLIMデータを読み取ることができます。 TCSPCまたは広視野時間ゲートFLIM機器からのデータを分析するために設計されており、減衰プロファイルを単一指数するフィッティングを含むopenFLIM-HCAからのデータに合うように多くの機能を提供し、このようなモデルを含む指数と高い複雑減衰プロファイルを、倍増するされました偏光分解蛍光減衰プロファイル。また、固定し、時間的に変化するバックグラウンド信号を考慮することができ、UTIができます平安大町測定時空計器応答関数（IRF）またはタイムシフトフル実験IRF測定から決定された量によって、画素毎の基準であってもよいという理想化されたIRFを使用し合うことができます。 IRFと蛍光試料の間でグローバル時間差（T 0）は 、蛍光標準の測定値から決定することができます。バックグラウンドシグナル及びIRFの空間的変動も考慮に入れることができます。 FLIMfitはピクセル単位ベースでFLIMデータを適合させることができるか、複雑な減衰モデルに控えめな（数百）の光子数とFLIMデータのフィッティングを容易にするために、「 グローバルビニング 」または「 グローバルフィッティング"を使用して。

グローバル・ビニングは、複雑な減衰モデルへフィッティング可能にするのに十分な光子数を提供するために、各時点で、ユーザ定義のROI内のピクセルのすべての検出された光子を集約することを伴います。 ROIは、視野全体（FOV）をすることができ、それがd手動ですることができますユーザによってefined、または、画像のセグメンテーションツールを使用して決定することができます。 ROIは、他の画像分割ソフトウェアからFLIMfitにインポートマスクを使用して定義することができます。 FRETの用途では、FRETingとROIにわたって空間的に不変であると仮定され、その後に再適合するために、非FRETingドナー発蛍光団に対応する蛍光寿命の成分を決定するために、二重指数減衰モデルに適合するように、グローバルビニングを使用するのが一般的です各画素におけるFRETingドナー集団の画分を得るために固定され、これらの寿命成分バレスの画素毎の基礎。

グローバルフィッティングは、同時にマルチウェルプレートの実験または蛍光寿命画像の時系列から、 例えば 、寿命部品全体FOV-間または複数のFOVを含むことができるFLIMデータセット全体画素単位FRETingドナー集団の画分をフィッティング伴います。グローバルフィッティングは、空間variatiを利用することができ、かなり多くの計算35のコストではあるが- 、したがって、より信頼性の高い結果-部品の寿命推定に強い制約を提供する世界的なビニングアプローチで失われた画像全体の人口の分画の上。 FLIMfitは急速にだけ32秒を必要とする、例えば、と従来のPCワークステーション上のグローバルフィッティングで394 FOVのそれぞれについて、5つの時間ゲートをそれぞれ含む672×512ピクセルで取得したマルチウェル時間ゲートFLIMデータセットを、マルチウェルプレートのFLIMデータセットを分析することができます二重指数関数的減衰モデル31に適合するようにメモリの2ギガバイトこれは、マルチコアプロセッサとFLIMfitコードに効果的なスケーリングを可能にするために、マルチスレッド並列アルゴリズムを使用して実装分離非線形最小二乗フィッティングアルゴリズムは、メモリ使用量を最小限に抑えるために最適化されている利用することによって達成されました。 図5は FLIMfitのグラフィカル・ユーザ・インタフェースのスナップショットを示していますおよび詳細については、グローバルなフィッティングとグローバルビニングの詳細については、参照31で見つけることができます参照36に与えられたウェブページで見ることができます。

我々のopenFLIM-HCA計測およびソフトウェアを使用してFLIMのHCAのための以下のプロトコールは、FLIMの読み出しと細胞イメージング実験の広い範囲に適合させることができます。一般に、マルチウェルプレートは、実験が検討された条件に加えて、正および負の生物学的コントロールの複製ウェルを含むように設計されるべきであるFRET。ここでは、光学的に区分さFLIMを実行するための具体的な実装について説明FRETは、短いペプチドリンカーによって連結されたmTurquoise蛍光タンパク質と金星の蛍光タンパク質からなる構築物を発現するCos細胞の（ 図3を参照）。ここでmTq32V、mTq17VとmTq5V FRETは（代表的な結果のセクションで説明）を構築する構築一緒に非FRETing mTq5Aで、低、中、高のFRET効率を提供します。これらの構築物と、このプロトコルに従うために必要な他の材料は、物質一覧に記載されています。

Protocol

マルチウェルプレートアレイの作製

  1. トン0の決意を有効にするには、基準測定のために、エタノール中の75μMクマリン6（τ〜2.43ナノ秒）の溶液を調製します。
  2. 6ウェルプレートの4ウェルにシード15万Cos細胞および培養培地中で一晩付着することを可能にする（材料リストを参照してください）。
  3. mTq5A、mTq5V、mTq17VとmTq32Vは24時間、メーカーの指示や文化に応じて商用トランスフェクション試薬を用いて各ウェル1をトランスフェクト。
  4. 製造業者のプロトコールに従って商業トリプシン/ EDTA溶液を用いて細胞を切り離し。
  5. ピペットハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に懸濁させ5,000 Cos細胞は、以前に、ポリ-L-リジンで処理された＃1.5厚ガラス底96マルチウェルプレートのウェルA1-G3のそれぞれにmTq5Aを表します。 mTq5VをウェルA10-G12に井戸A5-G9とmTq32Vに井戸A4-G6、mTq17Vに細胞を発現させるために繰り返します。 空H1（マルチウェルプレートから任意の静的なバックグラウンドの測定を提供するために）十分にしておきます。
  6. HBSSのピペット200μLだけよくH2に（細胞培養培地からのバックグラウンドシグナルの測定を提供します）。
  7. ウェルH3にピペットHBSSで5,000非トランスフェクト細胞（細胞の自己蛍光からのバックグラウンドシグナルの測定を提供します）。
  8. ピペットよくH4（へ75μMのクマリン色素溶液の200μLによる周囲温度の変化や、レーザーやタイミング回路の変動に、 例えば 、マルチウェルプレートの取得中トン 0の任意のバリエーションのチェックを提供します。

2. openFLIM-HCAデータ集録

注：詳細な情報はopenFLIM-HCAのwiki 33で検出されたことができます。

  1. マイクロマネージャーとOpenFLIM-HCAのプラグインを起動します。
  2. 遅延発生器ユニットの特定の組み合わせのための較正ファイルを選択して下のレーザー繰り返し率」FLIM制御：ディレイボックスのキャリブレーションファイル：キャリブレーションファイル」を参照してください。
  3. "：セットベースフォルダファイル」データが下に保存するフォルダを設定します。
  4. 配信光ファイバに結合することは安定しており、カップリング効率は、電力計を用いて送出ファイバを介して伝達される動力を測定することによって最大化されることを確実にするために、励起ビーム光路を確認します。 5％よりも低い変動が許容されます。
  5. GOIトリガーがGOI入力トリガ信号によってトリガオシロスコープ上GOIからモニタ出力信号を表示することにより、安定していることを確認してください。
  6. 750 Vにその利得を設定し、リレーレンズのいずれかを中心に、そのようなことはGOIの光電面を覆うことにより、CCDセンサへのGOI蛍光体のイメージングをチェックGOIカバーものの漏れるによる背景光に疎単一光子イベントの画像（ ）CCDに記録され、可能な限りシャープです。
  7. サンプルことを確認してください視野を均一GOIが飽和しないことを確実にするために十分に低い励起パワー（<1μW）を用いて、このようなカバースリップ上で参照色素溶液の液滴として均一な蛍光試料を撮像して照射されます。
  8. 適切なプレート定義ファイルを選択し、 すなわち、96ウェルプレートのための選択オプション（「 ファイル：ロード・プレートのプロパティ」）。
  9. マイクロマネージャー GUIを使用して、空の位置を選択することにより、顕微鏡のフレームには、ダイクロイックビームスプリッタキューブが存在しないことを確認してください。
  10. 手動で全体の実験のためのGOIで4ナノ秒のゲート幅を選択します。
  11. IRFの画像データを取得：
    1. マイクロマネージャー GUIを使用して、空の位置を選択することにより、ビーム経路には顕微鏡の対物レンズがないことを確認してください。手動でそれが戻っ顕微鏡フレームに任意の反射を最小限に抑えるために、任意のレーザー光のエスケープと角度を防止するために、対物レンズタレット上記アルマイトブラックビームブロックを配置します。
      2. <李>はマイクロマネージャーのGUIを使用して、スピニングニポウディスクから散乱励起光の一部を撮像するが、強度が200のためのシステムを飽和させるのに十分でないことを確認することができるように、CSUX（ 励起、ダイクロイック、エミッション ）でフィルタを設定しますミリ秒のCCD積分時間。これは、光電面に損傷を与える可能性があまりにも多くの光にGOI光電面を露出させないようにすることです。
    2. プログラム可能な高速の遅延ボックスで覆われた遅延の全範囲にわたって検索maxpoint機能を使用してください。表示される出力図をチェックした後、完全IRFプロファイルが速い遅延ボックスのスキャン範囲内になるように前方にボタンを押すことで手動コース遅延ボックスを調整します。
    3. 取得パラメータ（ ニュートラル密度、露出時間、フレーム蓄積 ）ので、CCDは明るい時間ゲートに飽和していないと効果的な積分時間が> 200 msですを調整します。
    4. フル遅延を超える25ピコ秒の設定遅延ステップが鳴りました電子（「FLIMコントロール：高速遅延ボックス：遅延を移入」）。
    5. 「 スナップFLIMイメージ」を押すことにより、IRF画像を取得。
    6. 、変更されていない他のすべてのプロパティを残し、遅延（「 現在の遅延設定（PS）：高速遅延ボックスFLIMコントロール」）の数を減らす、（「 ブロック：：ニュートラル密度光路制御」）、レーザーを遮断することによって、背景画像を取得押して" スナップFLIMイメージ」。
  12. 参照色素データを取得します：
    1. マイクロマネージャー GUIを（ "：ウェルに行く：H4をXYZ制御」）を使用してもH4を選択します。
    2. mTqFPを撮像するためのマイクロマネージャーのGUIで、[フィルタ（励起17分の434 nmで、二色性、エミッション25分の482のnm）を使用。
    3. 高速遅延ボックスの全範囲にわたって検索maxpoint機能を使用し、完全な減衰プロファイルが速い遅延ボックスの遅延範囲内にあるように、粗遅延ボックスを調整します。
    4. 遅延時間を設定"：高速遅延ボックス：現在の遅延設定（PS）FLIM制御」を変更することにより、最大強度のポイントに。 CCDが飽和しないように、取得パラメータ（ ニュートラル密度、露出時間）を調整します。
    5. フル遅延範囲にわたって25ピコ秒の設定遅延ステップ（「FLIMコントロール：高速遅延ボックス：遅延を移入 ）。
    6. 「 スナップFLIMイメージ」を押すことにより、参照色素データを取得します。
    7. 励起レーザを遮断することによって第2の背景のCCDカメラ画像を取得する（2.11.7を参照）
  13. マイクロマネージャー収集ソフトウェアを使用してマルチウェルプレートサンプルのFLIMデータを取得します：
    1. ウェルが画像化されるべきであり、FOVの数はウェルあたりに取得されるように設定し（「セットアップHCAに配列決定取得：XYZ位置」）。
    2. 手動で画像化されるべきサンプルを含む模範FOVを選択します。最適な減光フィルタ、GOIのゲート幅を決定するために、このFOVを使用し、CCDカメラのダイナミックレンジの75％に達するように、カメラの積分時間。
    3. 設定オートフォーカス（「XYZ制御：オートフォーカス」）：プレス「 戻るフォーカス制御のみ」は 、その後、手動で目的の細胞または構造に焦点を当てます。 2000ミクロンと"Enter"キーを押しますと、「 オートフォーカスサーチ範囲」に設定します。オートフォーカス手順を開始するを押して、「 今AF」。オフセット値は、フィールド「FocusOffset（オートフォーカス）」に表示されます。
    4. オートフォーカスシステムの正しい機能を示す、「AFオフセット」に2.13.3で得られたオフセット値を入力し、オフセット値が現在ゼロであることを確認する（「AF今」）を2回オートフォーカス手順を繰り返します。
    5. 遅延ポイントの対数サンプリングを選択するOpenFLIM-HCA収集ソフトウェアに「AutoGate」機能を使用してください。あるいは、これらを手動で選択することができ、参照する参照詳細については、36をレンス。
    6. 収量は、総データ取得時間を希望する値に「 累積フレーム」に設定します。蓄積されたフレームの数を増加させることも増加合計FLIMデータ取得時間を犠牲にFLIMデータの信号対雑音比を増加させます。
    7. 「HCAのシーケンスを開始する」ボタンを押して、マルチウェルプレートのFLIMの取得を実行します。
  14. FLIMデータ取得のために使用されるような同一の取得設定で（2.11.7を参照）励起レーザを遮断することによって、さらに背景CCDカメラ画像を取得します。

3. openFLIM-HCAデータ分析FLIMfitを使用しました

  1. FLIMデータ分析のために、その必要な補助的なファイルが存在するチェック（ すなわち 、IRFと参照色素測定）。
  2. 空のウェル（H1）からデータをロードし、よく含む培養液（H2）と培養液中でよく含む非標識細胞（H3）FLIMfitへ（「 ファイル：FLIMデータのロード 」）をウェルA1-G3で、すなわち 、「ドナーのみ」を発現する細胞からの信号の1％よりも大きい任意のバックグラウンドの寄与があるかどうかをチェックします。
  3. FLIMfit（ "：FLIMデータを読み込みファイル」）に培養液で十分にロードすることによって、時間的に変化する背景（TVB）ファイルを準備します。セクション2.14で取得したカメラの背景データ読み込み（ "背景：ロード・背景」）とFLIMfitオプション " ツール：TVB強度マップの作成 」 を使用TVBを生成します。 TVBについて詳しくは、31を参照して参照してください。
  4. 2.11節で取得したIRFデータをロードすることにより、空間的に変化するIRFシフトマップを準備し、セクション2.11.7で取得したCCDカメラのバックグラウンドを差し引きます。 FLIMfitオプション " ツール：IRFは、地図をシフト作成 」を使用し、空間的に変化するIRFシフトマップを計算します。 IRFの変速マップについての詳細は参考文献[31]を参照してください。
  5. monoexponenを取り付け2.12節で取得した参照色素データへのシャル崩壊。負荷基準色素およびセクション3.4で計算された空間的に変化するIRFマップ、設定フィットパラメータ（「生涯：第経験：1 "）フィットパラメータとしてトンで0セット（「寿命：FIT IRFシフト：フィット」）。得られたT 0の値は、「 パラメータ 」タブに示される表に報告されています。
  6. セクション3.4で計算された空間的に変化するIRF地図、セクション2.14で取得したカメラの背景、得られたT 0の負の値に3.3節と型で製造さTVBファイル、セクション2.13で取得した実験FLIMデータをロードすることにより、FLIMデータを分析セクション3.5で（「IRF：IRFシフト：トン0 "）。その後、実験の要件に応じてFLIMfit 36を用いて所望の減衰モデルに実験データをフィット。

Representative Results

openFLIM-HCA計測の機能を説明するために、我々は3模範FRETアプリケーションを提示します。最初の懸念はスティーブン・フォーゲルの研究室38によって開発されたFRETモデル構築物から適応される構造をFRET。彼らは、ドナー蛍光タンパク質（mTurquoise）は5、17、32アミノ酸（mTq5V、mTq17V、mTq32V）の短い制御長さによってアクセプターフルオロフォア（金星）にリンクされている遺伝的に発現可能蛍光一連の構築物を含みます。ドナーおよびアクセプターフルオロフォアとの間の異なるリンカー長は、異なるFRET効率、したがって異なるドナー寿命をもたらします。負の制御を提供するために、わずか5アミノ酸リンカー構築物中のヴィーナスは、アンバーによって置き換えられている- FRETアクセプタ38として機能することはできませんYFP（mTq5A）の非蛍光変異を。私たちは、VECTを消化制限によって、元のpCXVとpC5Aベクトルでセルリアンを置き換えますNheIおよびBglII酵素と連結するmTurquoiseの断片とORSはpmTurquoise-N1ベクターから同じ酵素を用いて消化しました。リンカー領域は、この置換により修飾されていないしました。

図6は模範FLIMは、マルチウェルプレートが3列に配列されたCos細胞で発現し、このモデルシステムを使用してアッセイをFRET提示し、陰性対照でトランスフェクトした細胞の各（列1-3）、5アミノ酸リンカーは、構築FRET （カラム4~6）は、17アミノ酸リンカーは、（列7-9）と32アミノ酸リンカー構築物（カラム10~12）を構築FRET FRET。 H列は、TVB推定のための井戸が含まれています。 図6（A）は 、各ウェル内のビューの一般的な分野の自動的に取得された蛍光寿命画像の例を示しています。陰性対照（列1-3）が最長の寿命を提示することは明らかであるとドナー寿命であることをFRETの最安最短リンカLENで構築しますGTH（列4-6）。 図6（b）は 、平均寿命がマルチウェルプレートを横切って変化各ウェル内のすべてのFOVにわたって平均方法を示しています。 図6（c）及び（d）はそれぞれmTq5AとmTq17VのFOVのための例示的なドナー蛍光強度マージ寿命のマップを示します 。 図6（e）は、ドナー蛍光強度の減衰プロファイルが一緒に単一指数減衰モデルと（GOIゲート幅によって支配されている）IRFにフィットして、A1ウェル内の撮像されたすべてのセルにわたって平均を示しています。 図6（f）は 、画素ごとの単一指数フィットから得られたマルチウェルプレートの各列の平均蛍光寿命を提示します。平均寿命及び標準偏差（STD）の表を以下の表1に見出すことができます。 図6に示した画像のためのデータ取得が取得するのに約160分を要しました。分析は、10コアと64 Gで2.6 GHzのコンピュータに92秒を要しましたRAMのB。

第二の例示的なアッセイは、このプロセス25,42の阻害剤を試験するための手段として、HIV-1ビリオンの組み立て中にHIV-1のGagのオリゴマー化を読み出すためのFLIM、FRETのアプリケーションを示しています。それは、未成熟HIV-1ビリオンに類似しているウイルス様粒子（VLP）の形成をもたらすために適切な宿主細胞中で発現するHIV-1のGagはHIV-1のライフサイクルのこの段階のためのモデル系を提供します。このアッセイのために、我々はHIV-1 Gagタンパク質は、HeLa細胞におけるCFPと融合およびGagオリゴマー形成から生じFRET信号への影響を介して、異なる阻害剤の作用を比較した発現しました。使用される阻害剤の詳細は、参照42に設けられています。

サンプル調製と実験測定の詳細については、我々はBOを読み出すFLIMを使用することができることを実証した参照25に包括的に記載されていますCFPとYFPとで確率的に標識し、また、CFPで標識された唯一のギャグを発現する細胞においてhomoFRET Gagタンパク質を集約する間番目heteroFRET。 homoFRETは通常、ドナー寿命の変化を提示していませんが、それは、フルオロフォアは、異なる平均蛍光寿命40,41と二つの異性体で存在しているCFPの特別な場合のために行います。 CFPホモFRETの読み出しはCFP / YFPヘテロFRETと比較して単純化試料調製の利点を有する多重FRETの読み出しのために重要である可能性があり、効率的な複数のスペクトルです。

私たちの前の仕事は、N-ミリストイル（NMT）の存在下でギャグのオリゴマー化をアッセイするFLIM、FRETを適用阻害剤42。この阻害剤は、原形質膜に結合することがギャグ蛋白質を可能にする、ギャグにミリスチン酸の添加を担う内因性酵素を破壊し、HIVビリオンの形成における前提条件43ですか、VLPは。我々は両方のheteroFRETとhomoFRET読み出しは、NMTの阻害剤との用量反応試験で> 0.6のZ 'を達成することができることを示しました。 > 0.5 - Z 'はZでアッセイの質を示すために製薬業界で使用されるパラメータであり、アッセイの品質の単一値のメトリックを生成するために、陽性および陰性対照の平均値及びそれらの相対的な広がりの差を表し、'製薬アッセイ44は、「優れた」とみなされています。我々は、この優れた性能は、平均ドナー寿命の変化は、300ピコ秒のオーダーであったためにサンプルを用いて達成されたことに注意してください - はるかに小さい用いて実現することが有益な読み出しを可能にする、多数の細胞のためのFLIMデータを分析する統計的な力を発揮します手動顕微鏡実験で撮像された細胞の代表的な数で可能であるよりも、蛍光寿命の変化。

ここでは、マルチウェルプレートのFLIMは、HIVのGagオリゴマー化のため4阻害化合物（指定ICL13、ICL14、ICL15＆ICL16）を比較したデータは、FRET提示します。この実験では、我々は、一過性のGag-CFPプラスミドでトランスフェクトしたHeLa細胞とhomoFRET読み出しを利用します。各阻害剤の9つの異なる投与量の合計は、条件ごとに2つの反復ウェルを可能にする、参照32で概説した標準プロトコルに従って適用しました。ポジティブコントロールとして、カラム1は、マイア・ギャグ、のVLPを形成し、トータルの阻害をシミュレートすることはできませんミ​​リスチン酸部分を欠く突然変異したGagタンパク質を発現する細胞を提供します。ネガティブコントロールは、唯一の他の列（列11）で阻害剤を送達するために使用されるだけで、車両とギャグ-CFPを発現している細胞を投与することにより提供されました。 8 FOVの合計は、ウェル当たり取得しました。

データは、画素毎に単一指数減衰モデルと蛍光寿命PLATを取り付けました（ビューの8つのフィールドを横切る強度閾値以上のすべてのピクセルを超える）ウェルあたりの平均寿命を示す電子マップは、（a）は、図7に以下に示されています。 図7（b）は、阻害剤濃度の関数としての蛍光寿命の対応するプロットを示します。ギャグ-CFPを発現している細胞とインキュベートしたときの阻害剤のうち3つは阻害作用（ICL13、ICL15＆ICL16）を示します。 One阻害剤（ICL14）は、試験したいずれの用量では効果を示しません。このプレートのために計算されたZ 'は0.51でした。正および負の対照について得られた値を100μM、0.1 nmで、黒の点として、図7（b）の上に示されています。

図示 ICL13、ICL15とICL16についての用量応答曲線を図7（b）その後に固定された最大及び最小の寿命を有する1 45に固定されたヒル係数で4パラメータロジスティック非線形回帰モデルにフィットさせましたポジティブ（列1）と負（列11）から得られた値をそれぞれ制御します。 3つの曲線のために返されたIC 50値は、あった：それぞれ38 nMで、24 nmおよびICL13、ICL15とICL16のための116 nMで。細胞内FLIMを経て得られたIC 50値との比較のための測定をFRET、我々は以前に報告された生化学的な酵素アッセイ42における組換えヒトNMT1の酵素活性の阻害についてのIC 50を決定しました 。 FLIM FRETによって活性であることが判明した3つの化合物は、有意な応答を示さなかったICL14、で、また（IC 17 nMで50値、51 nMの、とICL13、ICL15とICL16のための39 nMで、それぞれ）このアッセイにおいて最も活性でありますFLIM FRETアッセイにおいて、 約ありますNMT1（1700 nMでのIC 50）に対する活性が低い100倍。活性化合物については、これらの独立したアッセイ様式を経て得られたIC 50値がdに起因するようマイナーなバリエーションで、著しく類似しています取り込みまたは細胞における化合物の代謝にifferences。

この小さな研究では、同一の関心対象に作用する種々の化合物の効力を判別するFLIM HCAの能力を強調しています。我々は、複数の用量反応曲線を生成するために、高含量のコンテキストで自動FLIMを用いて、画面の最初の実証であり、スクリーニングおよび/または有用な治療用化合物を特徴付けるために適用されるFLIMの可能性を示していると考えています。

第三の模範FLIM FRET実験は、cAMPに特異的に結合するRAP-1グアニン交換因子である環状アデノシン一リン酸（cAMP（EPAC））によって活性化Exchangeのタンパク質のための遺伝的に発現したFRETバイオセンサーに関する。このEPAC FRETバイオセンサー（EPAC-S H188）は、ドナーフルオロフォアとしてmTurquoise2蛍光タンパク質（mTq2FP）を利用し、共同を実現するために、2つの金星-FPを組み込んアクセプター46を mposite。 cAMPは遍在セカンドメッセンジャーであり、多くの異なる生物全体に細胞内プロセスの過多に関与しています。これは、細胞膜におけるATPの変換からのアデニル酸シクラーゼによって合成されます。ここでは、読み出しおよびフォルスコリン、cAMPの細胞内産生をアップレギュレートし、したがって、その細胞質濃度を増加アデニル酸シクラーゼ活性化剤を添加した後の生HEK293T細胞でその活性を定量化する当社の能力を実証します。 cAMPバイオセンサーの開口部につながるように、このEPACセンサは、その不活性化（結合していない）状態でのFRETとcAMP濃度とのドナー寿命は増加を受けます。 mTq2FPのモノ指数関数的減衰プロファイルは、CFPベースのバイオセンサー45より定量的な寿命解析のために、このバイオセンサは、より良い適しています。 図8は、我々は変化をプロットしている自動化されたマルチウェルプレートのFLIM顕微鏡を用いて記録された時間経過の一例を示しています平均寿命および100μMのフォルスコリンを添加した後の経時FRETingドナー人口割合の変化インチ簡単にするために、我々は、全信号を時系列の両端の二重指数関数的減衰プロファイルを適合させることにより得られた単一指数FRETing非FRETingドナーおよび活性化EPAC FRETバイオセンサーの集団の画分を混合することによって説明することができると仮定する。

cAMPのデータ集録（EPAC）5ゲート遅延のために、4000 PSのゲート幅で、1300 PS、4300 PS（ピーク強度）、4919 PS、6656 PS、8035 PS、1に設定された遅延時間に選ばれました0391 PSおよび16000 psの。各遅延のため、カメラの積分時間は250ミリ秒でした。 1つのウェルでは、我々は10分かけて10秒毎に取得された画像でFLIMの時間経過を獲得しました。フォルスコリンの添加は、その試料の焦点位置の小さなシフトを引き起こし、ので、時間120秒及び130秒で取得されたデータポイントを除去しましたこれらの時点でFLIMの買収時に記録された蛍光強度の電子。

データ分析のために画像がFLIMfitにロードし、細胞ごとにセグメント化されました。蛍光寿命データは、参照色素（75μMクマリン6）から得られたIRF固定T 0値を用いて、二重指数減衰モデルに適合させました。ドナー蛍光寿命は、すべてのセルは、 図8（A）に示される平均化を意味します。 図8（b）は 、同じ二重指数減衰モデルに同じFLIMデータを当てはめることによって計算時間をかけてFRETing人口割合の変化を示しています

式（1）

ここで、βは FRETingドナー画分です。我々はFRETingと非FRETing elemeの混合物を仮定しますフォルスコリンを添加する前の時点のためのNTS。これらの寿命を得るためには、二重指数フィットは、非FRETingドナーのためのτ1 = 3964±21 psの、およびFRETingドナーのためのτ2 = 3022±27 psのの寿命を与える最初の3つの時点に適用しました。これらは、各時点でβ値を取得するように設定全データの後続の適合のために固定しました。

要約すると、我々は3つの実験サンプルのための模範FLIM HCA結果を提示しています。最初は、FRETが金星FP受容体またはアンバーはペプチドリンカーの長さを変化させることによって構築する非蛍光のいずれかにリンクされているmTqFP供与体を含む構築物を発現するCos細胞に配列された96ウェルプレートでした。リンカーの長さ、FRET効率の変化、したがってドナー寿命は明白であり、各構成物の平均寿命の標準偏差未満で36ピコ秒でした。第二の模範ASSAyは％阻害がCFPで標識Gagタンパク質を発現するHeLa細胞で測定された阻害剤濃度の平均ドナー蛍光寿命の変化量から計算されたためにHIV Gagタンパク質のミリストイル化のための4つの潜在的な阻害剤の「画面」でした。この読み出しは、通常、ドナー寿命の変化を提示するが、これは異なる蛍光寿命を持つ複数の異性体で存在しているため、CFPのためにしないだろうhomoFRET、に基づいています。これは、多重の異なるFRETの読み出し25、例えば 、スペクトル効率の点で有用であることができます。第三の模範アッセイは、cAMP FRETバイオセンサー、EPACを発現している生きたHEK293T細胞を監視する時間経過でした。これは、フォルスコリンとライブセルイメージングに見合っている検出された光子の数と二重指数減衰モデルを使用してFLIMfitのアプリケーションで処理した後の予想される応答を示した-私たちは以前にLIBRA FRET biosenで示したようにIP3 47のためのSOR。

図1
ゲートされた光イメージインテンシファイア（GOI）を使用して、広視野時間ゲートFLIMの図1の回路図。左側は、実験系の概略図を示します。右上、励起パルスの概略、時間ゲート画像の位置およびデータへの単一指数フィット。実験系に示す二つの物体からの蛍光減衰を示す右下、漫画。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
ゲーテッド光学イメージインテンシファイア（GOI）を使用して、広視野openFLIM-HCAの図2.回路図。のより詳細な説明については本文を参照システムコンポーネント。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
ニポーディスクスキャナ部でゲート光イメージインテンシファイア（GOI）を使用して光学的に区分さopenFLIM-HCAの図3の回路図。システム構成要素のより詳細な説明については本文を参照。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
分析のためのOMEROサーバやコンピュータのディスクへとFLIMfitにマネージャー取得プログラムからの画像データの流れを図4の回路図。データフローは、トップリットルで開始します生画像データは、μ-Managerの取得ソフトウェアで取得したEFTコーナー。外のものは、データ取得およびストレージに対応しながら、破線のボックス内の項目は、FLIMデータ分析の段階を表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
FLIMfitユーザインタフェースの図5.スクリーンショット。左上、ビューのフィールドのリストには、現在ロードされ、ビューの現在選択されているフィールドの蛍光強度画像。左下、フィッティングモデルとフィッティング条件を選択します。データに適合右上、関心の電流領域（青丸）用の蛍光減衰、（赤線）、IRF以下フィットの残差（青線）と（赤点線）。g5large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
FRETモデルの図6.マルチウェルプレートFLIMはmTq5V、mTq17Vを構築し、mTq32VはCos細胞で発現させました。本文で説明したように、（A）は、異なるFRETの構築のために、各ウェル中のFOVの例示的な蛍光寿命画像は、COS細胞で発現しました。 （b）の平均金星の蛍光寿命のヒートマップは、各ウェル内のすべてのセルにわたって平均しました。 mTurquoiseアンバーの（c）の強度画像は、寿命マップ（スケールバーは20μm）を重ね。 mTurquoise金星（17アミノ酸）の（d）の強度画像は、寿命マップ（スケールバーは20μm）を重ね。 （E）mTq5Aの測定された強度の減衰プロファイル（青丸）（陰性対照）を構築蛍光Aウエルに結像すべてのセルにわたって平均1、一緒に単一指数減衰（青実線）とIRF（破線のオレンジ色の線）へのデータのフィット感。 （f）は 、平均寿命のグラフは、ビューのフィールド間の蛍光寿命の標準偏差を示すエラーバーで、マルチウェルプレート全体の各列にわたって平均しました。以下のための（広告）寿命値は、ピコ秒で示された制限に偽カラースケールを使用して表されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7
ギャグ-CFPを発現するHeLa細胞を用いたGagインヒビターの図7模範マルチウェルプレートFLIM画面。 （a）は、カラム1がpositivとしてMYR-GAG-CFPをトランスフェクションした細胞を提示して配列されたマルチウェルプレートウェル当たりの平均ドナー蛍光寿命のヒートマップを阻害用の電子制御、ギャグ-CFPをトランスフェクトした細胞のみ車両にさらされ、および高用量塔2から低用量カラム10の範囲の濃度で4異なる阻害剤の1を投与した井戸を示す点線の色の付いた四角形を提示コラム11 。偽カラースケールは2200ピコ秒から3100ピコ秒までの範囲の平均蛍光寿命を表しています。各エラーバーは、反復ウェル間の標準偏差を示して阻害するため（b）の蛍光寿命をプロットします。横軸の2で黒と-4でのポイントは、それぞれ、それぞれの列1および11から得られた正および負の制御点です。実線は、異なる阻害剤の用量反応曲線をデータにフィットを示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

グレ8 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg "/>
HEK293T細胞を用いたタイムラプス測定でEPAC FRETバイオセンサーを読み出すためのFLIMの図8.模範使用。 （a）の変更は緑色のバーで示されるフォルスコリンの添加後の時間の関数としての蛍光寿命とFRETingドナーの（b）の割合を意味します。エラーバーは、セル当たりの標準誤差を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

まああたり STD ERR まああたり STD ERR
mT5A 4008 32 12 MT17V 3004 26 10
mT5V 2717 35 13 mT32V 3133 30 11

表1の平均寿命とFRET構築物の標準偏差（STD）。

Discussion

我々は、時間ゲートFLIMを用いてHCAために設計された自動化されたマルチウェルプレート、顕微鏡を記載しています。この機器はOMEROサーバーにデータを保存するオプションとFLIMfit 36、MATLABで書かれたオープンソースのプログラムを使用して行われてFLIMデータ分析とマイクロマネージャーで書かれたオープンソースのソフトウェアを使用して制御し、OMEROクライアントとして利用可能な32 マイクロマネージャー楽器れます制御ソフトウェア、openFLIM-HCAは 、自分のFLIMのHCAの楽器を構築するために学術研究者を有効にするには、システムコンポーネント48のリストと33オンラインで入手できます。

ロバストFLIMデータを取得するためには、GOIとCCD取得設定を最適化し、T 0における任意の変化を考慮する必要があります。 3.8.2で説明したように、GOIゲイン設定とCCDカメラの積分時間〜CCDのダイナミックレンジの75％に達するように設定されるべきです。 U各時点でゲート遅延が対雑音比49に信号を増加させるが、これは、より少ない蛍光光子をCCDカメラが飽和する前に、フレームごとに取得しているため、合計FLIM取得時間（とようにフレームの蓄積の数を増加させ、より高いGOI電圧および複数のCCDフレームの蓄積を歌います増加させるべきである）ので、このトレードオフは、各実験のために決定されるべきです。遅延発生器の較正は、レーザ繰り返し率に依存し、使用される繰り返し率の正しい較正ファイルを取得ソフトウェアにロードされていることを確認する必要があります。遅延ボックスを較正するための手順はopenFLIM-HCAのwiki 33で見つけることができます。

細胞の自己蛍光は、蛍光シグナルと比較して低い場合、我々は、時間的に変化するバックグラウンド（TVB）を提供するために十分に含むだけ培地からの信号を使用します。細胞培養培地からのバックグラウンド蛍光を最小化するために、我々は避けますフェノールレッドを含む培地。細胞の自己蛍光が有意である場合、TVBは、非標識細胞の測定から導出することができます。これは自家蛍光の背景が画像内の画素ごとに同じであることを前提としていたようしかし、この場合には注意が払わなければなりません。自家蛍光が細胞間または励起ビームまたは検出感度が視野にわたって均一でない場合、大幅に変化した場合、この仮定は有効になりません。

散乱励起光パルスを用いIRF画像の取得は、フィッティングプロセスでのデータモデルで畳み込まれている一時的なIRFのプロファイルを提供し、また、視野全体でIRFの空間的変化のマップを提供します。 IRFは、ニポウディスクはIRFのクリーンな測定を提供するから散乱励起光を使用して、我々の機器では、このようなコロイド懸濁液もののとして散乱試料を撮像して測定することができます。タイミングOの正確な決意複雑な指数関数的減衰モデルに当てはめる場合は特に励起と時間ゲートとの間の時間遅延の誤差が大きく、フィッティングプロセスに影響を与える可能性があるため、IRF fが重要です。 IRFは、IRFの空間的変動は、同じであるべきであるが、そのタイミングに影響を与えることができ、それは励起波長ではなく、蛍光発光波長で記録されるので、嵌合プロセスのために必要とされないまさに散乱励起光を用いて取得しました両方の波長で。光学切片化FLIMでニポウディスクから取得したIRFの場合のように加えて、散乱IRFはグローバルに起因散乱物体からの異なる光路長に真IRFに時間的にシフトされてもよいです。 Protocに示すように取得された散乱励起光IRFに適用されるべき必要なグローバル時間的なシフトでこの補正、T 0は 、次指数参照色素データから計算されますオールステップ4.4。下記の染料は、異なる励起波長のために使用することができます：メタノール中の75μMのクマリン153溶液（τ〜4.3ナノ秒50）は範囲295から442 nmの励起のために使用することができます。エタノール中75μMのクマリン6溶液（τ〜2.43ナノ秒37）範囲430から500 nmの励起のために使用することができます。水に75μMローダミンB溶液（τ〜1.7ナノ秒37）範囲488から575 nmの励起のために使用することができます。我々は、システムの各画素に対して異なるIRFを使用するFLIMfitに可能であるが、通常、空間的に変化するIRFは、画像内の画素毎に同じ時間プロファイルを有するが、範囲を示すという仮定を行うことが妥当であることに注意します空間的にグローバルトン0からの相対時間的オフセットを変化させます。私たちは、散乱光のIRFから決定されたIRFの変速マップ、としてこれを記述します。一緒に、IRFプロファイル、 時刻t 0およびIRFシフトマップには専用に使用されていますFOV内の各ピクセルは、適切なIRFが装着されていることを確認してください。それは任意のFLIMデータ収集前に測定されるべきであるので、重要なことに、T 0は、時間の経過とともに徐々に変化することができます。

ユーザーは、蛍光減衰プロファイルをサンプリングする方法を決定する必要があり、励起後の時間ゲートおよびそれらの相対的な遅延の幅を設定する必要があります。一般的には、検出信号を最大にするために、広いゲート幅を使用し、典型的には、我々は、蛍光タンパク質で標識された細胞のFLIM 4ナノ秒に設定し、ゲート幅を使用することが望ましいです。時間ゲート遅延の数は、分析に使用されるフィッティングモデルの複雑さ所与の（単に励起パルス前の信号を測定するように設定つのゲートを含む）蛍光減衰プロファイルをサンプリングするのに十分であるべきです。最適値は、寿命及び減衰成分の相対振幅に依存することができます。一般的には、4ゲートは、フィッティング単一指数のために十分である7以上のゲートがかもしれないが減衰しますより複雑な崩壊モデルに使用されます。

私たちは、FLIMは、時間領域または周波数領域技術の範囲を使用して実装することができ、マルチウェルプレートアレイの自動FLIMのHCAが最初にFRET 51の周波数ドメイン寿命の読み出しを使用して（非切片）広視野顕微鏡で実装されたことに注意してください。広視野時間ゲートイメージング28を利用HCAための最初の自動光学セクショニングFLIMマルチウェルプレートリーダーは次に、報告されました。続いて、広視野（非切片）周波数領域FLIMのHCAは、FRET 52を用いて、遺伝子ライブラリー全体の翻訳後修飾（チロシンリン酸化）をスクリーニングするために適用し、時間ゲートFLIMのHCAは、HIV-1のGagのFRETアッセイするために適用されていますオリゴマー化53およびFOXM1 54のSUMO化のとライチュウのRhoAおよびRac1のバイオセンサー33の。マルチウェルプレートFLIM 26 TCSPCを使用することも可能であるが、今日まで、それはTに一致するように挑戦的証明されています彼は広視野検出を利用した技術のスループット。この問題に対処することができ一新興のアプローチは、SPADアレイ55のような単一の光子計数検出器のアレイを使用することです。

我々は、蛍光タンパク質を用いたFRETのいずれかの読み出しは慎重にとFLIMfitから得られたパラメータまたは任意の他のFLIM解析ソフトウェアの絶対値はフィッティングモデルに関連付けられた仮定に依存することに扱われるべきであることに注意してください。 FRETドナーが重要な第2の減衰成分を有する例については、FRET FLIMデータに合わせてbiexponentialモデルの使用は、典型的には、それが必要以上FRETing集団は高い現れると関連付けられ速い減衰成分の寄与をもたらすことができます。このようなmTq2FPモノ指数寿命のドナーを使用することが望ましいです。それでも、最近の研究は、FRET分析は依然としてアクセプタ蛍光タンパク質またはによって暗い状態により影響され得ることを示しています発色団の角度と距離56の様々な蛍光体の立体構造の分布に方向係数κ2の不均一。それにもかかわらず、我々などがFRETの蛍光寿命の読み出しは、生化学的測定値と相関し、タンパク質相互作用をスクリーニングするために、又はバイオセンサのダイナミクスを追跡するために使用することができる有用な結果を生み出す行うことが示されています。したがって、このopenFLIM HCAプラットフォームは、FRETまたは細胞の自己蛍光8を利用して 、同様に染料ベースのプローブ25の定量的な読み出しを提供する蛍光寿命に基づくアッセイの広い範囲に適用することができます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microscope frame Olympus IX81 http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
optical autofocus Olympus ZDC http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
motorized (x-y-z) microscope stage Marzhauser 00-24-565-0000 Stage with Corvus controlle
excitation laser source Fianium SC400-4 Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
gated optical intensifier  Kentech High Rate Imager (HRI)
delay generators Kentech --- See agile delay generator and precision delay generator
camera Hamamatsu ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit  Yokogawa CSU-X1  http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Top hat diffuser Thorlabs ED1-S20-MD Engineered diffusers
mTq5V  Oxford Genetics P3850 mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker
mTq17V Oxford Genetics P3847 mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker
mTq32V Oxford Genetics P3848 mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker
mTq5A Oxford Genetics P3849 mTurquoise Amber construct
HEK293T --- --- cell type used
phenol red-free HBSS Sigma Aldrich 55021C-1000ML imaging media
culture media DMEM + 10% FBS + 0.5% Antibiotics
DMEM Sigma Aldrich D6046-500ML for culture media
FBS Sigma Aldrich 12003C-500ML for culture media
xTremeGene9 Sigma Aldrich 6.37E+09 for transfection, follow online protocol from La Roche
trypsin/EDTA Solution Thermo Fischer R001100 for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer

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References

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生物物理学、問題119、蛍光顕微鏡、FLIM、HCA、オープンソース、FRET、自動化された顕微鏡検査、薬物の発見
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