Summary
המוח תסיסנית הבוגרת הוא מערכת יקרה ללימוד מעגלים עצביים, תפקוד מוח גבוה, והפרעות מורכבות. שיטה יעילה כדי לנתח רקמות מוח כולו מראש הזבוב הקטן תקל מחקרים מבוססי מוח. כאן אנו מתארים פשוט, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב.
Abstract
יש עניין גובר בשימוש תסיסנית מודל מחלות ניווניות במוח האנושי, למפות circuitries עצביים במוח הבוגר, וללמוד את הבסיס המולקולרי הסלולר של תפקודי מוח גבוהים. תכשיר כל ההר של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב הוא קריטי ללימודי מוח מבוסס כולו כזה, אבל יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ונדרש זמן רב. פרוטוקול זה מתאר גישת דיסקציה קלה ללמוד, צעד אחד של ראש זבוב בוגר תוך פחות מ -10 שניות, תוך שמירה במוח השלם מחובר לשאר הגוף כדי להקל מדרגות עיבוד שלאחר מכן. ההליך מסייע להסיר ביותר של רקמות העין לקנה הנשימה הקשורים בדרך כלל עם המוח שיכולים להפריע צעד הדמיה מאוחר יותר, וגם מציב פחות ביקוש על איכות מלקחיים לנתח. בנוסף, אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת מרפרף נוח של דגימות מוח רכוב על coverslip, שהינה חשובה הדמיה משני צידי בגשמים בעצמה ואיכות אות דומות. כדוגמה של הפרוטוקול, אנו מציגים ניתוח של דופאמין (DA) נוירונים במוח הבוגר של WT (w 1118) זבובים. היעילות הגבוהה של השיטה לנתיחה עושה את זה שימושי במיוחד עבור מבוגר בקנה מידה גדולה מחקרי מוח מבוססים תסיסנית.
Introduction
האורגניזם המודל תסיסנית, הידוע בכינויו זבוב הפרות, כבר מוערך ארוך עבור הכלים הגנטיים האלגנטיים שלה, פעמי רבייה קצרות, ומאוד נשמר מסלולים מולקולריים תאיים. זבוב הפרות הועסק בהצלחה לנתח מסלולי איתות בסיסיים, מנגנוני הדפוסים של יצורים רבים-תאיים, כמו גם את מנגנוני התפתחות עצבית, פונקציות, ומחלות 1,2. עם התקדמות בטכנולוגיות תיוג הדמית תא, מוח זבוב פרות הפך חזק במיוחד במיפוי קנס של מעגלים עצביים לשלוף את הבסיס המולקולרי הסלולר של תפקודי מוח גבוהים, כגון למידה וזיכרון, וכן מקצב צירקדי 1,3, 4,5,6,7,8.
יתרון אחד מסוים של מערכת תסיסנית הוא גודלו הקטן יחסית, מה שמאפשר כל הר הכנה ובדיקה של המוח באמצעות תרכובת רגילה או מיקרוסקופ confocal. תיתכונה של אפשר ניתוחים אנטומיים מפורטים ופונקציונליים של מעגלים עצביים, או אפילו תא עצב יחיד, ברמות הסלולר subcellular, בהקשר של רקמות מוח כולו, ובכך לספק היא נקודת מבט הוליסטית של המטפלים בנושא והגיאומטריה המדויקת שלה בתוך המכלול מוֹחַ. עם זאת, בהתחשב בגודל מיניאטורי למדי של המוח, זה גם אתגר טכני לנתח רקמה במוח שלמה ביעילות מתוך תיק ראש השלד חיצוני המגן בתוך זבוב בוגר. יעיל שונה ופשוט יחסית שיטות לנתיחה תוארו בפירוט, אשר בדרך כלל כרוכות זהיר צעד חכם הסרה במקרה הראש ואת הרקמות הקשורות כוללות העיניים, קנה נשימה, שומן מהמוח 9 הראוי, 10. שיטות לנתיחת מייקרו אלה לעתים קרובות למקום יותר בדרישות המחמירות על איכות מלקחיים לנתיחה, בהסתמך על מלקחיים עם עצות גם מזדהות בסדר כי עלולים להיפגע בקלות. יתרה מזאת, כפי המוח הגזור הוא בדרך כלל בהסרהאד משאר הגוף, המוח יכול בקלות ללכת לאיבוד במהלך תהליכי המכתים והשטיפה עוקבים כי בעלי המידות הקטנות שלהם והשקיפות שלהם למאגר העיבוד. כאן, אנו מתארים פשוט יחסית וקל ללמוד, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד עבור מוחות בוגרים שמחזיקים את המוח הגזור מצורף הטורסו. תהליך לנתיחה לעתים קרובות בקלות מנקה את רוב הרקמות הקשורים במוח כגון העין ואת קנה הנשימה ומקטין את הביקוש מלקחיים דיסקציה באיכות טובה.
בנוסף, כאשר הדמית המוח מתחת למיקרוסקופ מתחם הניאון או confocal, הצד של המוח כי הוא הרחק ממקור אור פלורסנט לעתים קרובות מייצר אות חלשה ותמונות פחות ברורות בשל העובי של המוח כל ההר. כאן אנו גם מתארים שיטת הרכבה פשוטה המאפשרת מרפרף קל של דגימות המוח, המאפשר הדמיה נוחה של שני הצדדים של המוח עם intensi אות הדומהty ואיכות.
כהוכחה של קונספט עבור היישום של השיטה בחקר המוח הבוגר, עוד בחנו את הנוכחות של נוירונים DA במוחם של w 1118 זבובים; גנוטיפ זה משמש לעתים קרובות כקו ההורי להפקת זבובים מהונדסים ואת שליטת wildtype במחקרים תסיסנית רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פתרונות 1. משמש המוח Dissection ו Immunofluorescent מכתים
- לנתח המבוגר לטוס המוח בנוזל השדרה מוחין מלאכותי (aCSF): 119 מ"מ NaCl, 26.2 מ"מ NaHCO 3, 2.5 מ"מ KCl, 1 מ"מ לאא 2 4 PO, 1.3 מ"מ MgCl 2, ו -10 גלוקוז מ"מ. לפני השימוש, הגז aCSF עם 5% CO 2/95% O 2 במשך 10 - 15 דקות ו ספייק עם 2.5 מ"מ CaCl 2. לעקר את הפתרון aCSF על ידי סינון דרך מסנן הממברנה 0.22 מיקרומטר.
הערה: חנות aCSF ב 4 ° C על מנת למנוע זיהום חיידקי. טוס מוח יכול להיות גזור גם בתמיסה פוספט שנאגר מלוח (PBS), אם כי השוואה מפורטת של ההשפעות של שני הפתרונים לנתיחה על איכות ההדמיה הסופית של המוח הגזור לא בוצעה. - השתמש paraformaldehyde 4% (PFA) שהוכנו 1x PBS כפתרון מקבע, אשר aliquoted בדרך כלל ומאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס.
Caution: PFA הוא רעיל ומאכל וצריך לטפל בהם בזהירות. - השתמש 1x PBS לשטוף את PFA מהמוחה ואחרי שלב הכביסה האחרון, במהלך מכתים immunofluorescent של המוח הגזור. הכן את PBS 1x מפתרון המניות 10x PBS (1.37 M NaCl, 27 KCl מ"מ, 100 מ"מ Na 2 HPO 4, ו -18 מ"מ KH 2 PO 4).
- השתמש 0.3% Tween-20 ב 1x PBS (1x PBT) עבור כל שלבי הכביסה הבאים במהלך מכתים immunofluorescent של המוח הגזור.
2. Dissection Microsurgical ראשים למבוגרים Fly
הערה: ההליך לנתיחה מתואר באיור 1.
- להרדים את הזבובים הבוגרים עם CO 2. בעזרת מלקחיים, להרים זבוב בקצרה dewax לציפורן שלה על ידי טבילה אותו אתנול 70% עבור 3 - 5 שניות. הדבר מבטיח כי אין בועות לדבוק לציפורן הזבובים כאשר שקוע בתוך aCSF או פתרון לנתיחה 1X PBS.
- תחתמיקרוסקופ לנתח עם מקור אור בזווית לא ייחסמו על ידי ידיים, להגדיר את העדשה אובייקטיבי כדי להשיג תצוגה ברורה של הזבוב (הגדלה 1.2x). שימוש במלקחיים עם יד nondominant כדי לשתק את החיה לטבול לטוס לתוך התמיסה לנתיחה הקרה עם הבטן שלה כלפי מעלה, כפי שמוצגת באיור 1 א.
- שמור מלקחיים בכל 160 - זווית ° 170 ביחס לצלחת לנתיחה, תוך הפעלת כוח קטן על הבטן של הזבוב (מאויר כחצים באיור 1 א). שלב זה יהיה לשתק את הזבוב לכפות את זה כדי להזיז את הראש לאחור על ידי 15 - 25 ° תוך הארכת החוטם כלפי מעלה. תוך כדי כך, אזור רך השקוף של לציפורן, מתחת החוטם, צריך להיות ברור. הגדל את ההגדלה ולהתאים את מישור המוקד על האזור הזה.
הערה: אל תקרבו את המלקחיים חזקים מדי, אלא רק חברה מספיק כדי לייצבהזבוב. כוח רב מדי יגרום האיברים בתוך להתפקע לתוך התמיסה. - השתמש ביד הדומיננטית ללחוץ על מלקחיים לנתח כך טיפים סגורים, אשר יפיקו כוח עמיד קל על קצות המלקחיים, כך המלקחיים יצמחו פתוחים כאשר לחץ מהיד החזקה הוא שוחרר. מקם את המלקחיים בניצב המלקחיים כשהוא לופת את הזבוב, כפי שמוצג באיור 1 ב.
- פירס הטיפים הסגורים של מלקחי דיסקציה דרך האזור הרך השקוף של לציפורן מתחת החוטם, כפי שמודגם על ידי החץ האדום באיור 1B. חשוב לא לחדור המלקחיים עמוקים מדי כי הוא בא במגע עם המוח. המוח הנכון צריך להיות גלוי. יש לשמור על אחיזה יציבה של הזבוב עם יד nondominant.
- במהירות אך בהתמדה, לשחרר את קצות מלקחיים דיסקציה בכוח משלה ולהסתמך על המומנטום מההשקה זה לקרוע tהוא שלד חיצוני סביב ראש הזבוב. שלמים במוח נכון צריך להיות גלוי (הרקמה הלבנה מייד מעל קצה המלקחיים התחתונים תרשים 1C) פעל קו דמיוני להנחות את המומנטום של טיפי המלקחיים שוחררו (המאויר כמו החצים האדומים החוצה שמוצגים באיור 1C). פעולה זו תסיר את שלד חיצוני בעדינות ביותר של העין הקשורים למוח קנה הנשימה מהמוח. התזמון הנכון ואת הכוח ליישם כדי לפתוח את השלד החיצוני יהיה תלוי ניסיון של החוקר.
הערה: זהו השלב הקריטי ביותר במהלך הניתוח. חשוב לסמוך על הכח הטבעי המופק את המומנטום של מלקחי הפתיחה להסיר את השלד החיצוני תוך השאיר את המוח החשוף נשאר מחובר לשאר הגוף. - השתמש מלקחיים ביד הדומיננטית להסיר את רקמות אבזר שריד בזהירות, כמו קנה הנשימה שמופיע כמבני סיבים לבנים remaining מצורפת המוח. היזהר שלא למשוך או נזק מוחי תקין.
3. מכתים Immunofluorescent של המוח
- תקן את דגימות מוח גזור עם torsos הקשורים בהם נע בין 1 מ"ל של 4% PFA עבור 40 - 60 דקות.
הערה: השלבים זה שלאחר מכן, לשמור על צינורות או צלחות עם דגימות על nutator לערבב דגימות כראוי הפתרון. - לשטוף עם 1 מ"ל של 1x PBS על ידי pipetting את הפתרון ולמטה 3 פעמים. היזהר שלא לשאוב את מוחם משם.
- לשטוף 5 פעמים עם 1x PBT במשך 5 דקות כל אחד. שמור את הדגימות על nutator במהלך דגירה.
- דגירה עם נוגדנים עיקריים ב O דילול הנכון / N ב 4 ° C.
- למחרת, להסיר את הנוגדנים הראשוניים, ולשטוף את הדגימות 5 פעמים עם 1x PBT. השאר את הדגימות עבור 5 - 10 דקות בתמיסת PBT 1x בין כל שטיפה. שמור את הדגימות על nutator במהלך דגירה.
- דגירת שטףדגימות נוגדנים משני מתאימים עם הדילול הציע ושעה של דגירה.
- שטוף את הדגימות שש פעמים עם 1x PBT עם דגירת 10 דקות בין כל שטיפה.
שלב זה הוא קריטי עבור הסרת נוגדנים משני מחויב nonspecifically מן המדגם. - מדגירים את דילול 1: 10,000 של 1 מ"ג / מ"ל 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בתמיסה 1x PBT במשך 30 דקות. DAPI הוא צבע DNA הנקשר אזורי AT של דנ"א שיכול לשמש כדי לחשוף את המורפולוגיה הכוללת של המוח.
- לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
- דגימות מעבירים לצלחת לנתיחה, ולהפריד את המוח מהגופים בצלחת לנתיחה באמצעות מלקחיים.
- לאחר הצעדים המכתימים ושטיפה, הר המוחות בין שני coverslips ולמקם את coverslips על גבי שקופית גוברת. בדרך זו, דגימות המוח ניתן התהפכו בקלות כך ששני צידי המוח ניתן הדמיה עם עוצמת אות דומה.
- הוסף coverslip 18 x 18 מ"מ על גבי שקופית גוברת. להרחיב את הפתח של קצה פיפטה עם להב ולהשתמש בו כדי להעביר את המוח בתמיסה 1x PBS על 18 x 18 מ"מ coverslip.
- מניחים את המוח על באמצע coverslip, להסיר את הנוזל סביב המוח עם קצה פיפטה בסדר, ולאחר מכן להוסיף עוד 20 - 40 μL של המדיום גובר אנטי לדעוך (0.2% (w / v) n-propyl gallate ב 99.5 גליצרול כיתה% ACS) את מוחם.
הערה: הכמות גוברת הוסיף בינוני תלויה במספר של המוח שנבדק.- בעדינות להפיץ את המוח בזמן דחק את ההרכבה הבינונית הצמיגה כלפי חוץ. מניח coverslip שני 18 x 18 מ"מ על גבי המוח על ידי הוריד את השקופית ראשונה מצד אחד עד שהוא יוצר מגע עםפני השטח של תלוש ההרכבה, ולאחר מכן הנמכת הצד השני לאט כדי למזער מגע מוח עם בועות אוויר.
הערה: אין צורך להשתמש spacer בין שתי coverslips, כמו נפח של המדיום גובר ואת המוח אמור לספק מספיק מקום להפריד בין שתי coverslips.- אפשר השקופיות להתיישב. הסר נוזל מוגזם שיוצאים מן הצדדים של תלושים עם רקמות במעבדה.
- כדי למנוע את coverslips עם המוח רכוב מלנפול השקופית הגוברת במהלך הובלה, השתמש פיסה קטנה של סרט לצרף את coverslips לשקופית הגוברת.
הערה: Brains רכוב בין שקופיות ניתן הדמיה באופן מיידי או משומרים ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע ללא אובדן משמעותי של אות ניאון, ללא צורך להשתמש בכל איטום לאטום את השקופיות. עבור שימור לטווח הארוך של המוח המוכתם, הצד של שני תלושים יכול להיות אטום wמסמר ה- i פולני ומאוחסן -20 ° C במקפיא, למרות מוח מוכתם עלול לאבד האותות שלהם לאורך זמן. אפשרות זו אינה מומלצת.
- ראשית, לרכוש את התמונה מהצד של המוח הקרוב אל המטרה, ולאחר מכן בזהירות להעיף את coverslips לקבל את הדגימות דחוקות באמצע. צעד זה הופך לפשוט רכישת התמונה של הצד השני של אותו המוח.
- השתמש מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם זקוף עדשה 20X אובייקטיבית תמונה במוח (דוגמאות באיור 2) השלם מטרת 40X לאזורים קטנים תמונה של המוח, כגון נוירונים DA ב המדיאלי Anterior מותאם באזור האשכול (PAM) (דוגמאות באיור 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מדגים את ההליכים העיקריים לנתיחה המוח הבוגר, כמתואר לעיל איורים 2 ו -3 הם תמונות נציג של 3 ימים בת WT. (גנוטיפ: w 1118) מבוגר לטוס המוח, שהיו costained עם נוגדן נגד טירוזין hydroxylase (TH צבעוני, באדום באיור 2 ולבן באיור 3), סמן נפוץ לתייג נוירונים DA 11, בנוסף לצבוע DNA DAPI לתייג כל גרעיני תאים נוגדן כנגד חלבון Elav, סמן כל הנוירונים הבדיל ב לטוס (בצבע ירוק), אשר יחד חשף את המבנה הכללי של המוח.
עבור נוגדנים ראשוניים איורים 2 ו -3, השתמשנו שפן נוגדן אנטי-TH ביחס של 1: נוגדן 200 דילול עכברוש אנטי Elav ביחס של 1: דילול 100, WHIch נערכו 1x PBT עם 5% נסיוב עז נורמלי לחסום מחייב ספציפי. עבור נוגדנים משני, השתמשנו אלקסה פלואוריד 488 מצומדות עזים אנטי עכברוש נוגדן AlexaFluor596 מצומדות עז נגד ארנב נוגדנים ביחס של 1: דילול 500 ב 1x PBT.
כדי לדמות את המוח, השתמשנו מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם זקוף מצויד בפונקצית apotome לרכוש תמונות מחסנית Z של פרוסות המוח שמכסים את העומק השלם של האזור של העניין במוח. לדוגמא, כדי לקבל ראיה ברורה של החלוקה הכללית של נוירונים DA במוח כולו, השתמשנו עדשה 20X אובייקטיבית לצלם בנפרד הצדדים הקדמיים וגם האחוריים של אותו המוח (איור 2). העומק של כל צד של המוח צלם שיכול לכסות את כל הנוירונים DA הוא כ 20 - 25 מיקרומטר בסך הכל. כדי מהימן לחזות ולכמת נוירונים DA באזור אשכול PAM, אשר יש בגדלים תא קטן סי TH חלשgnals (ראה להלן), השתמשנו עדשה אובייקטיבית 40X. בנוסף, פונקצית רכישת Z-series מן התוכנה המסחרית, בחרנו עובי סעיף של 0.5 - 1 מיקרומטר בין כל פרוסה צלמה, אשר הבטיח איכות תמונה אופטימלית בתוך שחזור 3D של אזור אשכול PAM (איור 3c). העובי של אשכול PAM במוח המכסה את כל הנוירונים DA הוא כ 8 - 10 מיקרומטר בסך הכל. מניסיוננו, פונקצית apotome יכולה להפחית את האות לרעש משמעותית הדמית דגימות עבות עם רקע גבוה, כגון מוח כולו או באזור אשכול PAM.
דמויות 2A-E להציג את התצוגה הקדמית של מוח, ואילו דמויות 2F-J להציג את התצוגה האחורית של אותו המוח לאחר מהרפרף את coverslips שמחזיק את דגימות המוח, אשר מציגות רמה דומה של עוצמת אות בין שני צידי המוח עבור כל הערוצים שלושה צילמו. Neur DAons קובץ לאשכולות שונים בעקבות הייעוד מוקדם 11, אם כי כאן אנו משתמשים בשם המותאם האחוריים המדיאלי (PPM) לכלול את PPM1, PPM2, ואשכולות PPM3 בצד הקדמי של המוח, ואת השם המותאם לרוחב אחורי (PPL ) כדי לכסות את אשכולות PPL1 ו PPL2 מהצד האחורי של המוח, כפי שהוא מתואר 2E דמויות 2J. 2E דמויות 2J ב הקדמי להראות לבן ונוף האחורי של אותו מוח הגדלה גבוהה, חושף את לאשכולות שונים של DA נוירונים משני צידי המוח. הלבן קווים מקווקווים לסמן את PAM בולט לרוחב Anterior מותאמים (PAL) אשכולות בצד הקדמי של המוח (איור 2E) וכן PPL ואת אשכולות PPM בצד האחורי של המוח (איור 2J).
ציורים A3 ו 3B מחדש סיכומים של תוצאות כימות לחלק אשכולות DA בזבובי w 1118. ספרנו נוירונים DA ובמשורה וגם מ 3D משוחזר תמונות, שאמור למזער ספירה מדויקת. אנו מעריכים כי יש 1118 זבובים w בן 3 ימים בממוצע 27 נוירונים DA הכוללת באשכול PPM לכל המוח, 16 נוירונים DA באשכול PPL לכל בחצי הכדור, 5 נוירונים DA באשכול PAL לכל בחצי הכדור (איור 3 א), ו -97 נוירונים DA בכל אחת אשכולות PAM (איור 3 ב). איור 3 ג הוא שחזור 3D נציג של נוירונים DA באשכולות PAL ו- PAM, מוקרן מתוך פרוסות תמונות בחדות גבוהה ההגדלה מכסה את כל הנוירונים DA באזור זה. ניכר כי בהשוואה לאשכולות אחרים כגון PAL, נוירונים DA באשכול PAM יש יחסית גדלי תא קטנים אותות מכתימים TH חלשים.
"Src =" / files / ftp_upload / 55,128 / 55128fig1.jpg "/>
איור 1:. איור גרפי של הפרוטוקול לנתיחה עבור מבוגרי תסיסנית המוח (א) זבובים מוצבים עם צד הגחון כלפי מעלה, ומוחזקים בידי בית החזה באמצעות היד הלא דומיננטית. החיל יושם בעדינות (חצים אדומים) אל המלקחיים כדי לגרום הטיה לאחור של ראש הזבוב ורחבה החוצה הקלה של החוטם, חשיפה באזור השקוף הלבן להלן. (ב) מלקחיים מן היד הדומיננטית מוכנסים באזור השקוף מתחת החוטם, יצירת חתך רדוד (חץ אדום). שים לב המלקחיים אנו משתמשים לא יש קצוות טיפ יפים מאוד. (C) מלקחיים מותרים להתפרק באמצעות כוח משלה, כפי שצוינו על ידי החצים האדומים. המומנטום שנוצר על ידי פתיחת המלקחיים מסיר את עיני שלד חיצוני, חשיפת מוח תסיסנית יחסית נקי. רוב של קנה הנשימה יוסרו בתהליך. (
איור 2:. DA נוירונים Revealed עם אנטי-טירוזין hydroxylase (TH) נוגדן למבוגרים זכר תסיסנית B גשם (נרכש עם מטרה 20X) נתון זה כולל תמונות מייצגות של מוחות בוגרים גזור, משוחזר באמצעות תמונות מוערמים Z של אזור במוח של הריבית שתתקבל עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם. (AE) Anterior ו (FJ) נופים אחוריים של אותו במוח הבוגר; (A & F) גרעין התא הם צילמו על ידי מכתים DAPI (לבן) ו- (C & H) נוירונים were שכותרתו ידי נוגדנים נגד Elav סמן הפאן העצבית (ירוק); (B & G) נוירונים DA מתגלים על ידי נוגדנים נגד TH (אדום). (D & I) כיסוי של תמונות עבור DAPI, TH וטיפול Elav. (E & J) תצוגה מוגדלת של אזורי המוח עם נוירונים DA מוצג לבן. קווים מקווקווים לסמן את אשכולות PAL ו PAM ב הקדמי של המוח PPL ו- PPM אשכולות האחורי של המוח. סרגל הסולם מייצג 50 מיקרומטר כל החלוניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. כימות DA נוירונים במוח של מבוגר זכר w 1118 זבובים (נרכש עם מטרה 40X). (A & B) כימות DA neurons של יום 3 זכר w 1118 זבובים, מתגלה על ידי מכתים אנטי-TH. נתונים מיוצגים על ידי חלקות תיבת זיף מראה ערכי מינימום ומקסימום כמו החריגים; וכן (Q1), השני (Q2) והשלישי (Q3) הראשון רבעונים. הרבעון השני מיוצג כערך הממוצע. (א) PPM {(n = 28) Min: 21, ש 1: 24, ממוצע: 27, ש 2: 30, מקס: 32}, PPL {(n = 26) Min: 10, ש 1: 12, ממוצע: 16, ש 2: 18, מקס: 25}, ו PAL {(n = 24), Min: 2, ש 1: 4, ממוצע: 5, ש 2: 5, מקס: 10} אשכולות; (ב) PAM אשכול {(n = 20) Min: 86, ש 1: 94, ממוצע: 97, ש 2: 97, מקס: 99}. (ג) הקרנת תמונה נציג מראה נוירונים DA באשכולות PAM ו PAL של זכר w 1118 זבובים ב 3 ד. סרגל קנה מידה מייצג 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עם עניין גובר בשימוש מוח תסיסנית מבוגר כדי לחקור מחלות מוח אנושיות, מעגלים עצביים, ועל תפקוד מוח גבוה, יש צורך לפתח שיטות פשוטות ומהירות להשיג מוח זבוב על תילן כל הר מנתח, אשר חשוב במיוחד עבור מידה גדולה סולם מסך מוחי. השיטה שלנו מספקת פשוט וקל ללמוד גישה לנתח את ראש זבוב (לעתים קרובות תוך פחות מ 10 שניות עם ניסיון) עם מורפולוגיה השתמרה היטב כי מנוקה בעיקר של רקמות כלולות. כמו המוח הגזור עדיין מחובר לשאר הגופים לטוס, הם בדרך כלל לשקוע לקרקעית של הצינור מדגם במהירות והם קלים לזהות ולאסוף במהלך שלבי כביסה וכתמים. זה משמעותי ממזערת אובדן מדגם זה יכול להיות נושא בולט בעיבוד דגימות מוח בגדלים פיזיים זעירים. בעיה זו יכולה להיות חשובה במיוחד עבור במחקרים של מספרים גדולים. המוח יכול להיות בקלות מנותק מן הגוףלאחר השלמת הליך מכתים, לפני הרכבה.
במהלך הניתוח, חשוב למקם את הזבוב כראוי, לשמור על הזוויות הנאות בעת הסרת השלד החיצונית מראש הזבוב, בעדינות להפעיל הכח הנאות בביצוע כל שלב. מומלץ המלקחיים ממוקמים בניצב זה לזה כדי למנוע עריפת ראש של הזבוב (איור 1 ב). כפי שניתן לראות בתמונות הנציג באיור 2, המוח המוכן באמצעות פרוטוקול זה יפיק תוצאות משביעות רצון. בדוגמה זו, התמקדנו נוירונים DA באשכול PAM של מוחות בוגרים. מוח לתסיסנית ממוצע יש בסך הכל כ -280 נוירונים DA לכל protocerebrum, אשר מופצים באשכולות ברורים באזורים שונים של המוח עם דפוסי הקרנה ייחודיים ופלט תפקודי 11, 12. אפיון קודם של נוירונים DA במוחות תסיסנית מבוגרות, including לטוס מודלים של גני מחל אנושיות כגון מוטנטים פרקין, התמקד בעיקר על PAL, PPL, ואשכולות PPM שיש בגדלי תאים גדולים יחסית ביטוי בולט של TH, היצרנית הסטנדרטית המשמשת עבור נוירונים תיוג DA 13-18.
עם זאת, הרוב המכריע של נוירונים DA במוח הזבוב נמצאים באשכולות PAM, עם כ -100 נוירונים DA לכל אשכול. לעומת תאים באשכולות DA אחרים, נוירונים DA באשכול PAM בדרך כלל להראות רמה קטנה ביטוי hydroxylase טירוזין וגדל תא קטן. בדגימות שהוכן פרוטוקול לנתיחה מכתים שלנו, הנוירונים DA באשכול PAM ניתן דמיינו בבהירות צילמו באיכות גבוהה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתחם, ללא הדמיה confocal. בהתחשב במספר הגדול שלה, כימות של נוירונים DA באשכול PAM של רקע גנטי שונה עלולה לייצר יותר תוצאות אמינות לשחזור. אנו מציעים כי נוירונים DA ב clus PAMter מייצג עוד מערכת שימושית לחקר ביולוגית DA ומידול פרעות DA קשורות, כגון מחלת פרקינסון.
מניסיוננו, פונקצית apotome המיקרוסקופ השתמשנו יכולה להפחית את אות הרקע באופן משמעותי, במיוחד חקר דוגמאות עם עובי משמעותי, כמו מוח הזבוב הבוגר כולו. למרות מיקרוסקופ confocal יכול להפיק תמונות עם פרטים נוספים, גדלה גבוהה ואיכות טובה יותר, הוא לעתים קרובות זמן רב ויקר. זה נכון במיוחד עבור הדמית מספר גדול של דגימות עבות כמו מוחות בוגרים הדורשים סדרת סעיף Z- מחסנית עבור שחזור 3D ברור ניתוח deconvolution. מבחינה זו, פונקצית apotome מייצגת חלופה מהירה וחסכונית להפקת תמונות באיכות מספקת (למשל, תמונות איורים 2 ו -3).
במחקרי מוח, זה לעתים קרובות יש צורך תאי תמונה משני סיdes של אותו המוח. לדוגמא, נוירונים DA נוכח באשכולות משני הצדדים הקדמיים וגם האחוריים של המוח. עם זאת, בשל העובי שלה, אחרי מוח הוא רכוב לשקופית, הצד רחוק ממקור האור (כלומר, צד פונת שקופית ההרכבה) בדרך כלל מעורר אותות חלשים יותר ופחות תמונות ברורות כאשר צלם באמצעות תרכובת רגילה confocal מיקרוסקופים. על ידי הרכבת הדגימות בין שתי שקופיות הכיסוי, היא מאפשרת מרפרף נוח של הדגימות בשקופית רכוב ההדמיה עוקבת של שני הצדדים של אותו המוח עם עוצמות אות דומות. איור 2 הוא דוגמא של נוירונים DA הדמיה משני צידי לטוס מוח באמצעות שיטה זו, אשר הראתה עוצמת איתות דומה יחסית ואיכות הדמיה.
קלות לעקוב אחר מספר גישות לנתח מוחות זבוב בוגרים תואר יפה 9, 10. הגישה שלנו מספקת שיטה חלופית שיכולה פרווהיס לפשט את התהליכים לנתיחה וצביעת המבוגר לטוס מוח. בעזרת מחקרים בקנה מידה גדולה יותר נערכים על מנת למפות את הפעילות המוחית עצבית כולה כמו גם כמרכיבים מולקולריים תאיים שלה, זה הנראה לעין, כי גישות לנתיחת הדמיה אוטומטיות ניתן לפתח עבור מוח תסיסנית מבוגר לממש מסכים גנטיים תרופת תפוקה גבוהה in vivo במודל גנטי קלאסית זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מכירים מר Enes מחמט, הגב 'קיארה אנדרדה, הגב' פילאר רודריגז, כריס קווק, והגב 'דנה Ghafir לתמיכה העצומה שלהם לפרויקט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
