Summary
Den vuxna Drosophila hjärnan är ett värdefullt system för att studera neuronal kretsar, högre hjärnfunktioner, och komplexa sjukdomar. En effektiv metod för att dissekera hela hjärnvävnad från den lilla flugan huvudet underlättar hjärnbaserade studier. Här beskriver vi en enkel, ett steg dissektion protokollet för vuxna hjärnor med välbevarad morfologi.
Abstract
Det finns ett ökande intresse av att använda Drosophila att modellera mänskliga hjärnan degenerativa sjukdomar, karta neuronala krets hos vuxna hjärnor, och studera den molekylära och cellulära basen av högre hjärnfunktioner. En hel-mount beredning av vuxna hjärnor med välbevarad morfologi är avgörande för sådana hela hjärnan baserade studier, men kan vara tekniskt utmanande och tidskrävande. Detta protokoll beskriver en enkel att lära sig, en-stegs dissektion tillvägagångssätt av en vuxen fluga huvud på mindre än 10 s, samtidigt som den intakta hjärnan fäst till resten av kroppen för att underlätta efterföljande behandlingssteg. Förfarandet bidrar till att avlägsna det mesta av ögat och luftrör vävnader som normalt förknippas med hjärnan som kan störa senare imaging steg, och även ställer mindre krav på kvaliteten på de dissekera pincett. Dessutom beskriver vi en enkel metod som möjliggör bekväm flipping av de monterade hjärnprover på ett täckglas, vilket är viktigt för bildframställning på båda sidor av bregn med liknande signalintensitet och kvalitet. Som ett exempel på protokollet, presenterar vi en analys av dopaminerga (DA) neuron hos vuxna hjärnan hos WT (w 1118) flugor. Den höga effektiviteten hos den dissekeringsmetod gör det särskilt användbart för storskaliga vuxen hjärna-baserade studier i Drosophila.
Introduction
Den modellorganism Drosophila, allmänt känd som bananflugan, har länge varit uppskattad för sina eleganta genetiska verktyg, korta reproduktiva gånger, och mycket konserverade molekylära och cellulära vägar. Bananfluga har framgångsrikt används för att dissekera grundläggande signalvägar, mönstringen mekanismer för flercelliga organismer, samt de mekanismer som ligger bakom neuronal utveckling, funktioner och sjukdomar 1,2. Med de senaste framstegen inom cell märkning och avbildningstekniker har bananfluga hjärnan blir särskilt stark i fin kartläggning av neuronal kretsar och dissekera den molekylära och cellulära basen av högre hjärnfunktioner, såsom inlärning och minne, och dygnsrytm 1,3, 4,5,6,7,8.
En speciell fördel med Drosophila-systemet är dess relativt ringa storlek, vilket gör att hela montering beredning och undersökning av hjärnan med hjälp av en vanlig förening eller konfokalmikroskop. This funktion möjliggör detaljerade anatomiska och funktionella analyser av neuronala kretsar, eller ens en enda neuron, vid cellulära och subcellulära nivåer, inom ramen för en hel hjärnvävnad, vilket ger både en helhetssyn på den studerade ämnet och dess exakta geometri inom hela hjärna. Men med tanke på den ganska miniatyr storlek i hjärnan, presenterar det också en teknisk utmaning i effektivt dissekera en intakt hjärnvävnad ur skydds exoskelett huvudet fallet i en vuxen fluga. Olika effektiva och relativt enkla dissektion metoder har beskrivits i detalj, vilket vanligtvis innebär noggrann och stegvis avlägsnande av huvudet fallet och omkringliggande vävnader, inklusive ögonen, luftstrupe och fett från hjärnan korrekt 9, 10. Dessa mikro dissektion metoder ofta ställer ganska höga krav på kvaliteten på dissektion pincett, att förlita sig på pincett med fina väl inriktade tips som lätt kan skadas. Eftersom de dissekerade hjärnor är ofta Separated från resten av kroppen, kan hjärnan lätt förloras under efterföljande färgnings och tvättprocesser på grund av deras små storlekar och insyn i processande buffert. Här beskriver vi en relativt enkel och lätt att lära sig, ett steg dissektion protokoll för vuxna hjärnor som håller dissekerade hjärnor kopplade till bålen. Dissektion process som ofta lätt rensar bort det mesta av hjärnrelaterade vävnader såsom ögat och luftstrupe och minskar efterfrågan på god kvalitet dissektion pincett.
Dessutom, när avbildning av hjärnan under fluorescerande förening mikroskop eller konfokalmikroskop, den sida av hjärnan som är borta från den fluorescerande ljuskällan ger ofta en svagare signal och mindre tydliga bilder på grund av tjockleken av hela-mount hjärnan. Här beskriver vi också en enkel montering metod som tillåter enkel vändning av hjärnprover, vilket möjliggör bekväm avbildning av båda sidor av hjärnan med liknande signal intensiTy och kvalitet.
Som ett proof-of-concept för tillämpning av denna metod för att studera den vuxna hjärnan, undersökte vi ytterligare närvaron av DA-neuroner i hjärnan hos w 1118 flugor; en genotyp som ofta används som moderlinjen för att generera transgena flugor och vildtyp-kontroll i många Drosophila studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. lösningar som används för Brain Dissection och immunofluorescerande färgning
- Dissekera vuxen flyga hjärnor i artificiell Cerebral Spinal Fluid (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCOs 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mM MgCl2, och 10 mM glukos. Före användning, gas den aCSF med 5% CO2 / 95% O2 under 10 - 15 min och spik med 2,5 mM CaCl2. Sterilisera aCSF lösningen genom filtrering genom ett 0,22 | im membranfilter.
Notera: Store aCSF vid 4 ° C för att förhindra bakteriell kontamination. Fly hjärnor kan också dissekeras i en fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning, även om detaljerade jämförelser av effekterna av de två dissektion lösningar på den slutliga bildkvalitet av de dissekerade hjärnor inte har utförts. - Använda 4% paraformaldehyd (PFA) framställd i 1 x PBS som fixeringslösning, som normalt är i alikvoter och lagrades vid -20 ° C.
caution: PFA är giftig och frätande och bör hanteras med försiktighet. - Använd 1 x PBS för att skölja PFA från hjärnorna och efter det sista tvättsteget, under immunofluorescerande färgning av de dissekerade hjärnor. Förbered 1x PBS från 10x PBS stamlösning (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na 2 HPO 4, och 18 mM KH 2 PO 4).
- Använd 0,3% Tween-20 i 1x PBS (1x PBT) för alla efterföljande tvättsteg under immunofluorescerande färgning av dissekerade hjärnor.
2. Mikro Dissekering av vuxna flugan Heads
Obs: Den dissektion förfarande illustreras i figur 1.
- Söva vuxna flugor med CO 2. Använd pincett, plocka upp en fluga och kortfattat avvaxa sin nagelband genom att doppa den i 70% etanol i 3 - 5 s. Detta säkerställer att inga bubblor följa farten nagelbanden när nedsänkt i aCSF eller 1X PBS dissektion lösning.
- under ettdissekera mikroskop med en ljuskälla i en vinkel som inte kommer att blockeras av händer, ställer objektiv för att uppnå en tydlig bild av flugan (1,2X förstoring). Använd pincett med icke-dominanta handen för att immobilisera djuret och sänk farten i den kalla dissektion lösning med dess buk uppåt, som visas i figur 1A.
- Hålla tången vid en 160-170 ° vinkel i förhållande till dissektion plattan, under utövande av en liten kraft på buken av flugan (illustrerat som pilar i figur 1 A). Detta steg kommer att immobilisera farten och tvinga den att flytta huvudet bakåt 15 - 25 ° samtidigt utvidga snabel uppåt. I processen, en mjuk och genomskinlig region av nagelband, underifrån snabel, bör bli uppenbara. Öka förstoringen och justera fokalplanet på detta område.
Obs: Håll inte tången för hårt, utan bara fast nog för att stabiliseraflugan. För mycket kraft kommer att orsaka de inre organen för att brista i lösningen. - Använd den dominerande handen att trycka på dissekera pincett så att dess spetsar är stängda, vilket kommer att generera en mild motståndskraft på tips av pincett, så att tången kommer våren öppen när trycket från grepphanden släpps. Placera tången vinkelrätt mot tången håller farten, som visas i figur 1B.
- Pierce slutna spetsarna på dissektion pincett genom den mjuka och genomskinliga område av nagelband under snabel, vilket framgår av den röda pilen i figur 1B. Det är viktigt att inte tränga in i tången för djupt att det berör hjärnan. Hjärnan korrekt bör bli synlig. Upprätthålla ett stabilt grepp om flyga med icke-dominanta handen.
- Snabbt men säkert, släpp tips av dissektion pincett av egen kraft och lita på takten från den här versionen att riva bort than exoskelett omger flugan huvudet. En intakt hjärna korrekt bör bli synlig (den vita vävnaden omedelbart ovanför toppen av botten forcep i figur 1C) Följ en tänkt linje att styra dynamiken i de frigjorda forcep tips (illustreras som passiv röda pilarna som visas i figur 1C). Detta kommer att försiktigt avlägsna exoskelett och de flesta av hjärnan associerade ögat och luftstrupe från hjärnan. Den rätta tidpunkten och kraft som appliceras för att öppna exoskelett kommer att vara beroende av undersökarens erfarenhet.
Obs: Detta är det mest kritiska steget under dissekering. Det är viktigt att förlita sig på naturkraft som genereras från dynamiken i öppnings pincett för att ta bort exoskelett medan den exponerade hjärnan förblir fäst till resten av kroppen. - Använd pincetten i den dominerande handen för att försiktigt bort kvarleva tillbehörs vävnader, såsom luftrör som visas som vita fiberstrukturer remaining fäst till hjärnan. Var noga med att inte dra eller skada hjärnan korrekt.
3. Immunofluorescens färgning av hjärnorna
- Fäst dissekerade hjärnprover med tillhörande överkroppar på cirka 1 ml 4% PFA för 40-60 min.
Anmärkning: För detta och efterföljande steg, hålla rör eller plattor med prover på en nutator att ordentligt blanda proverna i lösningen. - Skölj med 1 ml 1 x PBS genom att pipettera lösningen upp och ner 3 gånger. Var noga med att inte aspirera hjärnan bort.
- Tvätta 5 gånger med 1x PBT under 5 min vardera. Håll proverna på nutator under inkubation.
- Inkubera med primära antikroppar vid rätt utspädning O / N vid 4 ° C.
- Nästa dag, ta bort de primära antikropparna, och tvätta proverna 5 gånger med 1x PBT. Låt prover för 5 - 10 minuter i 1x PBT lösning mellan varje tvätt. Håll proverna på nutator under inkubation.
- Inkubera det tvättadeprover i lämpliga sekundära antikroppar med den föreslagna utspädning och tid för inkubation.
- Tvätta proverna sex gånger med 1x PBT med en 10 minuters inkubation mellan varje tvätt.
Detta steg är kritiskt för att avlägsna ospecifikt bundna sekundära antikroppar från provet. - Inkubera i en 1: 10000-spädning av 1 mg / ml 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 1x PBT lösningen under 30 min. DAPI är en DNA-färgämne som binder till AT regioner av DNA och kan användas för att avslöja den övergripande morfologin hos hjärnan.
- Skölj tre gånger med 1 x PBS.
- Överför proverna till en dissektion maträtt, och separera hjärnan från kropparna i en dissektion maträtt med pincett.
- Efter färgning och tvättstegen, montera hjärnorna i mellan två täck och placera täck ovanpå en monterings bild. På detta sätt kan de hjärnprover lätt vändas så att båda sidor av hjärnan kan avbildas med en liknande signalintensitet.
- Placera en 18 x 18 mm täckglas ovanpå en monterings slide. Bredda öppnandet av en pipettspets med ett blad och använda den för att överföra hjärnor i 1x PBS-lösning på 18 x 18 mm täckglas.
- Placera hjärnorna på mitten av täckglaset, avlägsna vätskan runt hjärnan med en fin pipettspets, och sedan lägga till en annan 20 till 40 mikroliter av anti-fade monteringsmedium (0,2% (vikt / volym) n-propylgallat i 99,5 % ACS grad glycerol) över hjärnan.
Obs: Mängden monteringsmedium tillsättas beror på antalet hjärnor som undersökts.- Försiktigt utspridda hjärnan samtidigt förskjuta viskösa monteringsmedium utåt. Placera en andra 18 x 18 mm täckglas ovanpå hjärnorna genom att först sänka sliden från den ena sidan tills den kommer i kontakt medytan av monterings slip, och sedan långsamt sänka den andra sidan för att minimera hjärn kontakt med luftbubblor.
Obs: Det finns ingen anledning att använda en spacer mellan de två täck, eftersom volymen av monteringsmedium och hjärnan bör ge ett utrymme är tillräcklig för att separera de två täck.- Låt bilderna att slå sig ner. Ta bort överdriven vätska som kommer ut från sidorna av de halk med ett laboratorium vävnad.
- För att förhindra att täck med monterade hjärnor från att falla av monterings glida under transport, använda en liten bit tejp för att fästa täckglasen på monterings bilden.
Obs: Hjärnor monterade i mellan bilderna kan avbildas omedelbart eller förvaras vid 4 ° C i upp till en vecka utan betydande förlust av fluorescenssignal, utan att behöva använda tätningsmedel för att täta bilderna. För ett långsiktigt bevarande av de färgade hjärnor, kan vid sidan av de två glider tätas w: te nagellack och lagrades i en -20 ° C frys, även färgade hjärnorna kan förlora sina signaler över tiden. Detta rekommenderas inte.
- Först hämta bilden från sidan av hjärnan närmare målet, och sedan försiktigt vända täck att ha proverna inklämt i mitten. Detta steg underlättar förvärvar bilden av den andra sidan av samma hjärnan.
- Använd en upprätt förening fluorescerande mikroskop och en 20X objektiv till bilden hela hjärnan (exempel i figur 2) och en 40X mål att bild mindre regioner i hjärnan, såsom DA-neuroner i den parade främre Medial (PAM) klusterområdes (exempel i figur 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar de viktigaste förfarandena för vuxna hjärnan dissekering, såsom beskrivits ovan Figurerna 2 och 3 är representativa bilder av tre dagar gamla WT. (Genotyp: w 1118) vuxen flyga hjärnor, som costained med en antikropp mot tyrosinhydroxylas (TH , färgad i rött i figur 2 och vitt i figur 3), en markör som vanligen används för att märka DA-neuroner 11, förutom att den DNA-färgämnet DAPI för att märka alla cellkärnor och en antikropp mot Elav protein, en markör för alla differentierade neuroner i flugan (färgad i grönt), som tillsammans avslöjade den övergripande strukturen av hjärnan.
För de primära antikropparna i figurerna 2 och 3, använde vi kanin-anti-TH-antikropp vid en 1: 200 utspädning och rått-anti-Elav antikropp vid en 1: 100 utspädning, which framställdes i 1x PBT med 5% normalt getserum för att blockera ospecifik bindning. För sekundära antikroppar, använde vi Alexa Fluor 488-konjugerad get-anti-rått-antikropp och AlexaFluor596-konjugerad get-anti-kanin-antikropp vid en 1: 500 utspädning i 1x PBT.
Att avbilda hjärnan, använde vi en upprätt förening fluorescerande mikroskop utrustat med en apotome funktion för att förvärva Z-stack bilder av hjärnan skivor som täcker hela djupet av regionen av intresse i hjärnan. Till exempel för att erhålla en klar visualisering av den allmänna fördelningen av DA-neuroner i hela hjärnan, använde vi en 20X objektivlins för att separat bild de främre och bakre sidor av samma hjärnan (figur 2). Djupet av varje sida av hjärnan avbildas som kan täcka samtliga DA-neuroner är ca 20-25 | j, m totalt. För att på ett tillförlitligt sätt visualisera och kvantifiera DA-neuroner i PAM klusterområdes, som har mindre cellstorlekar och svagare TH signals (se nedan), använde vi en 40X objektivlins. Dessutom, i förvärvsfunktionen Z-serien från kommersiell programvara, valde vi en snittjocklek av 0,5-1 um mellan varje avbildas skiva, som säker optimal bildkvalitet i en 3D-rekonstruktion av PAM klusterregionen (Figur 3c). Tjockleken på PAM kluster i hjärnan som täcker alla DA-neuroner är ca 8-10 ^ m totalt. Enligt vår erfarenhet kan apotome funktionen avsevärt minska brussignalen vid avbildning tjocka prover med hög bakgrund, såsom en hel hjärna eller PAM klusterområdes.
Figurerna 2A-E visar den främre vy av en hjärna, medan Figurerna 2F-J visar den bakre vy av samma hjärnan efter vända täckglasen som håller hjärnprover, som uppvisar en liknande nivå av signalintensitet mellan två sidor av hjärnan för alla tre avbildas kanalerna. DA Neurons grupperades i olika kluster efter den tidiga beteckningen 11, även om vi här använder namnet Kopplade Posterior Medial (PPM) för att inkludera PPM1, PPM2 och PPM3 kluster på den främre sidan av hjärnan, och namnet Kopplade Posterior Lateral (PPL ) för att täcka PPL1 och PPL2 kluster från den bakre sidan av hjärnan, som visas i figurerna 2E och 2J. figurerna 2E och 2J i vitt show främre och bakre vyer av samma hjärnan i hög förstoring, avslöjar olika kluster av DA neuroner på båda sidor av hjärnan. Den vita streckade linjerna markerar den framstående PAM och Paired Anterior Lateral (PAL) kluster i den främre sidan av hjärnan (figur 2E) såväl som den PPL och PPM kluster i den bakre sidan av hjärnan (figur 2J).
Figurerna 3A och 3B en re sammanfattningar av kvantifieringen resultat för några av DA kluster i w 1118 flugor. Vi räknade DA nervceller skiva för skiva och även från 3D rekonstruerade bilder som ska minimera oprecis räkning. Vi uppskattar att de tre dagar gamla w 1118 flugor har ett genomsnitt på 27 DA-neuroner totalt i PPM klustret per hjärna, 16 DA-neuroner i PPL klustret per halvklotet, 5 DA-neuroner i PAL kluster per halvklotet (figur 3A), och 97 DA-neuroner i varje PAM kluster (Figur 3B). Figur 3C är en representativ 3D-rekonstruktion av DA-neuroner i klustren PAL och PAM, projiceras från skivor av hög förstoring bilder täcker alla DA nervceller i denna region. Det är uppenbart att i jämförelse med andra kluster såsom PAL, DA-neuroner i PAM klustret har relativt mindre cellstorlekar och svagare TH färgningssignaler.
"Src =" / filer / ftp_upload / 55128 / 55128fig1.jpg "/>
Figur 1:. Grafisk illustration av Dissection protokoll för vuxna Drosophila hjärnan (A) Flugor placeras med den ventrala sidan uppåt, och som innehas av bröstkorgen med hjälp av icke-dominanta handen. Force försiktigt tillämpas (röda pilarna) till tången för att inducera bakåt lutning av flugan huvudet och lätt utåt förlängning av snabel, exponera vita genomskinliga området nedanför. (B) Tång från den dominerande handen infogas i den transparenta regionen under snabel, skapar en grund snitt (röd pil). Observera att tången vi använder inte har mycket fina spetsändar. (C) Tång får komma ifrån varandra genom sin egen kraft, såsom indikeras av de röda pilarna. Drivkraften genereras genom att öppna tången bort ögonen och exoskelett, exponera en relativt ren Drosophila hjärnan. De flesta av luftstrupen avlägsnas i processen. (
Figur 2:. DA nervceller avslöjas med anti-tyrosinhydroxylas (TH) antikropp hos vuxna manliga Drosophila B regn (Förvärvad med en 20X mål) Denna siffra inkluderar representativa bilder av dissekerade vuxna hjärnor, rekonstrueras med hjälp av Z-staplade bilder av hjärnan regionen intresse som erhållits med föreningen fluorescerande mikroskop. (AE) Främre och (FJ) Posteriora vyer av samma vuxna hjärnan; (A & F) cellkärnor avbildades av DAPI färgning (vit) och (C & H) neuroner were märkt av pan-neuronal markör anti-Elav antikroppar (grön); (B & G) DA-neuroner avslöjas av anti-TH-antikroppar (röd). (D & I) överlagring av bilder för DAPI, TH och Elav behandling. (E & J) Förstorad bild av de områden i hjärnan med DA-neuroner visas i vitt. Streckade linjer belysa de kluster PAL- och PAM i den främre av hjärnan och PPL och PPM kluster i den bakre delen av hjärnan. Skalstrecket representerar 50 pm i alla panelerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Kvantifiering av DA nervceller i hjärnan på Male vuxen w 1118 flugor (Förvärvad med en 40X mål). (A & B) Kvantifiering av DA neurons på dagen tre manliga w 1118 flugor avslöjade av anti-TH färgning. Data representeras av morrhår lådagram visar min- och maxvärden som extremvärden; såväl som de första (Q1), andra (Q2) och tredje (Q3) kvartiler. Den andra kvartilen representeras som medelvärdet. (A) PPM {(n = 28) Min: 21, Q1: 24, Medel: 27, Q2: 30, Max: 32}, PPL {(n = 26) Min: 10, Q1: 12, Medel: 16, Q2: 18, Max: 25}, och PAL {(n = 24), Min: 2, Q1: 4 Average: 5, Q2: 5, Max: 10} kluster; (B) PAM kluster {(n = 20) Min: 86, Q1: 94 Medel: 97, Q2: 97, Max: 99}. (C) En representant projektionsbild som visar DA-neuroner i PAM och PAL kluster av manliga w 1118 flugor på 3 d. Skala stapel representerar 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med ett ökande intresse för att använda vuxna Drosophila hjärnan att studera mänskliga hjärnsjukdomar, neuronal kretsar och högre hjärnfunktioner, är det nödvändigt att utveckla enkla och snabba metoder för att få intakta fly hjärnor för hel-mount analyser, vilket är särskilt viktigt för stor- skala hjärnbaserade skärmar. Vår metod ger en enkel och lätt att lära sig strategi för att dissekera en fluga huvud (ofta på mindre än 10 s med erfarenhet) med välbevarad morfologi som till stor del bort av omkringliggande vävnader. Eftersom de dissekerade hjärnor fortfarande fästad vid resten av flugan organen, de brukar sjunka till botten av provröret snabbt och är lätta att känna igen och samla under tvättnings- och färgningssteg. Detta minimerar betydligt provförlust som kan vara en framträdande fråga i bearbetning av hjärnprover från små fysiska storlekar. Denna fråga kan vara särskilt viktigt för storskaliga studier. Hjärnan lätt kan tas loss från kroppenefter slutförandet av färgningsprocessen, före monteringen.
Under dissektion, är det viktigt att placera flugan rätt bibehålla rätt vinklar när du tar bort exoskelett från flugan huvudet och försiktigt utöva rätt kraft för att utföra varje steg. Det rekommenderas att tången är placerade vinkelrätt mot varandra i syfte att förhindra halshuggning av flugan (Figur 1B). Såsom visas i de representativa bilder i figur 2, hjärnorna ställas med användning av detta protokoll ett tillfredsställande resultat. I det här exemplet har vi fokuserat på DA-neuroner i PAM kluster av vuxna hjärnor. En Drosophila hjärnan i genomsnitt har totalt cirka 280 DA-neuroner per protocerebrum, som är fördelade i olika kluster i olika regioner av hjärnan med distinkta projektionsmönster och funktionella utgång 11, 12. Tidigare karakterisering av DA-neuroner hos vuxna Drosophila hjärnor, including flyga modeller av sjukdomsgener humana såsom i Parkin mutanter, till stor del har fokuserat på PAL, PPL, och PPM kluster som har relativt stora cellstorlekar och framträdande expression av TH, standardkokare används för märkning av DA-neuroner 13-18.
Dock är majoriteten av DA-neuroner i farten hjärnan finns i PAM kluster, med cirka 100 DA-neuroner per kluster. Jämfört med celler i andra DA kluster, DA-neuroner i PAM klustret visar normalt en mindre grad av tyrosinhydroxylas uttryck och mindre cellstorlekar. I prover som framställts från vår dissektion och färgningsprotokollet kan DA-neuroner i PAM klustret tydligt visualiseras och avbildas i hög kvalitet med hjälp av en förening fluorescerande mikroskop, utan konfokal avbildning. Med tanke på dess stora antal, kanske kvantifiering av DA-neuroner i PAM kluster av olika genetisk bakgrund producera mer tillförlitliga och reproducerbara resultat. Vi föreslår att DA-neuroner i de PAM cluster representerar en annan användbart system för att studera DA biologi och modellering DA-relaterade sjukdomar, såsom Parkinsons sjukdom.
I vår erfarenhet, den apotome funktionen från mikroskopet vi använt kan avsevärt minska bakgrundssignalen, i synnerhet i att undersöka prover med betydande tjocklek, såsom hela den vuxna flugan hjärnan. Även konfokalmikroskop kan producera bilder med fler detaljer, högre förstoring och bättre kvalitet, är det ofta tidskrävande och kostsamt. Detta gäller särskilt för avbildning av ett stort antal tjocka prover, såsom vuxna hjärnor som kräver serie av Z-stack sektion för tydlig 3D-rekonstruktion och deconvolution analys. I detta perspektiv utgör apotome funktionen en snabb och kostnadseffektiv alternativ att producera bilder av tillräcklig kvalitet (t.ex. bilder i figurerna 2 och 3).
I hjärnan studier, är det ofta nödvändigt att bild celler på båda sides av samma hjärnan. Till exempel, DA-neuroner förekommer i kluster från både de främre och bakre sidor av hjärnan. Men på grund av sin tjocklek, efter en hjärna är monterad på bilden, sidan bort från ljuskällan (det vill säga, den sida som vetter monterings bild) ger vanligtvis upphov till svagare signaler och mindre tydliga bilder när avbildas med vanlig förening och konfokal mikroskop. Genom att montera proven i mellan de två täckskivor, gör det bekvämt flipping av proverna på den monterade sliden och efterföljande avbildning av båda sidor av samma hjärnan med liknande signalintensiteter. Figur 2 är ett exempel på bildgivande DA-neuroner från båda sidor av fly hjärnor med denna metod, som visade relativt jämförbar signalintensitet och bildkvalitet.
Flera enkla att följa metoder för dissekera vuxna flyga hjärnor har varit fint beskrivs 9, 10. Vår metod ger en alternativ metod som kan pälsther förenkla dissekering och färgningsprocesser vuxen flyga hjärnor. Med fler storskaliga studier pågår för att kartlägga hela hjärnan neuronala kretsar samt dess molekylära och cellulära beståndsdelar, kan man förutse att automatiserade dissekering och avbildningsmetoder kan utvecklas för vuxna Drosophila hjärnor att inse hög genomströmning genetiska och drogskärmar in vivo i denna klassiska genetiska modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi erkänner Mr Enes Mehmet, Ms Kiara Andrade, Ms Pilar Rodriguez, Chris Kwok, och Ms. Danna ghafir för deras enorma stöd till projektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22 µm Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
References
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genetics. 199, 639-653 (2015).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
