Summary
De volwassen Drosophila hersenen waardevol voor de studie van neuronale circuits, hogere hersenfuncties, en complexe aandoeningen. Een efficiënte methode om hele hersenweefsel van de kleine vlieg hoofd ontleden zal brain-based studies vergemakkelijken. Hier beschrijven we een eenvoudige, een-stap dissectie protocol van volwassen hersenen met goed bewaard gebleven morfologie.
Abstract
Er is een toenemende belangstelling voor het gebruik Drosophila tot menselijke hersenen degeneratieve ziekten te modelleren, kaart neuronale circuits in volwassen hersenen, en de studie van de moleculaire en cellulaire basis van de hogere hersenfuncties. Een hele-mount voorbereiding van de volwassen hersenen met goed bewaarde morfologie is van cruciaal belang voor een dergelijke hersenen als geheel op basis van studies, maar kan technisch uitdagende en tijdrovend zijn. Dit protocol beschrijft een eenvoudig te leren, een stap dissectie aanpak van een volwassen vliegen kop in minder dan 10 s, terwijl de intacte hersenen aan de rest van het lichaam om verdere verwerkingsstappen vergemakkelijkt. De procedure helpt bij het verwijderen van de meeste oog en tracheale weefsels die normaal zijn voor de hersenen die kunnen interfereren met de latere beeldvormingsstap en plaatst ook minder eisen aan de kwaliteit van het ontleden tang. Daarnaast beschrijven we een eenvoudige methode die gemakkelijk omkeren van de gemonteerde hersenmonsters maakt op een dekglaasje, wat belangrijk is voor het afbeelden van beide zijden van de bregens met gelijke signaalintensiteit en kwaliteit. Als voorbeeld van het protocol, een analyse van dopaminerge (DA) neuronen presenteren we volwassen hersenen van WT (w 1118) vliegt. De hoge werkzaamheid van de dissectie methode maakt het bijzonder nuttig voor grootschalige volwassen hersenen-gebaseerde studies in Drosophila.
Introduction
De modelorganisme Drosophila, algemeen bekend als de fruitvlieg, is al lange tijd gewaardeerd om zijn elegante genetische instrumenten, korte reproductieve keer, en sterk geconserveerd moleculaire en cellulaire routes. De fruitvlieg is met succes toegepast om fundamentele signaalwegen, welke patroonvormende mechanismen van meercellige organismen, en de onderliggende mechanismen van neuronale ontwikkeling, functies en ziekten 1,2 ontleden. Met recente ontwikkelingen in cel labeling en beeldvormende technieken, heeft Fruitvlieghersenen bijzonder krachtig in fine mapping van neuronale circuits en het ontleden van de moleculaire en cellulaire basis van hogere hersenfuncties, zoals leren en geheugen, en circadiane ritme 1,3 worden, 4,5,6,7,8.
Een bijzonder voordeel van de Drosophila systeem is de relatief kleine omvang, waardoor whole-mount voorbereiding en onderzoek van de hersenen met behulp van een gewone verbinding of confocale microscoop. This functie maakt gedetailleerde anatomische en functionele analyse van neuronale circuits, wellicht slechts één neuron op cellulaire en subcellulaire niveaus, in de context van een hele hersenweefsel, waardoor zowel een holistische kijk op het onderzochte subject en de precieze geometrie in de hele hersenen. Echter, gezien de nogal miniatuur grootte van de hersenen, het presenteert ook een technische uitdaging in een intacte hersenweefsel efficiënt te ontleden uit de beschermende exoskelet hoofd geval in een volwassen vlieg. Verschillende effectieve en relatief eenvoudige dissectie werkwijzen zijn beschreven, die meestal betrekking voorzichtig en stapsgewijze verwijdering van de kop zaak en de omliggende weefsels zoals de ogen, de luchtpijp en vet van de hersenen juiste 9, 10. Deze microchirurgische dissectie methoden plaats vaak nogal strenge eisen aan de kwaliteit van de dissectie pincet, met een beroep op de tang met fijne goed uitgelijnd tips die gemakkelijk kunnen worden beschadigd. Bovendien, zoals de hersenen ontleed zijn vaak separated van de rest van het lichaam, kan de hersenen gemakkelijk verloren tijdens de daaropvolgende kleuring en wasprocessen vanwege hun kleine afmetingen en de transparantie bij de verwerking buffer. Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige en makkelijk te leren, éénfasige dissectie protocol voor volwassen hersenen die de hersenen ontleed aan de romp blijft. De dissectie proces is vaak gemakkelijk ruimt meeste van de hersenen weefsels zoals het oog en trachea en vermindert de vraag naar goede kwaliteit dissectie pincet.
Bovendien, bij beeldvorming van de hersenen onder de fluorescerende verbinding microscoop of confocale microscoop, de kant van de hersenen dat is verwijderd van de fluorescerende lichtbron levert vaak een zwakker signaal en minder heldere beelden doordat de dikte van de hele-mount hersenen. We beschrijven ook een eenvoudige montage methode die eenvoudig omkeren van de hersenmonsters toelaat, waardoor gemakkelijke beeldvorming aan beide zijden van de hersenen met gelijke signaal intensity en kwaliteit.
Als een proof-of-concept voor de toepassing van deze methode om de volwassen hersenen te bestuderen, we verder onderzocht op de aanwezigheid van DA neuronen in de hersenen van w 1118 vliegt; een genotype dat vaak wordt gebruikt als ouderlijn voor transgene vliegen en wildtype controle in vele studies Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Oplossingen Gebruikt voor Brain Dissection en immunofluorescentiekleuring
- Ontleden de volwassen hersenen vliegen kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 1,3 mM MgCl2 en 10 mM glucose. Voor gebruik gas de aCSF met 5% CO2 / 95% O2 gedurende 10 - 15 min en piek met 2,5 mM CaCl2. Steriliseer de aCSF oplossing door filtreren door een 0,22 urn membraanfilter.
Opmerking: WINKEL aCSF bij 4 ° C om bacteriële contaminatie te voorkomen. hersenen vlieg kan worden ontleed in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing, hoewel Vergelijk de effecten van de twee oplossingen dissectie van de uiteindelijke beeldkwaliteit van de ontleed hersenen werden niet uitgevoerd. - Met 4% paraformaldehyde (PFA) bereid in 1x PBS als fixatief, die normaal in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C.
caution: PFA is giftig en bijtend en moet met zorg worden behandeld. - Gebruik 1x PBS om de PFA spoelen van de hersenen en na de laatste wasstap in de immunofluorescentie kleuring van de hersenen ontleed. Bereid de 1x PBS van PBS 10x voorraad-oplossing (1,37 M NaCl, 27 mM KCI, 100 mM Na 2 HPO 4 en 18 mm KH 2 PO 4).
- Met 0,3% Tween-20 in 1x PBS (1x PBT) voor alle volgende wasstappen tijdens immunofluorescentie kleuring van de hersenen ontleed.
2. Microchirurgie Dissectie van Adult Fly Heads
Opmerking: De dissectie procedure is geïllustreerd in figuur 1.
- Verdoven de volwassen vliegen met CO 2. Met behulp van een tang, pick-up een vlieg en kort Dewax haar cuticula door dompelen in 70% ethanol gedurende 3-5 s. Dit zorgt ervoor dat er geen luchtbellen vast te houden aan de vlieg cuticula bij onderdompeling in de aCSF of 1X PBS dissectie oplossing.
- Onder eenontleden microscoop met een lichtbron onder een hoek die niet zal worden geblokkeerd door de handen, stelt het objectief om een duidelijk beeld van de vlieg (1,2X vergroting) te bereiken. Tang met de niet-dominante hand om het dier te immobiliseren en dompel de vliegen in de koude dissectie oplossing zijn buik naar boven, zoals weergegeven in figuur 1A.
- Houd de tang op 160-170 ° hoek ten opzichte van de dissectie plaat, onder uitoefening van een kleine kracht op de buik van de vlieg (getoond als pijlen in Figuur 1A). Deze stap zal de vlieg immobiliseren en dwingen om het hoofd naar achteren te verplaatsen met 15 - 25 °, terwijl de uitbreiding van de slurf omhoog. In het proces, een zacht en doorschijnend gebied van de cuticula, onder de zuigorganen, moet blijken. Verhoog de vergroting en stel de focal plane op deze regio.
Let op: Laat de tang niet te strak te houden, maar liever gewoon stevig genoeg te stabiliserende vlieg. Te veel kracht zorgt ervoor dat de binnenste organen scheuren in de oplossing. - Gebruik de dominante hand de tang ontleden zodat de uiteinden gesloten zijn, waarbij een milde weerstandskracht op de uiteinden van de tang genereren drukken, zodat de tang springt open wanneer de druk van de vasthoudende hand wordt losgelaten. Plaats de tang loodrecht op de tang met de vlieg, zie figuur 1B.
- Pierce de gesloten uiteinden van de dissectie forceps door het zachte en doorschijnende gebied van de cuticula onder de zuigorganen, zoals blijkt uit de rode pijl in figuur 1B. Het is belangrijk om niet te vergeten de tang te diep dat het de hersenen raakt dringen. De hersenen juiste moet zichtbaar worden. Zorg voor een stabiele greep van de vlieg met de nondominant de hand.
- Snel maar gestaag, laat de uiteinden van de dissectie pincet door zijn eigen kracht en vertrouwen op het momentum van deze release om weg te scheuren tHij exoskelet rondom de vlieg hoofd. Een intactehersenen goede moet zichtbaar (wit weefsel onmiddellijk boven het uiteinde van de onderste tang in figuur 1C) Volg een denkbeeldige lijn om de dynamiek van de vrijgemaakte pincet tips (geïllustreerd als de uitwendige rode pijlen getoond in figuur 1C) te geleiden. Dit verwijder het exoskelet en de meeste van de hersenen geassocieerde ogen en luchtpijp uit de hersenen. De juiste timing en de kracht die wordt uitgeoefend om te openen het exoskelet zal afhankelijk zijn van de ervaring van de onderzoeker zijn.
Let op: Dit is de meest kritische fase tijdens de dissectie. Het is belangrijk om te vertrouwen op de natuurlijke kracht gegenereerd door de dynamiek van de opening tang om het exoskelet te verwijderen terwijl de blootgestelde hersenen blijft bevestigd aan de rest van het lichaam. - Gebruik de tang in de dominante hand om verwijder voorzichtig het overblijfsel accessoire weefsels, zoals de tracheale dat verschijnt als witte fiber structuren remaining aan de hersenen. Wees voorzichtig niet te trekken of beschadiging van de hersenen juiste.
3. immunofluorescentiekleuring van de Brains
- Bevestig de ontleedde hersenstalen met bijbehorende torso in ongeveer 1 ml 4% PFA gedurende 40 - 60 min.
Opmerking: Bij deze en volgende stappen houdt de buizen of platen met monsters op een nutator om de monsters te mengen goed in de oplossing. - Spoelen met 1 mL 1 x PBS door pipetteren de oplossing en neer 3 keer. Wees niet naar de hersenen weg te zuigen.
- Was 5 keer met 1x PBT gedurende 5 minuten elk. Houd de monsters op de nutator tijdens incubatie.
- Incubeer met primaire antilichamen bij juiste verdunning O / N bij 4 ° C.
- De volgende dag, verwijder de primaire antilichamen, en was de monsters 5 keer met 1x PBT. Laat de monsters voor 5-10 min in 1x PBT-oplossing tussen elke wasbeurt. Houd de monsters op de nutator tijdens incubatie.
- Incubeer de gewassenmonsters in geschikte secundaire antilichamen met de voorgestelde verdunning en incubatietijd.
- Was de monsters zes keer met 1x PBT met een 10 minuten incubatie tussen elke wasbeurt.
Deze stap is essentieel voor het verwijderen van niet-specifiek gebonden secundaire antilichamen uit het monster. - Incubeer in een 1: 10.000 verdunning van 1 mg / ml 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in 1x PBT oplossing gedurende 30 min. DAPI is een DNA kleurstof die bindt aan de AT regio van DNA en kan worden gebruikt om de totale morfologie van de hersenen te onthullen.
- Spoel driemaal met 1x PBS.
- Transfer monsters naar een dissectie gerecht, en scheiden de hersenen uit de lichamen in een dissectie schotel met behulp van een tang.
- Na de kleuring en wasstappen, zet de hersenen tussen twee dekglaasjes en plaats de dekglaasjes bovenop een montage dia. Op deze wijze kan de hersenstalen gemakkelijk worden omgedraaid zodat beide zijden van de hersenen kan worden afgebeeld met dezelfde signaalintensiteit.
- Plaats een 18 x 18 mm dekglaasje bovenop een montage dia. Verbreden van de opening van een pipetpunt met een mes en gebruiken om de hersenen overdragen 1x PBS oplossing op de 18 x 18 mm dekglaasje.
- Plaats de hersenen in het midden van het dekglaasje, verwijder de vloeistof rond de hersenen met een fijne pipet en voeg een 20 - 40 pl anti-fade montage medium (0,2% (w / v) n-propylgallaat in 99,5 % ACS niveau glycerol) over de hersenen.
Opmerking: De hoeveelheid fixeermiddel toegevoegd is afhankelijk van het aantal hersenen onderzocht.- Voorzichtig verspreid de hersenen tijdens het verplaatsen van de viskeuze montage medium naar buiten. Plaats een tweede 18 x 18 mm dekglaasje bovenop de hersenen door eerst de schuif verlagen van de ene kant tot deze tegen maakthet oppervlak van de montage slip, en dan langzaam verlagen van de andere kant van de hersenen contact met luchtbellen te minimaliseren.
Opmerking: Het is niet nodig om een afstandhouder te gebruiken tussen de twee dekglaasjes, als het volume van het fixeermiddel en de hersenen moet een ruimte volstaat de twee dekglaasjes scheiden verschaffen.- Laat de dia's om te settelen. Verwijder overmatige vloeistof die uit de zijkant van de glijstukken met een laboratorium tissue komen.
- Om te voorkomen dat de dekglaasjes met gemonteerde hersenen van het vallen van de montage-slide tijdens het transport, gebruik dan een klein stukje tape om de dekglaasjes hechten aan de montage dia.
Opmerking: Hersenen tussen de schuiven kan onmiddellijk worden afgebeeld of bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal een week zonder significant verlies van fluorescerend signaal, zonder noodzaak om afdichtmiddel om de objectglaasjes dichten gemonteerd. Voor de lange termijn behoud van het lood hersenen, kan de zijkant van de twee slips worden verzegeld wet nagellak en opgeslagen in een -20 ° C vriezer, hoewel in lood hersenen hun signalen na verloop van tijd zou kunnen verliezen. Dit wordt niet aanbevolen.
- Ten eerste, de afbeelding vanuit de kant van de hersenen dichter bij het doel, en dan voorzichtig flip de dekglaasjes naar de kern in het midden monsters. Deze stap vergemakkelijkt het ophalen van de afbeelding van de andere kant van dezelfde hersenen.
- Gebruik een rechtopstaande samengestelde fluorescentiemicroscoop en een 20X objectief het imago van de hele hersenen (voorbeelden in figuur 2) en een 40X objectief beeld kleinere gebieden van de hersenen, zoals DA neuronen in de gepaarde voorste Medial (PAM) cluster regio (voorbeelden in figuur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 illustreert de belangrijkste procedures voor volwassen hersenen dissectie, zoals hierboven beschreven figuren 2 en 3 zijn representatief afbeeldingen 3 dagen oude WT. (Genotype: w 1118) adulte hersenen, die werden costained met een antilichaam tegen tyrosine hydroxylase vlieg (TH , gekleurd in rood in figuur 2 en wit in figuur 3), een marker vaak gebruikt voor DA neuronen 11 label, naast de DNA kleurstof DAPI alle celkernen en een antilichaam tegen Elav eiwit, een marker voor gedifferentieerde neuronen label in de vlieg (gekleurd in groen), die tezamen bleek de totale structuur van de hersenen.
Voor de primaire antilichamen in figuren 2 en 3, gebruikten we konijnen anti-TH antilichaam bij een 1: 200 verdunning en rat anti-Elav antilichaam bij een 1: 100 verdunning, whilech werden bereid in 1x PBT met 5% normaal geit serum niet-specifieke binding te blokkeren. Voor secundaire antilichamen, gebruikten we Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit-anti-rat antilichaam en AlexaFluor596-geconjugeerd geit anti-konijn antilichaam bij een 1: 500 verdunning in 1x PBT.
Om beeld de hersenen, gebruikten we een rechtopstaande samengestelde fluorescentiemicroscoop uitgerust met een apotome functie Z-stack afbeeldingen hersenschijfjes de gehele diepte van het gebied van belang in de hersenen dekking te verkrijgen. Bijvoorbeeld, een duidelijk overzicht van de algemene verspreiding van DA neuronen in de gehele hersenen verkrijgen gebruikten we een 20X objectief afzonderlijk beeld de voorste en achterste zijden van dezelfde hersenen (figuur 2). De diepte van elke hersenhelft afgebeeld die betrekking hebben op alle DA neuronen ongeveer 20 - 25 pm in totaal. Betrouwbaar visualiseren en kwantificeren DA neuronen in de PAM clustergebied, die kleinere celgrootte en zwakkere TH si hebbengnals (zie onder), gebruikten we een 40X objectief. Bovendien moet in het Z-serie functie voor acquisitie van de commerciële software, selecteerden we een snijdikte van 0,5-1 urn tussen de afgebeelde plak, die een optimale beeldkwaliteit gegarandeerd een 3D reconstructie van het PAM clustergebied (figuur 3c). De dikte van PAM cluster in de hersenen die de DA neuronen omvat ongeveer 8-10 urn in totaal. In onze ervaring, kan de apotome functie een aanzienlijke vermindering van het geluid signaal in de beeldvorming van dikke monsters met een hoge achtergrond, zoals een hele brein of de PAM cluster regio.
Figuren 2A-E tonen het voorste oog van hersenen, terwijl figuren 2F-J tonen de dorsaal aanzicht van dezelfde hersenen na het wegknippen van de dekglaasjes die de hersenen monsters, die een vergelijkbaar signaalintensiteit weer tussen twee zijden van de hersenen te houden alle drie kanalen afgebeeld. De DA neurons werden gegroepeerd in verschillende clusters na de vroege aanwijzing 11, maar hier gebruiken we de naam Gekoppelde posterior Medial (PPM) aan de PPM1, PPM2 en PPM3 clusters aan de voorste kant van de hersenen, en de naam Gekoppelde posterior Lateral (PPL omvatten ) ter dekking van de PPL1 en PPL2 clusters uit de achterste kant van de hersenen, zoals weergegeven in de figuren 2E en 2J. figuren 2E en 2J in wit toon voorste en achterste weergaven van dezelfde hersenen in high-vergroting, het openbaren van de verschillende clusters van DA neuronen aan beide zijden van de hersenen. De witte stippellijnen markeren de prominente PAM en Paired Anterior laterale (PAL) clusters in het voorvlak van de hersenen (figuur 2E) en de PPL en de PPM clusters in de achterste zijde van de hersenen (Figuur 2J).
Figuren 3A en 3B een re samenvattingen van de kwantificering resultaten voor sommige van de DA clusters w 1118 vliegt. We telden DA neuronen slice door slice en ook van 3D gereconstrueerde beelden, die onnauwkeurig tellen moeten een minimum te beperken. Wij schatten dat de 3-dagen oude w 1118 vliegt hebben gemiddeld 27 DA neuronen algemeen in het PPM cluster per brein, 16 DA neuronen in de PPL cluster per halfrond, 5 DA neuronen in PAL cluster per hemisfeer (Figuur 3A), 97 en DA neuronen in elk van de PAM clusters (Figuur 3B). Figuur 3C is een representatief 3D reconstructie van DA neuronen in de PAL en PAM clusters, geprojecteerd van segmenten van sterk vergrotende beelden die alle DA neuronen in deze regio. Het is duidelijk dat in vergelijking met andere clusters zoals PAL, DA neuronen in de PAM cluster relatief kleinere celgrootte en zwakkere kleuring TH signalen.
"Src =" / files / ftp_upload / 55128 / 55128fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Grafische Illustratie van de Dissection protocol voor Adult Drosophila Hersenen (A) Vliegen zijn gepositioneerd met de buikzijde naar boven, en in het bezit van de thorax met behulp van de niet-dominante hand. Force werd voorzichtig aangebracht (rode pijlen) om de tang om terug te kantelen van de vlieg hoofd en lichte uiterlijke uitbreiding van de slurf te induceren, bloot onder de witte transparante regio. (B) Forceps van de dominante hand ingebracht in het transparante gebied onder de zuigorganen, waardoor een ondiepe incisie (rode pijl). Merk op dat de tang die wij gebruiken niet zeer fijne tip uiteinden. (C) Forceps mogen loskomen door eigen kracht, zoals aangegeven door de rode pijlen. Het momentum gegenereerd door het openen van de tang verwijdert de ogen en exoskeleton, het blootstellen van een relatief schone Drosophila hersenen. De meeste van de trachea worden verwijderd in het proces. (
Figuur 2:. DA Neuronen Revealed met anti-tyrosine hydroxylase (TH) Antibody in Volwassen Mannelijke Drosophila B regen (Verworven met een 20X Objective) Dit cijfer is inclusief representatieve beelden van ontleed volwassen hersenen, gereconstrueerd met behulp van Z gestapelde beelden van de hersenen regio interest verkregen met de verbinding fluorescentiemicroscoop. (AE) Anterior en (FJ) posterior weergaven van dezelfde volwassen hersenen; (A & F) Cell kernen werden afgebeeld door DAPI kleuring (wit) en (C & H) neuronen wEre gelabeld door pan-neuronale marker anti-Elav antilichamen (groen); (B & G) DA neuronen worden onthuld door anti-TH-antilichamen (rood). (D & I) Overlay van beelden voor DAPI, TH en behandeling Elav. (E & J) vergroot aanzicht van de hersenen met DA neuronen in het wit. Stippellijnen markeren de PAL en PAM clusters in de voorste van de hersenen en PPL en PPM clusters in de achterkant van de hersenen. De schaal balk geeft 50 micrometer in alle van de panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Kwantificering van DA neuronen in hersenen van Mannelijke volwassen w 1118 vliegt (Verworven met een 40x objectief). (A & B) Kwantificering van DA neurons van de dag 3 mannelijke w 1118 vliegt, onthuld door anti-TH kleuring. Gegevens worden weergegeven door whisker boxplots toont minimum- en maximumwaarde als uitschieters; en de eerste (Q1), tweede (Q2) en derde (Q3) kwartiel. De tweede kwartiel wordt voorgesteld als de gemiddelde waarde. (A) PPM {(n = 28) Min: 21, Q1: 24 Gemiddeld: 27, Q2: 30, Max: 32}, PPL {(n = 26) Min: 10, Q1: 12 Gemiddeld: 16, Q2: 18, Max: 25} en {PAL (n = 24), Min: 2, Q1: 4, Average: 5, Q2: 5, Max: 10} clusters; (B) PAM cluster {(n = 20) Min: 86, Q1: 94 Gemiddeld: 97, Q2: 97, Max: 99}. (C) Een beeld representatief projectie toont DA neuronen in de PAM en PAL clusters van mannelijke w 1118 vliegt in 3 d. Schaal bar vertegenwoordigt 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met een toenemend belang bij volwassen Drosophila hersenen menselijke hersenziekten, neuronale circuits en hogere hersenfuncties bestuderen, is het noodzakelijk om eenvoudig en snel te ontwikkelen tot intacte fly hersenen krijgen voor hele-mount analyses, wat vooral belangrijk voor grote- schalen brain-based schermen. Onze methode biedt een eenvoudige en makkelijk te leren aanpak te ontleden uit een vlieg hoofd (vaak in minder dan 10 s met ervaring) met goed bewaard gebleven morfologie, dat is grotendeels ontdaan van de bijbehorende weefsels. Aangezien de hersenen ontleed nog de rest van de vlieg organen zijn bevestigd, zijn ze meestal zinken naar de bodem van de monsterbuis snel en gemakkelijk te herkennen en te verzamelen tijdens het wassen en vlekken stappen. Dit minimaliseert aanzienlijk monster verlies dat een prominente probleem kan zijn bij het verwerken van de hersenen monsters van kleine fysieke afmetingen. Dit probleem kan met name van belang voor grootschalige studies. De hersenen kunnen gemakkelijk worden losgemaakt van het lichaamna voltooiing van de kleuring werkwijze voor de montage.
Bij de dissectie, is het belangrijk dat de vlieg juiste positie, handhaven de juiste hoeken bij het verwijderen van het exoskelet van de vlieg hoofd en voorzichtig oefenen de goede werking van de uitvoering van elke stap. Aanbevolen wordt de tang loodrecht op elkaar zijn geplaatst teneinde onthoofding van de vlieg (figuur 1B) te voorkomen. Zoals getoond in de representatieve beelden in figuur 2, de hersenen bereid met dit protocol bevredigende resultaten. In dit voorbeeld hebben we ons gericht op de DA neuronen in de PAM cluster van adulte hersenen. Een Drosophila hersenen heeft gemiddeld totaal van ongeveer 280 DA neuronen per protocerebrum, die zijn verdeeld in verschillende clusters in verschillende gebieden van de hersenen met onderscheidende projectie patronen en functionele uitgang 11, 12. Vorige karakterisatie van DA neuronen in volwassen Drosophila hersenen, including vliegen modellen van de ziekte bij de mens genen zoals in parkin mutanten, zijn grotendeels gericht op de PAL, PPL, en PPM clusters die relatief grote cel maten en prominente expressie van TH, de standaard maker gebruikt voor het labelen van DA neuronen 13-18 hebben.
De meerderheid van de DA neuronen in de vlieg hersenen worden gevonden in de PAM clusters, met ongeveer 100 DA neuronen per cluster. In vergelijking met andere cellen in clusters DA, DA neuronen in de PAM cluster laten gewoonlijk een kleiner niveau van tyrosine hydroxylase expressie en kleinere celgroottes. In monsters bereid uit de dissectie en kleuring protocol, kan de DA-neuronen in de PAM cluster duidelijk gevisualiseerd en afgebeeld in hoogwaardige toepassing van een verbinding fluorescentiemicroscoop zonder confocale beeldvorming. Gezien het grote aantal kan kwantificering van DA neuronen in de PAM cluster van verschillende genetische achtergronden produceren betrouwbaarder en reproduceerbare resultaten. Wij stellen voor dat DA neuronen in de PAM cluster vertegenwoordigt een nuttig voor het bestuderen DA biologie en modelleren DA-gerelateerde aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson.
In onze ervaring, de apotome functie van de microscoop gebruikten we kunnen aanzienlijke vermindering van de achtergrondsignaal, vooral in de behandeling monsters met een dikte, zoals de totale volwassen vlieg brein. Hoewel confocale microscoop beelden met meer details, sterkere vergroting en betere kwaliteit kunnen produceren, is het vaak tijdrovend en kostbaar. Dit geldt vooral voor het afbeelden van een groot aantal dikke monsters zoals volwassen hersenen die reeks Z-stack gedeelte duidelijke 3D reconstructie en deconvolutie analyse vereisen. In dit perspectief is de apotome functie vertegenwoordigt een snel en kosteneffectief alternatief om beelden van voldoende kwaliteit te produceren (bijvoorbeeld, beelden in de figuren 2 en 3).
Bij bestudering van de hersenen, is het vaak noodzakelijk om afbeeldingscellen beide sides van dezelfde hersenen. Bijvoorbeeld, DA neuronen aanwezig in clusters van zowel de voorste en achterste zijden van de hersenen. Vanwege zijn dikte na hersenen op de slede is aangebracht, waarbij de zijde weg van de lichtbron (dat wil zeggen, de kant van het montage dia) geeft gewoonlijk als zwakke signalen en minder duidelijk beeld wanneer afgebeeld met behulp van gewone verbinding en confocale microscopen. Door montage van de monsters tussen de twee dekglaasjes, laat gemakkelijke wegknippen van de monsters op de gemonteerde glijbaan en daaropvolgende beeldvorming aan beide zijden van dezelfde hersenen met gelijke signaalintensiteiten. Figuur 2 is een voorbeeld van beeldvorming DA neuronen aan weerszijden van fly hersenen met behulp van deze methode, die relatief vergelijkbare signalering intensiteit en de beeldkwaliteit liet zien.
Aantal eenvoudig te volgen benaderingen ontleden volwassen vlieg hersenen zijn goed beschreven 9, 10. Onze aanpak biedt een alternatieve methode kan further vereenvoudigen de dissectie en vlekken processen van volwassen vliegen hersenen. Met meer grootschalige studies uitgevoerd om in kaart te brengen van de hele hersenen neuronale circuits evenals de moleculaire en cellulaire bestanddelen, is te verwachten dat geautomatiseerde dissectie en imaging benaderingen kunnen worden ontwikkeld voor volwassen Drosophila hersenen om high-throughput genetische en drug screens realiseren in vivo in dit klassieke genetische model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij erkennen Mr Enes Mehmet, mevrouw Kiara Andrade, mevrouw Pilar Rodriguez, Chris Kwok, en mevrouw Danna Ghafir voor hun enorme steun aan het project.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
