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Developmental Biology

BMPR-आईबी + का तेजी से अलगाव एक calvarial दोष हीलिंग मॉडल में वसा व्युत्पन्न उपयोग के लिए stromal कोशिकाओं

doi: 10.3791/55120 Published: February 24, 2017

Introduction

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मेजर की हड्डी की चोट, संक्रमण, या आक्रामक कैंसर से उत्पन्न दोष एक मरीज की वसूली और जीवन की गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। तकनीक कहीं और मरीज की अपनी ही शरीर में से स्वस्थ हड्डियों के साथ इन दोषों को भरने के लिए मौजूद हैं, लेकिन इस हस्तांतरण के लिए अपने स्वयं के रुग्णता और जटिलताओं 1, 2, 3 के जोखिम रहता है। इसके अलावा, कुछ दोष इतनी बड़ी या जटिल है कि पर्याप्त दाता अस्थि दोष को भरने के लिए उपलब्ध नहीं है। कृत्रिम उपकरणों बोनी दोषों को भरने के लिए एक संभावित विकल्प हैं, लेकिन इन संक्रमण के जोखिम, हार्डवेयर विफलता, और विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया 4 सहित कई नुकसान के साथ जुड़े रहे हैं।

इन कारणों के लिए वहाँ एक मरीज की अपनी कोशिकाओं 5 का उपयोग जैविक हड्डी के विकल्प इंजीनियरिंग की संभावना में बहुत रुचि है। वसा व्युत्पन्न stromal कोशिकाओं (ASCs)क्योंकि वे मरीज की अपनी ही वसा ऊतकों में बहुतायत से उपलब्ध हैं और वे नई हड्डी के ऊतकों 6, 7 को उत्पन्न करके अस्थि दोष ठीक करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है इस आवेदन के लिए क्षमता है। ASCs कोशिकाओं और कई अध्ययनों की एक विविध आबादी से पता चला है कि विशिष्ट कोशिका की सतह मार्करों के लिए चयन बढ़ाया osteogenic गतिविधि 8, 9 के साथ सेल आबादी का उत्पादन कर सकते हैं। उच्चतम osteogenic क्षमता के साथ ASCs चयन संभावना बढ़ जाएगी कि एक पाड़ इन कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त एक बड़ी अस्थि दोष को पुनर्जीवित कर सकता है।

हड्डी morphogenetic प्रोटीन (बीएमपी) संकेतन हड्डी भेदभाव और गठन के 10 और बीएमपी रिसेप्टर प्रकार आईबी (BMPR-आईबी) ASCs 11 में osteogenesis के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए जाना जाता है के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है। हाल ही में, हम BMPR-आईबी की है कि अभिव्यक्ति से पता चला है सकते हैं खई बढ़ाया osteogenic गतिविधि 12 के साथ ASCs के लिए चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यहाँ हम BMPR आईबी व्यक्त एक विवो calvarial दोष मॉडल का उपयोग कर अपने osteogenic गतिविधि का एक परख के द्वारा पीछा मानव वसा से ASCs के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है।

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Protocol

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नोट: नमूने रोगियों को जो सूचित सहमति दे दी है से प्राप्त किया गया। सभी प्रोटोकॉल की समीक्षा की और उचित स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया। मानव ऊतकों और कोशिकाओं से निपटने, वहीं हमेशा जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) सावधानियों का पालन करना, के रूप में अपनी संस्था द्वारा निर्दिष्ट।

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. FACS बफर तैयार: 10 मिलीलीटर FBS, 5 एमएल Poloxamer 188 और 5 एमएल कलम strep 500 एमएल बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) जोड़ें।
  2. मिश्रण को पचाने को तैयार: जोड़े 0.375 जी सी hemolyticum कोलैजिनेज़ प्रकार द्वितीय पाउडर और 5 एमएल Poloxamer 188 से 500 एमएल बाँझ 199 / EBSS माध्यम।
  3. मानक मध्यम तैयार: 50 मिलीलीटर FBS और 5 एमएल 500 एमएल Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम करने के लिए कलम strep जोड़ें।

2. फसल काटने वाले और ASCs का अलगाव

नोट: यह सुनिश्चित करें कि पर्याप्त संस्थागत मंजूरी मानव ऊतक का उपयोग करने के लिए और अलग-थलग घंटे के लिए जगह में हैंउमान स्टेम कोशिकाओं। मानव पेट प्राप्त करने, पार्श्व, या एक स्वस्थ दाता वैकल्पिक लिपोसक्शन के दौर से गुजर से वसा जांघ। एक प्लास्टिक सक्शन कनस्तर में वसा रखें।

  1. मूल प्लास्टिक कनस्तर में वसा के लिए: 1 के अनुपात में एक 1 में बाँझ पीबीएस जोड़ें। (अगर कोई है 500 एमएल वसा, 500 एमएल पीबीएस जोड़ने)। 30 एस के लिए कोमल आंदोलन से मिलाएं। जलीय परत एक 10 एमएल प्लास्टिक पिपेट सक्शन से जुड़ी साथ नीचे (चित्रा 1) और फिर महाप्राण करने के लिए व्यवस्थित और जलीय परत त्यागने के लिए अनुमति दें।
  2. एक बड़े प्लास्टिक कंटेनर में वसा छानना और एक 1 में मिश्रण को पचाने जोड़ें: 1 अनुपात। कंटेनर बंद करें और 70% इथेनॉल के साथ बाहर साफ। आयल फिल्म के साथ टोपी सील।
  3. इस कंटेनर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 180 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन में आंदोलन।
  4. : 1 के अनुपात में एक 1 में मानक मध्यम जोड़कर पाचन बेअसर। (अगर कोई है 1000 मिलीलीटर वसा मिश्रण, 1000 मिलीलीटर मानक के माध्यम जोड़ें)।
  5. समान रूप से 25 का एक भी संख्या में मिश्रण वितरित0 एमएल प्लास्टिक शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 300 XG पर मिश्रण
  6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और गोली बरकरार छोड़ने के लिए सावधान रहना होगा। प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब के लिए 5 एमएल मानक मध्यम में Resuspend छर्रों।
  7. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर। फिर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र।
  8. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 5 एमएल कमरे के तापमान आरबीसी lysis बफर में गोली resuspend। मिश्रण कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बैठने के लिए तो (आरटी) कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र की अनुमति दें।
  9. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 15 एमएल मानक माध्यम में गोली resuspend। फिर 50 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर।
  10. एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में, 15 एमएल polysucrose समाधान घनत्व के आधार पर जुदाई (अभिकर्मकों की सूची देखें) के लिए डिज़ाइन किया गया जोड़ें। फिर, एक 45 डिग्री के कोण पर ट्यूब पकड़े, ध्यान से कोशिकाओं के पक्ष पर पिपेटट्यूब इतना है कि सेल निलंबन धीरे (चित्रा 2) polysucrose समाधान के शीर्ष पर परतें।
    नोट: यह समाधान की सतह पर पिपेट कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं के निलंबन को polysucrose समाधान जोड़ने के रूप में यह एक अपरिवर्तनीय मिश्रण पैदा करेगा मत करो। इसी तरह, polysucrose समाधान के केंद्र में कोशिकाओं पिपेट नहीं है।
  11. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर इस मिश्रण अपकेंद्रित्र। कम त्वरण (2 - 3 से 10) का प्रयोग करें और इस कदम के लिए शून्य करने के लिए सेंट्रीफ्यूज का ब्रेक समारोह की स्थापना की।
    नोट: बीच में तल पर स्पष्ट, बादल, और सामन रंग शीर्ष पर: तीन परतों दिखाई जाएगी। मध्यम परत ब्याज की सेल शामिल हैं।
  12. एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग सावधानी से मध्यम परत को हटाने और एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण।
    नोट: यह पूरी तरह से मध्यम स्तर के हस्तांतरण और इस प्रक्रिया में करने के लिए की तुलना में ऊपर और नीचे परतों में से कुछ लेकर मध्यम स्तर से कुछ के पीछे छोड़ने के लिए बेहतर है।
  13. <li> एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना और कुल जीवित कोशिका संख्या निर्धारित है।
    नोट: हम आम तौर पर उपयोग करने trypan नीले 0.8% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सेल मिश्रण को जोड़ा गया कोशिकाओं की गिनती में सहायता करते हैं। व्यवहार्य जीवित कोशिकाओं नीले रंग की डाई तक नहीं ले जाएगा और सफेद दिखाई देगा।

3. FACS BMPR-आईबी सकारात्मक कोशिकाओं और सेल युक्त scaffolds की तैयारी के लिए छंटनी

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। 100 μL (सेल कदम 2.13 में किया गिनती के आधार पर) प्रति 1 लाख कोशिकाओं की एकाग्रता में FACS बफर में कोशिकाओं Resuspend।
  2. लेबल एक प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में कम से कम 10 लाख कोशिकाओं स्थानांतरण "BMPR-आईबी।" उधर, एक अलग प्लास्टिक सेंट्रीफ्यूज लेबल ट्यूब के लिए 100 μL FACS बफर में एक लाख कोशिकाओं को हस्तांतरण "बेदाग।" "बेदाग" ट्यूब के लिए 1 एमएल FACS बफर जोड़ें। जबकि FACS अनुभव के हिस्से छँटाई बर्फ पर FACS बफर में कोशिकाओं के शेष रखेंiment किया जा रहा है। इन कोशिकाओं लेबल "Unsorted।" नियंत्रण बाद में प्रयोग के रूप में इन का प्रयोग करें।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार "BMPR-आईबी" ट्यूब के लिए एक फ्लोरोसेंट विरोधी मानव BMPR-आईबी एंटीबॉडी का एक उचित मात्रा में जोड़ें। मिश्रण के ऊपर और नीचे पिपेट धीरे एंटीबॉडी वितरित करने के लिए।
    नोट: हम एक 1:10 कमजोर पड़ने पर एक मानव BMPR-आईबी / ALK-6 एपीसी संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करें (विवरण के लिए अभिकर्मकों की सूची देखें)। हालांकि, विभिन्न निर्माताओं से एंटीबॉडी अलग सिफारिश की सांद्रता होगा।
  4. एक तरीका है कि बाहर प्रकाश रहता में बर्फ बाल्टी कवर। सेल / एंटीबॉडी मिश्रण 30 मिनट (या एंटीबॉडी निर्माता के निर्देशों के अनुसार) के लिए बैठने की अनुमति दें।
    नोट: विरोधी BMPR-आईबी एंटीबॉडी एक प्राथमिक unconjugated एंटीबॉडी कि एक माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता के रूप में आता है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ बर्फ पर एक अलग धुंधला कदम प्रदर्शन करते हैं।
  5. पर दोनों ट्यूबों अपकेंद्रित्र4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG। सतह पर तैरनेवाला Aspirate, गोली निकालना नहीं सावधान किया जा रहा। 1 एमएल FACS बफर में pelleted कोशिकाओं resuspend। फिर 5 मिनट के लिए 300 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate और 1 एमएल प्रति 1 लाख कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए FACS बफर में कोशिकाओं resuspend।
  6. 40 माइक्रोन नया लेबल गिलास FACS ट्यूबों में सेल झरनी के माध्यम से "BMPR-आईबी," "बेदाग," और "Unsorted" कोशिकाओं फ़िल्टर। 500 μL FACS बफर के साथ फिल्टर कुल्ला सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं फिल्टर में पीछे नहीं छोड़ रहे हैं। इसके अलावा दो अलग प्लास्टिक सेंट्रीफ्यूज लेबल "BMPR आईबी पॉजिटिव" और ट्यूबों के लिए 2 एमएल मानक मध्यम जोड़ने "BMPR-आईबी नकारात्मक।" FACS मशीन में हल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इन दोनों का प्रयोग करें।
  7. FACS मशीन पर, फ्लोरोसेंट मार्कर के लिए एक नकारात्मक गेट को परिभाषित करने के बेदाग कोशिकाओं का उपयोग करें।
  8. एक 100 माइक्रोन नोक, संबंधित ट्यूबों के चुनाव में क्रमबद्ध BMPR-आईबी सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं का प्रयोगमानक मध्यम taining। क्रमबद्ध दौरान इन ट्यूबों 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखें अगर FACS मशीन इस क्षमता है।
    नोट: कृपया शेरोन एट अल द्वारा जौव लेख 13 को देखें। FACS छँटाई के लिए एक उत्कृष्ट प्रोटोकॉल के लिए।
  9. एक hemocytometer का उपयोग करना, प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं की गिनती। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर ", BMPR आईबी पॉजिटिव" "BMPR-आईबी नकारात्मक," और "Unsorted" ट्यूब अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate, सेल गोली परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है। तब 250 μL प्रति 1 लाख कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए मानक माध्यम में कोशिकाओं resuspend।
  10. प्राप्त पूर्व में कटौती 4 मिमी पीएलजीए (पाली [लैक्टिक-सह-एसिड]) हाइड्रॉक्सियापटाइट के साथ लेपित scaffolds। प्रत्येक पाड़ 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में रखें। Unsorted, BMPR-आईबी सकारात्मक है, और BMPR-आईबी नकारात्मक (चित्रा 3): (। मैं करें.ई., 200,000 कोशिकाओं) को तीन समूहों में से एक से सेल निलंबन के 50 μL के साथ प्रत्येक पाड़ कवर।
    नोट: कृपयालो एट अल द्वारा जौव लेख 14 को देखें। पीएलजीए scaffolds के निर्माण पर जानकारी के लिए।
  11. आंशिक रूप से मानक माध्यम के साथ (scaffolds के सुखाना को रोकने के लिए), उसके ढक्कन के साथ प्लेट कवर, और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में सेते आसपास के खाली कुओं भरें।

4. calvarial दोष और पाड़ एसीएस-युक्त आवेदन के निर्माण

नोट: यह सुनिश्चित करें कि पर्याप्त संस्थागत मंजूरी लाइव चूहों में calvarial दोष के निर्माण के लिए जगह में हैं। इस प्रोटोकॉल स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

  1. एक सीडी -1 नग्न माउस या तो साँस isoflurane गैस या एक इंजेक्शन लंबे समय से अभिनय संवेदनाहारी कॉकटेल का उपयोग anesthetize।
    1. अकेले गैस का उपयोग करने के लिए, एक संज्ञाहरण कक्ष में माउस जगह है और 2 में ऑक्सीजन का प्रवाह शुरू - 3 एल / isoflurane की एक 2% एकाग्रता के साथ मिनट। एक बार माउस चully बेहोश, एक absorbant पैड के साथ यह एक गर्म पानी recirculating कंबल पर प्रवण जगह है और ऑक्सीजन और isoflurane का एक ही एकाग्रता के साथ एक संज्ञाहरण नाक शंकु में अपनी थूथन जगह है। ध्यान सांस की दर पर नजर रखने और जरूरत के रूप में isoflurane की एकाग्रता को समायोजित।
    2. एक इंजेक्शन लंबे समय से अभिनय संवेदनाहारी कॉकटेल का उपयोग करने के लिए, एक संज्ञाहरण कक्ष में माउस anesthetize के रूप में ऊपर वर्णित है और फिर संवेदनाहारी कॉकटेल इंजेक्षन। संज्ञाहरण कक्ष से माउस निकालें और अपने व्यवहार निरीक्षण करते हैं।
      नोट: माउस संक्षेप संज्ञाहरण से लेकिन कई मिनट के भीतर फिर से उभर सकता है पूरी तरह से इंजेक्शन संवेदनाहारी के प्रभाव के तहत anesthetized किया जाना चाहिए। एक गर्म पानी recirculating एक absorbant पैड के साथ कवर कंबल करने के लिए माउस स्थानांतरण।
      नोट: एक संवेदनाहारी कॉकटेल के लिए, हम सामान्य नमक में ketamine 10 मिलीग्राम / एमएल और xylazine 1 मिलीग्राम / एमएल युक्त एक मिश्रण है, intraperitoneally वितरित की सलाह देते हैं। इस मिश्रण के मानक खुराक हैएक 30 जी माउस, जो 100 मिलीग्राम / किग्रा और xylazine 10 मिलीग्राम / किग्रा ketamine के लिए equates के लिए 300 μL। इंजेक्शन संवेदनाहारी के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।
    3. संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी पैंतरेबाज़ी का प्रयोग करें। एक पर्याप्त रूप से anesthetized माउस अपने हाथ वापस लेना नहीं होगा जब इसे हल्के ढंग से सर्जन द्वारा pinched है।
    4. कॉर्निया की सुखाना को रोकने के लिए आंख मरहम लागू करें।
    5. 1 मिलीग्राम / किलो buprenorphine एसआर subcutaneously प्रशासन।
      नोट: बेहतर दर्द से राहत में सर्जरी के परिणामों से पहले पीड़ानाश प्रदान करना।
    6. पूरी प्रक्रिया के दौरान, माउस की सांस की दर पर नजर रखने के।
      नोट: - 100 साँस / मिनट ठीक से isoflurane के तहत anesthetized एक माउस 50 के श्वसन दर होनी चाहिए। एक वृद्धि की सांस की दर इंगित करता है कि संज्ञाहरण, भी प्रकाश है, जबकि एक कम श्वसन दर का संकेत हो सकता है कि संज्ञाहरण भी गहरी है।
  2. povidone-IOD के साथ खोपड़ी के पृष्ठीय पहलू की त्वचा तैयारीine समाधान 70% इथेनॉल तीन बार द्वारा पीछा किया। बाँझ पर्दे के साथ कपड़ा, शल्य उजागर साइट छोड़ने।
    ध्यान दें: बाँझ सर्जिकल दस्ताने पहनें और प्रक्रिया के दौरान बाँझ तकनीक बनाए रखें। केवल ऐसे बाँझ कपड़ा और autoclaved उपकरणों के रूप में बाँझ सतहों और वस्तुओं को स्पर्श करें। एक सहायक प्रकाश व्यवस्था, खुले सिवनी के पैकेट, आदि को समायोजित किया है
  3. 15 ब्लेड छुरी का प्रयोग, एक बाण midline चीरा कि पृष्ठीय खोपड़ी के बहुमत पर फैली हुई हैं। ठीक एक दांतेदार संदंश का प्रयोग, सही पार्श्विका हड्डी बेनकाब करने के लिए चीरा के दाईं ओर त्वचा वापस लेना।
  4. एक autoclaved 4 मिमी हीरा लेपित trephine ड्रिल बिट के साथ एक ड्रिल का प्रयोग, पार्श्विका हड्डी के माध्यम से एक दोष ड्रिल। ड्यूरा मेटर परत में पिछले अस्थि दोष का विस्तार नहीं है। (चित्रा 4)
  5. एक पाड़ दोष में रखें, और फिर नायलॉन सीवन चलाने के साथ त्वचा चीरा बंद करें।
  6. माउस मॉनिटर और मानक पश्चात की देखभाल के लिए एक प्रदानसंस्थागत दिशा निर्देशों के ccording।
    1. एक साफ पिंजरे के अंदर एक साफ कागज तौलिया पर माउस रखें जबकि यह ठीक हो जाए। पिंजरे में से एक आधा गर्म पानी recirculating कंबल पर रखा जाना चाहिए और माउस के शुरू में इस छमाही में रखा जाना चाहिए।
    2. जब तक यह ambulate करने के लिए पर्याप्त होश आ गया है एक माउस पहुंच से बाहर मत छोड़ो। एक माउस जब तक यह पूरी तरह से ठीक है कि अन्य चूहों के साथ एक पिंजरे में सर्जरी आया है वापस नहीं है।
  7. प्रत्येक पाड़ है कि परीक्षण किया जा करने के लिए एक नया माउस के साथ ऊपर के चरणों को दोहराएँ। एक गर्म मनका अजीवाणु या अन्य उपयुक्त विधि का उपयोग सर्जरी के बीच में शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित।
  8. शीघ्र ही प्रक्रिया के बाद, और फिर 2, 4, 6, और 8 सप्ताह में, माइक्रो सीटी स्कैन का उपयोग calvarial दोष बंद होने की दर का विश्लेषण करने के लिए।
    नोट: लेवी एट अल द्वारा लेख देखें। Calvarial दोष के सूक्ष्म सीटी स्कैन का वर्णन के लिए 6।
  9. जब प्रयोग comple हैते, उन्हें एक स्वच्छ इच्छामृत्यु के चेंबर में रखने और 2 एल / मिनट की दर से कार्बन डाइऑक्साइड गैस का प्रवाह चैम्बर में शुरू करने से चूहों euthanize। बाद श्वास पूरी तरह से (के बाद लगभग 10 मिनट) रह गए हैं इच्छामृत्यु की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन ग्रीवा अव्यवस्था।
  10. वैकल्पिक रूप से, के बाद प्रयोग पूरा हो गया है, उपयोग सेक्शनिंग और histological धुंधला दोष के भीतर हड्डी गठन का आकलन करने के लिए।
    नोट: McArdle एट अल द्वारा लेख देखें। हड्डी की तैयारी की जानकारी के लिए 12 ऊतक विज्ञान के लिए नमूनों। ऊतकीय और धुंधला तकनीक की एक समीक्षा के लिए, इस तरह के सर्जिकल पैथोलॉजी 15 के मैनुअल के रूप में एक ऊतकीय मैन्युअल देखें।

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Representative Results

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माइक्रो सीटी सर्जरी के दिन पर किया स्कैन स्पष्ट रूप से खोपड़ी दोष दिखाएगा। इस समय वहाँ 4 मिमी दोष में कोई अंतर्वृद्धि होगा। इसके बाद स्कैन समय के साथ दोष का आकार यों की आधारभूत के साथ तुलना में समय के साथ प्राप्त कर रहे हैं। BMPR-आईबी + कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त दोष दोष के और अधिक तेजी से बंद करने का प्रदर्शन करना चाहिए जब BMPR-IB- और Unsorted कोशिकाओं (चित्रा 5) के साथ तुलना। इसके अलावा, दोष युक्त खोपड़ी के हिस्से decalcified और मानक तरीकों का उपयोग कर 12 ऊतक विज्ञान के लिए कार्रवाई की जा सकती है। Movat के pentachrome दाग के साथ दाग वर्गों दोष अन्य सेल आबादी (चित्रा 6) के साथ तुलना BMPR-आईबी कोशिकाओं के साथ इलाज में अधिक से अधिक हड्डी पुनर्जनन को उजागर करेंगे।

आकृति 1
चित्रा 1: पीबीएस धोने के बाद Lipoaspirate। strong> पीबीएस के बाद lipoaspirate का एक कनस्तर जोड़ा जाता है और मिश्रण व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी है। जबकि नीचे की परत जलीय परत, मुख्य रूप से खारा और रक्त के शामिल है शीर्ष ऊतक की परत, वसा ऊतकों जो ASCs मेजबान है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Polysucrose समाधान पर सेल निलंबन की नियुक्ति। (क) सेल निलंबन ट्यूब के पक्ष पर बहुत धीरे pipetted किया जाना चाहिए, यह polysucrose समाधान के शीर्ष पर परत करने के लिए अनुमति देता है। (ख) इस polysucrose centrifugation से पहले के शीर्ष पर एक सेल निलंबन परत की सही उपस्थिति है।"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: पाड़ पर कोशिकाओं की सीडिंग। (क) 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली से एक अच्छी तरह से बाँझ सतह पर, सेल निलंबन के लगभग 50 μL के साथ एक सूखी पाड़ लोड। (ख) कोशिका आसंजन अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में पाड़ सेते हैं। नोट: चित्र में, एक 10 सेमी की थाली प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: calvarial दोष का निर्माण। calvarial दोष (तीर) के भीतर दिखाई दे रहा हैखुली त्वचा चीरा। नोट बरकरार Dural रक्त वाहिकाओं (तीर), यह दर्शाता है कि ड्रिलिंग ड्यूरा का उल्लंघन नहीं किया है। स्केल पट्टी, 5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: विभिन्न एएससी उप-जनसंख्या के साथ महत्वपूर्ण आकार calvarial दोष की हीलिंग। (-) ASCs (ए) तीन आयामी सूक्ष्म सीटी पुनर्निर्माण calvarial दोष के लिए प्रदर्शन किया गया अवर्गीकृत, BMPR-आईबी (+), या BMPR-आईबी के साथ रखा फिर से। (बी) अवर्गीकृत और के साथ तुलना में 8 सप्ताह BMPR-आईबी (+) ASCs (92%) के साथ काफी अधिक हड्डी पुनर्जनन प्रदर्शन पर चिकित्सा की मात्रा BMPR-आईबी (-) ASCs (58% और 46%, क्रमशः, ** पी < 0.01)। चिकित्सा में महत्वपूर्ण मतभेद भी 2 हम पर देखा गयाई.के.एस. (** पी <0.01), 4 सप्ताह (*** पी <0.001), और 6 सप्ताह (*** पी <0.001)। सूक्ष्म सीटी, सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी। McArdle एट अल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। 12। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: अस्थि पुनर्जन्म के histological धुंधला हो जाना। हड्डी के (ए) Movat के pentachrome धुंधला अवर्गीकृत, BMPR-आईबी (+), या BMPR-आईबी के साथ की मरम्मत दोष में पुनर्जन्म (-) उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग 5X बढ़ाई ASCs। नोट BMPR-आईबी (+) समूह BMPR-आईबी के साथ तुलना में अधिक मजबूत हड्डी गठन (-) समूह। बिंदीदार रेखा दोष क्षेत्र की हद तक का प्रतिनिधित्व करता है। काले आयत के भीतर इस क्षेत्र में उच्च Magnific पर दिखाया जाता हैव्यावहारिक उपयोग कर (बी) 10X और (सी) 40X उज्ज्वल क्षेत्र दोष क्षेत्र के माइक्रोस्कोपी। McArdle एट अल से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। 12। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

ASCs की फसल के दौरान महत्वपूर्ण कदम collagenase के साथ वसा की पर्याप्त पाचन है। अपर्याप्त पाचन ASCs की कम उपज में परिणाम होगा। BMPR-आईबी + कोशिकाओं की FACS छँटाई के दौरान, यह ध्यान से सकारात्मकता के लिए गेट को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है। फाटकों को परिभाषित करना भी शिथिल हल आबादी है कि शुद्ध नहीं हैं हो सकता है। calvarial दोष के निर्माण के दौरान, यह खोपड़ी की हड्डी के माध्यम से दोष ड्रिल करने के लिए, लेकिन ड्यूरा मेटर में अग्रिम नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस विपुल खून बह रहा है और दिमाग है, जो जानवर की इच्छामृत्यु की जरूरत होगी के प्रदर्शन के लिए प्रेरित करेगा।

संशोधन और समस्या निवारण

calvarial दोष सर्जरी के लिए संज्ञाहरण के बारे में, हमारी प्रयोगशाला साँस isoflurane का उपयोग करने के लिए पसंद करते हैं, लेकिन एक और विकल्प intraperitoneally सामान्य सा में ketamine 10 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता और xylazine 1 मिलीग्राम / एमएल युक्त एक मिश्रण इंजेक्षन करने के लिए हैलाइन। इस मिश्रण के मानक खुराक 30 ग्राम माउस के लिए 300 μL है। यह विश्वसनीय संज्ञाहरण कि माउस की आवश्यकता नहीं है सर्जरी के दौरान isoflurane नाक शंकु में होना का लगभग 30 मिनट प्रदान करता है। इंजेक्शन संवेदनाहारी का उपयोग करने का एक नुकसान यह है कि यह संभव के बाद इंजेक्शन दिया गया है खुराक कम करने के लिए नहीं है। इसके विपरीत, साँस isoflurane आसानी से ऊपर या वास्तविक समय में नीचे titrated जा सकता है।

जब पाड़ के लिए सेल निलंबन जोड़ने, शोधकर्ताओं पा सकते हैं कि तरल पदार्थ की मात्रा बहुत छोटा है और आंशिक रूप से ऊष्मायन के 30 मिनट में लुप्त हो जाएगा। वाष्पीकरण कोशिका मृत्यु, जो हड्डी चिकित्सा प्रयोगों में एक विशेष रूप से हानिकारक confounder है पैदा कर सकता है। इस लड़ाई, एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से अंदर पाड़ लोड। सादे माध्यम के साथ तुरंत आसपास के कुओं भरें। यह एक humidified सूक्ष्म वातावरण मदद करता है जो बाहर सुखाने से भरी हुई पाड़ रखने पैदा करेगा।

हड्डी के histological धुंधला पूर्व हैएम्बेडिंग और सेक्शनिंग से पहले calvarium की सही और पूरी तरह से विकैल्सीकरण पर dicated। यह स्वीकार किया है कि अलग-अलग उम्र के खोपड़ी विकैल्सीकरण के भिन्न अवधियों की आवश्यकता होती है, पारंपरिक रूप से एक EDTA समाधान में किया

तकनीक की सीमाएं

इस प्रोटोकॉल दोष के बंद को बढ़ाने के लिए कोशिकाओं की आबादी की क्षमता का आकलन करने के लिए एक 4 मिमी calvarial दोष का इस्तेमाल करता है। यह मॉडल चिकित्सा कि इस तरह के एक लंबी हड्डी फ्रैक्चर या एक ट्यूमर लकीर के रूप में एक अधिक जटिल माहौल में होता है अनुकरण नहीं कर सकते। इस कारण से, वैकल्पिक पशु मॉडल इन सेटिंग्स में हड्डी उपचार के लिए ASCs के योगदान को समझने के लिए इस्तेमाल करने की आवश्यकता हो सकती है।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

cytometry विशिष्ट ए एस सी आबादी को अलग करने के लिए प्रवाह का उपयोग कर कई ऊतक के संदर्भ में और में चिकित्सा और उत्थान को बढ़ाने के लिए एक आशाजनक तकनीक हैऐसे angiogenesis, वसाजनन, और osteogenesis के रूप में जूरी मॉडल,। समर्थक osteogenic कोशिकाओं की उपयोगिता इस अध्ययन में पता लगाया है, कोशिकाओं सकारात्मक एक calvarial दोष के उपचार में BMPR-आईबी के लिए चुना के साथ एक गहरा असर दिखा।

एएससी के अलगाव के लिए पहले प्रोटोकॉल सेल संस्कृति प्लेटों 16 पर कई दिनों के लिए संवर्धन कोशिकाओं को शामिल करना। हालांकि, कोशिकाओं महत्वपूर्ण प्ररूपी बहाव जबकि संस्कृति में अनुभव हो सकता है। इस कारण से, हम एक एएससी अलगाव प्रोटोकॉल है कि इन कोशिकाओं का तेजी से अलगाव के लिए अनुमति देता है, FACS का उपयोग आगे उप-जनसंख्या शुद्धि के बाद का उपयोग करें। इस पूरी प्रक्रिया में कम से कम एक दिन में पूरा हो रहा है, कोशिका की सतह मार्कर या प्ररूपी बहाव के प्रभाव को कम से कम।

भविष्य अनुप्रयोगों और दिशा-निर्देश

हमें पता चला है कि ASCs अत्यधिक व्यक्त BMPR-आईबी अधिक से अधिक अन्य ASCs के साथ तुलना में पुनर्जन्म का अस्थि दोष चिकित्सा बढ़ाने की क्षमता प्रदर्शित करता है। तंत्र underlyइस घटना आईएनजी नहीं जाना जाता है। उदाहरण के लिए, यह है कि क्या कोशिकाओं को खुद सीधे बोन बनाने कोशिकाओं में अंतर, या कि क्या वे कारक हैं जो अन्य कोशिकाओं ऐसा करने के लिए प्रोत्साहित उत्पादन स्पष्ट नहीं है। भविष्य के अध्ययन के लिए इन सवालों के जवाब देने के लिए प्रदर्शन करने की आवश्यकता होगी।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

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References

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BMPR-आईबी + का तेजी से अलगाव एक calvarial दोष हीलिंग मॉडल में वसा व्युत्पन्न उपयोग के लिए stromal कोशिकाओं
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Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).More

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

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