Abstract
정확한 탐지 및 저주파 돌연변이의 식별은 치료 중 내성 돌연변이 신흥 심사, 치료 후 잔여 질병을 평가할 때 문제가 될, 또는 수의 환자가 몇 순환 종양 세포가있을 때. 서열 분석 하였다 PCR 차단 야생형 이러한 저주파 변이를 검출하는 방법으로 고감도, 유연성 및 단순성을 제공한다. 신설하거나 이전에 종래의 PCR 계 서열 분석에 핵산 올리고 뉴클레오티드 로크 설계 정의를 첨가함으로써, 1000 WT 대립 유전자의 배경에서 약 1 돌연변이 대립 유전자의 민감도 (1,000 1)를 실현할 수있다. 탈 아미 노화 이벤트와 연관된 시퀀싱 아티팩트 일반적 부분적 추출 단계 동안 우라실 DNA 글리코의 사용에 의해 해결 될 수 포르말린 고정 파라핀 조직에서 발견. 최적화 된 프로토콜은 여기에서 MyD88 돌연변이를 검출하기위한 특정이지만, 어떤을 설계하는 템플릿 역할을 할 수 있습니다WTB-PCR 분석. PCR 및 실시간 정량 PCR 가양 적게 발생, 유연성 및 구현의 용이성을 포함 특정 대립 유전자를 포함하여 낮은 주파수 변이의 검출에 대한 기타 일반적으로 사용되는 분석을 통해 WTB-PCR 분석의 장점, 둘 다 알려진 감지 할 수있는 능력 알 수없는 돌연변이.
Introduction
생거 시퀀싱은 전통적으로 알려진 알 수없는 체세포 돌연변이 시험에서 황금 표준되었습니다. 생거 시퀀싱의 한계 중 하나는 검출 한계 인 (~ 10 - WT의 배경에 20 % 돌연변이 대립 유전자 1). 감도 수준은 몇 순환 종양 세포 또는 골수 (BM)이 고르지 때와 암성 조직 또는 환자 샘플에 존재할 수있는 낮은 수준의 체세포 돌연변이를 검출하기위한 부적절한. 이것은 또한 치료 후 잔여 질병을 평가 또는 혼자 두 기존의 염기 서열에 의해 어려운 치료 중에 새로운 저항 변이를 감지한다. 잠긴 핵산 (LNA)와 종래의 PCR 대체함으로써 생거 시퀀싱에 PCR (WTB-PCR)을 차단 야생형를 매개 성, WT의 배경 최대 0.1 % 돌연변이 대립 유전자의 감도는 2, 3, 4를 달성 할 수있다. 에서WT WT DNA의 DNA 증폭 방지하여 우선적으로 결합 - (NT 14 ~ 10) 차단 (LNA) 올리고 WTB-PCR은, 돌연변이 대립 유전자 농축 짧은의 첨가를 통해 달성된다. 돌연변이 풍부한 WTB-PCR 제품은 다음 순서가 될 수있다. WT DNA를 차단하기보다는 특정 돌연변이 선택 WTB-PCR은 분 세포 분획에 존재하는 알려진 알려지지 돌연변이 농축을 허용한다.
여러 방법이 현재 작은 세포 분획에 돌연변이를 검출하기 위해 사용된다. 이는 고성능 액체 크로마토 그래피 (DHPLC), 비드, 에멀젼, 증폭, 및 마그네틱들 (빛나는), 전계 유도 방출 측정 (EFIRM) 변성 대립 유전자 특이 적 PCR 증폭 불응 돌연변이 시스템 (ARMS), 높은 해상도를 포함 녹는 점 등이있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 가양 만 분석은 4 설계된 하나의 돌연변이를 검출 할 수있는 능력에 의해 제한된다 6 앰플 리콘 기반 NGS 5 문제를 제기 할 수있다.
여기에서는 Albitar 등에 의해 기술 된 바와 같이 골수 분화 인자 88 유전자의 돌연변이에 대해 스크리닝 WTB-PCR에 의해 달성 감도의 증가를 보여준다. 3에서 MyD88의 mutatioNS는 발덴 스트롬 마크로 글로불린 혈증 (WM) 알 수없는 의미 (IgM의-MGUS)의, IgM의 단일 클론 감마 병증, 비장 한계 영역 림프종 (SMZL)에서 중요한 진단 및 예후 인자, 그리고 큰 B 세포 림프종 (DLBCL)을 확산. 에서 MyD88 돌연변이는 WM의 거의 모든 경우와 면역 글로불린 M (IgM의) MGUS를 -secreting 환자의 약 50 %에서 발견된다. 이에 대해서,에서 MyD88 돌연변이는 SMZL 환자의 0 내지 6 %에서 발견 다발성 골수종 7, 8 결석된다. 겹치는 형태 학적, immunophenotypic, 염색체 및 WM 및 SMZL 또는 종종 감별 진단을 복잡하게 할 수-IgM의 다발성 골수종 사이의 임상 적 특성 때문에하는 돌연변이에서 MyD88의 존재하에 유용한 식별 9 인자로서 작용할 수있다. 에서 MyD88 돌연변이 또한, 치료 (7) 다음 DLBCL와 가난한 전체 생존 환자에서 더 큰 질병 부담과 관련이있다 10. 또한에서 MyD88 돌연변이가 자주보다 활성화 된 B 세포 형 (ABC) DLBCL에서 발견되기 때문에 B가 셀 형상 (GCB) DLBCL 또는 기본 종격동 B 세포 림프종 (PMBL)에서 MyD88 돌연변이 상태가로서 작용할 수 배 중심 ABC 방송의 아형 (11), (12)에 대한 대리 마커.
여기에 제공된 상세한 프로토콜은 새로운 분석법이 개발 될 수 있거나 대부분의 기존 서열 분석을 용이하게 정확하게 다양한 샘플 종류 저주파 돌연변이를 검출하도록 구성 될 수있는 주형으로 작용한다. 이 접근법은 또한 모니터링하거나 종양 환자가 치료 표적 항생제로 처리되는 동안 생길 수 심지어 박테리아 개발할 수 내성 돌연변이를 검출하기 위해 사용될 수있다. 또한, 주소, 특히 포르말린 고정 파라핀 (FFPE) 조직에 돌연변이 농축과 관련된 많은 문제 구제.
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Protocol
윤리 성명서 : 인간의 모든 샘플 테스트는 임상 시험 심사위원회 (IRB)의 승인을 얻은 후 시행 하였다.
1. FFPE 조직에서 DNA 추출, 말초 혈액 및 골수 대기음
- DNA FFPE 추출 키트 골수 FFPE 조직에 대한
- 흠 슬라이드에서 FFPE 조직으로 시작 (5-5에서 10 절 - 10 μm의 두께).
참고 : 조직 부스러기 시작, 3 개를 사용하는 경우 - 5에서 6 섹션 - 10 μm의 두께와 1.1.6 단계로 건너 뜁니다. - 슬라이드 바구니 슬라이드 놓고 네 세척 저장소 (크실렌 두 100 % 알코올 개의)을 준비한다. 각 바스켓 용액을 600 mL의 최소 부피를 추가한다.
- 제 트레이에 5 분 크실렌 세척을 수행하여 슬라이드 Deparaffinize. 추가로 5 분 동안 제 크실렌 세척 저장소에 슬라이드 이동.
- 탈 파라핀 한 후, 5 분 동안 100 % 알코올로 슬라이드를 세척한다. 두 번째로 슬라이드를 이동추가로 5 분 동안 세척 알코올 저장조.
- 슬라이드가 microcentrifuge 관에 면도날로 근근이 살아가고하기 전에 후드를 완전히 말리십시오.
참고 : 종양 지역과 H & E 슬라이드가 표시된 경우 사용할 수 있으며, 슬라이드를 정렬 만 종양 영역을 긁어. - 키트에 포함 된 제조업체의 유인물의 지시로 진행합니다.
- 흠 슬라이드에서 FFPE 조직으로 시작 (5-5에서 10 절 - 10 μm의 두께).
- BM 대기음 및 말초 혈액의 경우
- 이러한 사양은 제조업체의 지침 유인물에 따라 압축을 풉니 다.
참고 : 많은 상용 키트와 FFPE 조직과 세포에서 DNA 추출 방법이 있습니다. 실질적으로 모두 사용할 수 있습니다. 실험실에서 확립 된 방법을 사용합니다.- 200 μL 말초 혈액 (PB) 100 μL BM + 100 μL PBS를 사용합니다.
- 4 μL의 RNase 주식 솔루션을 사용합니다.
- 100 μL 용출 완충액으로 용출시켰다.
- 이러한 사양은 제조업체의 지침 유인물에 따라 압축을 풉니 다.
- DNA의 정량화
- (순수한 DNA 위해) 약 1.8 260 ㎚ / 280 nm의 비율을 보장하는 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 비가 상당히 낮은 경우, 하류 어플리케이션을 방해 할 수있는 단백질, 페놀, 또는 다른 오염 물질의 존재를 나타낼 수있다.
- 적합한 용출 완충액 100 NG / μL - 약 50 DNA의 농도를 조정.
PCR을 차단 2. 야생형
- 프라이머 디자인
- 이전에 따라 관심의 유전자 설계 및 취득 프라이머는 PCR 프라이머 디자인 (13)의 일반적인 가이드 라인을 설명했다. M13 감기를 포함하고 PCR 프라이머의 보편적 인 시퀀싱 프라이머를 역.
주 :에서 MyD88 세이에서 MyD88의 엑손 5를 증폭하기 위해 개발되었다 (G259 - N291) 5에 위치하고 있으며 110 개의 뉴클레오티드 '프라이머 인트론 4. 순방향의 접합 부위와 부품을 커버하고 리버스 인트론 영역은 5 설계된' -M13 시퀀스 (M13 포워드 : TGT ACG AAA GCC ACG AGT; M13 역 : CAG GAA ACA GCT ATG ACC)는 (재료 표 참조) 상보 시퀀싱 프라이머 어닐링을 허용한다.
- 이전에 따라 관심의 유전자 설계 및 취득 프라이머는 PCR 프라이머 디자인 (13)의 일반적인 가이드 라인을 설명했다. M13 감기를 포함하고 PCR 프라이머의 보편적 인 시퀀싱 프라이머를 역.
- 잠금 핵산 올리고 뉴클레오티드 디자인
- 돌연변이 보충이 요구되는 WT 템플릿 길이가 15 염기와 상보 - 약 10로 차단 된 올리고 뉴클레오티드를 설계한다.
주 : 짧은 올리고는 불일치 차별을 향상시킬 수 있습니다. 높은 목표 특이성을 달성하기 위해,이 매우 "끈끈한"올리고 뉴클레오타이드가 발생할 수 있기 때문에 너무 많이 차단 뉴클레오티드를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 콘텐츠와 길이 및 염기 차단 차단해야하는 특정 염기에 따라 최적화 될하도록해야한다. 이는 이차 구조를 손상 자기 상보성 위험없이 높은 결합 특이성을 달성하기 위해 중요하다. - 확장 temperat 위 15 °의 C - T 자에 10 m를 갖는 차단 올리고 설계열 순환 동안 URE. G 또는 C 염기 차단 - (4- 염기 3) 추가하거나 차단 염기를 제거하거나 긴 스트레치를 회피하면서 블로킹 DNA 염기 치환하여 T의 m을 조정한다.
- 올리고 도구 웹 사이트로 이동 (재료의 표 참조)하고 "올리고 Tm은 예측 차단"도구를 선택합니다.
- 은 "올리고 시퀀스"박스에 차단하고자하는 WT 템플릿의 서열을 붙이기. 차단 기지를 나타 내기 위해 기지 앞에 "+"추가합니다.
- DNA의 차단제 하이브리드 대략 T의 m을 결정하기 위해 "계산"버튼을 선택한다.
- 이차 구조의 형성 또는 자체 이량 체를 피하기 위해 차단 올리고을 디자인합니다.
- 올리고 도구 웹 사이트로 이동 (재료의 표를 참조) "올리고 최적화를 차단"도구를 선택합니다.
- 상자에 차단하고자하는 WT 템플릿의 서열을 붙이기. 기지를 차단 나타 내기 위해 기지 앞에 "+"추가합니다.
- "차 구조"와 "오직 자기"의 두 상자를 선택합니다. 문제를 일으킬 차 구조 또는 자체 이량 체의 올리고를 검토 할 수있는 분석 버튼을 누릅니다.
참고 : 점수는 T m의 이차 구조와 자기 이량 체의 매우 거친 견적을 나타냅니다. 낮은 점수 따라서 최적이며 차단제 차단제 쌍을 제한함으로써 달성 될 수있다. 아미노산 Q262-I266 다루도록 설계 및 기능 된 3'-가 반전에서 MyD88 [(TCAGA + AG + C +는 G +는 + C T + G + A + T + CC / invdT가 / +) MYD88blocker]의 차단 올리고 DT는 3'- 엑소 뉴 클레아 제에 의한 DNA 중합 효소에 의해 열화를 모두 확장을 억제한다. 이러한 특정 차단 올리고는 "+ N"으로 표시되어 열 개 차단 염기와 17mer이다. 나머지 7 개 염기는 일반적인 DNA 뉴클레오티드이다.
- 돌연변이 보충이 요구되는 WT 템플릿 길이가 15 염기와 상보 - 약 10로 차단 된 올리고 뉴클레오티드를 설계한다.
- WTB-PCR 설정 및 열 순환
- WTB-PCR 마스터 마일 준비X / 20 mM의 승의 MgCl 2, 250 개 μM의 dNTP를 0.2 μM 정방향 2.5 μL PCR 반응 완충액 10 배하여 (MMX) 및 역방향 프라이머, 1.2 μM MYD88blocker와 DNase를, RNAse가없는, 고순도의 H 2 O 최종를 만들 반응 당 21.75 μL 용액의 부피.
주 : 작업 농도 (DNA 템플릿과 폴리머의 첨가 후) 25 μL의 최종 반응 부피위한 것이다. 종래의 PCR MMX 단순히 차단의 추가를 생략하여 제조된다. 모든 프로토콜 단계는 WTB 기존 PCR 모두 동일하게 유지됩니다. 이 검증에 사용할 수 있으며, 결정 농축는 차단제의 첨가에 의해 달성했다.- MMX의 양을 산출 할 때 (오염 확인 양성 및 음성 대조군과 비 템플릿 제어) 및 피펫의 오류에 대하여 적어도 하나의 추가의 반응 3 개 추가의 반응을 고려하여 확인 제조 하였다.
- 철저하게 소용돌이 MMX. MMX는 불안하기까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다귀.
- MMX에 반응 당 0.25 μL의 Taq DNA 중합 효소를 추가하고 혼합하는 반전. 중합 효소는 MMX에 추가되면, 얼음에 보관하십시오.
- 각 웰에 효소 반응과 냉각 판과 피펫에 MMX 22 μL을 새로운 96 웰 PCR 플레이트를 넣어.
- 폴리머와 MMX를 함유하는 각각의 웰에 100 NG / μL - 3 μL 게놈 DNA (50 추가.
- 용액을 각 웰의 바닥에 닿을 수 있도록 플레이트 및 원심 간단히 인감.
- 열 순환기에 PCR 플레이트를로드합니다.
- 다음과 같이 WTB-PCR 반응을위한 열 순환 조건을 설정 : 초기 변성을 6 분 동안 95 ℃로; 1 분 20 초 동안 72 ° C에서 30 초 동안 56 ° C에서 30 초, 프라이머의 어닐링, 95 ℃에서 변성, 및 연장 40 사이클; 10 분 동안 72 ℃에서 최종 연장.
참고 : 모범 사례는 amplicon의 오염을 방지하기 위해 물리적으로 분리 된 지역에 프로토콜의 나머지 부분을 완성 포함 전n은 미래 설정.
- 다음과 같이 WTB-PCR 반응을위한 열 순환 조건을 설정 : 초기 변성을 6 분 동안 95 ℃로; 1 분 20 초 동안 72 ° C에서 30 초 동안 56 ° C에서 30 초, 프라이머의 어닐링, 95 ℃에서 변성, 및 연장 40 사이클; 10 분 동안 72 ℃에서 최종 연장.
- WTB-PCR 마스터 마일 준비X / 20 mM의 승의 MgCl 2, 250 개 μM의 dNTP를 0.2 μM 정방향 2.5 μL PCR 반응 완충액 10 배하여 (MMX) 및 역방향 프라이머, 1.2 μM MYD88blocker와 DNase를, RNAse가없는, 고순도의 H 2 O 최종를 만들 반응 당 21.75 μL 용액의 부피.
- WTB-PCR의 성공 여부를 결정하는과 비 템플릿 컨트롤의 증폭의 부족을 확인하기 위해 이전에 설명한 프로토콜 (14)에 따라 겔 전기 영동을 수행합니다.
- 자석 구슬에 의한 PCR 제품의 정제
- 4 ° C에서 자기 구슬을 제거하고 실온에 가져다.
- 새로운 PCR 플레이트에 10 μL PCR 제품을 전송합니다.
- 소용돌이는 자기 구슬 적극적 완전히 자기 입자를 재현 탁합니다.
- 새로운 플레이트에 각 웰에 18 μL에게 자기 구슬을 추가합니다. 피펫 10 배를 섞는다.
- 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
- 용액으로부터 분리 된 비드 2 분간 사이드 스커트 자석판 위에 PCR 플레이트를 놓는다.
- 비드 펠렛을 피하고, 다중 채널 피펫으로 상층 액을 흡인.
- 각 150 μL에 70 % 에탄올을 잘 분배하고, 실온 FO 부화적어도 30의 R. 멀티 채널 피펫과 에탄올을 대기음 및 팁을 폐기합니다. 다시 한번이 세척 절차를 반복합니다.
- 20 μL 멀티 채널 피펫 잘 각각의 나머지 에탄올을 대기음 및 팁을 폐기하여.
- 우물 (~ 10 분) 건조되면, 15 시간 또는 소용돌이 부드럽게를 자석 플레이트에서 제거하고 각 웰 피펫 믹스 40 μL에게 뉴 클레아없는 물을 추가합니다.
- 2 분 동안 실온에서 인큐베이션.
- 용액으로부터 분리 된 비드 1 분 동안 자석 플레이트 상 PCR 플레이트를 놓는다.
- 새로운 PCR 플레이트로 정제 된 생성물의 양도 35 μL. 이 정제 된 PCR 제품은 이제 양방향 시퀀싱을 진행 할 준비가 또는 필요할 때까지 -20 ° C에서 저장 될 수있다.
참고 : 새로운 분석을 개발할 때, 정제 된 PCR 산물의 정량화가 요구 될 수있다. 1 - NG / μL의 DNA 앰플 리콘 양방향 시퀀싱에 적합하다. 농도가 지속적으로 낮은 경우, PCR 제품 및 자기 구슬을 증가 proportionally (1 : 1.8). 농도가 지속적으로 높은 경우, 물을 더 큰 볼륨으로 용출.
WTB-PCR 제품의 3 연속
- 양방향 시퀀싱
참고 : 다음 프로토콜은 적은 시약을 사용하여 최적화 된 제조업체의 지침의 수정 된 형태이다.- 순방향 준비 및 역방향 시퀀싱 반응은 최종 용액을 만들기 위해 추가의 DNase, RNAse가없는, 고순도의 H 2 O 0.25 μL 레디 반응 혼합물 1.88 μL 시퀀싱 버퍼, 1.78 μM M13-F 또는 M13-R 시퀀싱 프라이머와 함께 혼합 반응 당 9 μL 부피. 이 염기 서열 반응 믹스 년까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 순방향 시퀀싱 반응을위한 새로운 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 순방향 시퀀싱 반응 혼합물의 9 μL 피펫. 역방향 시퀀싱 반응을위한 별도의 플레이트상에서 반복한다.
- 정제 된 WTB-PCR 제품 t의 1 μL를 추가O 각 웰에 순방향 및 역방향 모두 판.
- 용액을 각 웰의 바닥에 닿을 수 있도록 플레이트 및 원심 간단히 인감.
- 열 순환기에 PCR 플레이트를로드합니다.
- 다음 시퀀싱 반응을위한 열 순환 조건을 설정 : 1 분 동안 96 ° C 단계; 10 초 동안 96 ℃에서 30 사이클, 5 초 동안 50 ℃, 4 분 동안 60 ° C; 정제를위한 준비가 될 때까지 4 ° C에서 개최.
- 시퀀싱 제품을 정화
- 3M 아세트산 나트륨 (pH5.2), 100 % 에탄올의 신선한 1시 25분 용액을 준비한다.
- 신선한 70 % 에탄올 용액을 준비합니다.
- 아세트산 나트륨의 30 μL 서열 플레이트 피펫 믹스 5 배 순방향 및 역방향의 각 웰 / 100 % 에탄올 용액을 추가한다.
- 플레이트를 봉인하고 20 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 배양한다.
- 15 분 동안 2,250 XG에 플레이트를 원심 분리기.
- 플레이트의 봉인을 제거하고 폐기물을 통해 반전컨테이너.
참고 : 반전 한 번만 또는 펠렛이 잘 바닥에서 느슨해 질 수 있습니다. - 1 분 동안 150 XG에 깨끗한 종이 타월 및 원심 분리기의 반전 플레이트를 놓는다.
- 각 웰에 150 μL 70 % 에탄올을 추가합니다.
- 5 분 2,250 XG에서 플레이트 스핀을 다시 봉인.
- 반복 3.2.6와 3.2.7 단계를 반복합니다.
- 우물이 완전히 건조하지 않은 경우, 실온에서 건조 공기로 할 수 있습니다. 건조하면서 샘플을 빛으로부터 보호되어 있는지 확인합니다.
- 각 웰 피펫 믹스에 10 배를 10 μL 포름 아미드를 추가합니다. 플레이트를 다시 봉인.
- 5 분 동안 39 ° C이어서 3 분 동안 95 ℃의 열 순환기에 변성.
- 변성 후, 제조업체의 지침 15에 따라 시퀀싱 플랫폼에서 격막 및 순서와 함께 접시 실러를 교체합니다.
시퀀싱 결과 4. 분석
- 시퀀싱 DAT를 사용하여 시퀀싱 흔적을 시각화제조업체의 지침 (16)과 각각의 기준 서열 정렬에 따른 분석 소프트웨어. NCBI 참조 서열 "NM_002468"에서 MyD88에 정렬.
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Representative Results
확장시 WTB-PCR의 개념적 개관도 1에 제시된다. 블로커-DNA 하이브리드의 단일 염기 미스 매치가 크게의 용융 온도 감소하므로 (ΔT의 m = 20 - 30 °의 C)에서, WT 대립 유전자의 증폭을 돌연변이 주형 DNA는 확장자 (17)을 완료 할 수없는 상태에서 차단된다. WT 선형 DNA 증폭 동안 이러한 방식으로, 돌연변이 DNA를 기하 급수적으로 증폭된다.
WTB-PCR에 의해 달성 돌연변이 농축 시연은도 2에 제시된다. 와 돌연변이가없는 환자의 게놈 DNA를 테스트했다 재래식 WTB-PCR 후 WTB-PCR에 의해 달성 전형적인 농축 및 WT DNA에 잘못된 반응의 부족을 보여 염기 서열. WTB MMX-PCR에 사용 된 차단기의 작동 농도 적정 실험들에 의해 결정되어야위양성 결과 또는 전체적으로 WT DNA의 증폭을 차단하지 않으면 서 hould 돌연변이 요구되는 레벨의 농축을 달성한다. WTB-PCR 산물의 염기 서열 분석은 돌연변이 대립 유전자 농축 종래 PCR 3 16 %와 비교하여 WT의 배경 0.5 %, 돌연변이 대립 유전자를 초과 검출 한계를 보여준다.
임상 시험의 민감도의 증가의 효과는 시험 된 시료에서 종양 세포의 상대적인 양에 따라 변할 수있다. 방법 비교 연구에서, 여기에 설명 된 WTB-PCR 분석은 돌연변이에서 MyD88의 64 %를 WM MGUS 3 또는 환자의 통상적 인 시험 놓친 것이 입증되었다.
PCR 후 정수기 경우 차단기의 너무 높은 농도가 사용되는 경우 또는 신호 강도 (도 3)에서 이탈 특성이 종종 보여진다기 양방향 시퀀싱하기 전에 차단기를 제거하는 데 실패했습니다. 자성 비드 정제 효소의 정제를 대입하면 후자가 설명된다. 효소 정제 큰 시료 번호 작업 매력적인 옵션은 비록 그것이 용액에서 이전 순서에 차단기를 제거하는 데 실패, 그것은 WTB-PCR과 응용에 부적절한.
서열 아티팩트의 예가 빈번 시토신 탈 아미 노화의 결과 FFPE 유래 DNA에서 발견되는 (C : G> T : A),도 4 (3), 18, 19, 20에 나타내었다. 사이토 신 탈 아미노 실제 원인이 제대로 이해 되더라도, 돌연변이 대립 유전자 풍부 어떤 PCR 기초 분석법은 이러한 저주파 아티팩트 (21, 22)을 검출한다. 때문에 마약 단속반에 오탐 (false positive)mination은 고품질의 템플릿 물질로 시작하여 피할 수있다; 이것이 가능하지 않은 많은 경우에, 추출시 우라실 DNA 글리코 (UDG) 치료는 탈아 민화 생성물의 빈도와 강도를 제한하는데 도움이 될 수있다. 합니다 (FFPE DNA 키트의 일부로서) 추출시 FFPE 조직 UDG 소비세 처리하여 인위적으로 유도 C 방지 시토신 잔기 deaminated : G> T하십시오 돌연변이. 그러나 자주 CpG 디 뉴클레오티드에서 발생 -5- 메틸 시토신 잔기 UDG하여 절제 될 수없는 티민에 deaminated된다. 그 결과 시퀀싱 유물은 매우 인식하고도 4에서 알 수있는 바와 같이 종종 탠덤 돌연변이로 나타납니다. 샘플들은 이미 추출 된 경우 UDG 처리는 비교적 낮은 DNA 손실 이차 추출로 구현 될 수있다.
그림 1 : 개념 비켜WTB-PCR의 rview. 블로커-DNA 하이브리드의 단일 염기 미스 매치는 최대 30 ° C에 의한 T m을 감소시킨다. 블로킹 올리고 뉴클레오티드를 설계하는 단계 (10)의 T의 m 갖도록함으로써 - 확장 중 온도보다 15 ° C를 돌연변이 DNA의 증폭을 허용하면서, WT DNA의 증폭이 차단된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :와 돌연변이가없는 환자의 게놈 DNA를 테스트했다 재래식 WTB-PCR 후 WTB-PCR에 의해 달성 할 수있는 일반적인 농축을 입증하는 염기 서열. WTB-PCR을 달성하기 위해 사용되는 차단제의 최종 농도는 WT의 DNA에서 위양성을 유발하거나 amplifica을 차단하지 않으면 서 최대 돌연변이 농축을 달성하도록 선택 하였다완전히 WT DNA의 기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : 효소 PCR 정제 대신 자성 비드를 사용하는 경우 신호 강도 특성 이탈 볼. 효소 정제 양방향 시퀀싱 전에 차단기를 제거하지 못하기 때문에이 쉽다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 : C : G> T : 순서화 아티팩트 FFPE 조직에서 발생 시토신 또는 시토신이 메틸화되는 V deaminated각각 우라실 또는 티민에 IA 포르말린 고정. 우라실 DNA 글리코 (UDG)의 순서 아티팩트를 줄일 수 있도록 사전 WTB-PCR로 우라실을 절제 할 수 있습니다. 그러나, 자주의 CpG 섬 발생 deaminated -5- 메틸 시토신, 티민의 결과는 UDG하여 절개 될 수 없다. WTB-PCR에 사용되는 차단기의 농도를 낮추면 UDG 처리에 의해 해결할되지 시퀀싱 유물의 발생을 감소하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명 된 WTB-PCR 분석은 신장 (도 1) 동안 WT에 DNA의 증폭을 차단하기위한 차단 올리고 프라이머와 일반 세트를 사용한다. WTB-PCR 생성물은 돌연변이 염기 서열을 분석한다. WTB-PCR / 생어의 유틸리티는 단순, 높은 감도 및 높은 처리량에있다. 여기에 설명 된 지침을 사용하여, 대부분의 기존 생어 기반 분석은 단순히 크게 감도를 증가시키기 차단 올리고 뉴클레오티드의 추가를 통해 수정 될 수 있습니다. 여기에 제시된 실시 예 분석에서 PCR 단일 차단 올리고 뉴클레오티드의 첨가는 WTB-PCR 분석 3> 0.5 %의 통상적 인 분석에 대한 WT의 배경에서 약 16 % 돌연변이 대립 유전자의 검출 한계를 증가. 효과는 임상 시험 3 본 위음성의 64 % 감소된다. 에서 MyD88 돌연변이의 존재를 확인하는 것은 중요한 진단 및 예후 IMPL있다ications; 거짓 전반적인 치료와 환자 관리에 심각한 결과를 초래할 수 있습니다 부정적 사건을보고. WTB-PCR로 테스트하는 것은 특히 상대적으로 낮은 비정상 세포 수를 가진 환자에 따라서 매우 중요하다.
WTB-PCR 기술은 매우 다양하고 때로는 LNA, BNA 또는 PNA 매개 PCR 또는 PCR 클램핑 클램프 프로브 분석법 2, 4, 23, 24와 같은 의미로 언급된다. WTB-PCR을 이용하여 약간 변형은 각각의 특정 돌연변이 추가 형광 프로브를 설계 할 필요로 qPCR의 분석을 포함한다. 이 기술과 관련된 중요한 문제는 정확하게 WT 및 돌연변이 대립 유전자를 구별 경쟁적으로 결합 프로브를 개발할 필요가 포함되어 있습니다. 돌연변이 특정 프로브가 필요하기 때문에 또한,의 qPCR의 접근 방식은 알 수없는 mutatio을 감지 할 수있는 능력이 부족하다NS. 대립 유전자 특정 방식 WTB-PCR 블록 WT 증폭의 다른 변형 예. 대신 그러나 돌연변이 특이 프라이머를 사용하는의 WT 대립 유전자에 대한 차단 프로브 특정 바인딩 전체 프라이머를 억제한다. 이 방법은 qPCR에 같은 돌연변이 특정 프로브를 필요로하지 않지만, 그것은 증가 잘못된 반응으로 이어질 수 변이 및 중합 효소에 의한 오류를 구별하지 못합니다. PCR을 통해 이러한 폴리머 - 유도 에러의 지수 적 증폭은 드문 돌연변이 이벤트의 검출을 가릴 수있다. 돌연변이 풍부 PCR 증폭을 사용하는 방법은 PCR 오류 25, 26, 27의 주파수 정확도에 의해 제한되었다. 많은 다른 고감도 방법론 위에 WTB-PCR / 생거의 기본적인 장점은 WT 템플릿과 그 돌연변이 차단 oligonucleoti 의해 표적 유전자의 영역 외부에서 발생하는 돌연변이의 두 템플릿 증폭을 방지한다는 것이다드. 따라서, 폴리머에 의해 도입 된 에러 PCR 효과적으로 WT DNA와 함께 여과된다. 그러나 AS-PCR 또는 qPCR에 달리 농축은 차단 올리고 적용 지역 내에서 발생하는 알 수없는 돌연변이 유지됩니다. 에서 MyD88의 경우 WTB-PCR 모두 L265P 및 R264 * 돌연변이 (3)의 검출을 허용했다. 기타 유사 WTB-PCR 4, 28의 사용과 여러 낮은 주파수 변이의 검출을보고했다. 이 연구와 임상 목적을 모두 WTB-PCR에 이상적이다.
높은 감도 및 오탐 (false positive)을 제거하기위한 고유 한 내부 통제와 함께, 차단 설계 매우 몇 가지 추가 단계를 기존의 염기 서열 분석을 적응 WTB-PCR의 유연성 설립 분석 많은 실험실하기에 매력적인 옵션을합니다. 종래의 분석에 사용 된 PCR 프라이머의 동일한 세트는 일반적 WTB-PCR 변화에 사용될 수있다. OT매우 FFPE 조직하고 적절한 사후 PCR 정화의 UDG 처리 WTB-PCR을 포함하여 권장되는 그녀의 프로토콜 변경 동일하게 양도 방법은-있습니다. 차단 디자인 따라서 WTB-PCR 분석을 구현하는 중요한 요소이다. 이 프로토콜에 제시된 가이드 라인이 그 디자인에 가장 관련 요소를 나타내고 있지만, 다양한 차단 올리고 뉴클레오티드는 PCR에 보조 효과없이 효율적으로 일을 차단 WT 증폭을 찾기 위해 테스트해야합니다. 이는 추가의 또는 T m을 조정 차단제 염기 제거는 WT 템플릿 차단 올리고의 위치를 이동하고, 올리고의 전체 길이를 변경 포함한다. 차단 적정 실험은 시퀀싱 아티팩트 및 검출 한계 상 허용 발생 사이의 균형을 설정하는데 사용될 것이다.
분 세포 분획에 존재하는 돌연변이를 검출하기 위해 적절한 방법을 선택하는 일에 크게 의존전자 응용 프로그램과 질병 / 돌연변이 유형. 돌연변이 정량화를 원하는 경우, qPCR에 디지털 PCR은 WTB-PCR / 생거보다 더 실행 가능한 솔루션을 제공 할 수 있습니다. WTB-PCR은 정량적 분석은 주로이지만, 종래의 병렬 및 WTB-PCR로 샘플을 시험하여 돌연변이 대립 유전자 빈도를 대략적으로 결정할 수있다. 종래 분석법의 검출 한계는 10 ~이므로 - WT의 배경에 20 % 돌연변이 대립 유전자는, 그 돌연변이는 WTB-PCR 분석법에 의해 검출 된 것으로 결론 적합하지만 종래없는 한계 미만의 농도로 존재 종래의 분석에 대한 검출. 몇몇 분석은 WTB-PCR의 다양성, 단순성 및 견고성을 제공합니다. 낮은 비용과 짧은 처리 시간은 치료 후 잔여 질병을 평가하거나 치료하는 동안 새로운 저항 변이를 모니터링에 이상적이다. 또한, 이전에 undescribed 변이를 감지 할 수있는 능력은 연구 목적으로 WTB-PCR에 이상적이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) | Roche | 12032937001 | With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
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