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Developmental Biology

Isolamento rapido di BMPR-IB + derivate da tessuto adiposo cellule stromali per l'uso in un cranica difetto di guarigione Modello

doi: 10.3791/55120 Published: February 24, 2017

Introduction

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I principali difetti ossei derivanti da lesioni, infezioni o cancro invasivo hanno un impatto significativo sul recupero e la qualità della vita del paziente. Le tecniche esistono per riempire questi difetti con ossa sane da altrove nel corpo del paziente, ma questo trasferimento porta proprio la morbilità e il rischio di complicazioni 1, 2, 3. Inoltre, alcuni difetti sono così grandi o complessi che sufficiente osso donatore non è disponibile per riempire il difetto. Dispositivi protesici sono una possibile opzione per il riempimento di difetti ossei, ma questi sono associati con diversi svantaggi, tra cui il rischio di infezione, guasti hardware, e la reazione da corpo estraneo 4.

Per questi motivi è grande interesse per la possibilità di ingegneria sostituti ossei biologici utilizzando cellule 5 del paziente. cellule stromali derivate da tessuto adiposo (ASC)hanno un potenziale per questa applicazione perché sono abbondantemente disponibili in proprio tessuto adiposo del paziente e hanno dimostrato la capacità di guarire difetti ossei generando nuovo tessuto osseo 6, 7. ASC sono una popolazione eterogenea di cellule e diversi studi hanno dimostrato che la selezione per specifici marcatori di superficie delle cellule in grado di produrre popolazioni di cellule con una maggiore attività osteogenica 8, 9. Selezione ASC con il più alto potenziale osteogenico aumenterebbe la probabilità che uno scaffold seminati con queste cellule potrebbe rigenerare un grande difetto osseo.

Proteina ossea morfogenetica (BMP) segnalazione è critica nel regolare differenziazione ossea e la formazione 10 e il tipo BMP Receptor IB (BMPR-IB) è noto per essere importante per osteogenesi in ASC 11. Recentemente, abbiamo dimostrato che l'espressione di BMPR-IB può be consente di selezionare per le ASC con una maggiore attività osteogenica 12. Qui mostriamo un protocollo per l'isolamento di BMPR-IB-esprimendo ASC dal grasso umano seguita da un saggio della loro attività osteogenica utilizzando un vivo cranica modello di difetto.

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Protocol

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NOTA: I campioni sono stati ottenuti da pazienti che hanno dato il consenso informato. Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal appropriata Stanford University Institutional Review Board. Durante la manipolazione dei tessuti e delle cellule umani, sempre aderire al livello di biosicurezza 2 (BSL2) le precauzioni, come specificato dal proprio istituto.

1. Preparazione dei reagenti

  1. Preparare tampone FACS: aggiungere 10 ml di FBS, 5 ml Polossamero 188 e 5 ml Pen-Strep a 500 ml di soluzione fisiologica sterile tampone fosfato (PBS).
  2. Preparare digerire miscela: Aggiungi 0.375 g C. hemolyticum tipo collagenasi II in polvere e 5 ml Polossamero 188 a 500 ml sterile 199 / EBSS medie.
  3. Preparare mezzo standard: aggiungere 50 ml di FBS e 5 ml Pen-Strep per Modified Eagle Medium di 500 ml Dulbecco.

2. Raccolta e Isolamento di ASC

NOTA: Assicurarsi che adeguate approvazioni istituzionali sono in atto per l'utilizzo di tessuti umani e per isolare hLe cellule staminali Uman. Ottenere addominale umana, affiancare, o coscia grasso sottocutaneo da un donatore sano fase di liposuzione elettiva. Mantenere il grasso in un contenitore di plastica di aspirazione.

  1. Aggiungere PBS sterile in un rapporto 1: 1 per il grasso nel contenitore in plastica originale. (Se non vi è 500 grasso ml, aggiungere 500 ml di PBS). Mescolare delicatamente agitazione per 30 s. Lasciare la fase acquosa di depositarsi sul fondo (figura 1) e poi aspirare e scartare lo strato acquoso con una pipetta 10 mL plastica applicata aspirazione.
  2. Decantare il grasso in un contenitore di plastica grande e aggiungere digerire miscela in un rapporto 1: 1. Chiudere il contenitore e pulire l'esterno con il 70% di etanolo. Sigillare il tappo con la pellicola di paraffina.
  3. Agitare il contenitore in un agitatore orbitale a 180 rpm a 37 ° C per 30 min.
  4. Neutralizzare la digestione aggiungendo mezzo standard in un rapporto 1: 1. (Se non vi è 1.000 miscela di grassi ml, aggiungere 1.000 ml medie standard).
  5. Distribuire il composto in parti uguali in un numero pari di 250 mL plastica provette coniche da centrifuga e centrifugare la miscela a 300 xg per 20 minuti a 4 ° C.
  6. Aspirare il surnatante e fare attenzione a lasciare intatto il pellet. pellet Risospendere in 5 ml di medio standard per ciascun tubo conico.
  7. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 100 micron in un tubo da 50 ml centrifuga. Poi, centrifugare a 300 xg per 15 min a 4 ° C.
  8. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di temperatura ambiente tampone di lisi RBC. Lasciare il composto riposare per 5 min a temperatura ambiente quindi si centrifuga a 300 xg per 15 min a temperatura ambiente (RT).
  9. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 15 ml di media standard. Ancora filtrata attraverso un filtro da 100 micron in 50 mL provetta conica.
  10. In un nuovo 50 ml conica, aggiungere 15 ml di soluzione polysucrose progettata per la separazione di densità-based (vedi elenco dei reagenti). Quindi, tenendo il tubo con un angolo di 45 °, pipettatura le cellule sul latoil tubo in modo che la sospensione cellulare delicatamente strati sulla parte superiore della soluzione polysucrose (Figura 2).
    NOTA: È importante cellule pipetta sulla superficie della soluzione. Non aggiungere soluzione polysucrose ad una sospensione di cellule in quanto ciò crea una miscela irreversibile. Analogamente, non pipettare le cellule al centro della soluzione polysucrose.
  11. Centrifugare questa miscela a 300 xg per 10 min a RT. Utilizzare bassa accelerazione (2 - 3 su 10) e impostare la funzione di freno della centrifuga a zero per questo passo.
    NOTA: Tre strati saranno visibili: chiara sul fondo, nuvoloso nel mezzo, e color salmone sulla parte superiore. Lo strato intermedio contiene le cellule di interesse.
  12. Usando una pipetta mL 10 rimuovere con cautela lo strato intermedio e il trasferimento ad un nuovo tubo da 50 ml.
    NOTA: E 'meglio trasferire completamente lo strato intermedio e nel processo prendere alcuni degli strati superiore e inferiore rispetto a lasciarsi alle spalle alcuni lo strato centrale.
  13. <li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e determinare il numero totale di cellule vive.
    NOTA: Usiamo tipicamente blu trypan aggiunto alla miscela di cellule ad una concentrazione finale di 0,8% per aiutare nella conteggio delle cellule. Vitali cellule vive non prenderanno il colorante blu e appariranno bianco.

3. FACS ordinamento per BMPR-IB Cellule positive e preparazione di scaffold cellulari contenenti

  1. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in tampone FACS ad una concentrazione di 1 milione di cellule per 100 microlitri (in base al conteggio delle cellule fatto nel passaggio 2.13).
  2. Trasferimento di almeno 10 milioni di cellule in una provetta da centrifuga di plastica con l'etichetta "BMPR-IB." Separatamente, il trasferimento di un milione di cellule in 100 microlitri di buffer FACS di un tubo da centrifuga di plastica separato con l'etichetta "senza macchia". Aggiungere 1 ml FACS buffer per il tubo "senza macchia". Mantenere il resto delle cellule in tampone FACS sul ghiaccio mentre le FACS ordinamento porzione del experiment è stato fatto. Etichettare queste cellule "non scelti". Utilizzare questi come controlli successivamente nell'esperimento.
  3. Aggiungere una quantità appropriata di un anticorpo BMPR-IB antiumano fluorescente al tubo "BMPR-IB" secondo le istruzioni del produttore. Pipettare la miscela su e giù delicatamente per distribuire l'anticorpo.
    NOTA: Usiamo un Umano BMPR-IB / ALK-6 Anticorpo APC-coniugato ad una diluizione 1:10 (vedi elenco di reagenti per i dettagli). Tuttavia, gli anticorpi di diversi produttori avranno diverse concentrazioni consigliate.
  4. Coprire il secchio di ghiaccio in un modo che mantiene la luce. Lasciare il composto cellule / anticorpo riposare per 30 min (o secondo le istruzioni del produttore anticorpi).
    NOTA: Se l'anticorpo anti-BMPR-IB viene come un anticorpo coniugato primario che richiede un anticorpo secondario, eseguire una fase di colorazione separata su ghiaccio con l'anticorpo secondario secondo le istruzioni del produttore.
  5. Centrifugare entrambi i tubi a300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non aspirare il pellet. Risospendere le cellule pellet in 1 mL di tampone FACS. Anche in questo caso centrifugare le provette a 300 xg per 5 min. attenzione aspirare il surnatante e risospendere le cellule in tampone FACS ad una concentrazione di 1 milione di cellule per 1 ml.
  6. Filtrare il "BMPR-IB", "senza macchia", e "le cellule non scelti" attraverso 40 micron filtri cellulari in nuovi tubi di vetro FACS etichettati. Sciacquare i filtri con 500 microlitri di buffer FACS per assicurare che le cellule non sono lasciati alle spalle nel filtro. Anche aggiungere 2 ml di medio standard per due provette da centrifuga di plastica separati etichettati "BMPR-IB-positivo" e "BMPR-IB-negativo." Utilizzare questi due per raccogliere le cellule ordinati nella macchina FACS.
  7. Sulla macchina FACS, utilizzare le cellule non colorate per definire un cancello negativo per il marcatore fluorescente.
  8. Utilizzando un ugello di 100 micron, di ordinamento BMPR-IB cellule positive e negative nelle rispettive provette della truffacontenente medie standard. Mantenere questi tubi raffreddati a 4 ° C durante l'ordinamento se la macchina FACS ha questa capacità.
    NOTA: Si prega di fare riferimento all'articolo 13 JOVE da Sharon et al. per un protocollo ottimo per FACS ordinamento.
  9. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule in ciascun tubo. Centrifugare la "BMPR-IB-positivo", "BMPR-IB-negativo" e "tubi" non scelti a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Poi risospendere le cellule in terreno standard ad una concentrazione di 1 milione di cellule per 250 ml.
  10. Ottenere ponteggi rivestite con idrossiapatite pre-tagliate quattro millimetri PLGA (poli [acido lattico-co-glicolico]). Posizionare ogni impalcatura in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti. Coprire ogni scaffold con 50 ml di sospensione cellulare da uno dei tre gruppi (i .e, 200.000 celle.): Unsorted, BMPR-IB-positive, e BMPR-IB-negative (figura 3).
    NOTA: Si prega diconsultare l'articolo JOVE 14 da Lo et al. Per i dettagli sulla costruzione di ponteggi PLGA.
  11. Riempire parzialmente circostanti pozzetti vuoti con medie standard (per evitare essiccazione dei ponteggi), ricoprono la piastra con il coperchio, e incubare in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C per 30 min.

4. Creazione di difetti cranica e l'applicazione di ACS contenenti Ponteggio

NOTA: assicuratevi che adeguate approvazioni istituzionali sono in atto per la creazione di difetti cranica in topi vivi. Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa la Stanford University.

  1. Anestetizzare un CD-1 topo nudo utilizzando sia inalato gas isoflurano o un iniettato lunga durata d'azione cocktail anestetico.
    1. Per utilizzare solo gas, posizionare il mouse in una camera anestesia e avviare il flusso di ossigeno a 2 - 3 l / min con una concentrazione del 2% di isoflurano. Una volta che il mouse è fully incoscienza, posizionarlo prono su una calda coperta di acqua di ricircolo con un tampone assorbente e mettere il muso in un cono anestesia con la stessa concentrazione di ossigeno e isoflurano. Monitorare attentamente la frequenza respiratoria e regolare la concentrazione di isoflurano, se necessario.
    2. Per utilizzare un iniettato azione prolungata cocktail anestetico anestetizzare il mouse in una camera di anestesia come descritto sopra e poi iniettare il cocktail anestetico. Rimuovere il mouse dalla camera di anestesia e osservare il suo comportamento.
      NOTA: Il mouse può brevemente emergere dall'anestesia ma in pochi minuti dovrebbe essere ancora completamente anestetizzato sotto l'effetto dell'anestetico iniettato. Trasferire il mouse per una calda coperta di acqua di ricircolo coperto con un tampone assorbente.
      NOTA: Per un cocktail anestetico, si consiglia una miscela contenente ketamina 10 mg / mL e xilazina 1 mg / ml in soluzione fisiologica, consegnato per via intraperitoneale. La dose standard di questa miscela è300 microlitri di 30 g del mouse, il che equivale a ketamina 100 mg / kg e xilazina 10 mg / kg. Vedi la sezione di discussione per ulteriori dettagli riguardanti l'anestetico iniettabile.
    3. Utilizzare una manovra punta pizzico di determinare la profondità dell'anestesia. Un mouse adeguatamente anestetizzato non rientra la zampa quando è leggermente schiacciato dal chirurgo.
    4. Applicare unguento oculare per prevenire l'essiccamento della cornea.
    5. Somministrare 1 mg / kg per via sottocutanea di buprenorfina SR.
      NOTA: fornire l'analgesia prima ai risultati di chirurgia nella riduzione del dolore superiore.
    6. Durante l'intera procedura, monitorare la frequenza respiratoria del mouse.
      NOTA: Un mouse adeguatamente anestetizzato sotto isoflurano dovrebbe avere una frequenza respiratoria di 50 - 100 respiri / min. Un aumento della frequenza respiratoria indica che l'anestesia è troppo leggero, mentre una diminuzione della frequenza respiratoria può indicare che l'anestesia è troppo profondo.
  2. Preparare la pelle della parte dorsale del cranio con povidone-IODsoluzione ine seguito da etanolo al 70% per tre volte. Telo con teli sterili, lasciando il sito chirurgico esposto.
    NOTA: Indossare guanti chirurgici sterili e mantenere una tecnica sterile durante la procedura. Solo toccare le superfici sterili e oggetti, come il telino sterile e gli strumenti in autoclave. Avere un assistente regolare l'illuminazione, i pacchetti di sutura aperti, etc.
  3. Usando un bisturi 15-lama, fare una incisione mediana sagittale che si estende sulla maggior parte del cranio dorsale. Utilizzando una pinza sottile dentate, ritrarre la pelle sul lato destro dell'incisione per esporre destra osso parietale.
  4. Utilizzando un trapano con una punta da trapano 4 millimetri trapano diamantata autoclave, praticare un difetto attraverso l'osso parietale. Non estendere il difetto passato osso nello strato di dura madre. (Figura 4)
  5. Mettere un ponteggio nel difetto, e quindi chiudere l'incisione cutanea con l'esecuzione di sutura in nylon.
  6. Monitorare il mouse e fornire standard di assistenza post-operatoria di unecondo le linee guida istituzionali.
    1. Tenere il mouse su un tovagliolo di carta pulito all'interno di una gabbia pulita mentre si recupera. Una metà della gabbia deve essere collocato sopra una calda coperta ricircolo acqua e il mouse deve essere inizialmente collocato in questo mezzo.
    2. Non lasciare incustoditi un mouse fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per deambulare. Non restituire un mouse che ha subito un intervento chirurgico per una gabbia con altri topi finché non è completamente recuperato.
  7. Ripetere i passaggi precedenti con un nuovo mouse per ogni scaffold che deve essere testato. Sterilizzare gli strumenti chirurgici tra interventi chirurgici utilizzando uno sterilizzatore a caldo tallone o altro metodo adeguato.
  8. Poco dopo la procedura, e poi a 2, 4, 6, e 8 settimane, utilizzare la scansione micro CT per analizzare il tasso di chiusura del difetto cranica.
    NOTA: Vedere l'articolo di Levi et al. 6 per una descrizione di TAC micro difetti cranica.
  9. Quando l'esperimento è complete, eutanasia i topi mettendoli in una camera eutanasia pulito e iniziare un flusso di anidride carbonica nella camera ad una velocità di 2 L / min. Dopo respirazioni hanno cessato completamente (dopo circa 10 min) eseguire dislocazione cervicale per confermare l'eutanasia.
  10. Facoltativamente, dopo l'esperimento è completa, l'uso di sezionamento e colorazione istologica di valutare formazione ossea all'interno del difetto.
    NOTA: Vedere l'articolo di McArdle et al. 12 per i dettagli della preparazione ossea campioni per esame istologico. Per una rassegna di tecniche istologiche e di colorazione, consultare un manuale istologico, come il Manuale di Patologia Chirurgica 15.

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Representative Results

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Micro TAC eseguita il giorno della chirurgia mostrerà chiaramente il difetto cranio. A questo punto non vi sarà alcuna ricrescita nel difetto 4 mm. scansioni successive vengono ottenuti nel tempo di quantificare l'entità del difetto nel tempo rispetto al basale. Difetti seminati con cellule BMPR-IB + dovrebbero dimostrare più rapida chiusura del difetto se confrontato con BMPR-IB e le cellule non scelti (Figura 5). Inoltre, la porzione del cranio contenente il difetto può essere decalcificata e trattati per istologia utilizzando metodi standard 12. Sezioni colorate con macchia pentachrome di Movat riveleranno una maggiore rigenerazione ossea nel difetto trattato con cellule BMPR-IB rispetto alle altre popolazioni cellulari (Figura 6).

Figura 1
Figura 1: lipoaspirato dopo PBS Wash. strong> viene aggiunta una bomboletta di lipoaspirato dopo PBS e la miscela è permesso di stabilirsi. Lo strato di tessuto superiore è il tessuto adiposo che ospita ASC, mentre lo strato inferiore è lo strato acquoso, principalmente costituito da soluzione salina e sangue. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Posizionamento del cellulare di sospensione sul Polysucrose Solution. (a) La sospensione cellulare deve essere pipettati molto delicatamente sul lato del tubo, permettendo così di strato sulla superficie della soluzione polysucrose. (b) Questo è il corretto aspetto di un livello sospensione cellulare in cima alla polysucrose prima della centrifugazione."> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Semina di cellule su l'impalcatura. (a) Sulla superficie sterile di un pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti, caricare un ponteggio secco con circa 50 ml di sospensione cellulare. (b) incubare il ponteggio in un incubatore di coltura cellulare per 30 minuti per permettere l'adesione delle cellule. Nota: Nella figura, una piastra 10 cm è utilizzato per scopi dimostrativi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Creazione del cranica difetto. Il difetto cranica (frecce) è visibile all'interno dellaaperto incisione cutanea. Nota i vasi sanguigni intatti durale (frecce), che indica che la perforazione non ha violato la dura. Barra di scala, 5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: La guarigione di difetti critici dimensioni cranica con diverse sottopopolazioni ASC. (A) tridimensionali ricostruzioni TC microfoni sono stati eseguiti per difetti cranica ri- accoppiato con non ordinati, BMPR-IB (+), o BMPR-IB (-) ASC. (B) Quantificazione di guarigione a 8 settimane dimostrato significativamente maggiore rigenerazione ossea con BMPR-IB (+) ASC (92%) rispetto ai misti e BMPR-IB (-) ASC (58% e 46%, rispettivamente, ** p < 0.01). Differenze significative nella guarigione sono stati osservati anche a 2 siamoEKS (** p <0.01), 4 settimane (*** p <0,001), e 6 settimane (*** p <0.001). Micro-CT, i micro-tomografia computerizzata. Ristampato con il permesso di McArdle et al. 12. barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: La colorazione istologica del rigenerato osseo. Pentachrome colorazione (A) di Movat di osso rigenerarsi nei difetti riparati con indifferenziati, BMPR-IB (+), o BMPR-IB (-) ASC a 5X ingrandimento usando la microscopia in campo chiaro. Nota formazione di osso più robusto in BMPR-IB (+) Gruppo rispetto al BMPR-IB (-) del gruppo. La linea tratteggiata rappresenta l'estensione dell'area difetto. L'area all'interno del rettangolo nero è mostrata su una maggiore magnificazione con (B) 10X e (C) 40X brillante campo microscopia di superficie difetto. Ristampato con il permesso di McArdle et al. 12. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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I passaggi critici all'interno del protocollo

Durante la raccolta di ASC, la fase critica è adeguata digestione dei grassi con collagenasi. digestione inadeguata si tradurrà in una bassa resa di ASC. Durante FACS ordinamento delle cellule BMPR-IB +, è importante definire con precisione il cancello per positività. Definire cancelli troppo debolmente può causare popolazioni ordinati che non sono puri. Durante la creazione del difetto cranica, è fondamentale per perforare il difetto attraverso l'osso del cranio ma non avanza all'interno della dura madre. Questo farà sì che il sanguinamento profuso e l'esposizione del cervello, che richiederà l'eutanasia dell'animale.

Modifiche e risoluzione dei problemi

Per quanto riguarda l'anestesia per la chirurgia difetti cranica, nostro laboratorio preferisce usare isoflurano per via inalatoria, ma un'altra opzione è quella di iniettare per via intraperitoneale una miscela contenente una concentrazione finale di ketamina 10 mg / mL e xilazina 1 mg / mL in sa normalelinea. La dose standard di questa miscela è 300 ml per 30 g mouse. Questo fornisce circa 30 min di anestesia affidabili che non richiedono il mouse per essere nel cono isoflurano durante l'intervento chirurgico. Uno svantaggio dell'utilizzo di anestetico iniettato è che non è possibile diminuire la dose dopo l'iniezione è stata proposta. Al contrario, isoflurano inalato può essere facilmente aumentato o ridotto in tempo reale.

Quando si aggiungono sospensione cellulare al ponteggio, i ricercatori possono trovare che il volume di fluido è troppo piccola e saranno parzialmente evaporare in 30 min di incubazione. L'evaporazione può causare la morte delle cellule, che è un fattore confondente particolarmente dannose in esperimenti di guarigione ossea. Per combattere questo, caricare l'impalcatura all'interno di un pozzetto di una piastra ben 24. Riempire i pozzetti immediatamente circostanti con media pianura. Questo creerà un umidificata micro-ambiente che aiuta a mantenere il patibolo caricato si secchi.

colorazione istologica del tessuto osseo è predicato sulla corretta e completa la decalcificazione del cranica prima di inclusione e sezionamento. E 'accettato che i teschi di epoche differenti richiedono durate diversi di decalcificazione, tradizionalmente fatto in una soluzione di EDTA

LIMITI DELLA TECNICA

Questo protocollo utilizza 4 mm difetti cranica per valutare la capacità di una popolazione di cellule per migliorare la chiusura del difetto. Questo modello non può simulare la guarigione che si verifica in un ambiente più complesso, come una frattura ossea lungo o una resezione del tumore. Per questo motivo, può essere necessario utilizzare per capire il contributo di ASC alla guarigione ossea in queste impostazioni modelli animali alternativi.

Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /

Utilizzo di citometria a flusso per isolare popolazioni ASC specifiche è una tecnica promettente per migliorare la guarigione e rigenerazione nel contesto di tessuto multiplo e inmodelli della giuria, come l'angiogenesi, adipogenesi, e osteogenesi. L'utilità delle cellule pro-osteogeniche è esplorato in questo studio, che mostra un effetto profondo con celle selezionate positivamente per BMPR-IB nella guarigione di un difetto cranica.

Protocolli precedenti per l'isolamento di ASC coinvolgono coltivando le cellule per diversi giorni su piastre di coltura cellulare 16. Tuttavia, le cellule possono sperimentare significativo deriva fenotipica mentre nella cultura. Per questo motivo, si usa un protocollo di isolamento ASC che permette un rapido isolamento di tali cellule, seguito da ulteriore purificazione sottopopolazione mediante FACS. L'intera procedura viene eseguita in meno di un giorno, minimizzando gli effetti di marcatore di superficie cellulare o deriva fenotipica.

Le domande e le direzioni future

Abbiamo dimostrato che le ASC che esprimono altamente BMPR-IB dimostrano una maggiore capacità di migliorare la guarigione rigenerativa difetto osseo rispetto ad altri ASC. I meccanismi sottostanno allaing questo fenomeno non sono noti. Ad esempio, non è chiaro se le cellule si differenziano direttamente in cellule ossee, o se producono fattori che incoraggiano altre cellule a farlo. Studi futuri dovranno essere eseguiti a rispondere a queste domande.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 micron cell strainer Falcon 352360
15 blade scalpel Miltex 4-515
24 well plate Corning 3524
40 micron cell strainer Falcon 352340
50 mL conical centrifuge tubes Falcon 352098
6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle,  Ethicon 1698G
Anti-BMPR-IB primary antibody R&D systems FAB5051A
BioGel PI surgical gloves Mölnlycke Health Care ALA42675Z
Buprenorphine SR ZooPharm
Castro-Viejo needle driver Fine Science Tools 12565-14
CD1 nude mouse Charles River 086
Collagenase Type II powder Gibco 17101-015
DMEM medium Gibco 10564-011
Drill: Circular knife 4.0 mm Xemax Surgical CK40
Drill: Z500 Brushless Micromotor NSK NSKZ500
FBS Gicbo 10437-077
Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" Fisher Scientific 14-206-62
Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" Fisher Scientific 22-415-469
Heating pad Kent Scientific DCT-20
Hyclone 199/EBSS medium GE  Life Sciences SH30253.01
Isothesia isoflurane Henry Schein  050033
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Micro Forceps with teeth Roboz RS-5150
Paraffin film (Parafilm) Bemis PM996
PBS Gibco 10010-023
Pen-Strep Gibco 15140-122
PLGA scaffolds Proprietary Formulation
Poloxamer 188, 10% Sigma P5556-100ML
Polylined Sterile Field, 18" x 24" Busse Hospital Disposables 696 Cut a rectangular hole of the appropriate size
Polysucrose Solution: Histopaque 1119 Sigma 11191
Povidone Iodine Prep Solution Medline MDS093944H
Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube Dechra Veterinary Products
RBC lysis buffer Sigma 11814389001
Webcol alcohol prep swabs Covidien 6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Isolamento rapido di BMPR-IB + derivate da tessuto adiposo cellule stromali per l&#39;uso in un cranica difetto di guarigione Modello
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Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).More

Marshall, C. D., Zielins, E. R., Brett, E. A., Blackshear, C. P., Hu, M. S., Leavitt, T., Barnes, L. A., Lorenz, H. P., Longaker, M. T., Wan, D. C. Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model. J. Vis. Exp. (120), e55120, doi:10.3791/55120 (2017).

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