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Biology

Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie

Published: January 18, 2017 doi: 10.3791/55119
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 4, 3, 5, 6, 1, 4, 1,7, 1
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Wir präsentieren eine Open-Source hohe Content-Analyse (HCA) Instrument unter Verwendung von automatisierten Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) zur Untersuchung von Protein-Interaktionen mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basiert Ablesungen. Die Datenerfassung für dieses openFLIM-HCA Instrument wird von der Software in μManager geschrieben gesteuert und Datenanalyse wird in FLIMfit unternommen.

Introduction

Der zunehmende Einsatz von automatisierten Hoch Content - Analyse (HCA) in der Wirkstoffforschung 1 zu Testsubstanzbibliotheken wird von der Entwicklung der Life - Science - Grundlagenforschung in Richtung automatisierte Bildgebung Experimente für systematische Untersuchungen, zum Beispiel für die phänotypische Bildschirme von siRNA - Bibliotheken ergänzt. Automatisierte HCA wird immer wichtiger, auch für kleinere biologische Studien, die typischerweise mit Handversuche mit Zehn Gerichte von Zellen abgebildet mit herkömmlichen Mikroskopen umgesetzt wurden. Die statistische Aussagekraft durch die Fähigkeit verliehen Hunderte bis Tausende von Sichtfeldern ermöglicht experimentelle Rauschen (einschließlich "biologisches Rauschen") und die Automatisierung von Bilddatenerfassung und Analyse großer Probenarrays können Bediener Bias beseitigen und oft Lungs zu untersuchen und zu analysieren helfen kann verwendet werden, um das Auftreten von systematischen Fehlern, wie beispielsweise eine Änderung des IRF Profil während einer Akquisition zu erfassen. Fluoreszenz-basierte Assayssind weit verbreitet in HCA, mit den meisten handelsüblichen HCA Instrumentierung mit Fluoreszenzintensitätsabbildungs ​​in einem oder mehreren spektralen Kanälen implementiert, um die relative Verteilung und Co-Lokalisierung von markierten Proteinen zuzuordnen. Anspruchsvollere Fluoreszenzbildgebungsmodalitäten, wie beispielsweise Fluoreszenz - Lebensdauer - Imaging (FLIM), Polarisationsanisotropie Bildgebung und zeitaufgelöste Fluoreszenz Anisotropie Bildgebung, sind nicht weit verbreitet in kommerziellen HCA Instrumente genutzt, obwohl sie leistungsfähige quantitative Ablesungen bieten, beispielsweise von Protein - Interaktionen. Hier präsentieren wir eine Open-Source-Ansatz FLIM in einem automatisierten Mikroskop für HCA zu implementieren.

Fluoreszenzlebensdauer liefert eine inhärent ratiometrisch spektroskopische Auslesung, die verwendet werden können unterschiedliche molekulare Spezies zu unterscheiden, oder die lokale molekulare Umgebung eines Fluorophors an die Sonde und ist unempfindlich gegen Fluorophorkonzentration zu Anregungs- / Nachweiseffizienzen, und auf die Auswirkungen der scatteRing und Probenaufnahme 2. Weiterhin kann, da der Fluoreszenzlebensdauer-Messungen in einem einzigen spektralen Kanal hergestellt werden, sind sie zwischen den verschiedenen Instrumenten und Proben ohne Kalibrierung direkt vergleichbar. Sie können auf endogene Fluorophore verwendet werden, einschließlich einiger zellulärer Metaboliten, Lipiden und extrazellulären Matrixkomponenten, intrinsische Auslesungen von biologischen Prozessen und Krankheiten bereitzustellen. So markierungsfreie FLIM kann metabolische Veränderungen in den Zellen 3,4 Karte und angewendet worden , um Stammzelldifferenzierung 5,6 und das Wachstum von Kollagen Gerüste 7 überwachen. Wir haben kürzlich gezeigt , dass FLIM HCA kann für die automatisierte markierungsfreien Assays des Zellstoffwechsels unter Verwendung von 8 Autofluoreszenz verwendet werden. Häufiger werden jedoch Fluoreszenzlebensdauer-Messungen und FLIM exogenen Fluorophoren angewendet, die spezifische Biomoleküle etikettieren, oft Farbstoffe implementiert, die zellulären Kompartimenten beflecken, gekoppelt Verwendung von Farbstoffen zu antibodies, die bestimmte Proteine ​​in fixierten Zellen zielen, oder genetische Information Fluorophore an spezifische Proteine ​​gekoppelt werden. Fluoreszenzlebensdauer kann verwendet werden, robust quantitative Ablesungen von Fluoreszenzsonden bereitzustellen ihrer physikalischen oder chemischen Umwelt Abfühlen. Für Beispiele sind Farbstoffe wurden eingesetzt , um die lokale Lipidphase der Zellmembranen 9 oder Zell Viskosität 10 und genetisch ausgedrückt fluoreszierendes Protein basierende Biosensoren entwickelt worden abzufühlen Konzentrationen von Zellmoleküle zu berichten Signalisierungs einschließlich wie IP3 11, PIP2 12 und Calpain 13 oder Ionen, wie Calcium 14,15, Kalium- und Chlorid - 16 17.

Viele solcher Biosensoren nutzen Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) 18,19 Auslesungen von Änderungen in der Konformation Biosensor bereitzustellen. FRET zwischen "Spender" und "Akzeptor" Fluorophore erfolgt über eine Nahbereichs direkte Dipol-Dipol-Wechselwirkung, für die Fluorophore werden typischerweise von weniger als ~ 10 nm getrennt sind. Somit ist die Detektion von FRET gibt die Nähe von entsprechend markierten Proteine und liefert daher ein Mittel , Protein-Protein - Wechselwirkungen 20 auszulesen, wie Bindung oder Oligomerisation - entweder als Endpunkte in fixierten Zellen oder als dynamische Ereignisse in Zeitverlaufsmessungen von lebendem Zellen. Durch Markierung eines geeigneten molekularen Konstruktes sowohl mit Donor- und Akzeptor - Fluorophore, ist es auch möglich , Konformationsänderungen auszulesen - oder Spaltung - des Konstrukts über die Veränderung in FRET und dies ist die Grundlage für viele Biosensoren 21. Messungen der FRET-Effizienz kann Information über den Abstand Donor-Akzeptor bereitzustellen und die Bevölkerungsanteil von Donor-Fluorophore unterzogen FRET. Somit kann FRET-basierte Bildgebungstechniken verwendet werden , um molekulare Wechselwirkungen in Raum und Zeit abzubilden und zu quantifizieren, beispielsweise Zellsignalprozesse 22 zu erläutern. Automating solche Abbildungstechniken könnten Assays mit hohem Durchsatz liefern basierend auf Ablesungen von Wegen oder Netzwerken zu signalisieren.

In HCA, die meisten der FRET Auslese üblicherweise implementiert ist spektrale ratiometrisch Bildgebung, wo Änderungen in dem Verhältnis von Akzeptor zu Donator Intensität zugeordnet sind. Während dieser Ansatz leicht implementiert ist - und in vielen handelsüblichen Multiwell - Plattenleser verfügbar ist - quantitative spektral aufgelöste FRET - Messungen erfordern eine Kalibrierung der spektralen Antwort des Systems 23. Dazu gehören spektrale Übersprechen aufgrund von spektralen Durchbluten und direkte Anregung des Akzeptors sowie die Übertragungseigenschaften des Instruments und der Probe (innere Filtereffekt). Im Prinzip bedeutet dies Messung von zusätzlichen "Kontrolle" Proben, die entweder mit Donor-Akzeptor nur oder nur für markiert sind.

Aus einer solchen spektralen ratiometrisch FRET - Messungen, eine wirksame FRETWirkungsgrad (das Produkt der tatsächlichen FRET - Effizienz und Fraktion von FRETing Donor / Akzeptor - Moleküle) können zusammen mit dem relativen Anteil der Donor- und Akzeptormolekülen 24 erhalten werden. Spectral ratiometrisch FRET wird oft mit unimolekularen FRET Biosensoren verwendet, wobei der Donor / Akzeptor-Stöchiometrie angenommen werden kann, bekannt sein. Um die Bevölkerungs Fraktionen des FRETing Donor- und Akzeptor bestimmen, beispielsweise eine Dosis - Wirkungskurve die Kenntnis der tatsächlichen FRET - Effizienz zu erhalten , ist erforderlich. Dies kann durch Messung einer positiven FRET Kontrollprobe mit bekannten Eigenschaften oder unter Verwendung einer anderen Methode zur Messung der FRET-Effizienz, wie Acceptor Photobleaching oder FLIM erhalten werden.

Mit Hilfe der Fluoreszenzlebensdauer Ablesungen können FRET erfasst und allein durch Messungen der Donoremission quantifiziert werden - die Notwendigkeit zur spektralen Kalibrierung und weitere Kontrollproben zu entfernen. Somit kann FLIM FRET Ablesungen zwischen den Instrumenten verglichen werdenund zwischen unterschiedlichen Proben - wodurch Daten aus Endoskopie oder Tomographie von lebenden Krankheitsmodellen 25 werden gegen gebenchmarkt Messungen der zellbasierte Assays. Durch den Einbau von Spender Fluoreszenzabklingkurve Profile auf einen geeigneten Multi-exponentiellen Abfall Modell FRETing entspricht, und nicht FRETing Spenderpopulationen, FRET-Effizienzen und Bevölkerungs Fraktionen können im Prinzip ohne weitere Messungen direkt erhalten werden. Diese signifikanten Vorteile kommen jedoch auf Kosten der FLIM erfordern mehr detektierten Photonen pro Pixel als spektral aufgelöste Intensität Bildgebung - in der Regel Hunderte von Photonen sind erforderlich, um eine Genauigkeit bei der Lebensdauerbestimmung von 10% bei der Montage zu einem einzigen exponentiellen Abfall-Modell zu erreichen, und wenn Fitting Fluoreszenzabklingzeit Profile Komplex (multiexponentiellen Zerfall) Modellen, die Anzahl der detektierten Photonen erhöht, um tausende erforderlich. Dies hat konventionell führte zu langen Erfassungszeiten (zehn bis einigen hundert Sekunden pro Feld von view) für FLIM, vor allem, wenn die Zeit mit korrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) implementiert mit sequentiellen Pixelerfassung in der Laser-Scanning-Mikroskope. Versuche, die Bildgebungsgeschwindigkeit zu erhöhen, indem sie höhere Anregungsintensitäten mit erheblichen Photobleichens und / oder Phototoxizität führen kann. Zusammen mit einem Mangel an geeigneten im Handel erhältlichen Geräte und Software-Tools, hat diese FLIM von gehinderten für die Wirkstoffforschung oder Systembiologie in HCA genutzt werden, wo Hunderte bis Tausende von Sichtfeldern sind abgebildet werden. Laserscanning TCSPC FLIM wurde in einem automatisierten Multi - Well - Platte Mikroskop 26 für sekundäre Messungen nach der Identifikation von "Hits" von Steady-State - polarisationsaufgelöste Fluoreszenz Anisotropie Imaging 27 implementiert , die 28 ähnlich Belichtungsgeschwindigkeiten zu spektralen ratiometrisches Imaging erreichen kann , mit dem er teilt viele Vorteile und Nachteile. Fluoreszenzanisotropiemessungen Bildgebung nutzt die Abnahmein Fluoreszenzanisotropie des Akzeptors in Gegenwart von FRET und ist auch empfindlich gegenüber spektralen Übersprechens (zB direkte Anregung des Akzeptors). Es erfordert Kalibrierung für Polarisationsübersprechen zu berücksichtigen und stellt keine direkte Messung der FRET-Effizienz.

Um die Vorteile von FLIM für HCA zu realisieren, haben wir gearbeitet, um die Fragen der Geschwindigkeit der Bildaufnahme und einen breiteren Zugang zu der Technologie zu adressieren. Hier bieten wir eine komplette Liste der Open-Source-Software und Hardware-Komponenten, die verwendet werden können, die automatisierte schnelle FLIM Multi-Well-Platten-Lesegerät zu implementieren, die weiter unten beschrieben wird, zusammen mit Exemplar FRET basierten-Assays. In unserem Ansatz 29 wird FLIM realisiert mit Weitfeldzeit Gated Imaging eine gated optische Bildverstärker (GOI) mit, die in Abbildung 1 dargestellt ist , die schnellere Bildgebung Raten und geringere Photobleichens als Single-Beam Scanning TCSPC aufgrund der zur Verfügung stellen kann parallele Pixel interrogation. Unsere openFLIM-HCA Instrument kann unbeaufsichtigt FLIM liefern, erfordert nur wenige Sekunden FLIM Datenerfassungs einigen 100 Photonen pro Pixel ( in Abhängigkeit von der Helligkeit der Probe) zu erhalten. In Kombination mit der Zeit benötigt , um die Probe aus dem vorherigen Sichtfeld zu bewegen, die Anschaffungs Einstellungen anzupassen und die Probe im Fokus zu halten, dies führt in der Regel in Multi - Well - Platte Erfassungszeiten von ~ 10 s pro Sichtfeld 25,28. Optische Schnitte können mit einem quasi-Weitfeld Nipkow ( "Spinning Disc") Scanner 30 implementiert werden.

Für FLIM Datenanalyse haben wir eine Open - Source - Software - Tool namens FLIMfit 31 entwickelt, das schnell Multiwellplatte FLIM Datensätze auf herkömmlichen PC - Arbeitsplätzen zu analysieren und ist ein Plug-in für OMERO 32. FLIMfit bietet globale Analysefunktionen (besprochen in Abschnitt 1.2) , die FLIM Daten ermöglichen, komplexe Modelle mit o eingebaut werdenNLY einigen 100 Photonen pro Pixel unter der Annahme, dass die Fluoreszenzlebensdauer Komponenten über ein Bild invariant sind oder eine Region von Interesse (ROI), damit die Anzahl der detektierten Photonen erforderlich, die Belichtung der Probe und Bildaufnahmezeit zu verringern. Laufen FLIMfit auf einem Standard - Desktop - PC, benötigt nur 10s Sekunden Rechenzeit auf Datensätze analysieren Hunderte von FOVs umfasst. Damit beide FLIM Datenerfassung und Analyse kann auf Zeitskalen unternommen werden, die für die HCA praktisch sind.

openFLIM-HCA - Hardware

Unsere Implementierung von FLIM HCA besteht aus sechs Hauptkomponenten: (i) ein Fluoreszenzmikroskop Rahmen mit optischen Autofokus; (Ii) ein motorisiertes (xyz) Mikroskoptisch; (Iii) eine Anregungslaserquelle; (Iv) ein Weitfeldzeit gated FLIM System mit gated optischen Verstärker (GOI), Verzögerungsgenerator und der Kamera; (V) einen Computer zur Datenerfassung und Analyse und (vi) einer Nipkow-Scheibe scannerEinheit für die optische Bildgebung im Schnitt aus der Fokus Licht zu unterdrücken. Dies kann wichtig sein , wenn schwache Signale Bildgebung, beispielsweise von FRET Biosensoren an der Zellplasmamembran, die durch die Beiträge der zytoplasmatischen Fluoreszenz oder Hintergrund von Deckgläsern oder Kulturmedium überschwemmt werden könnte. Time-gated FLIM Daten werden durch Beleuchten der Probe mit dem ultrakurzen gepulsten Anregungsstrahlung, Abbilden der Fluoreszenzemission an die Photokathode des GOI und Erfassen einer Reihe von CCD-Bilder der Leuchtstoff der GOI für eine Reihe von Einstellungen der Zeitverzögerung erworben von die optische Verstärkergate nach der Ankunft der Anregungsimpulse. Da die Zeitgatterverzögerung nach Anregung erhöht wird, wird das Fluoreszenzsignal zu verringern, und die Reihe von zeitabhängigen Intensitätsfluoreszenzbilder auf dem CCD bilden die Datensatzes erforderlich ist, um zu analysieren, die Zerfallsprofile aller Fluorophore in dem Sichtfeld gewonnen gesehen . Die Verknüpfung von der indischen Regierung wird an die Anregungspulse synchronisiertund für die Reihe von CCD Nahmen, die Verzögerung des Zeittores relativ zu den Anregungspulsen eingestellt, um eine Reihe von Werten über den gewünschten Bereich zu erhöhen. Diese Synchronisation wird erreicht, den Verzögerungsgenerator verwenden, die eine "schnelle Verzögerung Box" (Bereitstellung von Verzögerungen bis zu 20 ns in 1 ps Stufen) umfasst und eine "grobe Verzögerungs Box", die Verzögerungen, die mit einem minimalen Schritt von 25 ps liefert.

Für FLIM kann die Anregung durch jede ultraschnellen Laser bereitgestellt werden. Der Einfachheit halber verwenden wir typischerweise einen Faserlasergepumpten Superquelle, die Pikosekundenpulsen abstimmbaren über das sichtbare Spektrum liefert, aus der die geeignete Anregungsstrahlung für jeden Fluorophor ausgewählt werden kann ein motorisiertes Filterrad mit unterschiedlichen Bandpassfilter verwenden. Typischerweise verwenden wir eine mittlere Leistung von ~ 100-200 & mgr; W bei der Probe mit Impulsen bei 40 oder 60 MHz Repetitionsrate. Solche Anregungsleistungen auch durch ultraschnelle Laserquellen auf Basis von Frequenzverdoppelung vorgesehen werden könnte vonmodengekoppelter Titan dotierten Saphir-Laser. Man beachte, daß eine Anregungsimpulsdauer unterhalb ~ 100 ps für die meisten Experimente ausreichend ist. Ein zweiter motorisierten Filterrad mit Neutraldichtefiltern ausgestattet wird die Anregungsintensität zu regulieren. Für die Sicherheit und Bequemlichkeit kann die Anregungsstrahlung über eine optische Einmodenfaser geliefert werden. Die Konfigurationen für die Weitfeld FLIM und optisch unterteilten FLIM sind in den 2 bzw. 3 dargestellt. Für weitere Einzelheiten über die genauen Komponenten verwendet, besuchen Sie bitte die openFLIM-HCA Wiki 33. Eine Kopie der aktuellen Stückliste ist im Zusatzmaterial gegeben.

Für Weitfeld FLIM wird die Anregungsstrahlung das gesamte Sichtfeld möglichst gleichmäßig auszuleuchten erforderlich. Hierzu leiten wir den Anregungslaserstrahl auf eine holographische "top-hat" Diffusor, der bei 10-50 Hz zu Zeit-Mittelwert der Laser Speckle, mit der Ebene der dif gedrehtFixiereinheit der hinteren Brennebene der Objektivmikroskoplinse abgebildet wird. Das Fluoreszenzbild von dem Ausgangsanschluss des Mikroskops wird auf die Photokathode des GOI und dem Leuchtstoff der GOI (aktive Bereich diagonal 18 mm) übertragen auf den Sensor einer gekühlten wissenschaftlichen CCD (Chipgrße 10,2 mm x 8,3 mm) abgebildet wird, Kamera ein Paar von Kameralinsen bietet eine Vergrößerung von 0,7 verwendet wird. Das System wird von einem Standard-PC gesteuert, die auf die Instrumentierung Schnittstelle verwendet RS232-Protokolle. Zusätzlich wird ein Arduino Mikroprozessor zu steuern, um einen Verschluß in dem Anregungslichtpfad verwendet, die außer geschlossen wird, wenn die CCD-Kamera FLIM Daten erwirbt und das Signal von einer Photodiode zu erfassen, die verwendet wird, um die Durchschnittsleistung der spektral gefilterten Supercontinuum zu messen Anregungsquelle. Für optisch unterteilten FLIM wird das Anregungslaserstrahlung gekoppelt in eine Single-Mode-polarisationserhaltende optische Faser, die direkt mit der Nipkow-Scheibe Scannereinheit, wie s verbindethown in Abbildung 3. Das Ausgangsfluoreszenzbild von der Nipkow Scannereinheit wird auf die Photokathode des GOI weitergeleitet und der Rest des Systems ist die gleiche wie für die Weitfeld FLIM.

openFLIM-HCA - Software

Die Datenerfassungssoftware ist in μManager 34 geschrieben. Es bietet die volle HCA Datenerfassungsfunktionen Optionen, einschließlich der Sequenz zu ändern, in dem die Vertiefungen der Platte abgebildet werden, Zeitverläufe für jeden FOV, zu erwerben, um automatisch pflegen Fokus während der Messung und zur Steuerung der Anregungs- und Emissionsfilterräder und den dichroitischen Wechsler für die automatisierte Multicolor-Imaging. Es ist auch möglich , eine "Vorabtastung" acquisition der Fluoreszenzintensität , um zu laufen , um automatisch zu identifizieren und die Positionen von geeigneten FOVs für eine nachfolgende FLIM Erwerb nach Kriterien aufnehmen, beispielsweise auf Basis von Intensität. FLIM HCA-Daten können als eine Reihe gespeichert werdenvon TIFF - Dateien, als eine Reihe von OME-TIFF - Dateien (dh eine pro FOV) oder als einzelne OME-TIFF - Datei , die alle Daten aus einer Multiwell - Platte enthält. Weitere Informationen und eine detaillierte Beschreibung der μManager Software kann auf der openFLIM-HCA Wiki 33 gefunden werden.

Die Datenanalyse - Software, FLIMfit 31, eine Open - Source - MATLAB-basierten Client für die OMERO Bilddaten - Management - Plattform 32, ist in der Lage FLIM Daten von einem OMERO Server oder von Computer - Festplatte zu lesen, wie in Abbildung 4 dargestellt. Es wurde entwickelt, um Daten aus TCSPC oder Weitfeldzeit gated FLIM Instrumente und viele Fähigkeiten passen Daten von openFLIM-HCA einschließlich Montage an monoexpotentielles Zerfallsprofile und verdoppeln exponentiell und höhere Profile Komplexität Verfall, einschließlich der Modelle liefert zu analysieren, wie polarisationsaufgelöste Fluoreszenzabklingkurve Profile. Es kann auch wegen der festen und zeitlich veränderliche nehmen Hintergrundsignale und können UTIlize einer gemessenen raumzeitlichen Instrument Antwortfunktion (IRF) oder eine idealisierte IRF passen verwenden, um einen Betrag von der vollständigen experimentellen IRF-Messung bestimmt auf einer pixelweisen Basis zeitverschoben sein kann. Eine globale Zeitdifferenz (t 0) zwischen dem IRF und einer fluoreszierenden Probe kann aus einer Messung eines Fluoreszenzstandard bestimmt werden. Räumliche Variationen in Hintergrundsignale und IRF können ebenfalls berücksichtigt werden. FLIMfit der Lage ist , FLIM Daten auf einer pixelweisen Basis oder unter Verwendung von "global binning" oder "global fitting" zu erleichtern Einbau von FLIM Daten mit bescheidenen (Hunderte) Photonenzahlen bis hin zu komplexen Zerfallsmodellen passen.

Global binning bringt zu jedem Zeitpunkt innerhalb eines benutzerdefinierten ROI aus den Pixeln alle detektierten Photonen Aggregieren ausreichende Photonenzahlen zu liefern , um komplexe Zerfallsmodelle zu ermöglichen Montage. Der ROI kann das gesamte Sichtfeld (FOV), kann es manuell defined durch den Benutzer, oder es kann Werkzeugen Bildsegmentierung bestimmt werden. Der ROI kann auch in FLIMfit von anderen Bildsegmentierung Software importiert unter Verwendung von Masken definiert werden. Für FRET-Anwendungen ist es üblich, global Binning zu verwenden, um ein Doppel exponentiellen Zerfalls Modell passen die Fluoreszenzlebensdauer Komponenten entsprechend FRETing und nicht-FRETing Donorfluorophore zu bestimmen, die räumlich invariant zu sein über den ROI angenommen werden und dann auf einem nachzurüsten pixelweisen Basis mit diesen vales Lebensdauer Komponente festgelegt, um die FRETing Spenderpopulation Fraktion in jedem Pixel zu erhalten.

Global Armatur beinhaltet Beschlag gleichzeitig die Lebensdauer Komponenten und pixelweise FRETing Spenderpopulation Fraktionen für einen ganzen FOV- oder über ein FLIM Datensatz, der mehrere FOVs aufweisen könnte, beispielsweise von einer Multiwellplatte Experiment oder eine Zeitreihe von Fluoreszenzlebensdauer Bilder. Globale Armatur ist in der Lage, die räumliche variati zu nutzenauf der Bevölkerungs Fraktionen über das Bild , das in dem globalen binning Ansatz verloren stärkere Einschränkungen für die Lebensdauer der Komponenten Schätzung bereitzustellen - und damit zuverlässigere Ergebnisse - allerdings auf Kosten einer erheblich mehr Rechen 35. FLIMfit schnell FLIM Multi - Well - Platte Datensätze mit globalen Montage auf herkömmlichen PC - Arbeitsplätze mit, beispielsweise ein Multi - Well - Zeit-gated FLIM Datensatz, erworben mit fünf Zeitfenstern für jede von 394 FOV jeweils bestehend aus 672 x 512 Pixeln und erfordert nur 32 Sekunden analysieren und 2 GB Speicher zu einem doppelten exponentiellen Abfall Modell 31 zu passen. Dies wurde durch Verwendung eines trennbaren nichtlinearen Least - Square - Anpassungsalgorithmus implementiert multithreaded parallel Algorithmen zu ermöglichen effektiven Skalierung auf Mehrkernprozessoren und die FLIMfit Code optimiert wurde Speicherverbrauch zu minimieren , erreicht. Figur 5 zeigt eine Momentaufnahme der grafischen Benutzerschnittstelle von FLIMfitund weitere Details finden Sie auf der Webseite in Bezug 36. Weitere Informationen über die globale Anpassung und globale Binning gegeben gefunden werden kann in Bezug 31 zu finden.

Das folgende Protokoll für FLIM HCA unsere openFLIM-HCA Instrumentierung und Software kann für eine breite Palette von Cell Imaging Experimente mit FLIM Ablesungen angepasst werden. Im allgemeinen FRET-Multiwellplatte Experimente entworfen werden sollte umfassen replicate Vertiefungen positive und negative biologische Kontrollen zusätzlich zu den Bedingungen untersucht. Hier wir die spezifische Implementierung beschreiben optisch unterteilten FLIM durchzuführen (siehe Figur 3) von Cos - Zellen, die FRET - Konstrukte bestehend aus dem mTurquoise fluoreszierendes Protein und fluoreszierende Protein Venus durch einen kurzen Peptid - Linker verbunden sind . Hier ist die mTq32V, mTq17V und mTq5V FRET-Konstrukte (in Repräsentative Ergebnisse Abschnitt) bieten niedrige, mittlere und hohe FRET Effizienzen zusammen mit dem nicht FRETing mTq5A konstruieren.Diese Konstrukte und die anderen Materialien benötigt, um dieses Protokoll zu folgen, werden in der Materialliste aufgeführt.

Protocol

1. Herstellung der Multiwell-Platte Array

  1. Eine Lösung aus 75 & mgr; M Cumarin 6 in Ethanol (τ ~ 2,43 ns) für Referenzmessungen ermöglichen die Bestimmung von t 0.
  2. Seed 150.000 Cos-Zellen in vier Vertiefungen einer 6-Well-Platte und lassen Sie über Nacht in Kulturmedium zu befestigen (siehe Materialliste).
  3. Transfizieren ein gut jeder mit mTq5A, mTq5V, mTq17V und mTq32V Kommerzielle Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers und Kultur für 24 Stunden.
  4. Zellen abzulösen Kommerzielle Trypsin / EDTA-Lösung nach dem Protokoll des Herstellers.
  5. Pipette 5000 Zellen Cos suspendiert in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mTq5A in jede der Vertiefungen A1-G3 eines # 1.5 Dicke Glasboden 96 Multiwell-Platte exprimiert, das mit Poly-L-lysin behandelt zuvor wurde. Wiederholen Sie dies für mTq5V Zellen in die Vertiefungen A4-G6, mTq17V in die Vertiefungen A5-G9 und mTq32V in die Vertiefungen A10-G12 Ausdruck zu bringen. Lassen Sie gut H1 leer (Messung aller statischen Hintergrund aus der Multi-Well-Platte zur Verfügung zu stellen).
  6. Pipette 200 ul HBSS nur in gut H2 (Messung von jedem Hintergrundsignal aus dem Zellkulturmedium zu schaffen).
  7. Pipette 5000 nicht transfizierten Zellen in HBSS in gut H3 (Messung von jedem Hintergrundsignal von zellulären Autofluoreszenz zur Verfügung zu stellen).
  8. Pipette 200 & mgr; l der 75 & mgr; M Cumarin - Farbstoff - Lösung in gut H4 (eine Kontrolle über jede Variation von t 0 in der Multiwell - Platte Erfassung zu schaffen, beispielsweise aufgrund von Änderungen der Umgebungstemperatur oder Schwankungen in Laser oder Zeitschaltung.

2. openFLIM-HCA Datenerfassung

Hinweis: Detaillierte Informationen über die openFLIM-HCA Wiki 33 finden kann.

  1. Starten Sie μManager und die OpenFLIM-HCA - Plugin
  2. Wählen Sie die Kalibrierungsdatei für die spezifische Kombination von Verzögerungsgeneratoreinheit undLaser-Wiederholungsrate unter "FLIM Kontrolle: Verzögerung Box Kalibrierungsdatei: Kalibrierung von Dateien".
  3. Stellen Sie den Ordner , in dem die Daten unter gespeichert werden "Datei: Set Basisordner".
  4. Anregungsstrahlengang überprüfen, dass die Kopplung in die Förder optische Faser, um sicherzustellen, ist stabil und dass die Kopplungseffizienz wird durch die Messung übertragenen Leistung durch Lieferung Faser mit einem Leistungsmesser maximiert. Schwankungen von weniger als 5% sind akzeptabel.
  5. Überprüfen Sie, ob die indische Regierung Auslösung durch die indische Regierung Eingangstriggersignal ausgelöst auf den Monitor-Ausgangssignal von dem GOI Anzeige Oszilloskop stabil ist.
  6. Überprüfen Sie die Abbildung des GOI Phosphor auf den CCD-Sensor durch die Photokathode der GOI abdeckt, Einstellung seiner Verstärkung auf 750 V und einer der Übertragungslinsen konzentrieren, so dass Bilder von spärlich Einzelphotonenereignisse (aufgrund von Hintergrundlicht, obwohl die indische Regierung Abdeckung undicht ) auf der CCD erfasst sind so scharf wie möglich ist.
  7. Überprüfen Sie, ob die ProbeSichtfeld wird durch Abbilden eines gleichförmigen Leuchtstoffprobe, wie beispielsweise ein Abfall der Referenzfarbstofflösung auf einem Deckglas, mit einer ausreichend niedrigen Anregungsleistung (<1 & mgr; W), um sicherzustellen, dass das GOI nicht gesättigt gleichmäßig beleuchtet.
  8. Wählen Sie die entsprechende Platte Definitionsdatei, also wählen Sie die Option für 96-Well - Platten ( "File: Lastplatteneigenschaften").
  9. Mit Hilfe der μManager GUI, stellen Sie sicher , dass es keine dichroitische Strahlteilerwürfel im Mikroskoprahmen durch eine leere Position auswählen.
  10. Wählen Sie manuell die indische Regierung für das gesamte Experiment eine Gate-Breite von 4 ns bei.
  11. Erwerben Sie IRF Bilddaten:
    1. Mit Hilfe der μManager GUI, stellen Sie sicher , dass es keine Mikroskopobjektiv in den Strahlengang durch eine leere Position auswählen. Stellen Sie manuell eine schwarz eloxierte Strahlblock oberhalb des Objektivrevolvers jede Laserlicht Entkommen und Winkel zu verhindern, dass es jede Reflexion zurück in das Mikroskop Rahmen zu minimieren.
      2. <li> Mit dem μManager GUI, setzen Sie die Filter in der CSUX (Erregungs, Dichroic, Emission) , so dass der Anteil der von der Spinn Nipkow - Scheibe verstreut Anregungslicht abgebildet werden kann , sondern sicherstellen , dass die Intensität nicht ausreicht, um das System für eine 200 zu sättigen ms CCD Integrationszeit. Dies ist zu vermeiden, dass die indische Regierung Fotokatode Belichtungslicht zu viel, was die Fotokatode beschädigen könnten.
    2. Verwenden Sie das Such maxpoint Funktion über den gesamten Bereich der durch die programmierbare schnelle Verzögerung Feld abgedeckt Verzögerungen. Überprüfen Sie das Ausgabediagramm dargestellt und passen Sie dann die manuelle Kurs Verzögerung Feld durch die Vorwärts-Taste drücken, so dass die volle IRF Profil innerhalb der Scanbereich des schnellen Verzögerung Box ist.
    3. Passen Sie die Aufnahmeparameter (Neutraldichte, Belichtungszeit, Frame Akkumulation) , so dass die CCD nicht in der hellsten Zeit-Tor gesättigt und die effektive Integrationszeit> 200 ms.
    4. Stellen Sie Verzögerung Schritten von 25 ps über die volle Verzögerung klingeltee ( "FLIM Kontrolle: Fast Verzögerung Box: Bestücken Verzögerungen").
    5. Erwerben Sie IRF Bild von "Snap - FLIM Bild" drücken.
    6. Erwerben Sie ein Hintergrundbild durch den Laser blockiert ( "Light Bahnsteuerung: Neutraldichte: gesperrt"), die Verringerung der Anzahl der Verzögerungen ( "FLIM Kontrolle: Fast Verzögerung Feld: aktuelle Verzögerungseinstellung (ps)"), lassen Sie alle anderen Eigenschaften unverändert und drücken Sie "Snap - FLIM Bild".
  12. Erwerben Referenzfarbstoff Daten:
    1. Gut H4 Wählen Sie mit der μManager GUI ( "XYZ Steuerung: Zum gut: H4").
    2. Mit Hilfe der μManager GUI, wählen Sie Filter (Erregungs 434/17 nm, Dichroic, Emission 482/25 nm) für mTqFP Bildgebung.
    3. Verwenden Sie das Such maxpoint Funktion über den gesamten Bereich der schnellen Verzögerung Box und dann die Grobverzögerungsfeld einstellen , so dass die volle Abklingprofil innerhalb der Verzögerungsbereich des schnellen Verzögerung Box ist.
    4. Stellen Sie die Verzögerungbis zu dem Punkt der maximalen Intensität von "FLIM Kontrolle: Fast Verzögerung Feld: Aktuelle Verzögerungseinstellung (ps)" zu ändern. Anpassen der Erfassungsparameter (Neutraldichte, Belichtungszeit) , so dass die CCD nicht gesättigt ist.
    5. Stellen Sie Verzögerung Schritten von 25 ps über die volle Verzögerungsbereich ( "FLIM - Steuerung: Schnelle Verzögerung Box: Bestücken Verzögerungen).
    6. Erwerben Referenzfarbstoff Daten durch "Snap - FLIM Bild" drücken.
    7. Erwerben Sie einen zweiten Hintergrund CCD-Kamerabild durch die Anregungslaser blockiert (siehe 2.11.7)
  13. Erwerben Sie FLIM Daten der Multi - Well - Platte Probe die μManager Erfassungs - Software verwenden:
    1. Set , die Brunnen sollte und die Anzahl der FOV abgebildet werden pro Well ( "Setup HCA sequenzierten Erwerb: XYZ - Positionen") erworben werden.
    2. Wählen Sie manuell ein FOV Exemplar mit der Probe abgebildet werden. Verwenden Sie diese FOV, um zu bestimmen, die optimale Neutraldichtefilter, Gate-Breite bei der indischen Regierung undIntegrationszeit der Kamera, um 75% des dynamischen Bereichs der CCD-Kamera zu erreichen.
    3. Set Autofokus ( "XYZ Steuerung: Autofokus"): Drücken Sie "Return Fokussteuerung nur", und konzentrieren uns dann manuell auf die Zellen oder die Struktur von Interesse. Stellen Sie "AF - Suchbereich" bis 2000 um und drücken Sie "Enter". Drücken Sie "AF jetzt" eine Autofokus - Verfahren einzuleiten. Ein Offset - Wert wird im Feld "FocusOffset (Autofokus)" angezeigt.
    4. Geben Sie den in 2.13.3 erhaltenen Offset - Wert in die "AF - Offset" und wiederholen Sie den Autofokus - Vorgang zweimal ( "AF jetzt") zu prüfen, ob der Offset - Wert nun Null ist, korrekte Funktion des Autofokus - System anzeigt.
    5. Verwenden Sie die "Autogate" -Funktion in der OpenFLIM-HCA - Erfassungssoftware eine logarithmische Abtastung der Verzögerung Punkte zu wählen. siehe Alternativ können diese manuell ausgewählt werden, sieheENCE 36 für weitere Details.
    6. Set "Accumulate Frames" auf einen Wert , dass die Renditen Gesamtdatenerfassungszeit gewünscht. Erhöhen der Anzahl der akkumulierten Rahmen erhöht Signal-Rausch-Verhältnis der FLIM Daten auf Kosten der Gesamt auch FLIM Datenerfassungszeit zu erhöhen.
    7. Führen Sie die FLIM Erwerb der Multiwell - Platte durch die "Start HCA - Sequenz" Taste drücken.
  14. Erwerben Sie eine weitere Bildkamera Hintergrund CCD durch die Anregungslaser blockiert (siehe 2.11.7) mit identischen Erwerb Einstellungen wie für die FLIM Datenerfassung.

3. openFLIM-HCA Datenanalyse FLIMfit Verwendung

  1. Überprüfen Sie, dass notwendige Zusatzdateien für FLIM Datenanalyse vorhanden sind (dh IRF und Referenzfarbstoff - Messung).
  2. Laden der Daten aus dem leeren Vertiefung (H1), wobei die Vertiefung mit Kulturmedium (H2) und die Vertiefung mit unmarkierten Zellen in Kulturmedium (H3) in FLIMfit( "File: Laden FLIM - Daten") zu überprüfen , ob es irgendwelche Hintergrundbeiträge von mehr als 1% des Signals aus den Zellen "Spender-only" zum Ausdruck, das heißt, in den Vertiefungen A1-G3.
  3. Bereiten Sie eine zeitlich veränderlichen Hintergrund (TVB) Datei durch die gut mit Kultur laden Medium in FLIMfit ( "File: Laden FLIM Daten"). Legen Sie die Kamera Hintergrunddaten in Abschnitt erworben 2,14 ( "Hintergrund: Hintergrund laden") und verwenden Sie die FLIMfit Option "Tools: Erstellen TVB Intensitätskarte" , um den TVB erzeugen. Siehe 31 für weitere Einzelheiten über den TVB verweisen.
  4. Bereiten Sie die räumlich variierende IRF Shift-Karte durch die IRF-Daten in Abschnitt erworben Laden 2.11 und subtrahieren Sie die CCD-Kamera Hintergrund in Abschnitt 2.11.7 erworben. Verwenden Sie die FLIMfit Option "Tools: Erstellen IRF Umschalt Map" , die räumlich zu berechnen unterschiedlichen IRF Karte verschieben. Siehe Referenz [31] für nähere Informationen auf der IRF Shift-Map.
  5. Setzen Sie einen monoexponenTiAl Zerfall zu den 2.12 in Abschnitt erfassten Daten Referenzfarbstoff. Lastreferenzfarbstoff und die räumlich berechnet unterschiedlichen IRF Karte in Abschnitt 3.4, setzen Fitparameter ( "Lebensdauer: Nein . Exp: 1") mit t 0 - Set als Einbauparameter ( "Lebensdauer: FIT IRF Shift: Ausgestattet"). Der Wert von t 0 erhalten wird , dann in der Tabelle in der Registerkarte "Parameter" angezeigt berichtet.
  6. Analysieren Sie die FLIM Daten , die durch die experimentellen FLIM Daten in Abschnitt erworben Laden 2.13, die räumlich variierende IRF Karte in Abschnitt berechnet 3.4, die Kamera Hintergrund in Abschnitt erworben 2.14 erstellte die TVB - Datei in Abschnitt 3.3 und geben Sie den negativen Wert von t 0 erhalten in Abschnitt 3.5 ( "IRF: IRF Verschiebung: t 0"). Dann passen die experimentellen Daten an das Modell gewünschten Zerfall unter Verwendung FLIMfit 36 entsprechend den Anforderungen des Experiments.

Representative Results

Um die Fähigkeiten des openFLIM-HCA Instrumentierung veranschaulichen, zeigen wir drei beispielhafte FRET-Anwendungen. Die erste betrifft FRET - Konstrukte , die von FRET Modell Konstrukte entwickelt von Stephen Vogel Labor 38 angepasst sind. Sie umfassen eine Reihe von genetisch exprimierbaren Fluoreszenz Konstrukte in dem ein Donor-Fluoreszenzprotein (mTurquoise) mit einem Akzeptor-Fluorophor gebunden ist (Venus) durch kurze gesteuerte Längen von 5, 17 und 32 Aminosäuren (mTq5V, mTq17V, mTq32V). Die verschiedenen Linkerlängen zwischen Donor und Akzeptor-Fluorophore führen zu unterschiedlichen FRET Effizienzen und damit unterschiedliche Spender Lebensdauer. Um eine Negativkontrolle bereitzustellen, die Venus in der kurzen 5-Aminosäuren-Linker - Konstrukt wird von Amber ersetzt - ein nicht-fluoreszierendes Mutation von YFP (mTq5A) , die nicht als FRET - Akzeptor 38 wirken kann. Wir ersetzten Cerulean in den ursprünglichen pCXV und pC5A Vektoren durch Restriktions Verdauen der vectors mit NheI und BglII Enzyme und Fragmente mTurquoise Ligieren verdaut die gleichen Enzyme aus der pmTurquoise-N1-Vektor verwendet wird. Der Linker-Region wurde durch diese Substitution unmodifiziert.

Figur 6 zeigt ein Musterbeispiel FLIM FRET - Assay unter Verwendung dieses Modellsystems in Cos Zellen exprimiert wird , in denen eine Multi - Well - Platte mit 3 Spalten jeder der Zellen angeordnet ist mit der negativen Kontrolle transfiziert (Spalten 1-3), die 5-Aminosäuren-Linker FRET - Konstrukt (Spalten 4-6), die 17-Aminosäuren-Linker FRET-Konstrukt (Spalten 7-9) und die 32-Linker Aminosäure FRET-Konstrukt (Spalten 10-12). Row H enthält Brunnen für die TVB-Schätzung. Figur 6 (a) zeigt Beispiele von automatisch erfasst Fluoreszenzlebensdauer Bildern von typischen Sichtfelder in jeder Vertiefung. Es ist offensichtlich, daß die negative Kontrolle (Spalten 1-3), um die längste Lebensdauern darstellen und dass der Spender Lebensdauer niedrigsten für das FRET-Konstrukt mit der kürzesten Linker length (Spalten 4-6). 6 (b) zeigt , wie die mittlere Lebensdauer über alle FOVs in jeder gemittelt und variiert über die Multiwellplatte. Die 6 (c) und (d) intensitäts fusionierte Lebensdauer Karten für ein FOV von mTq5A und mTq17V bzw. Exemplar Donor - Fluoreszenz zeigen. 6 (e) zeigt die Spenderfluoreszenzintensität Abklingprofil gemittelt über alle in A1 zusammen mit der Anpassung an eine monoexponentiellen Modell abgebildet Zellen und die IRF (die von der indischen Regierung Gate - Breite dominiert wird). Figur 6 (f) zeigt die mittlere Fluoreszenzlebensdauer für jede Spalte der Multiwell - Platte aus einem pixelweise monoexponentiellen fit erhalten. Eine Tabelle der mittlere Lebensdauer und die Standardabweichung (STD) in der nachstehenden Tabelle 1 zu entnehmen. Die Datenerfassung für die Bilder , die in 6 gezeigt dauerte etwa 160 min zu erwerben. Die Analyse wurden 92 s auf einem 2,6-GHz-Computer mit 10 Kernen und 64 GB RAM.

Die zweite beispielhafte Assay demonstriert die Anwendung von FRET FLIM die Oligomerisierung von HIV-1 Gag zum Auslesen bei der Montage von HIV-1 - Virionen als Mittel Inhibitoren dieses Prozesses 25,42 zu testen. Exprimieren HIV-1 Gag in geeigneten Wirtszellen stellt ein Modellsystem für diese Phase des Lebenszyklus von HIV-1, da es zur Bildung von virusähnlichen Partikeln (VLPs) führt, die ähnlich sind zu HIV-1-Virionen unreif. Für diesen Assay ausgedrückt wir HIV-1 Gag Protein in HeLa-Zellen mit GFP fusioniert und die Wirkung von verschiedenen Inhibitoren über ihre Auswirkungen auf das FRET-Signal verglichen, die aus der gag-Oligomerisierung geführt. Einzelheiten der Inhibitoren verwendet werden, in Bezug 42 vorgesehen.

Die Details der Probenvorbereitung und experimentellen Messungen werden umfassend 25 in Bezug beschrieben, in denen wir gezeigt, dass wir FLIM verwenden könnte bo auszulesenth heteroFRET zwischen Proteinen markiert stochastisch mit GFP-Gag-Aggregation und mit YFP, und auch in Zellen, die nur Gag markiert mit GFP homoFRET. Obwohl homoFRET in der Regel keine Änderung in den Geber Lebensdauer präsentieren, macht es für den speziellen Fall der GFP , wo die Fluorophore 40,41 in zwei Isomeren mit unterschiedlichen mittleren Fluoreszenzlebensdauern besteht. Die GFP-homo FRET Auslesung hat die Vorteile vereinfachter Probenvorbereitung im Vergleich zu CFP / YFP Hetero FRET und ist spektral effizient, die für gemultiplexte FRET Auslesungen wichtig sein könnte.

Die bisherige Arbeit angewendet FLIM die Gag - Oligomerisierung in Gegenwart eines N-Myristoyltransferase (NMT) Inhibitor 42 zu testen FRET. Dieser Inhibitor stört die endogenen Enzyme , die für die Zugabe von Myristinsäure zu Gag, die an die Plasmamembran zu binden Gag - Proteine ermöglicht und ist eine Voraussetzung , 43 bei der Bildung von HIV - Virionen oderVLPs. Wir haben gezeigt, dass beide heteroFRET und homoFRET Ablesungen Z erreichen könnte "von> 0,6 in Dosis-Wirkungs-Studien mit einem NMT-Inhibitor. Z 'ist ein Parameter , in der Pharmaindustrie verwendet , um die Qualität eines Assays , um anzuzeigen , und die Unterschiede in den Mittelwerten der positiven und negativen Kontrollen und deren relative Aufstriche stellt einen einzelnen Wert metric Assay Qualität zu erzeugen , - mit Z'> 0,5 für einen pharmazeutischen Test 44 als "ausgezeichnet" zu werden. Wir nehmen zur Kenntnis, dass dies eine ausgezeichnete Leistung bei Proben erreicht wurde, für die die Änderung der mittleren Spender Lebensdauer in der Größenordnung von 300 ps war - die statistische Aussagekraft der Analyse FLIM Daten für eine große Anzahl von Zellen zeigen, was nützlich Ablesungen ermöglicht viel kleiner realisiert werden unter Verwendung von Veränderungen in der Fluoreszenzlebensdauer als bei den typischen Zahlen im manuellen Mikroskopie Experimente abgebildeten Zellen möglich ist.

Hier präsentieren wir eine Multi-Well-Platte FLIM FRET-Datensatz zu vergleichen 4-Inhibitorverbindungen für HIV-Gag-Oligomerisierung (bezeichnet ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16). Für dieses Experiment verwendeten wir den homoFRET Auslesung mit HeLa-Zellen transient mit dem Gag-GFP-Plasmid transfiziert. Insgesamt neun verschiedene Dosen eines jeden Inhibitor wurden nach dem Standardprotokoll in Bezug 32, skizziert angewendet so dass zwei Wiederholungs Wells pro Zustand. Als Positivkontrolle Spalte 1 zeigt Zellen myr-Gag, ein mutiertes Gag-Protein exprimieren, die Myristinsäure Rest fehlt, die nicht VLPs bilden kann und simuliert so vollständige Hemmung. Eine negative Kontrolle wurde durch Zudosieren exprimierenden Zellen Gag-CFP nur mit nur dem Fahrzeug vorgesehen ist verwendet, um die Inhibitoren in den anderen Spalten (Spalte 11) zu liefern. Insgesamt acht FOV wurden pro Vertiefung erworben.

Die Daten wurden mit einer einzigen exponentiellen Zerfallsmodell auf einer Pixel-für-Pixel-Basis und der Fluoreszenzlebensdauer plat ausgestattete Karte , um die durchschnittliche Lebensdauer pro Vertiefung (über alle Pixel oberhalb des Intensitätsschwellenwert für die acht Sehfelder) ist unten gezeigt in Figur 7 (a) zeigt. Figur 7 (b) zeigt die entsprechende graphische Darstellung der Fluoreszenzlebensdauer als Funktion der Inhibitorkonzentration. Drei der Inhibitoren zeigen eine hemmende Wirkung (ICL13, ICL15 & ICL16), wenn mit Zellen, die Gag-CFP inkubiert. Ein Inhibitor (ICL14) zeigt keine Wirkung bei jeder getesteten Dosis. Die Z 'für diese Platte berechnet wurde, betrug 0,51. Die Werte für die positive und negative Kontrollen sind in schwarz bei 100 uM und 0,1 nM auf Figur 7 (b) als Punkte dargestellt.

Die Dosis - Wirkungs - Kurven für ICL13, ICL15 und ICL16 in Abbildung 7 (b) wurden dann dem logistischen Modell 1 45 mit den maximalen und minimalen Lebensdauer der festen fixiert mit dem Hill - Koeffizienten der nichtlinearen Regression 4 Parameter ausgestattetWerte aus der positive (Spalte 1), erhalten und negative (Spalte 11) steuert beziehungsweise. Die zurückgegebenen IC 50 -Werte für die drei Kurven wurden dann: 38 nM, 24 nM und 116 nM für ICL13, ICL15 und ICL16 sind. Zum Vergleich mit IC 50 -Werten durch intrazelluläre FLIM erhaltenen Messungen FRET bestimmten wir IC 50 zur Hemmung der enzymatischen Aktivität von rekombinantem humanem NMT1 in unserer zuvor berichtet biochemischen Enzymtest 42. Die drei Verbindungen als aktiv durch FLIM FRET auch die aktivste in diesem Assay (IC 50 Werte von 17 nM, 51 nM und 39 nM für ICL13, ICL15 und ICL16, respectively) mit ICL14 gefunden , die zeigte keine signifikante Reaktion im FLIM FRET - Assay, wobei ca. 100-fach weniger aktiv gegen NMT1 (IC 50 von 1700 nM). Für die aktiven Verbindungen sind die IC 50 Werte durch diese unabhängige Assay Modalitäten erhalten bemerkenswert ähnlich, mit geringfügigen Variationen wahrscheinlich zurückzuführen differences in die Aufnahme oder den Metabolismus der Verbindung in den Zellen.

Diese kleine Studie unterstreicht die Fähigkeit von FLIM HCA die Wirksamkeit von verschiedenen Verbindungen, die auf dem gleichen Ziel von Interesse handeln zu unterscheiden. Wir glauben, dass es die erste Demonstration eines Bildschirms ist ein hoher Gehalt Zusammenhang mit automatisierten FLIM in mehreren Dosis-Wirkungs-Kurven zu erzeugen, und zeigt das Potential für FLIM auf Bildschirm angewendet werden für und / oder nützliche therapeutische Verbindungen zu charakterisieren.

Das dritte Exemplar FLIM FRET Experiment betrifft eine genetische Information FRET Biosensor für Exchange-Protein durch zyklisches Adenosinmonophosphat aktiviert (cAMP (EPAC)), die ein Rap-1-Guanin-Austauschfaktor ist, der spezifisch an cAMP bindet. Dieser EPAC FRET Biosensor (EPAC-S H188) nutzt mTurquoise2 fluoreszierende Protein (mTq2FP) als Donor - Fluorophor und beinhaltet zwei Venus-FP eine Zusammenarbeit zu implementierenmposite Akzeptor - 46. cAMP ist ein allgegenwärtiges second messenger und ist in einer Vielzahl von intrazellulären Prozesse in vielen verschiedenen Organismen beteiligt. Es wird durch Adenylat-Cyclase aus der Umwandlung von ATP in der Zellmembran synthetisiert. Hier zeigen wir unsere Fähigkeit, seine Aktivität in lebenden HEK293T Zellen auszulesen und zu quantifizieren, nach Zugabe von Forskolin, einem Aktivator der Adenylatcyclase, die intrazelluläre Produktion von cAMP upregulates und erhöht somit ihre cytoplasmatische Konzentration. Dieser EPAC Sensor erfährt FRET in seinem inaktivierten (ungebunden) Staat und seine Spender Lebensdauer steigt mit cAMP-Konzentration als die cAMP auf die Öffnung des Biosensors führt. Die Mono-exponentiellen Abfall Profil von mTq2FP macht diesen Biosensor besser geeignet für die quantitative Analyse Lebensdauer als GFP-basierten Biosensoren 45. Abbildung 8 zeigt ein Beispiel für einen Zeitverlauf unter Verwendung des automatisierten Multiwellplatte FLIM Mikroskop aufgenommen , wo wir die Änderung aufgetragen habenin mittleren Lebensdauer und der Änderung in der Spenderpopulation FRETing Fraktion über die Zeit nach der Zugabe von 100 & mgr; M Forskolin. Der Einfachheit halber nehmen wir an, daß das Gesamtsignal kann durch eine Mischung von monoexponentiellen FRETing und nicht-FRETing Donoren und Bevölkerungsanteil des aktivierten EPAC FRET Biosensor erhalten wurde Profil durch Einpassen eines Doppel exponentiellen Abfall beschrieben in der Zeitreihe.

Für die Datenerfassung von cAMP (EPAC) fünf Gatterverzögerungen, mit einer Gate-Breite von 4000 ps, ​​mit der Verzögerungszeit gewählt wurden 1,300 ps eingestellt, 4,300 ps (Peakintensität), 4919 ps, 6.656 ps, 8.035 ps, 1, 0391 ps und 16.000 ps. Die Kamera Integrationszeit für jede Verzögerung betrug 250 ms. An einem gut erwarben wir eine FLIM Zeitverlauf mit Bildern alle 10 s über 10 min erworben. Die Datenpunkte zu Zeiten erworben 120 s und 130 s wurden entfernt, da die Zugabe von Forskolin eine kleine Verschiebung in der Fokusposition der Probe verursacht und deshalbe der Fluoreszenzintensität während der FLIM Akquisitionen zu diesen Zeitpunkten erfasst.

Für die Datenanalyse wurden die Bilder in FLIMfit geladen und pro Zelle segmentiert. Die Fluoreszenzlebensdauer - Daten wurden zu einem doppelten exponentiellen Abfall Modell ausgestattet eine IRF und einem festen t 0 Wert von einem Referenzfarbstoff , erhalten unter Verwendung (75 & mgr; M Cumarin 6). Die Donor - Fluoreszenz mittlere Lebensdauer alle Zellen gemittelt über wird in 8 (a) gezeigt. 8 (b) zeigt die Veränderung der FRETing Bevölkerungsanteil im Laufe der Zeit berechnet durch Anpassen der gleichen FLIM Daten auf die gleiche Doppel exponentielle Abklingen Modell

Gleichung 1

wo β der FRETing Spenderfraktion. Wir gehen davon aus einer Mischung aus FRETing und nicht-FRETing elements für den Zeitpunkten vor der Zugabe von Forskolin. Zu erhalten , wurde diese Lebensdauern, ein Doppel exponentielle Anpassung an den ersten drei Zeitpunkten angewendet geben Lebensdauern τ 1 = 3,964 ± 21 ps für die nicht-FRETing Donator und τ 2 = 3.022 ± 27 ps für die FRETing Spenders. Diese wurden für die nachfolgende Anpassung der gesamten Daten fixiert setzen die β - Werte zu jedem Zeitpunkt zu erhalten.

Zusammenfassend haben wir Exemplar FLIM HCA Ergebnisse für drei Versuchsproben dargestellt. Die erste war eine Platte mit 96 Vertiefungen mit Cos Zellen exprimiert angeordnet FRET-Konstrukte, umfassend eine mTqFP Spender entweder einer Venus FP verbunden Akzeptor oder ein nicht-fluoreszierendes Amber von variierenden Längen von Peptidlinker konstruieren. Die Veränderung der FRET-Effizienz und damit mit Linkerlänge Spenderlebensdauer ist klar ersichtlich, und die Standardabweichung der mittleren Lebensdauer für jedes Konstrukt war weniger als 36 ps. Das zweite Exemplar ASSAy war ein "Schirm" von vier potentiellen Inhibitoren für Myristoylation des HIV-Gag-Protein, für das die% Hemmung aus der Veränderung des mittleren Spenderfluoreszenzlebensdauer mit Inhibitor-Konzentration in Hela-Zellen, die Gag-Protein mit GFP markierten gemessen wurde berechnet. Diese Anzeige basiert auf homoFRET, die nicht in der Regel eine Änderung der Spender Lebensdauer darstellen würde, sondern tut für GFP, weil diese in mehrere Isomere mit unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern besteht. Dies kann in Bezug auf die spektrale Effizienz, beispielsweise zum Multiplexen verschiedener FRET Auslesungen 25 nützlich sein. Das dritte Exemplar Test war eine Zeit, natürlich Live-HEK293T Zellen Überwachung des cAMP-FRET Biosensor zum Ausdruck, EPAC. Dies zeigte die erwartete Antwort nach der Behandlung mit Forskolin und die Anwendung von FLIMfit einen doppelten exponentiellen Abfall Modell mit der Anzahl der detektierten Photonen ist angemessen mit lebenden Zellen unter Verwendung von - wie wir zuvor mit dem LIBRA FRET BIOSEN gezeigt haben ,sor für IP3 47.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Weitfeldzeitfenster FLIM eine gated optische Bildverstärker mit (GOI). Linken Seite zeigt eine schematische Darstellung des experimentellen Systems. Oben rechts Schema Anregungspulses, die Position der Zeitfenster Bilder und monoexpotentielles fit zu Daten. Unten rechts, cartoon die Fluoreszenzabklingkurve von den beiden Objekten gezeigt im experimentellen System zeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Weitfeld openFLIM-HCA eine gated optische Bildverstärker mit (GOI). Siehe Haupttext für detailliertere Beschreibung derSystemkomponenten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Schematische Darstellung der optisch openFLIM-HCA unter Verwendung eines gated optischen Bildverstärker (GOI) mit einer Nipkow - Scheibe Scannereinheit geschnitten. Siehe Haupttext für detailliertere Beschreibung der Systemkomponenten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Schematische Darstellung der Bilddatenfluss vom Manager - Erfassungsprogramm auf OMERO Server oder Computer - Festplatte und in FLIMfit für die Analyse. Der Datenfluss beginnt in Top-l inks Ecke, wo rohe Bilddaten in μ-Manager-Erfassungssoftware erworben wird. Die Elemente innerhalb der gestrichelten Kasten stellen die Stufen der FLIM Datenanalyse, während die Außenseite zu der Datenerfassung und -speicherung entsprechen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Screenshot von FLIMfit Benutzeroberfläche. Links oben, Liste der Sichtfelder aktuell geladenen und Fluoreszenzintensität Bild des aktuell gewählten Blickfeld. Unten links, Auswahl an passenden Modell und Einbaubedingungen. Rechts oben Fluoreszenzabklingkurve für aktuelle Region von Interesse (blaue Kreise), fit zu Daten (rote Linie), IRF (rot gestrichelte Linie) mit Sitz Residuen unter (blaue Linie).g5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. Multiwellplatte FLIM von FRET - Modell konstruiert mTq5V, mTq17V, mTq32V in Cos - Zellen exprimiert wird . (A) Exemplar Fluoreszenzlebensdauer Bilder von FOV in jeder Vertiefung für verschiedene FRET - Konstrukte in COS - Zellen exprimiert , wie in Text diskutiert. (B) Heatmap der mittleren Venus Fluoreszenzlebensdauern gemittelt über alle Zellen in jeder Vertiefung über. (C) Intensitätsbild von mTurquoise Bernstein überlagert mit Lebensdauer Karte (Maßstab 20 um). (D) Intensitätsbild von mTurquoise Venus (17 Aminosäuren) überlagert mit Lebensdauer Karte (Maßstab 20 um). (E) gemessene Intensität Abklingprofil (blaue Kreise) von mTq5A konstruieren (Negativkontrolle) Fluoreszenz , gemittelt über alle in gut A abgebildeten Zellen1 zusammen mit der Anpassung der Daten an einen monoexponentiellen (blau durchgezogene Linie) und IRF (gestrichelte blaue Linie). (F) Graphen der mittleren Lebensdauer , gemittelt über jede Spalte über die Multi - Well - Platte, mit Fehlerbalken , die Standardabweichung in der Fluoreszenzlebensdauer zwischen Sichtfeldern zeigt. Für (ad) Lebensdauerwerte werden unter Verwendung einer falschen Farbskala mit der angegebenen Grenzen in Pikosekunden vertreten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

7
Abbildung 7. Exemplar Multiwellplatte FLIM Bildschirm von Gag - Inhibitoren mit HeLa - Zellen, die Gag-GFP. (A) Wärmekarte der mittleren Spenderfluoreszenzlebensdauer pro Vertiefung für Multi - Well - Platte mit Spalte 1 - präsentierenden Zellen mit myr-Gag-GFP als positiv transfizierte angeordnet nur, und die gestrichelten farbigen Quadraten e Kontrolle für die Hemmung, Spalte 11 Zellen, die mit Gag-CFP ausgesetzt Fahrzeug präsentiert die Vertiefungen anzeigt, dass 10 mit einem der vier verschiedenen Inhibitoren mit Konzentrationen im Bereich von hohen Dosis Spalte 2 zu niedrig dosiertem Säule dosiert wurden . die Falschfarbenskala stellt den Mittelwert der Fluoreszenzlebensdauer von 2.200 ps bis 3.100 ps reichen. (B) Grundstücke Fluoreszenzlebensdauer für jeden Inhibitor mit Fehlerbalken die Standardabweichung zwischen den Wiederholungs Brunnen zeigt. Punkte in schwarz bei 2 und -4 auf der horizontalen Achse sind die positiven und negativen Kontrollpunkte jeweils von Spalten 1 erhalten bzw. 11. Die durchgezogenen Linien zeigen eine Anpassung an die Dosis-Antwort-Kurvendaten für die verschiedenen Inhibitoren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 8. Exemplar Verwendung von FLIM die EPAC FRET Biosensor in einem Zeitraffer-Messung auszulesen HEK293T Zellen. Ändern Sie in (a) bedeuten Fluoreszenzlebensdauer und (b) der Anteil von FRETing Spender als Funktion der Zeit nach Zugabe von Forskolin durch den grünen Balken angezeigt. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler pro Zelle. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

pro Well STD ERR pro Well STD ERR
mT5A 4008 32 12 MT17V 3004 26 10
mT5V 2717 35 13 mT32V 3133 30 11

Tabelle 1. Mittlere Lebensdauer und Standardabweichung (STD) der FRET - Konstrukte.

Discussion

Wir haben ein automatisiertes Multiwellplatte Mikroskop für HCA mit zeitgesteuerten FLIM entworfen beschrieben. Dieses Instrument ist Open - Source - Software mit der Option in μManager geschrieben gesteuert unter Verwendung der Daten zu einem OMERO Server zu speichern und die Analyse FLIM Daten unternommen 36 FLIMfit Verwendung ist, ein Open - Source - Programm geschrieben in Matlab und erhältlich als OMERO Client 32 μManager Instrument Steuerungssoftware, openFLIM-HCA, ist eine Online - 33 mit einer Liste der Systemkomponenten 48 verfügbaren akademischen Forschern zu ermöglichen , ihre eigenen FLIM HCA Instrumente zu bauen.

Um robuste FLIM Daten zu erfassen, ist es notwendig , die indische Regierung und CCD Erwerb Einstellungen zu optimieren und 0 Berücksichtigung etwaiger Änderungen in t zu nehmen. Wie in 3.8.2 beschrieben, sollte die indische Regierung Verstärkungseinstellung und CCD-Kamera Integrationszeit ~ 75% des CCD-Dynamikbereich zu erreichen eingestellt werden. Usingen höhere GOI Spannungen und mehrere CCD - Rahmen Akkumulationen in jedem Zeitgatterverzögerung erhöht das Signal - Rausch - Verhältnis 49 jedoch erhöht dies die Gesamt FLIM Erfassungszeit (da weniger Fluoreszenzphotonen pro Rahmen vor der CCD - Kamera sättigt erfasst werden und so die Anzahl der Rahmen Akkumulationen erhöht werden) und so diese Trade-off für jedes Experiment werden sollte, entschieden sollte. Die Kalibrierung des Verzögerungsgenerators hängt von der Laserwiederholungsrate, und es ist daher notwendig, dass die richtige Kalibrierungsdatei für die Wiederholungsrate, um sicherzustellen, verwendet wird, in die Akquisitionssoftware geladen. Das Verfahren zur Kalibrierung der Verzögerung Box kann auf der openFLIM-HCA Wiki 33 gefunden werden.

Wenn das zellulare Autofluoreszenz auf das Fluoreszenzsignal gering im Vergleich ist, verwenden wir das Signal von einem gut enthält nur Kulturmedium mit der zeitveränderlichen Hintergrund (TVB) bereitzustellen. In den Hintergrundfluoreszenz aus dem Zellkulturmedium zu minimieren, vermeidenMedien Phenolrot enthält. Wenn das zellulare Autofluoreszenz signifikant ist, dann kann der TVB aus Messungen der unmarkierten Zellen abgeleitet werden. Allerdings muss in diesem Fall darauf geachtet werden, wie dies setzt voraus, daß der Hintergrund-Autofluoreszenz der gleiche für jedes Pixel in dem Bild ist. Diese Annahme wird ungültig, wenn der Autofluoreszenz signifikant in einer Zelle oder wenn der Anregungsstrahl oder Erfassungsempfindlichkeit variiert nicht gleichmäßig über das Sichtfeld.

Der Erwerb eines IRF Bildimpulsen gestreute Anregungslicht liefert die zeitliche IRF-Profil, das mit dem Datenmodell in den Anpassungsprozess und bietet auch eine Karte der räumlichen Variation des IRF über das Sichtfeld convolved wird. Das IRF kann durch Abbilden einer Streuprobe, wie eine kolloidale Suspension, obwohl in unserem Instrument gemessen werden, unter Verwendung von Anregungslicht gestreut von der Nipkow-Scheibe eine sauberere Messung des IRF bietet. Eine genaue Bestimmung des Zeitpunkts of die IRF ist wichtig, weil Fehler in der Zeitverzögerung zwischen der Anregung und zeit Gating signifikant die Anpassungsprozess auswirken können, insbesondere bei der Montage zu komplexen exponentiellen Zerfallsmodellen. Das IRF erworben gestreutem Erregungslicht nicht genau das, was für den Anpassungsprozess benötigt wird, weil es bei der Anregungswellenlänge aufgezeichnet wird, und nicht auf der Fluoreszenzemissionswellenlänge, die ihre Zeitsteuerung beeinflussen können, auch wenn die räumliche Variation des IRF gleich sein sollten bei beiden Wellenlängen. Zusätzlich kann die Streu IRF global kann in der Zeit relativ zu dem wahren IRF aufgrund einer unterschiedlichen optischen Weglänge von dem Streuobjekt verschoben, wie es der Fall für eine IRF ist von der Platte Nipkow erworben in optisch unterteilten FLIM. Diese Korrektur, t 0, was die erforderliche globale zeitliche Verschiebung ist, die auf die erworbenen gestreuten Anregungslicht IRF angewendet werden soll, wird aus den monoexpotentielles Referenzfarbstoff Daten berechnet , wie in Protocol Schritt 4.4. Die folgenden Farbstoffe können für verschiedene Anregungswellenlängen verwendet werden: eine 75 & mgr; M Cumarin 153 - Lösung in Methanol (τ ~ 4,3 ns 50) kann im Bereich von 295 bis 442 nm für die Anregung verwendet werden; eine 75 & mgr; M Cumarin 6 -Lösung in Ethanol (τ ~ 2,43 ns 37) kann im Bereich von 430-500 nm für die Anregung verwendet werden; und einer 75 & mgr; M Rhodamin B - Lösung in Wasser (τ ~ 1,7 ns 37) für eine Anregung im Bereich von 488 bis 575 nm verwendet werden. Wir bemerken , dass, obwohl es in FLIMfit möglich ist, in der Regel eine andere IRF für jedes Pixel des Systems zu verwenden , ist es sinnvoll, die Annahme zu machen , daß das räumlich variierende IRF den gleichen zeitlichen Verlauf für jedes Pixel in dem Bild hat stellt aber eine Reihe unterschiedlicher räumlich zeitlichen Verschiebungen relativ zum globalen t 0. Wir bezeichnen dies als die IRF Schaltkarte, die aus dem Streulicht IRF bestimmt wird. Zusammen sind das IRF - Profil, t 0 und die IRF Verschiebung Karte en verwendetsicher, dass jedes Pixel in dem FOV mit einem geeigneten IRF angebracht ist. Wichtig ist, dass t 0 langsam im Laufe der Zeit variieren , so dass es vor jedem FLIM Datenerfassung gemessen werden soll.

Der Benutzer sollte entscheiden, wie die Fluoreszenzabklingkurve Profile zur Probe und wird benötigt, um die Breite der Zeitfenster und ihre relativen Verzögerungen nach der Anregung zu setzen. Im allgemeinen ist es wünschenswert, breite Gatebreiten verwenden, um das detektierte Signal zu maximieren und typischerweise verwenden wir Gate-Breiten auf 4 ns für FLIM von mit Fluoreszenzproteine ​​markierten Zellen. Die Anzahl der Zeit-Gate-Verzögerungen sollte ausreichen, um das fluoreszierende Abklingprofil Probe (einschließlich ein Tor gesetzt, das Signal unmittelbar vor dem Anregungsimpuls zu messen) die Komplexität der Anpassungsmodell gegeben, die in der Analyse verwendet werden. Der optimale Wert kann auf die Lebensdauer und die relativen Amplituden der Zerfallskomponenten abhängen. In der Regel 4 Tore für die Montage monoexpotentielles ausreichend sind, zerfällt während 7 oder mehr Tore könnenwerden für komplexere Zerfallsmodelle verwendet.

Wir stellen fest , dass FLIM mit einer Reihe von durchgeführt werden kann im Zeitbereich oder Frequenzbereich Techniken und automatisierte FLIM HCA von Multi - Well - Platte - Arrays wurde zum ersten Mal in einem (nicht Schnitte) Weitfeldmikroskop Frequenzbereich Lebensdauer Ablesungen von FRET 51 umgesetzt. Die erste automatische optische Schnitte FLIM Multi - Well - Plattenleser für HCA Weitfeldzeit Gated Imaging - 28 verwendet wurde dann berichtet. Anschließend Weitfeld (nicht Sektionieren) Frequenzbereich FLIM HCA angewendet wurde für posttranslationale Modifikationen (Tyrosin - Phosphorylierung) in einer Genbank zu screenen FRET unter Verwendung von 52 und mit Zeitfenster FLIM HCA wurde angewendet , um FRET - Assays von HIV-1 Gag 53 Oligomerisierung und von SUMO von FOXM1 54 und von Raichu RhoA und Rac1 Biosensoren 33. Es ist auch möglich TCSPC für Multi - Well - Platte FLIM 26 aber bisher zu verwenden , hat es sich als herausfordernd t entsprechener Durchsatz von Techniken Weitfelderkennung nutzen. Ein Schwellen Ansatz, dieses Problem zu beheben könnte , ist die Verwendung von Arrays von Einzelphotonenzählung Detektoren wie SPAD - Arrays 55.

Wir nehmen zur Kenntnis , dass alle Ablesungen von FRET Fluoreszenzproteine verwenden , sollten aus FLIMfit oder einer anderen FLIM - Analyse - Software erhalten , mit Vorsicht und dass die absoluten Werte der Parameter behandelt werden , wird sich auf die mit dem passenden Modell zugeordnet Annahmen abhängen. Zum Beispiel, in dem der FRET-Donor eine signifikante zweite Zerfallskomponente hat, die Verwendung eines biexponentiellen Modell die FRET FLIM Daten passen in den Beitrag der schnelleren Zerfall Komponente zur Folge haben, in der Regel mit der FRETing Bevölkerung erscheinen, verbunden sind höher als es sollte. Es ist daher wünschenswert Donatoren mit einer monoexponentiellen Lebensdauer wie mTq2FP zu verwenden. Schon damals haben neuere Studien gezeigt, dass FRET-Analyse noch durch dunkle Zustände der Akzeptor-Fluoreszenzproteine ​​beeinflusst werden kann oder durchHeterogenität der Orientierungsfaktor κ 2 aufgrund einer Verteilung von Fluorophor Konformationen mit einer Vielzahl von Chromophor Winkel und Abstände 56. Dennoch haben wir und andere gezeigt, dass die Fluoreszenzlebensdauer Ablesungen von FRET brauchbare Ergebnisse produzieren zu tun, die mit biochemischen Messungen korrelieren und kann verwendet werden für Protein-Interaktionen zu screenen oder Dynamik von Biosensoren zu folgen. Somit ist dieses openFLIM HCA Plattform kann auf eine Vielzahl von Fluoreszenzlebensdauer basierende Tests angewendet werden FRET oder zelluläre Autofluoreszenz unter Verwendung von 8, sowie die Bereitstellung quantitative Ablesungen von farbstoffbasierten Sonden 25.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microscope frame Olympus IX81 http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
optical autofocus Olympus ZDC http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
motorized (x-y-z) microscope stage Marzhauser 00-24-565-0000 Stage with Corvus controlle
excitation laser source Fianium SC400-4 Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
gated optical intensifier  Kentech High Rate Imager (HRI)
delay generators Kentech --- See agile delay generator and precision delay generator
camera Hamamatsu ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit  Yokogawa CSU-X1  http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Top hat diffuser Thorlabs ED1-S20-MD Engineered diffusers
mTq5V  Oxford Genetics P3850 mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker
mTq17V Oxford Genetics P3847 mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker
mTq32V Oxford Genetics P3848 mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker
mTq5A Oxford Genetics P3849 mTurquoise Amber construct
HEK293T --- --- cell type used
phenol red-free HBSS Sigma Aldrich 55021C-1000ML imaging media
culture media DMEM + 10% FBS + 0.5% Antibiotics
DMEM Sigma Aldrich D6046-500ML for culture media
FBS Sigma Aldrich 12003C-500ML for culture media
xTremeGene9 Sigma Aldrich 6.37E+09 for transfection, follow online protocol from La Roche
trypsin/EDTA Solution Thermo Fischer R001100 for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer

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References

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Biophysik Heft 119 Fluoreszenzmikroskopie FLIM HCA Open Source FRET automatisierte Mikroskopie Arzneimittelforschung
Open Source High Content Analyse Unter Verwendung Automatische Fluorescence Lifetime Imaging Mikroskopie
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