Introduction
yaralanma, enfeksiyon veya invaziv kanser kaynaklanan başlıca kemik defektleri hastanın iyileşmesi ve yaşam kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip. Teknikleri yerde hastanın kendi vücudunda sağlıklı kemik ile bu kusurları doldurmak için var, ama bu transfer, kendi morbidite ve komplikasyonları 1, 2, 3 riskini taşır. Ayrıca, bazı kusurları yeterli donör kemik defekti doldurmak için mevcut değildir o kadar büyük veya karmaşık. Protez cihazlar kemikli defektleri doldurmak için potansiyel bir seçenek ancak bu enfeksiyon riski, donanım arızası ve yabancı cisim reaksiyonu 4 dahil olmak üzere çeşitli dezavantajları ile ilişkilidir.
Bu nedenlerden dolayı hastanın kendi hücrelerini 5 kullanan biyolojik kemik yerine geçen mühendislik olasılığı büyük ilgi var. Yağ-kaynaklı stromal hücreler (TSK)onlar hastanın kendi yağ dokusunda bolca mevcuttur ve yeni kemik dokusu 6, 7 üreterek kemik defektleri iyileşmek için yeteneğini göstermiştir çünkü bu uygulama için potansiyel var. TSK hücreler ve çeşitli çalışmalar çeşitli nüfus spesifik hücre yüzey belirteçleri için seçilerek geliştirilmiş osteojenik aktivitesi 8, 9 hücre popülasyonları göstermiştir vardır. En yüksek osteojenik potansiyele sahip TSK seçilmesi, bu hücreleri ile seribaşı bir iskele büyük bir kemik defekti yeniden olabilir olasılığını artırmak olacaktır.
Kemik morfogenetik proteini (BMP) sinyal kemik farklılaşmasını ve oluşumu 10 ve TSK 11 osteogenesis için önemli olduğu bilinen BMP reseptörü tip lb (BMPR-IB) düzenlenmesi için çok önemlidir. Son zamanlarda, biz olabilir b BMPR-IB o ifadeyi göstermiştirE geliştirilmiş osteojenik aktivite 12 TSK için seçmek için kullanılır. Burada, bir in vivo kalvaryal hata modeli kullanarak osteojenik aktivitesi deneyi takiben, insan yağ TSK BMPR-IB-sentezleyen izolasyonu için protokol göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: numuneleri rıza veren hastadan elde edildi. Tüm protokoller gözden geçirilmiş ve uygun Stanford Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. insan doku ve hücrelerinin işlerken, her zaman kurum tarafından belirtilen, Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL2) önlemlere uymak.
Reaktiflerin 1. Hazırlık
- FACS tampon hazırlanması: 10 ml FBS, 188 5 ml Poloxamer 500 ml steril fosfat tamponlu tuz için 5 ml Pen-Strep (PBS) ekleyin.
- Karışımı sindirmek hazırlayın: 0.375 gr C hemolyticum kollajenaz tip II tozu ve 5 mL Poloxamer steril 199 / EBSS ortamı 188 500 ml ekleyin.
- Standart orta hazırlayın: 50 ml FBS ve 500 mL Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı için 5 ml Pen-Strep ekleyin.
2. Hasat ve TSK izolasyonu
NOT: yeterli kurumsal onaylar insan dokusu kullanarak ve izolasyon saat yerinde olduğundan emin olunuman kök hücreleri. Insan karın elde kuşatan, ya da seçmeli liposuction uygulanan sağlıklı bir donörden cilt altı yağ uyluk. Bir plastik emme kabı içinde yağ tutun.
- Orijinal plastik kutunun içinde yağ: 1 oranında bir 1, steril PBS ilave edin. (500 mi yağ var ise, 500 ml PBS ilave). 30 saniye için hafif ajitasyon ile karıştırın. Sulu tabaka, emme bağlanmış bir 10 ml plastik pipet ile sulu tabakanın alt (Şekil 1) ve daha sonra aspire yerleşmek ve atın izin verin.
- büyük bir plastik kap içine yağ süzün ve 1 karışımı sindirimi ekleyin: 1 oranında. Kabı kapatın ve% 70 etanol ile dışını temizleyin. parafin film ile kapağı mühür.
- 30 dakika boyunca 37 ° C'de 180 rpm'de yörüngesel karıştırıcıda bu kabı çalkalayın.
- : 1 oranında bir 1, standart orta ekleyerek sindirim nötralize. (1000 ml yağ karışımı varsa, 1.000 ml standart orta ekleyin).
- eşit 25 eşit sayıda içine karışımı dağıtın0 ml plastik konik santrifüj tüpleri ve santrifüj 4 ° C 'de 20 dakika boyunca 300 x g'de kanşım
- Süpernatantı aspire ve bozulmamış pelet bırakmak için dikkatli olun. Her konik tüp için 5 ml standart ortamda pelet tekrar.
- Bir 50 ml konik santrifüj tüpüne 100 mikronluk bir filtre boyunca süspansiyon filtre. Daha sonra, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı aspire ve 5 ml oda sıcaklığında RBC parçalama tamponunda pelletini. Karışım, daha sonra oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (RT) 300 xg'de santrifüj, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bekletin.
- Süpernatantı aspire ve 15 ml standart orta pelletini. Yine, 50 ml konik santrifüj tüpüne 100 mikronluk bir filtre boyunca filtre edin.
- Yeni 50 ml konik, yoğunluk tabanlı ayırma (reaktif listesine bakınız) için tasarlanmış 15 mL polisükroz çözüm ekleyin. Sonra, bir 45 ° açıyla tüp tutarak dikkatlice yüzüne hücreleri pipetTüp polisükroz çözeltisi üzerine hücre süspansiyonu hafifçe katmanları (Şekil 2), böylece.
NOT: Bu çözeltinin yüzeyine pipet hücreleri için önemlidir. Bu geri dönüşü olmayan bir karışım oluşturmak gibi bir hücre süspansiyonu polisükroz çözüm katmayın. Benzer şekilde, polisükroz çözeltisi merkezine hücreleri pipetle değildir. - Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de bu karışımın santrifüjleyin. Düşük ivme kullanın (- 2 10 üzerinden 3) ve bu adım için sıfıra santrifüj fren işlevini ayarlayın.
NOT: ortasında bulutlu, alt net ve somon renkli üstünde: Üç katmanlar görünür olacaktır. orta tabaka ilgi hücreleri içerir. - 10 ml pipet kullanarak dikkatlice orta tabakayı kaldırmak ve yeni bir 50 ml konik tüp transfer.
NOT: tamamen orta tabakanın bazı geride bırakmak daha üst ve alt katmanları bazılarını almak orta tabaka transferi ve bu süreçte daha iyidir. <li> hemasitometre kullanarak hücre sayımı ve toplam canlı hücre sayısını belirlemek.
Not: Genellikle kullanımı tripan mavi hücreleri sayma yardımcı olmak için% 0.8 bir son konsantrasyona kadar, hücre karışımına ilave edildi. Canlı canlı hücreler mavi boya kadar sürmez ve beyaz görünecektir.
BMPR IB pozitif hücrelerin ve hücre ihtiva eden ıskelesının Sıralama 3. FACS
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. (Adım 2.13 yapılan hücre sayımına bağlı olarak), 100 uL başına 1.000.000 hücre konsantrasyonunda FACS tamponu içerisinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- etiketli plastik santrifüj tüpüne en az 10 milyon hücre Transferi "BMPR-IB." Ayrı, etiketli ayrı bir plastik santrifüj tüpüne 100 uL FACS tampon bir milyon hücreleri transferi "boyanmamış." "Boyanmamış" tüp 1 ml FACS tampon ekleyin. FACS exper kısmı sıralama buz üzerinde FACS tamponu içerisinde hücrelerin kalan tutuniment yapılmaktadır. Bu hücreleri etiketlemek "Unsorted." kontroller daha sonra deneyde olarak kullanın.
- üreticinin talimatlarına göre "BMPR IB" tüp bir flüoresan anti-insan BMPR IB antikorun uygun miktarda. antikor dağıtmak için hafifçe yukarı ve aşağı karışımı pipetle.
NOT: 1:10 seyreltme bir insan BMPR-IB / ALK-6 APC-konjuge antikor kullanmak (detaylar için reaktif listesine bakınız). Ancak, farklı üreticilerin antikorlar farklı tavsiye edilen konsantrasyonlarda olacaktır. - ışığı tutan bir şekilde buz kovası örtün. Hücre / antikor karışımı, 30 dakika boyunca (ya da antikor üretici talimatlarına göre) yapılmaktadır izin verin.
Not: Anti-BMPR IB antikor, bir ikincil antikor gerektiren birincil konjuge olmayan antikor olarak gelir, üreticinin talimatlarına uygun olarak ikincil antikor ile buz üzerinde ayrı bir boyama adımı gerçekleştirmek. - Her iki tüpleri santrifüj4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g. pelet aspire için dikkatli olmak, süpernatant aspire. 1 ml FACS tampon maddesi içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri. Yine 5 dakika boyunca 300 xg'de tüpler santrifüj. Süpernatantı dikkatlice aspire 1 ml başına 1.000.000 hücre konsantrasyonunda FACS tamponu içerisinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Yeni etiketli cam FACS tüpler içine 40 mikron hücre süzgeçler aracılığıyla "BMPR-IB", "unstained" ve "Unsorted" hücreleri Filtre. Hücreler filtre geride değil emin olmak için 500 uL FACS tamponu ile filtre durulayın. Ayrıca "BMPR-IB-pozitif" ve etiketli iki ayrı plastik santrifüj tüplerine 2 ml standart orta ekleyin "BMPR-IB-negatif." FACS makine sıralanır hücreleri toplamak için bu ikisini kullanın.
- FACS makinede, floresan işaretleyici için negatif bir kapı tanımlamak için lekesiz hücreleri kullanın.
- 100 mikron memesi, ilgili tüplere con içine sıralama BMPR-IB pozitif ve negatif hücreler kullanılarakStandart ortam taining. FACS makine bu yeteneği varsa sıralama sırasında 4 ° C'de soğutulmuş bu tüpler tutun.
NOT: Sharon ve arkadaşları tarafından JOVE 13. Maddenin bakın. FACS sıralama için mükemmel bir protokol için. - Bir hemasitometre kullanarak, her bir tüp içinde hücreleri sayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 xg'de "", BMPR-IB-pozitif "BMPR-IB-negatif" ve "Unsorted" tüpleri Santrifüj ve hücre pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, süpernatant aspire. Daha sonra 250 uL başına 1.000.000 hücre konsantrasyonunda standart ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Ön-kesim, 4 mm PLGA (poli [laktik-ko-glikolik asit]) hidroksiapatit ile kaplanmış iskeleleri elde edilir. 24-iyi plaka iyi her bir iskele yerleştirin. BMPR-IB-pozitif Unsorted, ve BMPR-IB-negatif (Şekil 3): (. I .e, 200.000 hücreleri) üç gruptan birine hücre süspansiyonu 50 ul her iskele örtün.
NOT: LütfenLo ve arkadaşları tarafından JOVE madde 14 başvurun. PLGA iskelelerinin yapımı ile ilgili detaylar için. - Kısmen, (iskelelerinin kuruma önlemek için), kapağı plakası kapağı ve 30 dakika boyunca 37 ° C 'de, bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe standart ortam ile çevre boş kuyu doldurun.
Kalvaryum Kusur ve ACS içeren Scaffold Uygulama 4. oluşturulması
NOT: yeterli kurumsal onaylar canlı farelerde kalvaryal kusurların oluşturulması için yerinde olduğundan emin olun. Bu protokol Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.
- inhale izofluran gaz veya enjekte uzun etkili anestezik kokteyl kullanarak CD-1 çıplak fare anestezisi.
- Tek başına gaz kullanmak, bir anestezi odasına fare koyun ve 2 oksijen akışını başlatmak - izofluran% 2 konsantrasyonda 3 L / dk. fare F sonraully bilinçsiz, bir emici ped ile sıcak su sirkülasyon battaniye üzerine o eğilimli yerleştirin ve oksijen ve izofluran aynı konsantrasyon ile bir anestezi burun konisi içine burun yerleştirin. Dikkatle solunum hızını izlemek ve gerektiğinde izofluran konsantrasyonu ayarlayın.
- yukarıda tarif edildiği gibi anestezi bölmesi fare anestezi, enjekte uzun etkili anestezik kokteyl kullanmak ve daha sonra anestezi kokteyl enjekte edilmesiyle gerçekleştirilebilmektedir. Anestezi odasından fareyi çıkarın ve davranışlarını gözlemlemek.
NOT: Fare kısaca anestezi ancak birkaç dakika içinde ortaya çıkabilir yine tam enjekte anestezi etkisi altında anestezi gerekmektedir. bir emici ped ile kaplı bir sıcak su sirkülasyon battaniye fare aktarın.
Not: bir anestetik kokteyl sağlamak için, normal tuzlu su içinde ketamin 10 mg / mL ve ksilazin, 1 mg / ml ihtiva eden bir karışım, intraperitoneal önerilir. Bu karışımın standart doz300 uL 100 mg / kg ve ksilizin 10 mg / kg ketamin eşittir 30 g fare için. Enjekte anestezi ile ilgili daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın. - Anestezi derinliğini belirlemek için bir ayak tutam manevrası kullanın. hafifçe cerrah tarafından sıkışmak zaman, yeterince anestezi fare pençesini geri olmaz.
- Korneanın kuruma önlemek için göz merhemi sürün.
- 1 mg / kg buprenorfin SR subkutan yönetme.
NOT: Üstün ağrının cerrahi sonuçlarına önce analjezi sağlanması. - tüm prosedürü sırasında, fare solunum hızını izlemek.
NOT: - / dk 100 nefesler düzgün izofluran altında anestezi bir fare 50 bir solunum oranına sahip olmalıdır. Artmış solunum hızı azalmış solunum hızı anestezi çok derin olduğunu gösteriyor olabilir iken anestezi, çok hafif olduğunu gösterir.
- povidon-iyot ile kafatası dorsal deri hazırlıkine çözeltisi% 70 etanol ile üç kez, ardından. maruz cerrahi siteden ayrılmadan, steril örtüler ile örtün.
NOT: steril cerrahi eldiven giyin ve işlem sırasında steril tekniği korumak. Ancak böyle steril örtü ve otoklava araçlar olarak steril yüzeyleri ve nesneler dokunun. Asistan aydınlatma, açık dikiş paketleri, vb ayarlamak mı - 15 bıçak neşter kullanılarak, dorsal kafatası çoğunluğu boyunca uzanan bir sagital orta hat kesi yapmak. ince dişli forseps kullanarak, sağ parietal kemik açığa kesi sağ tarafındaki deriyi geri çekin.
- otoklavlanıp 4 mm elmas kaplı trefin matkap ile bir matkap kullanarak, paryetal kemik yoluyla kusur matkap. dura mater tabakası içine kemik geçmiş kusur uzatmayın. (Şekil 4)
- defekt içine bir iskele yerleştirin ve sonra naylon dikiş çalışan cilt kesisi kapatın.
- fare izleyin ve standart postoperatif bakım a sağlamakkurumsal kurallarına şeklinizi ona göre.
- o kurtarır iken temiz bir kafes içinde temiz bir kağıt havlu üzerinde fare tutun. kafes bir yarısı, bir ılık su çevrimli battaniyesi üzerine yerleştirilmelidir ve fare başlangıçta bu devre, yerleştirilmelidir.
- o ambulate için yeterli bilinci yerine kadar bir fare gözetimsiz bırakmayın. tamamen iyileşti kadar diğer fareler ile bir kafes için ameliyat geçirmiş bir fare iade etmeyin.
- test edilecek olan her iskele için yeni bir fare ile yukarıdaki adımları tekrarlayın. sıcak bir boncuk sterilizatör veya diğer uygun yöntem kullanılarak ameliyatlar arasında cerrahi aletler sterilize.
- Kısa bir süre işlemden sonra ve daha sonra 2, 4, 6, ve 8 hafta sonra, kalvaryal kusur, kapağın oranının analizi için bir mikro CT tarama kullanımı.
NOT: Levi ve ark makalesine bakın. Kalvarial kusurların mikro BT'de açıklaması için 6. - Ne zaman deney komple birTe, temiz bir ötanazi bölme içine yerleştirilmesi ve 2 L / dakikalık bir hızda bölme içine, karbon dioksit gazı akışı başlayarak fareler euthanize. solunuma tamamen (sonra yaklaşık 10 dakika) durdurdu sonra ötenazi onaylamak için servikal dislokasyon gerçekleştirin.
- Deney tamamlandıktan sonra isteğe bağlı olarak, kullanım kesit ve histolojik boyama defekti içinde kemik oluşumunu değerlendirmek.
NOT: McArdle ve arkadaşları tarafından makalesine bakın. Kemik hazırlama ayrıntılar için 12 histoloji için numune. Histolojik ve boyama teknikleri gözden geçirmek için, bu tür Cerrahi Patoloji 15 Manual olarak histolojik el kitabına bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikro BT açıkça kafatası defekti gösterecektir ameliyat günü yapılan tarama. Şu anda 4 mm defekt içine hiçbir büyümesi olacak. Daha sonraki taramaları başlangıca kıyasla zamanla kusurun büyüklüğünü ölçmek için zamanla elde edilir. BMPR-IB- ve tasnif hücreleri (Şekil 5) ile karşılaştırıldığında BMPR IB + hücreleri ile tohumlanmış Kusur kusurun daha hızlı kapanmasına göstermelidir. Buna ek olarak, kusur içeren kafatasının kısmı kireçten ve standart yöntemler kullanılarak 12 histolojisi için işlenmiştir. Movat pentakrom en boyası ile boyanmış kesitler diğer hücre popülasyonları (Şekil 6) ile karşılaştırıldığında BMPR IB hücreler ile muamele edilen kusur daha fazla kemik rejenerasyonu ortaya çıkaracaktır.
Şekil 1: PBS Wash sonra Lipoaspirate. Güçlü> PBS sonra lipoaspirate bir kap ilave edildi ve karışım, çökelmeye bırakılır. alt katman sulu tabaka, özellikle tuzlu ve kan oluşan iken üst doku tabakası, TSK ev sahipliği adipoz dokudur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: polisükroz Çözüm üzerine Hücre Süspansiyon Yerleştirme. (a) hücre süspansiyonu bu polisükroz çözeltisinin üzerine katman sağlayan tüp kısmı üzerine çok hafif pipetle gerekir. (b) Bu santrifüjleme öncesi polisükroz üstünde bir hücre süspansiyonu tabakasının doğru görünümüdür."> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: İskele üzerine Hücreleri Tohum. (a) 24-iyi hücre kültür plakasının bir kuyunun steril bir yüzey üzerinde, hücre süspansiyonu, yaklaşık 50 ul kuru iskele yükleyin. (b) hücre yapışmasını sağlamak için 30 dakika için bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe iskele. Not: Şekilde, 10 cm'lik plaka gösteri amaçlı kullanılmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Kalvaryum Defektinin oluşturulması. kalvarial defekt (oklar) içinde görünüraçık cilt kesi. Sondaj dura ihlal değil belirten, sağlam dura kan damarları (ok başları) dikkat edin. Ölçek çubuğu, 5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Farklı ASC alt popülasyonlar ile Kritik boyutlu Kalvaryum Kusur Şifa. (-) TSK (A) Üç boyutlu mikro BT rekonstrüksiyon kalvarial kusurlar için yapılmıştır ayıklanmamış, BMPR-IB (+) veya BMPR-IB ile eşleştirilmiş yeniden. (B) sıralanmamış ile karşılaştırıldığında BMPR-IB (+) TSK (% 92) önemli ölçüde daha yüksek bir kemik rejenerasyonunu gösterdi 8 haftalık iyileşme miktarının BMPR-IB (-) TSK (sırasıyla% 58 ve% 46, ** p < 0.01). iyileşmesinde önemli farklılıklar da 2 biz görüldüeks (** p <0.01), 4 hafta (*** p <0.001), ve 6 hafta (*** p <0.001). Mikro-CT, mikro-bilgisayarlı tomografi. McArdle ark izni ile yayımlanmaktadır. 12. Hata çubukları, standart sapmayı temsil ederler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: Kemik Regenerate histolojik boyama. Kemik (A) Movat en pentakrom boyama sıralanmamış, BMPR-IB (+) veya BMPR-IB ile tamir kusurları yeniden (-) parlak bir alan mikroskobu kullanarak 5X büyütmede TSK. (-) Grubunda BMPR-IB ile karşılaştırıldığında BMPR-IB (+) grubunda daha güçlü kemik oluşumunu unutmayın. noktalı çizgi kusuru alanının genişliği, temsil eder. siyah dikdörtgen içinde alan yüksek magnific gösterilirkusur alanı tirme kullanarak (B) 10X ve (C) 40X parlak bir alan mikroskobu. McArdle ark izni ile yayımlanmaktadır. 12. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
TSK Hasat sırasında, kritik bir adım kollajenaz ile yağ yeterli sindirim olduğunu. Yetersiz sindirim TSK düşük bir verimle sonuçlanır. BMPR-IB + hücrelerinin FACS sıralama sırasında, dikkatli pozitifliği açısından kapısı tanımlamak önemlidir. çok gevşek kapıları tanımlanması saf değildir sıralı nüfus neden olabilir. kalvarial defekt oluşturulması sırasında, kafatası kemik yoluyla kusur delmek için ancak dura mater içine ilerlemek değil kritik öneme sahiptir. Bu bol kanama ve hayvan ötenazi gerektirecek beynin maruz kalma neden olur.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
kalvarial kusur, cerrahi anestezi ile ilgili olarak, laboratuar inhale izofluran kullanmayı tercih ama başka bir seçenek intraperitonal, normal sa nihai ketamin 10 mg / ml konsantrasyonda ve ksilazin, 1 mg / ml ihtiva eden bir karışım enjekte etmektirhat. Bu karışımın standart doz 30 g fare için 300 uL olduğunu. Bu ameliyat sırasında izofluran burun konisi olmak için fareyi gerektirmez güvenilir anestezi yaklaşık 30 dakika sağlar. enjekte anestetik kullanmanın bir dezavantajı, enjeksiyon verildikten sonra doz azaltmak mümkün olmadığıdır. Buna karşılık, inhale izofluran kolayca titre edilebilir ya da gerçek zamanlı olarak aşağı.
iskele hücre süspansiyonu eklerken, araştırmacılar sıvı hacmi çok küçük olduğunu fark edebilirsiniz ve kısmen inkübasyon 30 dakika buharlaşır. Buharlaşma kemik iyileşmesi deneylerde özellikle zararlı karıştırıcı olan hücre ölümüne neden olabilir. Bu mücadele için, 24 plaka bir kuyu içinde iskele yükleyin. Düz ortam ile hemen çevredeki kuyu doldurun. Bu kurumasını yüklü iskele tutmaya yardımcı nemlendirilmiş mikro ortam yaratacaktır.
kemik histolojik boyama öncesi birönce gömme ve kesit için kalvaryumun doğru ve eksiksiz yumuşatma üzerinde dicated. farklı yaş kafatasları dekalsifikasyon farklılaşan sürelerini gerektiren geleneksel olarak bir EDTA çözeltisi yapılır, kabul edilir
Tekniğin Sınırlamalar
Bu protokol, kusurun kapatma geliştirmek için bir hücre popülasyonunun yeteneğinin tayin edilmesi için, bir 4 mm kalvaryal kusur kullanmaktadır. Bu model, bir uzun kemik kırığı veya bir tümör rezeksiyonu olarak, daha karmaşık bir ortamda meydana şifa taklit edemez. Bu nedenle, alternatif hayvan modelleri, bu ortamlarda kemik iyileşmesi için TSK katkısını anlamak için kullanılan gerekebilir.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
Belirli ASC popülasyonlarını izole etmek için flow sitometri kullanılarak çoklu doku bağlamında ve iyileşme ve rejenerasyonu sağlamak için umut verici bir tekniktirBöyle anjiyogenez, adipogenesis ve osteogenezinin olarak jüri modelleri. yanlısı osteojenik hücrelerin yarar olumlu bir kalvarial kusur şifa BMPR-IB için seçilen hücreleri ile derin bir etki göstererek, bu çalışmada incelenmektedir.
ASC izolasyonu için Önceki protokoller, hücre kültürü plakaları 16 birkaç gün boyunca hücrelerin kültürlenmesi içerir. Ancak, hücreler kültürde ise önemli fenotipik drift karşılaşabilirsiniz. Bu nedenle, FACS kullanılarak daha fazla alt popülasyonu, ardından arıtma için, bu hücrelerin hızlı izolasyonu sağlayan bir ASC yalıtım protokolünü kullanır. Tüm prosedür hücre yüzey işaretleyici ya da fenotipik sapma etkilerinin en aza indirilmesi, daha az bir günde gerçekleştirilir.
Gelecek Uygulamalar ve Yol
Son derece BMPR-IB ifade TSK diğer TSK kıyasla rejeneratif kemik defekti iyileşmesini geliştirmek için daha büyük bir yeteneğe sergilediğini göstermiştir. mekanizmalar altında yatanBu fenomen ing bilinmemektedir. Örneğin, kendileri doğrudan kemik oluşturan hücrelerin içine ayırt ya da bunu yapmak için diğer hücreleri teşvik faktörler üretmek olmadığını hücrelerin olup olmadığı açık değildir. Gelecekteki çalışmalar, bu soruları cevaplamak için yapılması gerekecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 micron cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 blade scalpel | Miltex | 4-515 | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB primary antibody | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI surgical gloves | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo needle driver | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 nude mouse | Charles River | 086 | |
| Collagenase Type II powder | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM medium | Gibco | 10564-011 | |
| Drill: Circular knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Drill: Z500 Brushless Micromotor | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS medium | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia isoflurane | Henry Schein | 050033 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA scaffolds | Proprietary Formulation | ||
| Poloxamer 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Polylined Sterile Field, 18" x 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | Cut a rectangular hole of the appropriate size |
| Polysucrose Solution: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Medline | MDS093944H | |
| Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube | Dechra Veterinary Products | ||
| RBC lysis buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol alcohol prep swabs | Covidien | 6818 |
References
- Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: an update. Injury. 36, S20-S27 (2005).
- Laurencin, C., Khan, Y., El-Amin, S. F. Bone graft substitutes. Expert Rev Med Devices. 3 (1), 49-57 (2006).
- Walmsley, G. G., et al. Nanotechnology in bone tissue engineering. Nanomedicine. 11 (5), 1253-1263 (2015).
- Chapekar, M. S. Tissue engineering: challenges and opportunities. J Biomed Mater Res. 53 (6), 617-620 (2000).
- Levi, B., et al. Human adipose derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defects. PLoS One. 5 (6), e11177 (2010).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100 (9), 1249-1260 (2007).
- Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. J Biol Chem. 286 (45), 39497-39509 (2011).
- Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1)-positive selection enhances osteogenic capacity of human adipose-derived stromal cells. Tissue Eng Part A. 19 (7-8), 989-997 (2013).
- Wozney, J. M., et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242 (4885), 1528-1534 (1988).
- Wan, D. C., et al. Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).
- McArdle, A., et al. Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage. Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J Vis Exp. (71), e4425 (2013).
- Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. J Vis Exp. (68), (2012).
- Lester, S. C. Manual of surgical pathology. , Saunders/Elsevier. (2010).
- Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
