Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Open Source Høy innholdsanalyse Utnytte Automated Fluorescence Lifetime Imaging Mikros

Published: January 18, 2017 doi: 10.3791/55119
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 4, 3, 5, 6, 1, 4, 1,7, 1
1Photonics Group, Department of Physics, Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre, Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry, Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development, Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology, Imperial College London
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en åpen kildekode høy innholdsanalyse (HCA) instrument utnytte automatiserte fluorescens levetid imaging (FLIM) for analyse av protein interaksjoner bruker Förster resonans energi overføring (FRET) basert avlesninger. Datainnsamlingen for denne openFLIM-HCA instrument styres av programvare skrevet i μManager og dataanalyse er gjennomført i FLIMfit.

Introduction

Den økende bruken av automatiserte høy innholdsanalyse (HCA) i stoffet funnet en til analyse sammensatte bibliotekene er supplert med utviklingen i life science grunnforskning mot automatiserte bildebehandling eksperimenter for systematiske studier, for eksempel, for fenotypiske skjermer av siRNA biblioteker. Automatisert HCA blir også stadig viktigere for mindre skala biologiske studier som vanligvis har vært gjennomført med manuelle eksperimenter med titalls retter av celler bilde av med konvensjonell mikroskop. Den statistiske styrken gitt av evnen til å analysere og analysere hundrevis til tusenvis av synsfelt gjør gjennomsnittsberegning av eksperimentell støy (inkludert "biologisk støy") og automatisering av bilde datainnsamling og analyse av store prøve arrays kan bidra til å eliminere operatør skjevhet og ofte kan anvendes for å påvise forekomsten av systematiske feil, for eksempel en endring i IRF profil under et anskaffelse. Fluorescens baserte analyserer mye implementert i HCA, med de fleste kommersielt tilgjengelige HCA instrumentering med fluorescensintensiteten avbildning i en eller flere spektrale kanaler for å kartlegge den relative fordelingen og ko-lokalisering av merkede proteiner. Mer avanserte fluorescens bildediagnostikk, som fluorescens levetid imaging (FLIM), polarisering anisotropi bildebehandling og tids løst fluorescens anisotropi bildebehandling, er ikke allment utnyttes i kommersiell HCA instrumenter, selv om de tilbyr kraftige kvantitative avlesninger, f.eks protein interaksjoner. Her presenterer vi en åpen kildekode tilnærming til implementering FLIM i en automatisert mikroskop for HCA.

Fluorescens levetid gir en iboende ratiometrisk utlesning spektroskopisk som kan brukes for å skille forskjellige molekylarter, eller for å undersøke den lokale molekylære miljø av en fluorofor, og er ufølsom for fluoroforen konsentrasjon, til eksitasjon / gjenkjenning effektivitet, og til virkningen av Scattering og prøve absorpsjon to. Videre, siden fluorescens-levetiden målinger kan gjøres i en enkelt spektral kanal, de er direkte sammenlignbare mellom forskjellige instrumenter og prøver uten kalibrering. De kan brukes til endogene fluoroforer, inkludert noen cellulære metabolitter, lipider og ekstracellulære matriks-komponenter, for å gi avlesninger indre av biologiske prosesser og patologier. Dermed label-free FLIM kan kartlegge metabolske forandringer i cellene 3,4 og har blitt brukt til å overvåke stamcelledifferensiering 5,6 og veksten av kollagen stillaser 7. Vi har nylig vist at FLIM HCA kan brukes til automatisert label-free analyser av cellenes stoffskifte utnytte autofluorescence 8. Mer vanlig blir imidlertid fluorescens levetid målinger og FLIM blir påtrykt eksogene fluoroforer som merke spesifikke biomolekyler, ofte iverksatt ved hjelp av fargestoffer som flekker cellulære avdelinger, ved hjelp av fargestoffer koplet til antilegemers som er rettet mot spesifikke proteiner i faste celler, eller ved hjelp av genetisk uttrykt fluorophores koblet til spesifikke proteiner. Fluorescens levetid kan brukes til å gi robuste kvantitative avlesninger av fluorescerende prober som avføler fysiske eller kjemiske miljø. For eksempler, er fargestoffer er utplassert for å avføle den lokale lipidfasen av cellemembraner 9 eller celle viskositet 10 og genetisk uttrykt fluorescerende protein-baserte biosensorer er blitt utviklet for å rapportere konsentrasjoner av cellesignaliseringsmolekyler inkludert som IP3 11, PIP2 12 og kalpain 13 eller ioner som kalsium 14,15, kalium 16 og 17 klorid.

Mange slike biosensorer utnytte Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 18,19 for å gi avlesninger av endringer i biosensor konformasjon. FRET mellom "donor" og "akseptor" fluorophores skjer via en kort rekkevidde direkte dipol-dipol interaksjonhvor fluoroforer er vanligvis adskilt med mindre enn ~ 10 nm. Dermed påvisning av FRET indikerer nærhet av riktig merkede proteiner og dermed gir et middel for å lese ut protein-protein interaksjoner 20, slik som bindende eller oligomeriseringsprosessen - enten som sluttpunkt i anleggs celler eller som dynamiske hendelser i tidskurs målinger av levende celler. Ved å merke en passende molekyl konstrukt med både donor og akseptor-fluoroforen, er det også mulig å lese ut konformasjonsendringer - eller spaltning - av konstruksjonen via endring i FRET, og dette er grunnlaget for mange biosensorer 21. Målinger av FRET effektivitet kan gi informasjon om donor-akseptor avstand og befolkningen brøkdel av giver fluoroforer gjennomgår gnage. Dermed kan FRET-baserte imaging teknikker brukes til å kartlegge og kvantifisere molekylære interaksjoner i tid og rom, for eksempel for å belyse cellesignalisering prosesser 22. Automating slike bildeteknikker kan gi høy gjennomstrømning analyser basert på avlesninger av signalveier eller nettverk.

I HCA, gnage avlesning oftest implementert er spektral ratiometrisk bildebehandling, der endringer i forholdet mellom akseptor til donor intensitet er kartlagt. Mens denne tilnærmingen er lett gjennomført - og er tilgjengelig i mange kommersielt tilgjengelige multiwell plate lesere - kvantitative spektralt løst FRET målinger krever kalibrering av den spektrale respons av systemet 23. Dette omfatter spektral krysstale som følge av spektral-blø gjennom og direkte eksitering av akseptor så vel som overføringsegenskaper i instrumentet, og prøven (indre filtereffekt). I prinsippet innebærer dette måling av ekstra "kontroll" prøvene som er merket med enten donor-only eller akseptor-bare.

Fra slike spektrale Proporsjonellekspansjon FRET målinger, en effektiv FRETeffektivitet (produktet fra selve FRET effektivitet og fraksjon av FRETing donor / akseptor-molekyler) kan oppnås sammen med den relative andel av donor og akseptor-molekyler 24. Spectral proporsjonal FRET brukes ofte med unimolecular FRET biosensorer, der donor / akseptor støkiometri kan antas å være kjent. For å bestemme populasjons fraksjoner av FRETing donor og akseptor, for eksempel, for å oppnå en dose-respons-kurve, er kjennskap til den aktuelle FRET effektivitet som kreves. Dette kan oppnås ved å måle en positiv FRET kontrollprøve med kjente egenskaper eller ved å anvende en annen metode for å måle den FRET effektivitet, slik som akseptor fotobleking eller FLIM.

Ved å bruke fluorescens-levetiden avlesninger, kan FRET påvises og kvantifiseres ved måling av donor utslipps alene - fjerner behovet for spektral kalibrering og ytterligere kontrollprøver. Dermed kan FLIM FRET leselig sammenlignes mellom instrumenterog mellom forskjellige prøver - slik at data fra endoskopi eller tomografi av levende sykdomsmodeller 25 for å bli vurdert opp mot målinger av cellebaserte analyser. Ved å montere donor fluorescens forråtnelse profiler til en passende multi-eksponentiell modell som tilsvarer FRETing og ikke-FRETing donorpopulasjoner, FRET effektivitet og befolknings fraksjoner kan i prinsippet oppnås direkte uten ytterligere målinger. Disse betydelige fordeler, men kommer på bekostning av FLIM krever mer oppdagede fotoner per piksel enn spektralt løst intensitet bildebehandling - vanligvis hundrevis av fotoner er nødvendig for å oppnå en nøyaktighet på livstid bestemmelse av 10% ved montering til en enkelt eksponentiell modell, og når sittende fluorescens forfallet profiler til komplekse (multieksponensiell) modeller, antall oppdagede fotoner som kreves øker til tusen. Dette har konvensjonelt ført til lange innhentingstider (titalls til hundrevis av sekunder per felt av VIew) for FLIM, spesielt når du bruker tid korrelert enkelt foton telling (TCSPC) implementert med sekvensiell pixel oppkjøpet i laser scanning mikroskop. Forsøk på å øke avbildningshastigheten ved hjelp av høyere eksiteringsfrekvenser intensiteter kan føre til betydelige fotobleking og / eller fototoksisitet. Sammen med en mangel på passende kommersielt tilgjengelige instrumentering og dataverktøy, har dette hindret FLIM blir brukt i HCA for medisiner eller systembiologi, der hundrevis til tusenvis av synsfelt skal avbildes. Laserskanning TCSPC FLIM har blitt implementert i en automatisert multiwell plate mikroskop 26 for sekundær målinger følgende identifikasjon av "treff" av steady-state polarisering-løst fluorescens anisotropi bildebehandling 27, som kan nå lignende bildebehandlings hastigheter til spektral ratiometrisk avbildning 28 som den deler mange fordeler og ulemper. Fluorescens anisotropi bildebehandling utnytter nedgangeni fluorescens anisotrofien av akseptor i nærvær av FRET og er også følsomme for spektral krysstale (f.eks, direkte magnetisering av akseptor). Det krever kalibrering å gjøre rede for polarisering krysstale og gir ikke en direkte måling av FRET effektivitet.

For å realisere fordelene av FLIM for HCA, har vi jobbet for å ta opp spørsmål om hastigheten på bildeopptak og bredere tilgang til teknologi. Her gir vi en oversikt over åpen kildekode programvare og maskinvare komponenter som kan benyttes for å implementere automatisert raske FLIM multiwell plate kortleser som er beskrevet nedenfor, sammen med eksemplar FRET baserte-analyser. I vår tilnærming 29 er FLIM realiseres med vidvinkeltids gated avbildning ved hjelp av en gated optisk bilde forsterker (GOI), som er illustrert i figur 1 som kan gi raskere bildebehandling og lavere fotobleking enn enkeltstråleskanning TCSPC på grunn av parallell pixel interrogation. Vår openFLIM-HCA instrument kan gi uten tilsyn FLIM, krever bare noen få sekunder å innhente FLIM data oppdager noen 100 fotoner per piksel (avhengig av lysstyrken på prøve). Kombinert med den tiden som kreves for å flytte prøven fra forrige synsfelt, for å justere oppkjøpet innstillinger og for å opprettholde prøven i fokus, dette vanligvis resulterer i multibrønnplate innhentingstider av ~ 10 s per synsfelt 25,28. Optisk seksjonering kan implementeres ved hjelp av en kvasi-wide-feltet Nipkow ( "roterende disk») skanner 30.

For FLIM dataanalyse, har vi utviklet en åpen kildekode verktøy kalt FLIMfit 31 som er i stand til å raskt analysere multibrønnplate FLIM datasett på konvensjonelle PC arbeidsstasjoner og er en plug-in for Omero 32. FLIMfit gir global analyse (omtalt i kapittel 1.2) som gjør det mulig FLIM data som skal monteres til komplekse modeller med oNLY noen 100 fotoner per piksel under forutsetning av at fluorescens levetid komponentene er invariant over et bilde eller en region av interesse (ROI), derfor redusere antall oppdagede fotoner nødvendig, lys eksponering for prøven og bildefangsten. Kjører FLIMfit på en standard stasjonær PC, krever bare 10s sekunder av beregnings tid til å analysere datasett bestående av hundrevis av FOVs. Dermed både FLIM datainnsamling og analyse kan foretas på tidsskalaer som er praktisk for HCA.

openFLIM-HCA maskinvare

Vår gjennomføring av FLIM HCA består av seks nøkkelkomponenter: (i) en fluorescens mikroskop ramme med optisk autofokus; (Ii) en motorisert (xyz) mikroskop trinn; (Iii) en eksitasjon laserkilde; (Iv) et bredt felt tids gated FLIM system med gated optisk forsterker (GOI), forsinkelse generator og kamera; (V) en datamaskin for datainnsamling og analyse og (vi) en Nipkow-plate skannerenhet for optisk seksjonert bilde å undertrykke ute av fokus lys. Dette kan være viktig når avbildning svake signaler, f.eks fra FRET biosensorer på celleplasmamembran, som kan bli overbelastet av bidrag fra cytoplasma fluorescens eller bakgrunn fra dekk eller dyrkingsmedium. Time-gated FLIM data er ervervet ved å belyse prøven med ultra pulset eksitasjon stråling, bildebehandling fluorescens utslipp til photocathode av GOI og anskaffe en serie av CCD-bilder av fosfor i GOI for en rekke innstillinger for tidsforsinkelse på den optiske forsterker gate etter ankomsten av eksitasjon pulser. Ettersom tiden portforsinkelsen følgende magnetisering blir øket, blir fluorescens-signalet sett å redusere og rekken av tidsstyrte fluorescensintensitet bilder tatt på CCD danne datasettet som kreves for å analysere råte profiler av alle fluoroforer i synsfeltet . Den gating av GOI er synkronisert til magnetisering pulseneog, for rekken av CCD kjøp, blir forsinkelsen av tidsport i forhold til magnetisering pulser satt til en serie av økende verdier over det ønskede området. Denne synkroniseringen er oppnådd ved hjelp av forsinkelsen generator som består av en "fast forsinkelse box" (gi forsinkelser på opptil 20 ns i 1 ps trinn) og en "grov forsinkelse boksen" som gir forsinkelser med et minimum trinn på 25 ps.

For FLIM kan eksitasjon gis av noen lynraske laser. For enkelhets skyld har vi anvender typisk en fiber-laser-pumpet supercontinuum kilde som gir picosecond pulser avstembar over det synlige spektrum fra hvilken den passende eksitasjonsstråling kan velges for ethvert fluorofor ved hjelp av en motorisert filterhjul med forskjellige båndpassfiltre. Vanligvis bruker vi en gjennomsnittlig strøm på ~ 100-200 μW ved prøven med pulser ved 40 eller 60 MHz repetisjon rate. Slike eksitasjon krefter kan også bli gitt av lynraske laserkilder basert på frekvens dobling avmodus-låst titan dopet safir lasere. Legg merke til at en eksitasjon pulsvarighet under ~ 100 ps er tilstrekkelig for de fleste eksperimenter. Et andre motorisert filterhjul er utstyrt med filtre nøytral tetthet blir brukt til å regulere eksitasjon intensitet. For sikkerhet og komfort, kan eksitasjon strålingen bli levert via en optisk enkeltmodus fiber. De konfigurasjoner for bred-felt FLIM og optisk i snitt FLIM er presentert i figurene 2 og 3 respektivt. For flere detaljer om de nøyaktige komponentene som brukes, kan du gå til openFLIM-HCA wiki 33. En kopi av gjeldende deler liste er gitt i tilleggsmaterialet.

For vidvinkel FLIM, er eksitasjon stråling er nødvendig for å belyse hele synsfeltet så jevnt som mulig. For dette direkte eksitasjon laserstrålen til en holografisk "flosshatt" diffusor som er rotert ved 10-50 Hz til tidsgjennomsnitts laseren speckle, med planet til difvarmeelementet som avbildes på baksiden fokalplan for objektivlinsen mikroskop. Fluorescensen bildet fra utgangsporten av mikroskopet er videresendt til den fotokatode av GOI og fosforet av GOI (aktive område diagonal 18 mm) avbildes på sensoren av en avkjølt vitenskapelig CCD (chip størrelse 10,2 mm x 8,3 mm) kameraet ved hjelp av et par av kameralinser som gir en forstørrelse på 0,7. Systemet styres av en standard PC som har et grensesnitt til instrumenteringen ved hjelp av RS232 protokoller. I tillegg er en Arduino mikroprosessor benyttes til å styre en lukker i eksitasjonslyset banen som er lukket bortsett fra når CCD kamera er å skaffe FLIM data og til å registrere signalet fra en fotodiode som brukes til å måle den gjennomsnittlige strøm fra spektralt filtrert supercontinuum eksitasjon kilde. For optisk kåret FLIM, blir magnetiseringen laserstråling koplet inn i en enkeltmodus polarisasjons-opprettholdende optisk fiber som kan kobles direkte til den Nipkow platen skannerenheten, som shown i figur 3. Utgangen fluorescens bildet fra Nipkow skannerenheten videresendes på fotokatode av GOI og resten av systemet er den samme som for bred-felt FLIM.

openFLIM-HCA programvare

Den datainnsamling programvare er skrevet i μManager 34. Det gir full HCA datainnsamling funksjonalitet inkludert alternativer for å endre rekkefølgen brønnene av platen er avbildet, å tilegne seg tid kurs for alle FOV, automatisk opprettholde fokus under målingene og å kontrollere eksitasjon og emisjon filterhjul og dichroic veksler for automatisert flerfarget bildebehandling. Det er også mulig å kjøre en "Prøve" kjøp av fluorescens-intensitet for automatisk å identifisere og registrere posisjonene på egnede FOVs for en etterfølgende FLIM anskaffelse i henhold til kriterier, for eksempel, basert på intensitet. FLIM HCA data kan lagres som en serieav TIFF-filer, som en serie av OME-TIFF-filer (dvs. én per FOV) eller som en enkelt OME-TIFF-fil som omfatter alle data fra en multiwell plate. Mer informasjon og en detaljert beskrivelse av μManager programvaren kan bli funnet på openFLIM-HCA wiki 33.

Den dataanalyse programvare, FLIMfit 31, en åpen kildekode MATLAB-basert klient for omero bildedata management plattform 32, er i stand til å lese FLIM data fra en omero server eller fra datamaskinen disk, som vist i Figur 4. Det har blitt designet for å analysere data fra TCSPC eller wide-felttids gated FLIM instrumenter og gir mange muligheter til å passe data fra openFLIM-HCA inkludert montering på monoeksponensiell råte profiler, og å doble eksponentiell og høyere kompleksitet forfall profiler, inkludert modeller som polarisering-løst fluorescens forfallet profiler. Det kan også ta hensyn til faste og tidsvarierende bakgrunnssignaler og kan UTIisere seg en følsom rom-tid-instrument responsfunksjon (IRF) eller kan få plass ved hjelp av en idealisert IRF som kan være tidsforskjøvet på en bildeelement-messig basis av en mengde som er bestemt fra den fulle eksperimentelle IRF måling. En global tidsdifferansen (t 0) mellom IRF og en fluorescerende prøve kan bestemmes ut fra en måling av en fluorescens-standard. Romlige variasjoner i bakgrunnssignaler og IRF kan også tas i betraktning. FLIMfit er i stand til å passe FLIM data på en piksel-messig basis eller ved å bruke "global binning" eller "global passende" for å lette montering av FLIM data med beskjedne (hundrevis) foton tall til komplekse råte modeller.

Globalt binning innebærer å samle alle de oppdaget fotoner fra pikslene i en brukerdefinert ROI på hvert tidspunkt å gi tilstrekkelige fotonnumre for å muliggjøre montering til komplekse råte modeller. Avkastningen kan være hele synsfeltet (FOV), kan det være manuelt defined av brukeren, eller det kan bestemmes ved hjelp av bildesegmenteringsverktøy. ROI kan også defineres ved hjelp av masker som importeres til FLIMfit fra andre image segmentering programvare. For FRET applikasjoner, er det vanlig å bruke global binning for å passe til en dobbel eksponentiell modell for å bestemme fluorescens levetid komponenter som tilsvarer FRETing og ikke-FRETing giver fluorophores som antas å være romlig invariant over avkastning og deretter å montere på en pixel-messig basis med disse levetid komponent vales faste for å få den FRETing donor befolkningen brøkdel i hver piksel.

Global montering innebærer samtidig montering av levetids komponenter og FRETing donor populasjons fraksjoner piksel-messig over en hel FOV- eller på tvers av en FLIM datasett som kan omfatte flere FOVs, for eksempel, fra en for flere brønner plate eksperiment eller en tidsserie av fluorescens levetid bilder. Global montering er i stand til å utnytte den romlige variatipå av befolknings fraksjoner over hele bildet som er tapt i den globale binning tilnærming for å gi sterkere begrensninger på komponent levetid estimering - og derfor mer pålitelige resultater - riktignok på bekostning av betydelig mer beregning 35. FLIMfit raskt kan analysere multibrønnplate FLIM datasett med global montering på konvensjonelle PC-arbeidsstasjoner med, for eksempel, en for flere brønner tids-gated FLIM datasett, ervervet med fem tidsporter for hver av 394 FOV hver omfattende 672 x 512 piksler, krever bare 32 sekunder og 2 GB minne for å passe til en dobbel eksponentiell modell 31. Dette er oppnådd ved å benytte et adskillbart ikke-lineær minste kvadraters tilpasningsalgoritmen implementert ved hjelp av flertråds parallelle algoritmer for å muliggjøre effektiv skalering på flerkjerneprosessorer og den FLIMfit koden er optimalisert for å minimalisere minnebruk. Figur 5 viser et øyeblikksbilde av det grafiske brukergrensesnittet til FLIMfitog flere detaljer finner du på nettsiden gitt i referanse 36. Ytterligere informasjon om global montering og global binning kan bli funnet i referanse 31.

Følgende protokoll for FLIM HCA bruke vår openFLIM-HCA instrumentering og programvare kan tilpasses et bredt spekter av celle bildebehandling eksperimenter med FLIM avlesninger. Generelt, for flere brønner plate FRET eksperimenter bør være utformet for å omfatte duplikate brønner av positive og negative biologiske kontroller i tillegg til de forholdene som studeres. Her beskriver vi spesifikke implementasjonen for å utføre optisk kåret FLIM (se figur 3) av COS-celler som uttrykker FRET-konstruksjoner som består av det mTurquoise fluorescerende protein og Venus fluorescerende protein sammen med en kort peptidlinker. Her mTq32V, mTq17V og mTq5V FRET konstruksjoner (omtalt i Representant Resultater seksjon) gir lav, middels og høy FRET effektivitet sammen med den ikke-FRETing mTq5A konstruere.Disse konstruksjonene og andre materialer som kreves for å følge denne protokollen er oppført i Materials List.

Protocol

1. Utarbeidelse av flere brønner Plate Array

  1. Forbered en løsning av 75 mikrometer Kumarin 6 i etanol (ź ~ 2,43 ns) for referansemålinger for å muliggjøre bestemmelse av t 0.
  2. Seed 150.000 Cos celler i fire brønner på en 6 brønners plate og tillate å feste natten i dyrkingsmedium (se Materials List).
  3. Transfektere en brønn hver med mTq5A, mTq5V, mTq17V og mTq32V bruker en kommersiell transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner og kultur i 24 timer.
  4. Løsne cellene ved hjelp av en kommersiell trypsin / EDTA-løsning i henhold til produsentens protokoll.
  5. Pipettes 5000 COS-celler suspendert i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) som uttrykker mTq5A inn i hver av brønnene A1-G3 av en # 1.5 tykkelse glassbunn 96 for flere brønner plate som tidligere er blitt behandlet med poly-L-lysin. Gjenta for mTq5V uttrykke celler i brønner A4-G6, mTq17V i brønner A5-G9 og mTq32V i brønner A10-G12. La vel H1 tom (for å gi måling av eventuell statisk bakgrunn fra flere brønner plate).
  6. Pipetter 200 ul HBSS bare i godt H2 (for å tilveiebringe målinger av en hvilken som helst bakgrunnssignalet fra cellekulturmediet).
  7. Pipette 5000 ikke-transfekterte celler i HBSS inn vel H3 (for å gi måling av bakgrunnssignal fra mobilnettet autofluorescens).
  8. Pipetter 200 mL av 75 pM Kumarin fargestoffløsning i tillegg H4 (for å tilveiebringe en sjekk på en hvilken som helst variant av t 0 i løpet av flere brønner plate anskaffelse, for eksempel på grunn av endringer i omgivende temperatur eller for fluktuasjoner i laser eller tidskretser.

2. openFLIM-HCA Data Acquisition

MERK: Detaljert informasjon finnes på openFLIM-HCA wiki 33.

  1. Begynn μManager og OpenFLIM-HCA Plugin
  2. Velg kalibreringsfilen for den spesifikke kombinasjon av forsinkelsesgeneratorenheten oglaser repetisjon sats under "FLIM kontroll: Delay box kalibrering fil: Kalibrering filer".
  3. Sett mappen hvor dataene lagres under "Fil: Set Base Folder".
  4. Sjekk eksitasjon strålebanen for å sikre at koplingen inn i den optiske levering fiber er stabil, og at koblingseffektiviteten maksimeres ved å måle kraften overføres gjennom levering fiber ved hjelp av en kraftmåler. Svingninger lavere enn 5% er akseptabelt.
  5. Sjekk at GOI utløser er stabil ved å vise skjermutgangen signal fra GOI på et oscilloskop utløst av GOI inngangstriggersignal.
  6. Sjekk avbildning av GOI fosfor på CCD-sensoren ved å dekke photocathode av GOI, sette sin gevinst til 750 V og fokusere en av stafett objektiver slik at bilder av spredte enkeltfoton hendelser (på grunn av bakgrunnslyset lekker om GOI dekselet ) registrert på CCD er så skarpe som mulig.
  7. Sjekk at prøvensynsfelt blir jevnt belyst ved avbildning av en ensartet fluorescerende prøve, slik som en dråpe av referansefargeoppløsning på et dekkglass ved å bruke en tilstrekkelig lav magnetiseringseffekt (<1 μW) for å sikre at GOI ikke er mettet.
  8. Velg riktig plate definisjonsfilen, dvs. velg alternativ for 96-brønners plater ( "File: Load Plate egenskaper").
  9. Bruke μManager GUI, sørge for at det ikke er noen dichroic stråledeler kube i mikroskop rammen ved å velge en tom posisjon.
  10. manuelt velge en port bredde på 4 ns ved GOI for hele forsøket.
  11. Acquire IRF bildedata:
    1. Bruke μManager GUI, sørge for at det ikke er noen mikroskop objektiv i strålebanen ved å velge en tom posisjon. sette inn manuelt et sort anodisert bjelke blokk over målet dreiehodet for å hindre enhver laserlys rømmer og vinkel for å minimere eventuelle refleksjoner tilbake inn i mikroskopet rammen.
      2. <li> Bruke μManager GUI, satt filtrene i CSUX (eksitasjon, dichroic, Emission) slik at brøkdel av eksitasjon lys som spres fra spinne Nipkow disken kan avbildes, men at intensiteten er ikke tilstrekkelig til å mette systemet for en 200 ms CCD integrasjonstiden. Dette er for å unngå å utsette GOI photocathode til for mye lys, noe som kan skade photocathode.
    2. Bruk Finn MaxPoint funksjon over hele spekteret av forsinkelsene som omfattes av den programmerbare rask forsinkelse boks. Kontroller utgangs diagrammet vises og deretter justere den manuelle selvfølgelig forsinkelse boks ved å trykke på fremover-knappen slik at full IRF profilen er innenfor skanneområdet for rask forsinkelse boksen.
    3. Juster oppkjøp parametere (Nøytral tetthet, eksponeringstid, Frame opphopning) slik at CCD er ikke mettet i de lyseste tids gate og effektiv integrering tid er> 200 ms.
    4. Forsinkelse trinn på 25 ps over hele forsinkelsen range ( "FLIM kontroll: Fast forsinkelse boks: Fylle forsinkelser").
    5. Acquire IRF bilde ved å trykke "Snap FLIM image".
    6. Erverve et bakgrunnsbilde ved å blokkere laser ( "Light bane kontroll: Nøytral tetthet: blokkert"), redusere antall forsinkelser ( "FLIM kontroll: Fast forsinkelse boks: Gjeldende forsinkelsesinnstillingen (ps)"), la alle andre egenskaper uforandret og trykk "Snap FLIM image".
  12. Acquire referanse fargestoff data:
    1. Velg vel H4 som ved hjelp av μManager GUI ( "XYZ kontroll: Gå til godt: H4").
    2. Bruke μManager GUI, velger filtre (Magnetiseringsutkobling 434/17 nm, dichroic, Emission 482/25 nm) for å avbilde mTqFP.
    3. Bruk Finn MaxPoint funksjon over hele spekteret av den raske forsinkelse boksen og deretter justere grov forsinkelse boksen så full forfallet profilen er innenfor forsinkelsen området for rask forsinkelse boksen.
    4. Sett forsinkelsetil poenget med maksimal intensitet ved å endre "FLIM kontroll: Fast forsinkelse boks: Gjeldende forsinkelsesinnstillingen (ps)". Juster oppkjøp parametere (Nøytral tetthet, Eksponeringstid) slik at CCD ikke er mettet.
    5. Forsinkelse trinn på 25 ps over hele forsinkelsen utvalg ( "FLIM kontroll: Fast forsinkelse boks: Fylle forsinkelser).
    6. Acquire henvisning fargestoff data ved å trykke "Snap FLIM image".
    7. Tilegne seg en annen bakgrunn CCD kamerabildet ved å blokkere eksitasjon laser (se 2.11.7)
  13. Acquire FLIM data fra flere brønner plate prøven ved å bruke μManager oppkjøpet programvare:
    1. Angi hvilke brønner skal avbildes og antall FOV som kan erverves per brønn ( "Setup HCA sekvensert oppkjøpet: XYZ stillinger").
    2. Velg Manuelt et eksemplar FOV som inneholder prøven som skal avbildes. Bruk denne FOV å finne den optimale nøytral tetthet filter, gate bredde på GOI ogintegreringstiden til kameraet, slik at for å nå 75% av det dynamiske område for CCD-kameraet.
    3. Sett autofokus ( "XYZ kontroll: Autofokus"): Trykk på "Tilbake fokus kontroll only", og deretter manuelt fokusere på cellene eller strukturen av interesse. Sett "Autofokus søkeområdet" til 2000 mikrometer og trykk "Enter". Trykk "AF nå" for å starte en autofokus prosedyre. En offset verdi vil dukke opp i feltet "FocusOffset (Autofokus)".
    4. Skriv inn forskyvningsverdien oppnådd i 2.13.3 inn i "AF offset" og gjenta autofokus prosedyren to ganger ( "AF nå") for å kontrollere at offset verdien er nå null, noe som indikerer riktig funksjon av autofokussystemet.
    5. Bruk "AutoGate" -funksjonen i OpenFLIM-HCA oppkjøpet programvare for å velge en logaritmisk prøvetaking av forsinkelsen poeng. Alternativt kan disse velges manuelt, se seENCE 36 for mer informasjon.
    6. Sett "Accumulate Frames" til en verdi som gir ønskede totale datafangsten. Økning av antallet oppsamlede rammer øker signal-til-støy-forholdet av de FLIM data på bekostning av også å øke total FLIM datainnsamling tid.
    7. Kjør FLIM oppkjøpet av flere brønner plate ved å trykke på "Start HCA sekvens" -knappen.
  14. Erverve ytterligere bakgrunns CCD kamerabildet ved å blokkere eksitasjon laser (se 2.11.7) med identiske oppkjøps innstillinger som brukes for FLIM datainnsamling.

3. openFLIM-HCA Data Analysis Bruke FLIMfit

  1. Sjekk at nødvendige hjelpefiler for FLIM dataanalyse er til stede (dvs. IRF og referanse fargestoff måling).
  2. Laste data fra den tomme brønnen (H1), en brønn inneholdende kulturmedium (H2) og brønnen inneholdende umerkede celler i kulturmedium (H3) i FLIMfit( "File: Load FLIM data") for å sjekke om det er noen bakgrunns bidrag større enn 1% av signalet fra cellene uttrykker "donor-only", dvs. i brønner A1-G3.
  3. Forbered en tidsvarierende fil bakgrunn (TVB) ved å laste den godt med kultur medium i FLIMfit ( "File: Load FLIM data"). Sett inn kameraets bakgrunnsdata anskaffet i avsnitt 2.14 ( "Bakgrunn: Load Bakgrunn") og bruk FLIMfit option "Verktøy: Lag TVB Intensitet Map" for å generere TVB. Se referere 31 for mer detaljer om TVB.
  4. Klargjør romlig varierende IRF Shift kart ved å laste IRF data ervervet i avsnitt 2.11 og trekke fra CCD-kamera bakgrunn ervervet i avsnitt 2.11.7. Bruk FLIMfit option "Verktøy: Lag IRF Shift Map" for å beregne romlig varierende IRF Shift kart. Se referanse [31] for flere detaljer om IRF Shift kart.
  5. Monter en monoexponential forfall til referanse fargestoff data ervervet i avsnitt 2.12. Load henvisning fargestoff og romlig varierende IRF kart beregnet i avsnitt 3.4, satt fit parametre ( «Lifetime: Nei Exp: 1") med t 0 sett som en montert parameter ( «Lifetime: FIT IRF Shift: Tilpasset"). Verdien av t 0 oppnådde deretter rapportert i tabellen vist i "Parameters" -kategorien.
  6. Analyser FLIM data ved å laste de eksperimentelle FLIM data ervervet i avsnitt 2.13, romlig varierende IRF kart beregnet i avsnitt 3.4, kameraet bakgrunn ervervet i avsnitt 2.14, den TVB filen utarbeidet i avsnitt 3.3 og skriv inn den negative verdien av t 0 innhentet i kapittel 3.5 ( "IRF: IRF skift: t 0"). Deretter tilpasse de eksperimentelle data til den ønskede nedbrytning modellen ved hjelp FLIMfit 36 i henhold til kravene i eksperimentet.

Representative Results

For å illustrere egenskapene til openFLIM-HCA instrumentering, presenterer vi tre Exemplar FRET applikasjoner. Det første gjelder FRET konstruksjoner som er tilpasset fra FRET modell konstruksjoner utviklet av Stephen Vogel laboratorium 38. De består av en serie av genetisk uttrykk fluorescerende konstruksjoner der en donor fluorescerende protein (mTurquoise) er knyttet til en akseptor fluorophore (Venus) etter kort kontrollerte lengder på 5, 17 og 32 aminosyrer (mTq5V, mTq17V, mTq32V). De forskjellige linker lengder mellom donor og akseptor fluoroforer resultere i forskjellige FRET effektivitet og derfor forskjellige donor levetid. For å gi en negativ kontroll, Venus i kort 5-amino-syre linkeren konstruksjonen erstattet med Amber - en ikke-fluoriserende mutasjon av YFP (mTq5A) som ikke kan fungere som et FRET-akseptor 38. Vi erstattet Cerulean i de opprinnelige pCXV og pC5A vektorer ved restriksjons fordøye VectORS med NheI og Bglll enzymer og ligere mTurquoise fragmenter fordøyd med de samme enzymene fra pmTurquoise-N1 vektor. Linker regionen ble umodifisert av denne erstatningen.

Figur 6 viser et eksemplar FLIM FRET analyse ved bruk av denne modellen system uttrykt i COS-celler, hvori en flerbrønn platen er kledd med 3 kolonner hver av celler transfektert med den negative kontrollen (kolonnene 1-3), 5-amino-sur linker FRET konstruere (kolonnene 4-6), 17-aminosyre-linker FRET konstruere (kolonnene 7-9) og den 32 aminosyre-linker FRET konstruere (kolonnene 10-12). Row H inneholder brønner for TVB estimering. Figur 6 (a) viser eksempler på automatisk ervervet fluorescens levetid bilder av typiske synsfelt i hver brønn. Det er klart at den negative kontrollen (kolonnene 1-3) frem den lengste levetid, og at den giver levetid er lavest for det FRET konstruere med kortest linkeren lenGTH (kolonnene 4-6). Figur 6 (b) viser hvordan den midlere levetid midlet over alle FOVs i hver brønn varierer mellom flere brønner plate. Figurene 6 (c) og (d) viser Exemplar donor fluorescens intensitet-fusjonerte levetid kart for en FOV av mTq5A og mTq17V hhv. Figur 6 (e) viser donor fluorescensintensiteten forråtnelse profil midlet over alle cellene fotografert i brønn A1, sammen med den passer til en monoeksponensiell forråtnelse modell og IRF (som er dominert av den GOI porten bredde). Figur 6 (f) viser den gjennomsnittlige fluorescens levetid for hver kolonne med flere brønner plate oppnådd fra en piksel-messig monoeksponensiell passform. En tabell av den midlere levetid og standardavvik (STD) kan finnes i Tabell 1 nedenfor. Datainnsamlingen for bildene som er vist i figur 6 tok ca 160 min å skaffe. Analysen tok 92 s på en 2,6 GHz maskin med 10 kjerner og 64 GB RAM.

Den andre eksemplar forsøk viser anvendelsen av FLIM FRET for å lese ut den oligomerisering av HIV-1 Gag under monteringen av HIV-1 viruspartikler som et middel for å teste inhibitorer av denne prosessen 25,42. Som uttrykker HIV-1 Gag i hensiktsmessige vertsceller gir et modellsystem for denne fasen av HIV-1 livssyklus, siden det fører til dannelse av viruslignende partikler (VLP) som er lik umodne HIV-1-virioner. For denne analysen, uttrykte vi HIV-1 Gag protein smeltet sammen med CFP i HeLa celler og sammenlignet virkningen av forskjellige hemmere via deres innvirkning på FRET signal som resulterte fra Gag oligomeriseringsprosessen. Detaljer om hemmere som brukes er gitt i referanse 42.

Detaljene i prøveopparbeidelse og eksperimentelle målingene er beskrevet utførlig i referanse 25, hvor vi viste at vi kunne bruke FLIM å lese ut both heteroFRET mellom aggregere Gag proteiner merket stokastisk med CFP og med YFP, og også homoFRET i celler som uttrykker bare Gag merket med CFP. Selv om homoFRET ikke vanligvis utgjøre en endring i donor levetid, gjør det for det spesielle tilfellet av CFP hvor fluoroforen eksisterer i to isomerer med forskjellige midlere fluorescens levetid 40,41. CFP homo-FRET avlesning har fordeler av forenklet prøveopparbeidelse i forhold til CFP / YFP hetero gnage og er mer spektral effektiv, noe som kan være viktig for multipleksede FRET leselig.

Vår tidligere arbeid søkt FLIM FRET å analysere den Gag oligomerisering i nærvær av en N-myristoyltransferase (NMT) inhibitor 42. Denne inhibitor forstyrrer de endogene enzymer som er ansvarlige for tilsetning av myristinsyre til Gag, noe som gjør det mulig Gag-proteiner til å binde til plasmamembranen og er en forutsetning 43 i dannelsen av HIV-virioner ellerVLP. Vi viste at både heteroFRET og homoFRET avlesninger kan oppnå Z 'på> 0,6 i responsstudier dose med en NMT-hemmer. Z 'er en parameter som brukes i den farmasøytiske industri for å indikere kvaliteten på et assay, og representerer forskjellene i middelverdier av de positive og negative kontroller og deres relative sprer seg for å generere en enkelt verdi beregning av analysekvalitet - med Z'> 0.5 blir vurdert "excellent" for en farmasøytisk analyse 44. Vi merker oss at dette utmerkede resultater ble oppnådd med prøver hvor endringen i midlere donor levetid var av størrelsesorden 300 ps - demonstrere den statistiske kraften til å analysere FLIM data for et stort antall celler, som muliggjør nyttige avlesninger for å kunne realiseres ved bruk av mye mindre endringer i fluorescens levetid enn det som er mulig med de typiske antall celler fotografert i manuelle mikros eksperimenter.

Her presenterer vi en multiwell plate FLIM slite datasett sammenligne 4 inhibitorer for HIV Gag oligomeriseringsprosessen (utpekt ICL13, ICL14, ICL15 & ICL16). For dette eksperimentet, benyttet vi den homoFRET avlesning med HeLa-celler transient transfektert med Gag-CFP plasmid. Til sammen ni forskjellige doser av hver inhibitor ble påført etter den protokoll som er beskrevet i referanse 32, slik at to tilbakevendende brønner pr tilstand. Som en positiv kontroll, kolonne 1 viser celler som uttrykker myr-Gag, en mutert Gag-protein som mangler den myristinsyre gruppe, kan dette ikke kan danne VLP og så simulerer total hemming. En negativ kontroll ble gitt ved doserings celler som uttrykker Gag-CFP bare med bare kjøretøy som brukes til å levere inhibitorene i de andre kolonner (kolonne 11). Totalt åtte FOV ble kjøpt per brønn.

Data ble utstyrt med en enkelt eksponentiell modell på en piksel-for-piksel basis og fluorescens levetid plate kart som viser den gjennomsnittlige levetid per brønn (i løpet av alle bildepunkter over intensiteten terskel tvers over de åtte synsfelt) er vist nedenfor i Figur 7 (a). Figur 7 (b) viser den tilsvarende plotting av fluorescens levetid som en funksjon av inhibitorkonsentrasjon. Tre av inhibitorene viser en inhiberende effekt (ICL13, ICL15 og ICL16) når de inkuberes med celler som uttrykker Gag-CFP. En inhibitor (ICL14) viser ingen effekt på noen dose testet. Z 'som beregnes for denne plate var 0,51. Resultatene oppnådd for de positive og negative kontroller verdier er vist på figur 7 (b) som punktene i sort ved 100 uM og 0,1 nM.

Doseresponskurver for ICL13, ICL15 og ICL16 er vist på figur 7 (b) ble så satt på fire parameters logistisk ikke-lineær regresjonsmodell med Hill-koeffisienten er festet til en 45 med maksimum og minimum levetid festet tilverdier oppnådd fra den positive (kolonne 1) og negative (kolonne 11) styrer henholdsvis. De returnerte IC 50-verdier for de tre kurvene var da: 38 nM, 24 nM og 116 nM for ICL13, ICL15 og ICL16 hhv. For sammenligning med IC 50 verdier oppnådd gjennom intracellulær FLIM FRET målinger, bestemt vi IC 50 for hemming av enzymatisk aktivitet av rekombinant humant NMT1 i vår tidligere rapportert biokjemiske enzym assay 42. De tre forbindelser som finnes å være aktive ved FLIM FRET er også de mest aktive i denne analysen (IC50-verdier på 17 nM, 51 nM og 39 nM for ICL13, ICL15 og ICL16, henholdsvis), med ICL14, som viste ingen signifikant respons i FLIM FRET analysen, blir ca. 100 ganger mindre aktiv mot NMT1 (IC50 på 1700 nM). For de aktive forbindelsene, de IC 50-verdier innhentet gjennom disse uavhengige analyse modaliteter er påfallende like, med små variasjoner sannsynlig tilskrives differences i opptak eller metabolismen av forbindelsen i celler.

Denne lille studien belyser evne FLIM HCA for å diskriminere styrken av forskjellige forbindelser som virker på det samme mål av interesse. Vi tror at det er den første demonstrasjon av en skjerm ved hjelp av automatisert FLIM i et høyt innhold sammenheng til å generere multiple doseresponskurver og illustrerer potensialet for FLIM som skal brukes på skjermen i og / eller karakterisere nyttige terapeutiske forbindelser.

Det tredje eksemplar FLIM FRET eksperiment gjelder en genetisk uttrykt FRET biosensor for Exchange protein aktiveres av syklisk adenosin monofosfat (cAMP (EPAC)), som er en Rap-en guanin utveksling faktor som binder seg spesifikt til cAMP. Dette EPAC FRET biosensor (EPAC-S H188) benytter mTurquoise2 fluorescerende protein (mTq2FP) som donor fluoroforen og inkorporerer to Venus-FP å gjennomføre en composite akseptor 46. cAMP er en allestedsnærværende andre budbringer og er involvert i en mengde intracellulære prosesser gjennom mange forskjellige organismer. Det er syntetisert av adenylatsyklase fra omdannelsen av ATP i cellemembranen. Her viser vi vår evne til å lese ut og kvantifisere dets aktivitet i levende HEK293T celler etter tilsetning av forskolin, en adenylatsyklase aktivator som oppregulerer intracellulær produksjon av cAMP og øker derfor dets cytoplasmiske konsentrasjon. Dette EPAC sensoren undergår FRET i sin inaktivert (ubundet) tilstand og dens donor levetid øker med cAMP konsentrasjon som cAMP fører til åpning av biosensoren. Mono-eksponentiell profil mTq2FP gjør denne biosensor bedre egnet for kvantitativ levetid analyse enn CFP-baserte biosensorer 45. Figur 8 viser et eksempel på en gang selvfølgelig spilt inn ved hjelp av automatiserte multiwell plate FLIM mikroskop hvor vi har plottet endringeni gjennomsnittlig levetid og endringen i den FRETing donorpopulasjon brøkdel over tid etter tilsetning av 100 uM forskolin. For enkelhets skyld antar vi at det totale signalet kan beskrives med en blanding av monoeksponensiell FRETing og ikke-FRETing donorer og befolkningen fraksjon av det aktiverte EPAC FRET biosensor ble oppnådd ved å montere en dobbel eksponentiell profil på tvers av tidsserien.

For datainnsamling av cAMP (EPAC) fem gate forsinkelser, med en port bredde på 4000 ps, ​​ble valgt med forsinkelsestiden satt til 1300 ps, ​​4300 ps (peak intensitet), 4919 ps, 6656 ps, 8035 ps, 1, 0391 ps og 16000 ps. Kameraet integrasjonstiden for hver forsinkelse var 250 ms. På et godt, kjøpte vi en FLIM tidsforløpet med bilder ervervet hver 10 s over 10 min. Datapunktene ble anskaffet tider 120 s og 130 s ble fjernet fordi tilsetningen av forskolin forårsaket en liten forskyvning i den sentrale posisjon av prøven og dermede av fluorescensintensiteten registrert i løpet av de FLIM anskaffelser ved disse tidspunkter.

For dataanalyse bildene ble lastet inn FLIMfit og segmentert per celle. Fluorescens levetid data ble tilpasset til en dobbelt eksponentiell modellen ved hjelp av en IRF og en fast t 0-verdi oppnås fra en referansefarvestoff (75 pM Kumarin 6). Donor fluorescens bety levetid midlet over alle celler er vist på figur 8 (a). Figur 8 (b) viser endringen i FRETing populasjon brøkdel over tid beregnes ved å tilpasse de samme FLIM data i den samme dobbelt-eksponentiell modellen

ligning 1

der β er FRETing donor fraksjonen. Vi antar en blanding av FRETing og ikke-FRETing elements for tidspunkter før tilsetning av forskolin. For å oppnå disse livene, ble en dobbel eksponentiell tilpasning påført de første tre tidspunkter som gir en levetid på τ 1 = 3964 ± 21 ps for ikke-FRETing donor, og τ 2 = 3022 ± 27 ps for FRETing donor. Disse ble fiksert for den etterfølgende tilpasning av hele datasettet for å oppnå p-verdiene ved hvert tidspunkt.

Oppsummert har vi presentert Exemplar FLIM HCA resultater for tre eksperimentelle prøver. Den første var en 96-brønners plate kledd med Cos celler som uttrykker FRET-konstruksjoner som omfatter et mTqFP donor er knyttet til enten et Venus FP-akseptor eller et ikke-fluorescerende Amber konstruksjon av varierende lengder av peptid-linker. Endringen i FRET effektivitet og derfor donor levetid med linkerlengde er klart synlig, og standardavviket av den midlere levetid for hver konstruksjon var mindre enn 36 ps. Den andre eksemplar assay var en "skjerm" av fire potensielle inhibitorer for myristoylation av HIV Gag-protein hvor% inhibering ble beregnet ut fra variasjonen av midlere donor fluorescens levetid med inhibitor-konsentrasjon målt i HeLa-celler som uttrykker gag protein merket med CFP. Denne avlesning er basert på homoFRET, noe som vanligvis ikke ville utgjøre en endring i donor levetid, men gjør for CFP fordi dette finnes i flere isomerer med forskjellige fluorescerende levetid. Dette kan være nyttig når det gjelder spektral effektivitet, for eksempel, for multipleksing ulike FRET leselig 25. Det tredje eksemplar analysen var et tidsforløp overvåking levende HEK293T celler som uttrykker cAMP FRET biosensor, EPAC. Dette viste den forventede respons etter behandling med forskolin og anvendelsen av FLIMfit bruke en dobbel eksponentiell modell med antall oppdagede fotoner være i samsvar med levende celle bildebehandling - som vi tidligere har vist med LIBRA FRET biosensor for IP3 47.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av vidvinkeltids gated FLIM bruke en gated optisk bilde forsterker (GOI). Venstre side viser et skjematisk riss av det eksperimentelle system. Øverst til høyre, skjematisk av eksitasjon puls, plassering av tidsstyrte bilder og monoeksponensiell tilpasning til data. Nederst til høyre, tegneserie som viser fluorescens nedbrytning fra de to objektene vist i det eksperimentelle system. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Skjematisk av vidvinkel openFLIM-HCA bruker en gated optisk bilde forsterker (GOI). Se hovedteksten for mer detaljert beskrivelse avsystemkomponenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Skjematisk av optisk delt openFLIM-HCA bruker en gated optisk bilde forsterker (GOI) med en Nipkow plate skannerenheten. Se hovedteksten for mer detaljert beskrivelse av systemkomponenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Skjematisk av bildedataflyt fra Manager anskaffelsesprogram for å omero server eller datamaskin disk og inn FLIMfit for analyse. Dataflyt starter i øverste l eft hjørne hvor rå bildedata er ervervet i μ-Manager oppkjøpet programvare. Elementene i stiplet ramme representerer stadier av FLIM dataanalyse, mens de utenfor svarer til datainnsamling og lagring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Skjermbilde av FLIMfit brukergrensesnitt. Øverst til venstre, liste over synsfelt som er lastet inn og fluorescens intensitet bilde på den valgte synsfelt. Nederst til venstre, valg av passende modell og montering forhold. Øverst til høyre, fluorescens forfall for gjeldende område av interesse (blå sirkler), passer til data (rød linje), IRF (rød stiplet linje) med passe rester under (blå linje).g5large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. multiwell plate FLIM av FRET modell konstruerer mTq5V, mTq17V, mTq32V uttrykt i Cos celler. (A) Exemplar fluorescens levetid bilder av FOV i hver brønn for ulike FRET konstruksjoner uttrykt i Cos celler som omtalt i teksten. (B) varmekart over gjennomsnitts Venus fluorescens levetid, fordelt på alle celler i hver brønn. (C) intensitet bilde av mTurquoise Amber kledde med livstidskart (skala bar 20 mikrometer). (D) intensitet bilde av mTurquoise Venus (17 aminosyre) kledde med livstidskart (skala bar 20 mikrometer). (E) målt intensitet forfall profil (blå sirkler) av mTq5A konstruere (negativ kontroll) fluorescens midlet over alle cellene fotografert i brønn A1, sammen med tilpasning av dataene til en monoeksponensiell forråtnelse (blå heltrukket linje) og IRF (stiplet linje orange). (F) graf over gjennomsnittlig levetid i gjennomsnitt over hver kolonne over flere brønner plate, med feilfelt som viser standardavviket i fluorescens levetid mellom synsfelt. For (ad) levetid verdiene er representert ved hjelp av en falsk fargeskala med de angitte grensene i picoseconds. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Forbilde multiwell plate FLIM skjermen på Gag hemmere ved hjelp av HeLa-celler som uttrykker Gag-CFP. (A) Varme kart over gjennomsnittet donor fluorescens levetid per brønn for multiwell plate kledd med kolonne en presenterende celler transfektert med myr-Gag-CFP som en positiv e kontroll for inhibering, kolonne 11 presenterende celler transfektert med Gag-CFP utsatt for kjøretøy bare, og de stiplede fargede firkantene angir de brønnene som ble dosert med en av de fire forskjellige inhibitorer med konsentrasjoner i området fra høy dose kolonne 2 til lavdose kolonne 10 . den falske fargeskalaen representerer gjennomsnittlig fluorescens levetid som strekker seg fra 2200 ps til 3100 ps. (B) plotter fluorescens levetid for hver inhibitor med feilfelt som viser standardavviket mellom gjentatte brønner. Punkter i svart på 2 og -4 på den horisontale akse er de positive og negative kontrollpunkter på henholdsvis erholdt fra kolonne 1 og 11 henholdsvis. De heltrukne linjer angir en tilpasning til doseresponskurven data for de forskjellige inhibitorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

gur 8 "src =" / files / ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg "/>
Figur 8. forbilde bruk av FLIM å lese ut EPAC FRET biosensor i en time-lapse måling med HEK293T celler. Endring i (a) betyr fluorescens levetid og (b) fraksjon av FRETing donor som en funksjon av tid etter tilsetning av forskolin angitt ved den grønne linjen. Feilsøylene viser standard feil per celle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

per Vel STD ERR per Vel STD ERR
mT5A 4008 32 12 MT17V 3004 26 10
mT5V 2717 35 1. 3 mT32V 3133 30 11

Tabell 1. Gjennomsnittlig levetid og standardavvik (STD) av båndet konstruksjoner.

Discussion

Vi har beskrevet en automatisert multiwell plate mikroskop designet for HCA bruker tid-gated FLIM. Dette instrumentet styres ved hjelp av åpen kildekode programvare skrevet i μManager med mulighet for å lagre data til en Omero server og FLIM dataanalyse blir gjennomført ved hjelp FLIMfit 36, en åpen kildekode program skrevet i Matlab og tilgjengelig som en omero klient 32 μManager instrument kontroll programvare, openFLIM-HCA, er tilgjengelig på nettet 33 med en liste over de systemkomponenter 48 for å muliggjøre akademiske forskere til å konstruere sine egne FLIM HCA instrumenter.

For å skaffe robuste FLIM data, er det nødvendig å optimalisere GOI og CCD oppkjøp innstillinger og å ta hensyn til eventuelle variasjoner i t 0. Som beskrevet i 3.8.2, bør GOI forsterkningsinnstillingen og CCD-kamera integreringstiden settes til nå ~ 75% av CCD dynamisk område. Usynge høyere GOI spenninger og flere CCD ramme ansamlinger ved hvert tidsportforsinkelsen øker signal-til-støy-forhold 49, men dette øker den totale FLIM innhentingstiden (siden færre fluorescens-fotoner er ervervet for hver ramme før CCD kamera mettede og slik at antall ramme ansamlinger bør økes) og så denne avveiningen bør avgjøres for hvert forsøk. Kalibreringen av forsinkelsesgeneratoren avhenger av laserrepetisjonstakten, og det er derfor nødvendig å sikre at den riktige kalibrering fil for repetisjonsfrekvensen som brukes er lastet inn i anskaffelse programvare. Prosedyren for kalibrering av forsinkelsen boksen kan bli funnet på openFLIM-HCA wiki 33.

Dersom den cellulære autofluorescens er lav i forhold til den fluorescens-signalet, bruker vi signalet fra en brønn som inneholder bare kulturmedium for å tilveiebringe den tidsvarierende bakgrunn (TVB). For å minimere bakgrunnsfluorescensen fra cellekulturmediet, unngår vimedier som inneholder fenol rødt. Dersom den cellulære autofluorescens er vesentlig, da det TVB kan utledes fra målinger av de umerkede celler. Men i dette tilfellet hensyn må tas, da dette forutsetter at autofluorescens bakgrunn er det samme for hver piksel i bildet. Denne forutsetningen vil ikke være gyldig hvis autofluorescence varierer betydelig over en celle eller hvis eksitasjon bjelke eller følsomhet er ikke ensartet over synsfeltet.

Kjøpet av en IRF bilde ved hjelp av spredt eksitasjon lyspulser gir tinning IRF profil som er foldet med datamodellen i tilpasningsprosessen og gir også et kart over den romlige variasjonen av IRF over synsfeltet. IRF kan måles ved å avbilde et spredningsprøve, slik som en kolloidal suspensjon, selv om, i vårt instrument, ved hjelp av eksitasjonslys som spres fra den Nipkow disk gir en renere måling av IRF. Nøyaktig bestemmelse av tidspunktet of IRF er viktig fordi feil i tidsforsinkelsen mellom eksitasjon og tidsportstyring i betydelig grad kan påvirke tilpasningsprosessen, særlig når passende til komplekse eksponensiell desintegrasjon modeller. IRF anskaffet ved hjelp spredt eksitasjon lys er ikke akkurat det som er nødvendig for tilpasningsprosessen fordi den er spilt inn på eksitasjon bølgelengde i stedet for på fluorescensemisjonen bølgelengde, noe som kan påvirke sin timing, selv om den romlige variasjonen av IRF bør være den samme på begge bølgelengder. I tillegg kan den spredte IRF bli globalt forskjøvet i tid i forhold til den sanne IRF på grunn av en forskjellig optisk veilengde fra det spredende objekt, slik tilfellet er for en IRF anskaffet fra Nipkow disken i optisk kåret FLIM. Denne korreksjonen, t 0, som er det aktuelle globale tidsmessige skift som skal brukes til det oppkjøpte spredt eksitasjon lys IRF, er beregnet ut fra monoeksponensiell henvisning dye data som angitt i Protocol trinn 4.4. Følgende fargestoffer kan brukes for forskjellige eksitasjonsbølgelengdene: en 75 uM Coumarin 153 oppløsning i metanol (τ ~ 4,3 ns 50) kan benyttes for eksitering i området 295-442 nm; en 75 pM Kumarin 6-løsning i etanol (ź ~ 2,43 ns 37) kan benyttes for eksitering i området 430-500 nm; og en 75 pM rhodamin B-oppløsning i vann (τ ~ 1,7 ns 37) kan benyttes for eksitering i området 488-575 nm. Vi merker oss at, selv om det er mulig i FLIMfit å bruke en annen IRF for hver piksel i systemet, vanligvis er det rimelig å gjøre antagelsen om at romlig varierende IRF har samme tidsmessige profil for hver piksel i bildet, men presenterer et utvalg av romlig varierende tidsmessige forskyvninger i forhold til den globale t 0. Vi beskriver dette som skift kart IRF, som bestemmes fra det spredte lys IRF. Sammen er IRF profil, t 0 og kart IRF skift brukes til ensørge for at hver piksel i FOV er utstyrt med en passende IRF. Viktigere, kan t 0 variere sakte over tid så det bør måles før FLIM datainnsamling.

Brukeren bør bestemme hvordan du vil prøve fluorescens forfall profiler og er nødvendig for å angi bredden av tids-porter og deres relative forsinkelser etter eksitasjon. Generelt er det ønskelig å anvende brede portbredde for å maksimere det detekterte signal, og vanligvis bruker vi portbredde satt til 4 ns for FLIM av celler merket med fluorescens-proteiner. Antallet tids-portforsinkelser bør være tilstrekkelig til å smake den fluorescerende forråtnelse profilen (inkludert en port innstilt til å måle signalet like før eksitasjonspulsen) gitt kompleksiteten av passende modell som vil bli brukt i analysen. Den optimale verdi kan avhenge av de relative levetider og amplituder for henfallsproduktene komponentene. Generelt, 4 portene er tilstrekkelig for montering monoeksponensiell avtar mens 7 eller flere porter kanbrukes til mer komplekse forfall modeller.

Vi merker oss at FLIM kan implementeres ved hjelp av en rekke tidsdomene eller frekvensteknikker og automatisert FLIM HCA av multibrønnplate matriser ble først implementert i en (ikke-seksjonering) wide-feltet mikroskop bruker frekvensområdet levetid avlesninger av FRET 51. Den første automatiserte optiske seksjonering FLIM flere brønner plateleser for HCA utnytte vidvinkel time-gated bilde 28 ble så rapportert. Deretter ble wide-feltet (non-seksjonering) frekvens domene FLIM HCA søkt å screene for posttranslasjonell modifikasjoner (tyrosinfosforylering) over et gen biblioteket ved hjelp FRET 52 og tids gated FLIM HCA har blitt brukt til å ergre analyser av HIV-1 Gag oligomerisering 53 og SUMOylation av FOXM1 54 og Raichu RhoA og Rac1 biosensorer 33. Det er også mulig å bruke TCSPC for multiwell plate FLIM 26, men hittil har det vist seg vanskelig å matche than gjennomstrømningen av teknikker som utnytter bredt felt gjenkjenning. En voksende tilnærming som kan løse dette problemet er bruk av matriser av enkeltfotontelling detektorer som SPAD arrays 55.

Vi registrerer at noen avlesninger av FRET bruker fluorescerende proteiner bør behandles med forsiktighet, og at de absolutte verdiene av parametrene hentet fra FLIMfit eller annen FLIM analyseprogramvare vil avhenge av forutsetninger knyttet til montering modell. For eksempel, hvor den FRET donor har en betydelig forråtnelse andre komponent, kan bruk av en modell bieksponensiell å passe FRET FLIM data resulterer i at bidraget fra raskere nedbrytning komponent, typisk assosiert med den FRETing befolkning vises høyere enn det burde. Det er derfor ønskelig å anvende givere med en mono-eksponentiell levetid slik som mTq2FP. Selv da, har nyere studier vist at FRET analyse kan likevel bli påvirket av mørke statene akseptor fluorescens proteiner eller vedheterogenitet av orienteringen faktor κ 2 på grunn av en fordeling av fluoroforen konformasjoner med en rekke kromofor vinkler og avstander 56. Likevel har vi og andre vist at fluorescens levetid avlesninger av FRET gjør gir brukbare resultater som korrelerer med biokjemiske målinger og kan brukes til å screene for protein interaksjoner eller for å følge dynamikken i biosensorer. Derfor er denne openFLIM HCA plattformen kan påføres på et vidt spekter av fluorescens levetid baserte analyser som anvender FRET eller cellulær autofluorescens 8, samt gi kvantitative avlesninger av fargestoffbaserte sonder 25.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
microscope frame Olympus IX81 http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
optical autofocus Olympus ZDC http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf
motorized (x-y-z) microscope stage Marzhauser 00-24-565-0000 Stage with Corvus controlle
excitation laser source Fianium SC400-4 Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
gated optical intensifier  Kentech High Rate Imager (HRI)
delay generators Kentech --- See agile delay generator and precision delay generator
camera Hamamatsu ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit  Yokogawa CSU-X1  http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Top hat diffuser Thorlabs ED1-S20-MD Engineered diffusers
mTq5V  Oxford Genetics P3850 mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker
mTq17V Oxford Genetics P3847 mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker
mTq32V Oxford Genetics P3848 mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker
mTq5A Oxford Genetics P3849 mTurquoise Amber construct
HEK293T --- --- cell type used
phenol red-free HBSS Sigma Aldrich 55021C-1000ML imaging media
culture media DMEM + 10% FBS + 0.5% Antibiotics
DMEM Sigma Aldrich D6046-500ML for culture media
FBS Sigma Aldrich 12003C-500ML for culture media
xTremeGene9 Sigma Aldrich 6.37E+09 for transfection, follow online protocol from La Roche
trypsin/EDTA Solution Thermo Fischer R001100 for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  3. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of nadh and fad redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. PNAS. 104 (5), 19494-19499 (2007).
  4. Datta, R., Alfonso-Garcıa, A., Cinco, R., Gratton, E. Fluorescence lifetime imaging of endogenous biomarker of oxidative stress. Sci Rep. 5, 9848 (2015).
  5. König, K., Uchugonova, A., Gorjup, E. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of 3d-stem cell spheroids during differentiation. Microsc. Res. Tech. 74 (1), 9-17 (2011).
  6. Wright, B. K., et al. Nadh distribution in live progenitor stem cells by phasor-fluorescence lifetime image microscopy. Biophys. J. 103 (1), 7-9 (2012).
  7. Fite, B. Z., et al. Noninvasive Multimodal Evaluation of Bioengineered Cartilage Constructs Combining Time-Resolved Fluorescence and Ultrasound Imaging. Tissue Eng Part C Methods. 17 (4), (2011).
  8. Kelly, D. J., et al. An automated multiwell plate reading FLIM microscope for live cell autofluorescence lifetime assays. J. Innov. Opt. Health Sci. 7 (5), 1-15 (2014).
  9. Owen, D. M., et al. Fluorescence lifetime imaging provides enhanced contrast when imaging the phase-sensitive dye di-4-ANEPPDHQ in model membranes and live cells. Biophys. J. 90 (11), 80-82 (2006).
  10. Suhling, K., et al. Imaging the environment of green fluorescent protein. Biophys. J. 83 (6), 3589-3595 (2002).
  11. Nezu, A., Tanimura, A., Morita, T., Shitara, A., Tojyo, Y. A novel fluorescent method employing the FRET-based biosensor "LIBRA" for the identification of ligands of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. BBA-Gen Subjects. 1760 (8), 1274-1280 (2006).
  12. Nishioka, T., et al. Rapid Turnover Rate of Phosphoinositides at the Front of Migrating MDCK Cells. Mol. Biol. Cell. 19 (10), 4213-4223 (2008).
  13. Stockholm, D., et al. Imaging Calpain ProteaseActivity by Multiphoton FRET in Living Mice. J. Mol. Biol. 346 (1), 215-222 (2005).
  14. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6645/full/388882a0.html 882-887 (1997).
  15. Mank, M., et al. FRET-Based Calcium Biosensor with Fast Signal Kinetics and High Fluorescence Change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  16. Ueyama, H., Takagi, M., Takenaka, S. A novel potassium sensing in aqueous media by synthetic oligonucleotide derivative. Fluorescence resonance energy transfer associated with guanine quartet-potassium ion complex formation. J. Am. Chem. Soc. 124 (48), 14286-14287 (2002).
  17. Kuner, T., Augustine, G. J. A Genetically Encoded Ratiometric Indicator for Chloride: Capturing Chloride Transients in Cultured Hippocampal Neurons. Neuron. 27 (3), 447-459 (2000).
  18. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  19. Gadella, T. W. J. Editor, FRET and FLIM Techniques, Volume 33. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. , Elsevier. http://www.sciencedirect.com/science/bookseries/00757535 (2009).
  20. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr. Opin. Biotech. 19 (4), 338-343 (2008).
  21. Aoki, K., Kiyokawa, E., Nakamura, T., Matsuda, M. Visualization of growth signal transduction cascades in living cells with genetically encoded probes based on Förster resonance energy. Phil. Trans. R. Soc. B. 363 (1500), 2143-2151 (2008).
  22. Welch, C. M., Elliott, H., Danuser, G., Hahn, K. M. Imaging the coordination of multiple signalling activities in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 749-756 (2011).
  23. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Sci. Signal. 2006 (331), 2 (2006).
  24. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys. J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  25. Kumar, S., et al. FLIM FRET technology for drug discovery: automated multiwell plate high content analysis, multiplexed readouts and application in situ. ChemPhysChem. 12 (3), 627-633 (2011).
  26. Barber, P. R., et al. The Gray Institute "open" high-content, fluorescence lifetime microscopes. J. Microsc. 251 (2), 154-167 (2013).
  27. Matthews, D. R., et al. A high-content screening platform utilizing polarization anisotropy and FLIM microscopy. Proc. of SPIE. 6859, 1-12 (2008).
  28. Matthews, D. R., et al. A Multi-Functional Imaging Approach to High-Content Protein Interaction Screening. PLOS ONE. 7 (4), e33231 (2012).
  29. Talbot, C. B., et al. High speed unsupervised fluorescence lifetime imaging confocal multiwell plate reader for high content analysis. J. Biophotonics. 1 (6), 514-521 (2008).
  30. Grant, D., et al. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events. Opt. Express. 15 (24), 15656-15673 (2007).
  31. Warren, S. C. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLOS ONE. 8 (8), e70687 (2013).
  32. OpenMicroscopy.org. , Available from: http://www.openmicroscopy.org/site/products/omero (2016).
  33. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki (2016).
  34. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. J. of Biol. Methods. 1 (2), 11 (2014).
  35. Pelet, S., Previte, M., Laiho, L., So, P. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
  36. FLIMFit webpage. , Available from: http://www.flimfit.org (2016).
  37. Kristoffersen, A. S., Erga, S. R., Hamre, B., Frette, Ø Testing Fluorescence Lifetime Standards using Two-Photon Excitation and Time-Domain Instrumentation: Rhodamine B, Coumarin 6 and Lucifer Yellow. J. Fluoresc. 24 (4), 1015-1024 (2014).
  38. Koushik, S. V., Chen, H., Thaler, C., Puhl, H. L., Vogel, S. S. Cerulean, Venus, and VenusY67C FRET Reference Standards. Biophys. J. 91 (12), 99-101 (2006).
  39. Ono, A. HIV-1 assembly at the plasma membrane: Gag trafficking and localization. Future Virol. 4 (3), 241-257 (2009).
  40. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
  41. Koushik, S. V., Vogel, S. S. Energy migration alters the fluorescence lifetime of Cerulean: implications for fluorescence lifetime imaging Forster resonance energy transfer measurements. J. Biomed. Opt. 13 (3), 031204 (2008).
  42. Goncalves, V., et al. A fluorescence-based assay for N-myristoyltransferase activity. Anal. Biochem. 421 (1), 342-344 (2012).
  43. Lindwasser, O. W., Resh, M. D. Myristoylation as a target for inhibiting HIV assembly: Unsaturated fatty acids block viral budding. PNAS. 99 (20), 13037-13042 (2002).
  44. Iversen, P. W., Eastwood, B. J., Sittampalma, G. S., Cox, K. L. A Comparison of Assay Performance Measures in Screening Assays: Signal Window, Z'Factor, and Assay Variability Ratio. J Biomol Screen. 11 (3), (2013).
  45. Alibhai, D. Fluorescence lifetime imaging applied to multiwell plate FRET assays for high content analysis. , Imperial College London. PhD thesis, https://spiral.imperial.ac.uk:8443/handle/10044/1/26843 (2013).
  46. Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513 (2015).
  47. Martins, M., et al. Activity of phospholipase C epsilon contributes to chemotaxis of fibroblasts towards platelet-derived growth factor. J. Cell Sci. 125, 5758-5769 (2012).
  48. Github.com. , Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki/2-Hardware-reference (2016).
  49. McGinty, J., et al. Signal-to-noise characterization of time-gated intensifiers used for wide-field time-domain FLIM. J. Phys. D: Appl. Phys. 42, 135103 (2009).
  50. Boens, N., et al. Fluorescence Lifetime Standards for Time and Frequency Domain Fluorescence Spectroscopy. ACS. 79 (5), 2137-2149 (2007).
  51. Esposito, A., Dohm, C. P., Bähr, M., Wouters, F. S. Unsupervised Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy for High Content and High Throughput Screening. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1446-1454 (2007).
  52. Grecco, H. E., et al. In situ analysis of tyrosine phosphorylation networks by FLIM on cell arrays. Nat Meth. 7 (6), 467-472 (2007).
  53. Alibhai, D., et al. Automated fluorescence lifetime imaging plate reader and its application to Förster resonant energy transfer readout of Gag protein aggregation. J. Biophotonics. 6 (5), 398-408 (2012).
  54. Kelly, D. J., et al. Automated multiwell fluorescence lifetime imaging for Főrster resonance energy transfer assays and high content analysis. Anal. Methods. 7 (10), 4071-4089 (2015).
  55. Poland, S. P., et al. A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging. Biomed. Opt. Exp. 6 (2), 277-296 (2015).
  56. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., Van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLOS ONE. 8 (1), e49593 (2012).

Tags

Biofysikk fluorescens mikroskopi FLIM HCA åpen kildekode gnage automatisert mikroskopi medisiner
Open Source Høy innholdsanalyse Utnytte Automated Fluorescence Lifetime Imaging Mikros
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Görlitz, F., Kelly, D. J.,… More

Görlitz, F., Kelly, D. J., Warren, S. C., Alibhai, D., West, L., Kumar, S., Alexandrov, Y., Munro, I., Garcia, E., McGinty, J., Talbot, C., Serwa, R. A., Thinon, E., da Paola, V., Murray, E. J., Stuhmeier, F., Neil, M. A. A., Tate, E. W., Dunsby, C., French, P. M. W. Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e55119, doi:10.3791/55119 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter