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Biology

开源高内涵分析利用自动荧光寿命成像显微镜

doi: 10.3791/55119 Published: January 18, 2017
* These authors contributed equally

Summary

我们目前使用的测定使用荧光共振能量转移(FRET)的读数蛋白质相互作用自动荧光寿命成像(FLIM)一个开源的高内涵分析(HCA)的仪器。此openFLIM-HCA仪数据采集是通过软件写入μManager和数据分析在FLIMfit进行控制。

Introduction

在药物发现1测定化合物库中越来越多地使用自动化的高内涵分析(HCA)是由对自动成像实验的系统研究, 例如 ,用于siRNA库的表型的屏幕在生命科学基础研究的趋势补充。自动HCA也成为了通常被实施与几十用常规显微镜成像细胞的菜肴手动试验规模较小生物学研究越来越重要。通过向测定和分析数百至数千视场的能力赋予的统计力量使实验噪声平均值(包括“生物噪音”)和图像数据的采集和大样本阵列分析的自动化可以帮助消除操作人员的偏见,往往可用于检测的系统误差,例如在采集过程中的IRF轮廓的变化的发生。基于荧光测定在HCA广泛实施,与大多数市售的HCA仪表设有荧光强度成像在一个或多个光谱信道映射的相对分布和标记的蛋白的共定位。更复杂的荧光成像模态,例如荧光寿命成像(FLIM),偏振各向异性成像和时间分辨荧光各向异性成像,没有被广泛利用在商业HCA仪器,虽然它们提供了强大的定量读数, 例如,蛋白质的相互作用。在这里,我们提出了一个开源的方式来为HCA自动化显微镜实现FLIM。

荧光寿命提供了可用于区分不同的分子种类或探测荧光团的局部分子环境是不敏感的荧光团浓度,激励/检测效率固有比例分光读出,并以scatte的冲击环和样品吸收2。此外,由于荧光寿命测量可以在单个光谱信道进行,它们是无需校准不同的仪器和样品之间直接比较。它们可以应用到内源性荧光团,包括一些细胞代谢产物,脂质和细胞外基质组分,以提供生物过程和病理的固有读数。因而无标记FLIM可以映射在细胞3,4-代谢改变和已被应用到监测干细胞分化5,6-和胶原支架7的生长。我们最近证明FLIM HCA可用于利用自发荧光8细胞代谢的自动化无标记测定。更常见的是,然而,荧光寿命测量和FLIM被施加到该标签特定的生物分子的外源荧光团,常常使用染色细胞区室的染料实现,使用染料耦合到antibodieS中的靶在固定的细胞特异性蛋白质,或使用耦合到特定的蛋白质的基因表达的荧光团。荧光寿命可以用于提供荧光探针感测其物理或化学环境的健壮定量读数。对于实施例,染料已部署以检测细胞膜9或细胞粘度10和基因表达的荧光蛋白质为基础的生物传感器的局部脂质相已被开发来报告细胞的浓度的信号分子包括如IP3 11,PIP2 12和钙蛋白酶13或离子如钙14,15,16和氯17。

许多这样的生物传感器利用荧光共振能量转移(FRET)18,19提供生物传感器的构象变化的读数。 “供体”和“受体”荧光团之间的FRET经由短程直接偶极相互作用产生对于其中的荧光团通常由小于约10纳米的分离。因此FRET的检测表明适当标记的蛋白质的紧密接近,因而提供了一种读出蛋白质-蛋白质相互作用20,例如结合或低聚-或者作为在固定的细胞或作为动态事件中的活时间过程的测量结束点细胞。通过标记与供体和受体荧光团的适当的分子构建体,也可以读出构象变化-或者裂解-经由FRET的变化构建体,这是许多生物传感器21的基础。的FRET效率测量可以提供供体 - 受体距离和供体荧光团经历FRET的人口比例的信息。因此,基于FRET的成像技术可以被用于映射和定量在空间和时间, 例如分子间的相互作用以阐明细胞信号处理22。自动售货机ING这种成像技术可以根据信号通路或网络的读数提供高通量检测。

在HCA中,读出FRET最常实行的是光谱成像比例,其中受体供体强度比的变化映射。虽然这种方法很容易实现的-并且可在许多市售的多孔板读取器-定量光谱分辨FRET测量需要系统23的光谱响应的校准。这包括从受的光谱渗出通过与直接激发以及仪器的传输特性和样品(内滤效应)而产生的光谱串扰。原则上,这需要的是标有捐赠者要么只或受体,唯一的额外“对照”样品的测量。

从这种光谱比例的FRET的测量,一个有效的FRET效率(实际的FRET效率和FRETing供体/受体分子的级分的产物)可与供体和受体分子24的相对比例沿来获得。光谱比例的FRET通常与单分子FRET生物传感器,其中可以假设在供体/受体的化学计量被称为使用。为了确定FRETing供体和受体, 例如人口馏分,得到剂量反应曲线,需要的实际的FRET效率知识。这可通过测量与已知特性的正FRET对照样品或通过使用不同的方法来测量FRET效率,如受体漂白或FLIM获得。

使用荧光寿命读数,FRET可以检测和由单独的供体发射的测量量化 - 除去用于频谱校准和进一步对照样品的需要。因此,FLIM FRET读数可以仪器之间进行比较和不同样品之间-从内窥镜或活疾病模型25断层允许数据对基于细胞的试验的测量结果进行基准测试。通过安装供体荧光衰减曲线对应于FRETing和非FRETing捐助人群适当的多指数衰减模型,FRET效率和人口部分,原则上,可以直接而无需进一步测量获得。这些显著优点,但是,来在FLIM的成本,需要每像素多个检测到的光子比光谱分辨强度成像 - 通常数百光子被要求达到10%寿命判定的精度时嵌合于单指数衰减模型而当拟合荧光衰减曲线到复杂的(多指数衰减)模型,需要检测的光子数量增加到数千人。这通常导致长的采集时间(几十到几百秒,每六场EW)为FLIM,使用时间特别是当相关,在激光扫描显微镜顺序像素收购实现单光子计数(TCSPC)。试图通过使用较高的激发强度可以导致显著漂白和/或光毒性,以增加成像速度。与缺乏适当市售仪器和软件工具在一起,这已经从HCA被用于药物发现或系统生物学,其中数百至数千的视场是要被成像受阻FLIM。激光扫描TCSPC FLIM已在自动多孔板显微镜26进行二次测量,下面的“命中”由稳态偏振分辨荧光各向异性成像27,它可以达到类似的成像速度与它共享频谱比例成像28鉴定实施许多的优点和缺点。荧光各向异性成像利用下降在FRET的存在下受体的荧光各向异性和也是频谱串扰( 例如,受体的直接激发)很敏感。它需要校准以考虑偏振串扰并且不提供的FRET效率的直接测量。

为了实现FLIM为HCA的优点,我们已经努力解决图像采集的速度,并以该技术更广泛地获得等问题。在这里,我们提供了可以用于实现自动化的快速FLIM的多孔板是与典范的FRET基的测定法如下所述,一起读取开源软件和硬件组件的完整列表。在我们的方法29,FLIM是用宽视场的时间选通成像使用选通光图像增强器(GOI),其在图1,可以提供由于更快的成像速率和更低的漂白比单光束扫描TCSPC所示实现平行像素INTERRogation。我们openFLIM-HCA仪器可以提供无监督FLIM,只需要几秒钟就可以获取FLIM数据检测每像素几100光子(取决于样品的亮度)。与到样品从视先前场移动,来调整采集设置,并保持在焦点的样品所需要的时间相结合,这通常导致在多孔板采集时间〜10秒每视场25,28。光学切片可使用准宽视场尼普科夫(“旋转的光盘”)扫描器30来实现。

对于FLIM数据的分析,我们已经开发了一种叫做FLIMfit 31的开源软件工具,能够快速分析在传统PC工作站多孔板FLIM数据集,是OMERO 32插件。 FLIMfit规定,使FLIM数据进行拟合与邻复杂模型的全球分析能力(在1.2节中讨论)NLY每像素几100个光子的假设是,荧光寿命组分是整个图像或感兴趣区域(ROI)的区域不变下,因此降低了检测到的光子的所需的数量,光线照射到样品和图像采集时间。一个标准的台式电脑上运行FLIMfit,只需要的计算时间10秒秒来分析包括上百视场的数据集。从而既FLIM的数据采集和分析可以对用于HCA实际时间表进行。

openFLIM-HCA硬件

我们FLIM HCA的实施包括六个关键组成部分:(i)与光学自动对焦荧光显微镜框架; (ii)一种机动(XYZ)显微镜阶段; (iii)一种激发激光源; (四)一个宽视场时间选通FLIM系统,选通光增强(印度政府),延迟发生器和摄像头; (五)进行数据采集和分析以及(vi)一尼普科夫盘扫描器的计算机单位光学切片成像来抑制失焦光。成像弱信号, 例如 ,当从在细胞质膜的FRET生物传感器,能够通过从盖玻片或培养基的细胞质荧光或背景的贡献被淹没这可能是很重要的。时间选通FLIM的数据是通过照射与超短脉冲激发辐射样品,成像荧光发射到所述GOI的光电阴极和获取一系列所述GOI的荧光体的CCD图像为一系列的时间延迟的设定获取激励脉冲到来后的光增强大门。如以下励磁时间门延迟的增加,荧光信号被视为降低和串联在CCD获取的时间选通荧光强度图像的形成来分析所有的荧光团的衰变型材中的视场所需的数据集。所述GOI的选通同步于激发脉冲并且,对于该系列的CCD收购,门相对于激发脉冲的时间的延迟被设定为一个系列的所需范围增加的值。这种同步是使用延迟发生器,它包括一个“快滞箱”(在第1步PS拖延提供高达20纳秒)和一个“粗延迟盒子”,提供延迟25 ps的最小步实现。

对于FLIM,激励可通过任何超快激光来提供。为方便起见,我们通常采用光纤激光器泵浦超连续源横跨从该合适的激发辐射可以使用机动滤光轮具有不同带通滤波器的任何荧光团来选择可见光谱提供皮秒脉冲可调。通常情况下,我们使用〜100-200μW的平均功率在40或60兆赫兹的重复率与脉冲样本。这种激发功率也可以通过基于对倍频超快激光源提供锁模钛掺杂蓝宝石激光器。请注意,下面〜100ps的激励脉冲的持续时间是足以满足大多数实验。搭载中性密度滤镜的第二个电动滤光轮用于调节激发强度。为安全和方便,激发辐射可经由单模光纤递送。对宽视场FLIM的且光学切片FLIM的配置在图23分别呈现。对于所用的精密零件的详细信息,请访问openFLIM-HCA维基33。当前零件清单的副本在补充材料中给出。

对宽视场FLIM,激发辐射是需要尽可能均匀地照射的整个视场。为此,我们直接激发激光束到在10-50赫兹旋转时间平均激光散斑全息“顶帽”扩散器,与DIF平面定影被成像到物镜的显微镜透镜的后焦平面。从显微镜的输出端口的荧光图像被中继到所述GOI的光电阴极和所述GOI(有效面积的对角线18毫米)的荧光体被成像到冷却的科学的CCD(芯片尺寸10.2毫米×8.3毫米)的传感器相机采用了一对相机镜头提供的0.7倍率的。该系统由被接口到采用RS232协议的仪器的标准PC的控制。此外,一个Arduino微处理器是用于控制在所述激励光路的快门关闭除非当CCD摄像机获取FLIM的数据,并从该被用来测量从频谱过滤超连续平均功率的光电二极管记录信号激励源。为光学截面FLIM,激发激光辐射耦合到单模偏振保持光纤直接连接到所述尼普科夫盘扫描器单元,为shown在图3中。从尼普科夫扫描仪单元的输出荧光图像被中继到所述GOI的光电阴极与系统的其余部分是相同的为宽视场FLIM。

openFLIM-HCA软件

数据获取软件被写入μManager34。它提供了包括期权改变,其中板的孔进行成像序列,以获得时间进程为任何视场,以在测量过程中自动地保持焦点,并控制激发和发射滤光轮和分色变换器充分HCA数据采集功能自动化多色成像。它也可以以自动识别并记录适当的FOV的位置,根据标准, 例如 ,基于强度随后FLIM采集运行“预扫描”采集荧光强度。 FLIM HCA的数据可以保存为一个系列的TIFF文件,为一系列的OME TIFF文件( 每FOV一个),或从多孔板结合所有数据的单一OME-TIFF文件。更多的信息和对μManager软件的详细描述可以在openFLIM-HCA维基33中找到。

数据分析软件,FLIMfit 31,为对OMERO图像数据管理平台32的基于MATLAB开源客户,是能够从OMERO服务器或计算机磁盘读取FLIM数据, 如图4所示。它已被设计成分析从TCSPC或宽视场时间选通FLIM的文书数据,并提供了许多功能,以从openFLIM-HCA拟合数据,包括拟合到单指数衰变型材,以及双指数和更高的复杂性衰变型材,包括模型,如偏振分辨荧光衰减曲线。它也可以采取固定和随时间变化的背景信号的帐户,并可以利用互联网宣传自丽泽测量的时空仪器响应函数(IRF)或可以适合使用的理想化的IRF可能时移通过从全实验的IRF测量确定的量的逐像素的基础上。在IRF和荧光样品之间的全局时间差异(t 0)可以由一个荧光标准的测量来确定。在背景信号和IRF空间变化也可以被考虑在内。 FLIMfit能够适应逐像素的基础上FLIM数据或使用“ 全局分级 ”或“ 全局拟合 ”,以方便与适度的(数百)FLIM数据拟合光子数到复杂的衰变模型。

全局分级办法涉及每个时间点汇集来自一个用户定义的ROI内的像素的所有检测到的光子,以提供足够的光子数,以使嵌合到复杂的衰变模型。在ROI可以是视场(FOV)的整个领域,它可以是手动ð由用户efined,或者它可以使用图像分割的工具来确定。在ROI也可以使用导入到从其他图像分割软件FLIMfit掩模限定。用于FRET应用中,通常使用全局分级以适合于双指数衰减模型来确定对应于FRETing和非FRETing供体荧光团被认为是在整个ROI空间不变的荧光寿命组件,然后改装上的逐像素的基础固定,以获得在每个像素中的FRETing施主人口馏分这些寿命成分的山谷。

全球拟合限嗣继承同时拟合横跨整个FOV-或跨FLIM数据集可以包括多个视场, 例如 ,从多孔板实验或时间序列荧光寿命图像的寿命组件和逐像素的FRETing献血人群分数。全球拟合能够利用的空间差来在整个图像人口馏分是在全局分级方法输给提供在组件的寿命估计强约束的-在显著更多的计算35的成本虽然- ,因此更可靠的结果。 FLIMfit可以快速分析与常规PC工作站与全球嵌合多孔板FLIM数据集,例如,多孔时间选通FLIM数据集,为每个394 FOV各自包含672×512象素五个时间门获得,只需要32秒和2 GB内存以适应双指数衰减模型31。这是通过利用可分离非线性使用多线程并行算法,以便在多核处理器和FLIMfit代码进行了优化,以减少内存使用有效的缩放实现最小二乘法拟合算法来实现。 图5示出FLIMfit的图形用户界面的快照并且可以在参考给定的36对全球拟合和全球分级的更多信息的网页上找到更多的细节可以参考31中找到。

使用我们openFLIM-HCA仪器和软件FLIM HCA以下协议可以适于范围广泛的与FLIM的读数细胞成像实验。在一般情况下,多孔板FRET实验的设计应包括的除了条件阳性和阴性生物控制重复孔正在研究中。这里,我们描述了具体的实施来执行光学截面FLIM( 见图3)表达的FRET构建体由通过短肽连接体连接的mTurquoise荧光蛋白和金星荧光蛋白的Cos细胞。这里mTq32V,mTq17V和mTq5V FRET结构(以代表性的成果中讨论)提供低,中,高效率的FRET连同非FRETing mTq5A构建。这些构建体并遵循该协议所要求的其他材料都列在材料清单。

Protocol

1.多孔板阵列的制备

  1. 制备用于参考测量,以使T 0测定75微米香豆素6在乙醇(τ〜2.43纳秒)的溶液。
  2. 种子150000的Cos细胞成四个孔6孔板的,并允许在培养基中过夜附着(参见材料列表)。
  3. 转一个孔各有mTq5A,mTq5V,mTq17V和mTq32V根据制造商的说明书和培养24小时使用商用转染试剂。
  4. 分离使用根据制造商的协议市售胰蛋白酶/ EDTA溶液的细胞。
  5. 悬浮于Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中吸移管5000的Cos细胞中表达mTq5A成#1.5厚度玻璃底96多孔先前已用聚-L-赖氨酸处理过的板的每个孔中的A1-G3。重复mTq5V表达细胞成井A4-G6,mTq17V成井A5-G9和mTq32V成井A10-G12。 离开以及H1空(提供任何静态背景测量从多孔板)。
  6. 吸移管200的HBSS微升只进井H 2(以提供从细胞培养介质中的任何背景信号的测量)。
  7. 吸移管在HBSS 5000非转染细胞进入孔H3(以提供从细胞的自体荧光的任何背景信号的测量)。
  8. 吸移管200中的75微米香豆素染料溶液进入井H4的微升(向多孔板采集, 在提供对T 0的任何变化进行检查时,由于环境温度的变化,或在激光或定时电路的波动。

2. openFLIM-HCA数据采集

注:详细资料可在openFLIM-HCA维基33中。

  1. 启动μManagerOpenFLIM-HCA插件
  2. 选择校准文件延迟发生器单元的具体组合和“:延迟箱校准文件:校准文件FLIM控制”下激光重复率。
  3. 将其中数据将在保存文件夹“ 文件:设置基本文件夹”。
  4. 检查激发束路径,以确保联接到输送光纤是稳定的,并且耦合效率通过测量使用功率计,通过传输光纤的发射功率最大化。波动低于5%都是可以接受的。
  5. 检查GOI触发是由伊拉克政府输入触发信号触发示波器显示来自伊拉克政府监视器输出信号稳定。
  6. 通过覆盖印度政府的光阴,它的增益设置为750 V和聚焦中继透镜中的一个,这样检查GOI荧光粉到CCD传感器的成像稀疏的单光子事件的图像(由于背景光泄漏虽然印度政府盖)记录在CCD尽可能尖锐。
  7. 检查样本视场被均匀地通过成像均匀的荧光样品,例如在盖玻片基准染料溶液的滴,使用足够低的激磁功率(<1μW),以确保所述GOI是不饱和照亮。
  8. 选择合适的板定义文件, 对于96孔板选择选项(“ 文件:压板属性”)。
  9. 使用μManagerGUI中,确保有在显微镜帧没有二色分光镜立方体通过选择一个空位置。
  10. 在印度政府对整个实验手动选择的4纳秒的栅极宽度。
  11. IRF获取图像数据:
    1. 使用μManagerGUI中,确保有在光束路径中没有显微镜物镜,通过选择一个空位置。手动放置炮塔目标上方的黑色阳极梁块,以防止任何激光转义和角度它来尽量减少任何反射回的显微镜机架。
    2. <利>使用μManagerGUI中,在CSUX( 励磁,分色,排放 ),使得从纺丝尼普科夫圆盘散射激励光的分数可以被成像,但确保强度不足以饱和系统200设置的过滤器毫秒的CCD的积分时间。这是为了避免所述GOI光电阴极暴露于太多的光,这可能会损坏光电阴极。
    3. 使用查找功能maxpoint在全范围内可编程快速滞箱覆盖的延迟。检查显示在输出图,然后通过按下正向按钮使之充分IRF轮廓是快速延迟框的扫描范围内调整手动过程延迟框。
    4. 调节采集参数( 中性密度,曝光时间,帧累加 ),以便在CCD中不亮时栅饱和的和有效的整合时间是> 200毫秒。
    5. 25 PS的,在整个延迟时间的延迟步长响E(“FLIM控制:快速滞箱:填充延迟”)。
    6. 按“ 快FLIM图像”获取IRF的形象。
    7. 通过阻断激光获取的背景图像(「 光通路控制:中性密度:封杀“),减少了延迟(”FLIM控制:快速滞箱:当前延时设置(PS)“)的数量,保留所有其他属性没有改变,按“ 快FLIM形象”。
  12. 获得参比染料数据:
    1. 选择好使用μManagerGUI H4(“XYZ控制:去得好:H4”)。
    2. 使用μManagerGUI,选择过滤器(激发波长一十七分之四百三十四,分色,发射二十五分之四百八十二NM)成像mTqFP。
    3. 使用查找功能maxpoint在整个范围内的快速滞箱,然后调节粗延迟框,以便充分衰减特性是快速滞箱的延迟范围内。
    4. 设置延迟通过改变“FLIM控制:快速滞箱:当前延时设置(PS)”的最大强度的点调节采集参数( 中性密度,曝光时间 ),使得在CCD不饱和。
    5. 25 PS的设置延迟步骤在整个延迟范围(“FLIM控制:快速滞箱:填充延迟 )。
    6. 按“ 快FLIM形象”获得参比染料的数据。
    7. 通过阻断激发激光获得第二个背景CCD摄像机图像(见2.11.7)
  13. 获得使用μManager采集软件的多孔板样品的FLIM的数据:
    1. 每孔(“:XYZ位置设置HCA测序采集”),以获取该孔应被成像集和视场的数目。
    2. 手动选择要成像装有样品的典范FOV。使用该视场,以确定最佳的中性密度过滤器,栅极宽度在所述GOI和摄像机的积分时间以便到达CCD摄像机的动态范围的75%。
    3. 设置自动对焦(“XYZ控制:自动对焦”):按“ 仅返回聚焦控制”,然后手动专注于细胞或感兴趣的结构。设置“ 自动对焦搜索范围”到2000微米,然后按“Enter”键 。按“AF现在”启动自动对焦方法。偏移值将在该领域“FocusOffset(自动对焦)”显示出来
    4. 输入在2.13.3获得的偏移值到“AF偏移”,并重复自动对焦过程两次(“AF现在”),以检查该偏移值是现在零,表示自动聚焦系统的正常运行。
    5. 使用在OpenFLIM-HCA采集软件的“ 自动门”功能选择延迟点的采样数。或者,这些可以手动选择,参见参考有关详细信息,ENCE 36。
    6. 设置“ 收集框架”,以国债收益率希望的总数据采集时间的值。增加积累帧数在总FLIM的数据采集时间也增加了费用增加信号到FLIM数据的信噪比。
    7. “启动HCA顺序”按钮运行FLIM收购多孔板。
  14. 通过作为用于FLIM数据采集阻断激发激光(参见2.11.7)具有相同采集设置获得进一步的背景CCD照相机的图像。

3. openFLIM-HCA数据分析使用FLIMfit

  1. 检查FLIM数据分析必要的配套文件是否存在( IRF和参比染料测量)。
  2. 装载从空孔(H1)中的数据,以及含有培养基(H2)和在培养基中的孔含有未标记细胞(H3)到FLIMfit(“ 文件:加载FLIM数据 ”),以检查是否有从细胞中表达“捐助者只有”任何背景贡献的信号大于1%, 也就是说,在井A1-G3。
  3. (“:负载FLIM的数据文件”)通过装载井用培养基成FLIMfit制备随时间变化的背景(TVB)文件。加载部分获得2.14摄像机背景数据(“背景:负载背景”),并使用FLIMfit选择“ 工具:创建TVB强度分布图 ”,以产生TVB。见参考文献31对TVB的详细信息。
  4. 通过加载在2.11节取得的IRF数据准备空间变化IRF移地图并减去在第2.11.7获得的CCD摄像头的背景。使用FLIMfit选择“ 工具:创建的IRF移图 ”来计算空间变化IRF移地图。见参考文献[31]在全局移位映射的更多细节。
  5. 适合monoexponenTiAl合金衰减到第2.12获取的参比染料的数据。加载参考染料和3.4节计算的空间变化IRF地图,设置合适的参数(“终身:序号经验:1”)T 0设置为拟合参数(“寿命:FIT IRF转变:合身”)。 ŧ获得0的值,然后在“ 参数 ”选项卡上显示的表中报告。
  6. 通过加载在第2.13节取得的实验FLIM数据分析FLIM数据,空间上变化IRF地图3.4节计算,在第2.14获取的摄像头背景下,TVB文件中的第3.3节和类型编制中获得T 0 的负值在3.5节(“IRF:IRF转变:T 0的”)。然后拟合实验数据,以根据实验的需要使用FLIMfit 36所需的衰减模型。

Representative Results

为了说明openFLIM-HCA仪器的能力,我们目前的三年表表FRET应用程序。第一个问题担心,改编自斯蒂芬·沃格尔的实验室开发的38 FRET模型结构构造。它们包括一系列在其中一个供体荧光蛋白(mTurquoise)由5,第17和32个氨基酸(mTq5V,mTq17V,mTq32V)短受控长度链接到受体荧光团(金星)基因表达的荧光构建体。供体和受体荧光团之间的不同的接头长度导致不同的FRET效率,因此不同的捐赠者的寿命。为了提供阴性对照,在短短的5个氨基酸的连接结构的金星是由琥珀取代- YFP的非荧光突变(mTq5A)不能作为FRET受体38。我们更换蔚蓝原pCXV和pC5A载体通过限制性消化VECT用NheⅠ和BglⅡ酶和结扎mTurquoise片段ORS使用从pmTurquoise-N1载体相同酶消化。连接区域被这种替换修改。

图6给出一个范例FLIM的使用在COS细胞中表达的该模型系统,其中多孔板是排列3列FRET测定各与阴性对照转染的细胞(列1-3),5氨基酸接头FRET构造(列4-6),17氨基酸接头FRET构造(列7-9)和32个氨基酸的连接子FRET构造(列10-12)。排H包含TVB估计井。 图6(a)示出的视图中的每个典型字段孔的自动获取荧光寿命的图像的例子。显而易见的是阴性对照(柱1-3)呈现最长寿命和该供体寿命是最低的FRET具有最短连接体的len构造GTH(列4-6)。 图6(b)示出了平均寿命如何平均在每所有的视场跨越多孔板孔而变化。 图6的(c)(d)分别示出了示例性供体荧光强度,合并的寿命地图mTq5A和mTq17V的一个视场。 图6(e)示出了供体荧光强度衰变分布平均成像A1孔中的所有细胞,用适合单指数衰变模型和IRF(这是由GOI栅极宽度为主)在一起。 图6(f)代表一种用于从逐像素单指数拟合得到的多孔板的各列中的平均荧光寿命。的平均寿命和标准偏差(STD)的一个表可以在下面的表1中找到。在图6所示的图像数据获取时间约为160分钟获得。分析了92个2.6 GHz的计算机上的10个核心和64克RAM的B点。

第二个典范分析表明FLIM FRET的应用HIV-1病毒颗粒组装,以测试这个过程25,42抑制剂的一种手段时读出HIV-1的Gag齐聚。表达HIV-1 Gag的在适当的宿主细胞中提供一个模型系统用于此阶段的HIV-1的生命周期,因为它会导致类似于未成熟的HIV-1病毒体的病毒样颗粒(VLPs)的形成。对于该测定,我们表达的HIV-1 Gag蛋白在HeLa细胞融合与CFP和经由其对起因于所述加格低聚FRET的信号的影响比较了不同抑制剂的作用。在参考42被提供使用的抑制剂的细节。

样品制备和实验测量的细节在参考25,在这里我们表明,我们可以使用FLIM的读出博全面描述聚合与CFP和YFP标记随机,也表达只标有CFP加格细胞homoFRET加格蛋白质之间的日heteroFRET。虽然homoFRET通常不存在于供体寿命的变化,它为CFP的特殊情况,其中所述荧光团在两种异构体具有不同的平均荧光寿命40,41存在。在CFP均-FRET读数相比具有CFP / YFP杂FRET简化样品制备的优点并且是多个频谱效率,这可能是对复用FRET读数重要。

我们以前的工作应用FLIM FRET法检测的加格齐聚在N-myristoyltransferase(NMT)抑制剂42的存在。这种抑制剂破坏负责加入肉豆蔻酸对的Gag,使加格蛋白质结合到质膜和是一个先决条件43中的HIV病毒粒子或形成的内源酶病毒样颗粒。我们发现,无论heteroFRET和homoFRET读数能达到的剂量反应研究> 0.6 Z'与NMT抑制剂。 Z'为在制药工业中用于指示测定的质量的参数,并且表示在阳性和阴性对照的平均值和它们的相对差的差异,以产生测定质量的单一值量度-其中Z'> 0.5被认为“优秀”的药品检测44。我们注意到,该优良性能的样品的量平均施主寿命的变化是300皮秒量级的取得 - 展示分析FLIM的数据为大量的细胞,从而使有用的读数的统计功效以实现使用小得多变化在荧光寿命比使用手动显微镜实验成像细胞的典型的数字。

在这里,我们提出了一个多孔板FLIM FRET数据集进行比较艾滋病毒加格齐聚4抑制剂化合物(指定ICL13,ICL14,ICL15和ICL16)。对于该实验,我们使用与所述的Gag-CFP质粒瞬时转染HeLa细胞中的homoFRET读数。一共有九种不同剂量的各种抑制剂被应用在以下32参考列出的标准协议,允许每个条件两个重复井。作为阳性对照,列一列出表达MYR-Gag的,缺乏不能形成的VLP等模拟总抑制的肉豆蔻酸部分的突变的Gag蛋白的细胞。的阴性对照通过表达Gag的-CFP仅只是用于递送抑制剂在其他列(列11)该车辆计量的细胞提供。共有8个FOV的每孔被收购。

数据装有上逐个像素基础单指数衰减模型和荧光寿命高原示出每孔的平均寿命(超过上述整个视八个场的强度阈值的所有像素)在线图在图7下面(a)所示。 图7(b)表示荧光寿命的相应情节作为抑制剂浓度的函数。抑制剂的三个时与表达的Gag-CFP细胞一起孵育显示出抑制作用(ICL13,ICL15&ICL16)。一种抑制剂(ICL14)示出了在所测试的任何剂量没有影响。该板计算Z'为0.51。对阳性和阴性对照获得的值示于图7(b),为黑色,在100μM和0.1纳米的点。

如图所示ICL13,ICL15和ICL16的剂量响应曲线如图7(b)然后装配到4参数逻辑非线性回归模型与固定到1 45的最大和最小的寿命的希尔系数固定到从正(列1)和负(列11)而获得的值分别控制。分别为38纳米,24纳米和116纳米的ICL13,ICL15和ICL16:三个曲线返回的IC 50值分别为即可。对于通过细胞内获得FLIM 50 IC值进行比较FRET的测量,我们确定IC 50抑制在我们先前报道的生物化学酶测定42重组人NMT1的酶活性。发现通过FLIM FRET活跃的三种化合物也最为活跃在这一试验(IC 17纳米,51纳米,39纳米的ICL13,ICL15和ICL16,分别为50个值),与ICL14,这表明无显著响应在FLIM FRET检测,被 100倍对NMT1(1700纳米IC 50)不太活跃。对于活性化合物,通过这些独立检测的模式中得到的IC 50值都非常相似,与可能归因至d的微小变化ifferences在摄取或细胞的化合物的代谢。

这个小研究突出FLIM HCA的区分作用于同一所关注的目标不同化合物的效力的能力。我们认为这是使用自动化FLIM的在高含量上下文生成多个剂量响应曲线的屏幕的第一示范和说明了要施加到屏幕和/或表征有用的治疗性化合物为FLIM的潜力。

第三表表FLIM的FRET实验涉及一种基因表达的FRET生物传感器用于通过环磷酸腺苷(cAMP(EPAC)),其是特异性结合至cAMP的一个说唱-1-鸟嘌呤交换因子激活交换蛋白。这EPAC FRET生物传感器(EPAC-S H188)采用mTurquoise2荧光蛋白(mTq2FP)作为供体荧光团,并集成了两个金星-FP实现合作受goaf作者:王金柱46。环磷酸腺苷是一种普遍存在的第二信使和全国各地的许多不同的生物是参与细胞内的过程中过多。它是通过腺苷酸环化酶从ATP在细胞膜转换合成。在这里,我们证明了我们读出并在活HEK293T细胞量化其活性的加成毛喉素,一种腺苷酸环化酶活化剂是上调的细胞内cAMP产生,因此增加了其细胞质浓度的以下能力。此EPAC传感器经历FRET的在其失活的(未结合)的状态,并与cAMP的浓度其供体寿命随着cAMP的导致生物传感器的开口。 mTq2FP的单指数衰变分布使得该生物传感器更适合于比基于CFP-生物传感器45定量寿命分析。 图8示出了使用自动多孔板FLIM显微镜记录的时间过程的一个例子,我们已绘制的改变在平均寿命和加入100μM福斯克林以下随时间的FRETing施主人口分数的变化。为简单起见,我们假设总信号可通过单指数FRETing和非FRETing供体和活化EPAC FRET生物传感器的人口馏分的混合物进行说明通过拟合整个时间序列双指数衰减资料被获得。

对于腺苷(EPAC)五,门延迟的数据采集,以4000 ps的栅极宽度,被设定为1300的ps 4300 PS(峰值强度),4,919 PS,6,656 PS,8035 PS,1的延迟时间选择, 0391 PS和16,000 ps的。对每个延迟的一体化摄像机时间为250毫秒。有一次好了,我们收购了FLIM时程超过10分钟,每10秒采集的图像。在时间120秒和130秒获取的数据点被移除,因为在加入毛喉素引起的样品的焦点位置的小的移位和为此期间在这些时间点的FLIM收购记录的荧光强度的即

用于数据分析的图像被加载到FLIMfit而每个单元分割。荧光寿命数据拟合到用IRF双指数衰减模型和来自参考染料(75μM香豆素6)中得到的固定T 0 值。供体荧光平均寿命平均超过所有单元示于图8(a)中图8(b)表示随着时间的推移由相同FLIM的数据拟合到相同的双指数衰减模型计算在FRETing人口分数的变化

式(1)

其中,β是FRETing施主分数。我们假设FRETing和非FRETing eleme的混合物NTS为之前加入毛喉素的时间点。获得这些寿命,双指数拟合应用于第三个时间点给予τ的寿命1 = 3964±21 ps的对非FRETing给体,和τ2 = 3,022±27的ps为FRETing供体。这些固定为整个数据集在每一个时间点,以获得β值的后续配合。

总之,我们已经提出了三个实验样本表表FLIM HCA结果。第一个是96孔板用表达FRET构建体,其包括mTqFP施主连结到任何一个金星FP受体或非荧光琥珀通过改变肽接头的长度构造的Cos细胞排列。在与接头长度的FRET效率,因此供体的寿命的变化是显而易见和每个构建体的平均寿命的标准偏差小于36 ps的。第二典范ASSAy为一的的量,抑制%从平均供体的荧光寿命与在表达标记CFP Gag蛋白的Hela细胞中测量的抑制剂浓度的变化计算出的HIV Gag蛋白豆蔻酰化四种潜在抑制剂“画面”。此读出是基于homoFRET,这通常不存在于供体寿命的变化,但确实为CFP因为此存在于不同的荧光寿命的多个异构体。这可以是在频谱效率, 例如,用于多路复用不同的FRET读数25而言是有用的。第三个典范分析是一个时间过程监控表达的cAMP FRET生物传感器,EPAC活HEK293T细胞。这表明在用毛喉素治疗和FLIMfit的使用具有检测到的光子是与活细胞成像相称的数目的双指数衰减模型的应用所期望的响应-作为我们先前已经与LIBRA FRET biosen所示SOR IP3为47。

图1
图1.宽视场时间选通FLIM示意图使用选通光图像增强器(印度政府)。左手侧,显示了实验系统的示意图。右上,激发脉冲的原理,时间选通的图像和单指数拟合数据的位置。右下方,卡通表示从实验系统中所示的两个对象的荧光衰减。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.宽视场openFLIM-HCA示意图使用选通光图像增强器(印度政府)。见正文为的更详细的说明系统组件。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.示意图使用选通光图像增强器(印度政府)与尼普科夫圆盘扫描单元光学切片openFLIM-HCA。查看系统组件的更详细的描述正文。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.经理采集程序图像数据流的原理图到OMERO服务器或计算机磁盘插入FLIMfit进行分析。数据流开始在顶级升其中,原始图像数据在μ-经理采集软件获得的EFT角落。虚线框内的项表示的FLIM数据分析的阶段,而那些外侧对应于数据采集和存储。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.截图FLIMfit的用户界面。左上角的视场的列表当前加载和视当前所选字段的荧光强度图像。左下,拟合模型和装配条件的选择。右上,荧光衰减利息(蓝圈)的当前区域,适合数据(红线),IRF(红色虚线)低于拟合残差(蓝线)。g5large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图6
FRET模型的图6的多孔板FLIM构建mTq5V,mTq17V,mTq32V在COS细胞中表达。 )在FOV的典范荧光寿命图像以及用于在文字讨论在COS细胞中表达不同的FRET结构。 ( )平均金星荧光寿命的热图平均每个细胞都很好。 ( )mTurquoise琥珀的强度图像叠加终生图(比例尺20微米)。 ( )mTurquoise金星(17个氨基酸)的强度图像叠加终生图(比例尺20微米)。 ( )mTq5A测量强度衰减曲线(蓝圈)建设(阴性对照)的荧光平均在成像以及A中的所有单元格1,用合适的数据,以一个单指数衰变(蓝色实线)和IRF(虚线橙色线)在一起。 ( )平均寿命的曲线图上平均跨越多孔板各柱,用误差棒表示在荧光寿命的视场之间的标准偏差。对于(AD)的寿命值是使用假色标在皮秒指定的限制表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7
使用表达的Gag-CFP HeLa细胞抑制剂加格图7.楷模多孔板FLIM屏幕。 )每口井平均捐助的荧光寿命为多孔板的热图上摆着用MYR-GAG-CFP转作为positiv列1提呈细胞为抑制e控制,柱11呈现与加格-CFP转染细胞只暴露于车辆,虚线彩色方块表示被给予与四个不同的抑制剂之一与浓度范围从高剂量塔2低剂量塔10的孔中,假色标表示平均荧光寿命从2200 PS 3100 PS。 ( )绘制的荧光寿命为每个误差线显示复读井之间的标准偏差抑制剂。个黑色在水平轴上2和-4分别从分别列1和11中获得的正和负的控制点。实线表示一个适合为不同的抑制剂的剂量反应曲线的数据。 请点击此处查看该图的放大版本。

古尔8“SRC =”/文件/ ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg“/>
图8的Exemplar使用FLIM的读出用HEK293T细胞时间推移测量EPAC FRET生物传感器。更改( )平均荧光寿命及(b)在另外的绿色条表示福斯克林FRETing捐助的分数作为时间的函数。误差棒显示每个细胞的标准误差。 请点击此处查看该图的放大版本。

每口井 STD 每口井 STD
mT5A 4008 32 12 MT17V 3004 26 10
mT5V 2717 35 13 mT32V 3133 三十 11

表1. FRET构建体平均寿命和标准偏差(STD)。

Discussion

我们所描述的自动多孔板显微镜使用时间选通FLIM为HCA设计的。该仪器是用写在μManager使用FLIMfit 36,写在Matlab和可作为OMERO客户端32μManager仪器的一个开源项目正在开展中的数据保存到一个OMERO服务器和FLIM数据分析选择开源软件控制控制软件,openFLIM-HCA,可在线33系统组件48的列表,使学术研究人员构建自己的FLIM HCA仪器。

为了获得健壮FLIM数据,有必要优化GOI和CCD采集设置,考虑到的任何变化的第t 0。如3.8.2所述,所述GOI增益设置和CCD照相机的积分时间应设置为达到〜CCD的动态范围的75%。 ü在每个时间门延迟唱更高GOI的电压和多个CCD的帧积累增加信噪比49,但是这增加了总FLIM的采集时间(因为更少的荧光光子CCD摄象机饱和物和帧积累的这样的数量之前每帧获得的应增加)等这种折衷应当决定每个实验。延迟发生器的校准取决于激光重复率,这是因此,有必要确保所使用的重复率的正确的校准文件被装入采集软件。用于校准延迟框的步骤可在openFLIM-HCA维基33中找到。

如果相比于荧光信号的细胞自发荧光低,我们使用的信号从一个孔含有只是培养基,以提供随时间变化的背景(TVB)。为了最小化从细胞培养基中的背景荧光,我们避免含有酚红的媒体。如果蜂窝自发荧光是显著,则无线电视可以由未标记细胞的测量得出。然而,在这种情况下,必须小心,因为这假定自体荧光背景是为图像中的每个像素是相同的。如果自发荧光跨细胞或如果激发束或检测灵敏度不均匀的视场显著变化这一假设将是无效的。

使用散射激发光脉冲在IRF图像的获取提供卷积与在嵌合过程中的数据模型的时间IRF信息,并且还提供在地图上的IRF跨越视场的空间变化的。该IRF可以通过成像散射样品使用分散来自尼普科夫圆盘提供了IRF的清洁测量激发光来测量,如胶体悬浮液,虽然在我们的仪器。时机邻精确测定F中的IRF是重要的,因为在激发和时间选通之间的时间延迟误差可以显著影响的嵌合过程中,特别是当嵌合到复指数衰变模型。在IRF使用散射的激发光不被需要正是对于拟合过程,因为它被记录在激发波长,而不是在荧光发射波长,这会影响它的定时,虽然在IRF的空间变化应该是相同的获取在两个波长。此外,该分散的IRF可以在全球范围内相对于真正的IRF时移由于从散射物体A型不同的光路长度,为的是在光学截面FLIM从尼普科夫盘获取的IRF的情况。这种校正, 0,这是应该施加到所获取的散射激发光IRF中所需的全局时间偏移,是从单指数参考染料的数据计算为Protoc指示OL步4.4。以下染料可用于不同的激发波长:75μM香豆素153溶液在甲醇(τ〜4.3纳秒50)可用于在范围295-442纳米激发;在乙醇中的75微米的香豆素6溶液(τ〜2.43纳秒37)可用于在范围430-500纳米激发;和在水中的75微米罗丹明B溶液(τ〜1.7纳秒37)可以在范围488-575纳米用于激发。我们注意到,虽然它在FLIMfit使用不同的IRF为系统的每个像素是可能的,它通常是合理的,使该空间上变化的IRF具有用于在图像中的每个像素的同一时间轮廓的假设,但提出了一系列的空间变化相对于全局T 0时间偏移。我们描述这种作为IRF变速图,这是从散射光的IRF确定。总之,IRF的轮廓,T 0和IRF变速图被用来连接确保在FOV每个像素配有一个适当的IRF。重要的是,T 0 可以慢慢随着时间的推移,所以应该任何FLIM数据采集前测量而变化。

用户应决定如何采样的荧光衰减型材和需要设置时间门和激发后其相对延迟的宽度。在一般情况下,理想的是使用广泛栅极宽度以最大化所检测的信号,并且通常我们使用设置为4纳秒为标记有荧光蛋白的细胞的FLIM的栅极宽度。时间门延迟的数目应足以采样荧光衰变分布给出了将在分析中使用拟合模型的复杂性(包括一个栅极仅有激励脉冲之前测量的信号)。的最佳值可取决于寿命和衰减组件的相对幅度。在一般情况下,4个门足以嵌合单指数衰减,而7或更多的门可可用于更复杂的衰变模型。

我们注意到,FLIM可使用的范围内的时域或频域技术使用FRET 51的频域寿命读数来实现,并且多孔板阵列的自动FLIM HCA在一个(非切片)中的第一个实施宽视场显微镜。然后报告的第一个自动光学切片FLIM多孔板HCA利用宽视场时间选通成像28读者了。接着,宽视场(非切片)频域FLIM HCA应用于筛选跨越使用FRET 52基因文库和时间选通FLIM HCA翻译后修饰(酪氨酸磷酸化)已经被应用到FRET的HIV-1的Gag的测定法齐聚53和FOXM1 54和雷丘RhoA和Rac1的生物传感器33的SUMO化的。另外,也可以使用TCSPC为多孔板FLIM 26但迄今为止,已经证明具有挑战性的,以匹配吨他吞吐量的技术开发宽视场检测。一种新兴的方法,可以解决这个问题是利用单光子计数探测器阵列,如SPAD阵列55。

我们注意到,使用荧光蛋白荧光共振能量转移的任何读数应该谨慎和从FLIMfit或任何其他FLIM的分析软件获得将取决于与嵌合模型相关联的假设参数的绝对值进行处理。例如,当FRET供体具有显著第二衰减部件,使用双指数模型的拟合FRET FLIM数据可导致更快衰减分量的贡献,通常与FRETing人口比它应有的显示更高有关。因此,希望使用供体与单指数寿命如mTq2FP。即使这样,最近的研究已经表明,FRET分析仍然可以通过受体荧光蛋白或由暗状态的影响由于荧光团的构象具有多种生色角的分布和取向因子κ2的异质性的距离56。尽管如此,我们和其他人已经表明,FRET的荧光寿命读数做产生与生物化学测量关联,并且可以用于筛选蛋白质相互作用或遵循生物传感器的动态有用的结果。因此,本openFLIM HCA平台可应用于广泛利用FRET或细胞的自体荧光8,以及提供基于染料的探针25的定量读数荧光基于寿命的测定的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microscope frame Olympus IX81 http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
optical autofocus Olympus ZDC http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
motorized (x-y-z) microscope stage Marzhauser 00-24-565-0000 Stage with Corvus controlle
excitation laser source Fianium SC400-4 Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
gated optical intensifier  Kentech High Rate Imager (HRI)
delay generators Kentech --- See agile delay generator and precision delay generator
camera Hamamatsu ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit  Yokogawa CSU-X1  http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Top hat diffuser Thorlabs ED1-S20-MD Engineered diffusers
mTq5V  Oxford Genetics P3850 mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker
mTq17V Oxford Genetics P3847 mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker
mTq32V Oxford Genetics P3848 mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker
mTq5A Oxford Genetics P3849 mTurquoise Amber construct
HEK293T --- --- cell type used
phenol red-free HBSS Sigma Aldrich 55021C-1000ML imaging media
culture media DMEM + 10% FBS + 0.5% Antibiotics
DMEM Sigma Aldrich D6046-500ML for culture media
FBS Sigma Aldrich 12003C-500ML for culture media
xTremeGene9 Sigma Aldrich 6.37E+09 for transfection, follow online protocol from La Roche
trypsin/EDTA Solution Thermo Fischer R001100 for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer

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Görlitz, F., Kelly, D. J., Warren, S. C., Alibhai, D., West, L., Kumar, S., Alexandrov, Y., Munro, I., Garcia, E., McGinty, J., Talbot, C., Serwa, R. A., Thinon, E., da Paola, V., Murray, E. J., Stuhmeier, F., Neil, M. A. A., Tate, E. W., Dunsby, C., French, P. M. W. Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e55119, doi:10.3791/55119 (2017).More

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