Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Published: March 29, 2017 doi: 10.3791/55130
Automatic Translation
1, 1, 1
1NeoGenomics Laboratories

Abstract

גילוי וזיהוי מדויק של מוטציות בתדירות נמוכה יכול להיות בעייתי כאשר להערכת מחלת שיורי לאחר טיפול, בדיקות סקר לאיתור מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול, או כאשר יש מטופלים כמה תאים סרטניים במחזור. Wild-סוג חסימת PCR ואחריו לניתוח רצפי מציעה רגישות גבוהה, גמישות, ופשטות כמו מתודולוגיה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה אלה. על ידי הוספת מעוצבים בהתאמה אישית נעול oligonucleotide חומצות גרעין אל assay סידור חדש או בעבר הקים קונבנציונאלי המבוסס PCR, רגישויות של כ 1 אלל מוטנטי רקע של 1000 אללים WT יכולה להיות מושגת (1: 1000). חפצי רצף אירועים הקשורים דיאמינציה נפוצים ברקמות מוטבעות פרפין קבוע בפורמלין ניתן לתיקון חלקי על ידי שימוש glycosylase DNA אורציל במהלך שלבי חילוץ. הפרוטוקול המותאם כאן הוא ספציפי לזיהוי מוטצית MYD88, אך יכול לשמש כתבנית לעצב כלassay WTB-PCR. יתרונות של assay WTB-PCR מעל מבחני אחרים מנוצלים בדרך כלל לאיתור מוטציות בתדירות הנמוכה כולל אלל ספציפי PCR ו PCR כמוני בזמן האמת כוללים מופעים פחות של תוצאות חיוביות שגויות, גמישות רבה יותר וקלות ליישום, ואת היכולת לזהות הן ידוע ומוטציות ידועות.

Introduction

רצף סנגר באופן מסורתי את תקן הזהב בדיקות עבור שתי מוטציות סומטיות ידועים ובלתי ידועים. אחת המגבלות של רצף סנגר הוא הגבול של זיהוי שלה (~ 10 - אלל מוטנטי 20% בתוך רקע של WT) 1. רמה זו של רגישות אינה מתאימה לזיהוי מוטציות סומטיות ברמה הנמוכה שעשויה להיות נוכח דגימות מרקמות ממאירות או בחולים עם כמה תאים סרטניים במחזור, או כאשר מח עצם (BM), הוא מעשה טלאים. זה גם עושה הערכת מחלה שיורית לאחר טיפול או לגילוי מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול קשה על ידי רצף קונבנציונאלי בלבד 2. על ידי החלפת PCR קונבנציונאלי עם חומצות גרעין נעול (LNA) בתיווך wild-type חסימת PCR (WTB-PCR) ב רצף סנגר, רגישויות של עד 0.1 אלל מוטנטי% בתוך הרקע של WT ניתן להשיג 2, 3, 4. בשנתWTB-PCR, העשרה עבור אללים מוטנטים מושג באמצעות התוספת של קצר (~ 10 - 14 NT) חסימה (LNA) oligonucleotide שקושרה מעדיפים את WT DNA ובכך למנוע ההגברה של WT DNA. מוצר WTB-PCR מועשר המוטציה יכול להיות רצף אז. על ידי חסימת WT DNA ולא בחירת מוטציות ספציפיות WTB-PCR מאפשרת העשרה של שניהם מוטציות ידועות ובלתי ידועים הנוכחות שברי תא דקות.

שיטות מרובות כיום משמשות לזיהוי מוטציות שברי תאים קטנים. זה כולל מערכת מוטצית אלל ספציפי PCR, הגברה-עקשנית (נשק), denaturing כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (DHPLC), חרוזים, תחליבים, הגברה, ומגנטיות (קורן), שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM), ברזולוציה גבוהה נקודה ואחרים היתוך. עם זאת, רוב השיטות אלה מוגבלים-תוצאות חיוביות שגויות ואת היכולת לזהות רק מוטציה אחת כי assay תוכנן עבור 4 5, 6.

כאן אנו מדגימים את הגידול רגיש מושג על ידי WTB-PCR הקרנה עבור מוטציות בגן 88 גורם בידול מיאלואידית כפי שתואר על ידי Albitar ואח. 3 MYD88 mutatioNS הם גורמים אבחון פרוגנוסטי חשוב Macroglobulinemia של Waldenström (WM), gammopathy מונוקלונלי IgM בעל משמעות לא ידוע (IgM-MGUS), לימפומה אזור שוליים הטחול (SMZL), מפוזר לימפומה B-cell גדול (DLBCL). מוטציות MYD88 נמצאים כמעט בכל המקרים של WM וכ 50% מהחולים עם אימונוגלובולין M (IgM) -secreting MGUS. וחשוף, מוטציות MYD88 נמצאות רק 0-6% מחולים עם SMZL ו נעדרות מיאלומה נפוצה 7, 8. מכיוון מורפולוגיים חופפים, immunophenotypic, ציטוגנטית, ואת המאפיינים הקליניים בין WM ו- SMZL או מיאלומה נפוצה-IgM יכול לעתים קרובות לסבך אבחנות דיפרנציאלי, בנוכחות מוטציה MYD88 עשוי לשמש כגורם 9 זיהוי שימושי. מוטציות MYD88 גם קושרו עם נטל המחלה יותר בחולים עם DLBCL והישרדות כוללת עניים לאחר טיפול 7, 10. בנוסף, בגלל מוטציות MYD88 נמצאים בתדירות גבוהה יותר B-cell-like מופעל (ABC) DLBCL מ מרכז נבטי B-cell-like (GCB) DLBCL או לימפומה B-cell mediastinal העיקרי (PMBL), מצב המוטציה MYD88 עשויה לשמש סמן פונדקאי עבור תת ABC 11, 12.

הפרוטוקול המפורט הניתן כאן משמש כתבנית שממנו המבחנים חדשים ניתן לפתח או ברוב מבחני רצף הקיימים ניתן להתאים בקלות לזהות מוטציות בתדירות נמוכות במדויק סוגים שונים מדגמים. הגישה יכולה לשמש גם עבור ניטור ואיתור מוטציות עמידות שעשויות להתפתח גידולים או אפילו חיידקים שעלולים להתפתח תוך חולי מטופלים עם טיפול ממוקד או אנטיביוטיקה. יתר על כן, היא מתייחסת ותרופות רבות מהבעיות הקשורות להעשרת מוטציה, במיוחד משובץ-פרפין קבוע פורמלין (FFPE) רקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

משפט ואתיקה: כל הבדיקה של דגימות אנושיות בוצעה לאחר קבלת אישור דירקטוריון הסקירה המוסדית (IRB).

1. הפקת DNA מרקמות FFPE, דם היקפי, מח עצם לשאוב

  1. עבור רקמות FFPE מח עצם עם ערכת חילוץ DNA FFPE
    1. התחילו עם רקמת FFPE מן שקופיות בלא כתם (5 - 10 חלקים ב 5 - עובי 10 מיקרומטר).
      הערה: אם בתחילת שבבי רקמות, להשתמש 3 - 6 חלקים ב 5 - 10 מיקרומטר עובי ולעבור לשלב 1.1.6.
    2. מניחים שקופיות בסל שקופיות להכין ארבעה מאגרים לשטוף (שני עבור קסילן ושני עבור 100% אלכוהול). הוספת נפח מינימלי של 600 מ"ל של פתרון לכל סל.
    3. Deparaffinize את השקופיות על ידי ביצוע לשטוף קסילן 5 דקות במגש הראשון. העברת שקופיות למאגר לשטוף קסילן השני במשך דקות 5 נוספים.
    4. לאחר deparaffinization, לשטוף את השקופיות עם אלכוהול 100% עבור 5 דקות. העברת השקופיות השנייהמאגר לשטוף אלכוהול במשך דקות 5 נוספות.
    5. אפשר השקופיות להתייבש לחלוטין מתחת למכסה המנוע לפני מגרדת אותן בסכין גילוח לתוך צינור microcentrifuge.
      הערה: אם מגלשה H & E עם אזור גידול מצוין זמין, ליישר את המגלשות לגרד רק באזור הגידול.
    6. המשך עם הנחיות נדבת יצרנית כלולות בערכה.
  2. עבור BM לשאוב דם היקפי
    1. חלץ פי עלון הוראות היצרן עם מפרטים אלה.
      הערה: ישנם רבים זמינות מסחרי ערכות ושיטות להפקת DNA מרקמות FFPE ותאים. באופן מעשי, כל יכול לשמש. השתמש בשיטה זו הוא הקים את המעבדה.
      1. השתמש 200 דם היקפי μL (PB) או 100 μL BM + 100 μL PBS.
      2. השתמשו 4 μL RNase פתרון המניות.
      3. Elute עם חיץ elution 100 μL.
  3. כימות DNA
    1. מדדו ריכוזים DNA באמצעות ספקטרופוטומטר הבטחת יחס ננומטר 260 ננומטר / 280 של כ 1.8 (על דנ"א טהור). אם היחס הוא נמוך במידה ניכרת, זה עשוי להעיד על נוכחות של חלבון, פנול, או מזהמים אחרים שעשויים להפריע ליישומים במורד הזרם.
    2. התאם ריכוזי DNA לכ 50 - 100 ng / μL עם חיץ elution המתאים.

2. wild-type חסימת PCR

  1. עיצוב פריימר
    1. פריימרים תכנון להשיג עבור הגנים של עניין על פי שתואר לעיל הנחיות כלליות של עיצוב פריימר PCR 13. כולל M13-קדימה לאחור תחל רצף אוניברסלי פריימרים PCR.
      הערה: assay MYD88 פותחה כדי להגביר אקסון 5 של MYD88 (G259 - N291) ו 110 נוקלאוטידים ממוקם 5' באזור אינטרוניים כדי לכסות את אתר השחבור וחלק אינטרון 4. קדימה לאחור תחל נועדו עם 5' -M13 רצף (M13-קדימה: TGT aaa ACG ACG gcc AGT; M13-הפוך: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) כדי לאפשר חישול של פריימרים רצף משלים (ראו טבלה חומרים).
  2. נעול חומצות גרעין עיצוב oligonucleotide
    1. תכנן את oligonucleotide החסימה להיות כ 10 - 15 בסיסים באורך משלים את תבנית WT שבו העשרת מוטציה היא רצויה.
      הערה: אוליגו קצר ישפר אפלית חוסר התאמה. כדי להשיג יעד ספציפי גבוהה, חשוב לא להשתמש יותר מדי נוקלאוטידים חסימה מאז זה יכול לגרום oligonucleotide "דביק" מאוד. התוכן ואת אורך נוקלאוטיד חסימת צריך להיות לייעל פי נוקליאוטידים ספציפיים שצריכים להיות חסום. חשוב להשיג סגולי מחייב גבוהה מבלי להתפשר מבנה משני מסכן-השלמה עצמית.
    2. עיצוב אוליגו החסימה יש T מ '10 - 15 מעלות צלזיוס מעל הרחבה לטמפרטורותיור במהלך thermocycling. התאם את T m ידי הוספה או הסרת בסיסי חסימה או על ידי החלפת בסיסי חסימה עבור DNA תוך הימנעות ארוכה (3 - 4 בסיסים) של חסימת בסיסי G או C.
      1. נווט אל אתר האינטרנט כלי אוליגו (ראו טבלה של חומרים) ובחר באפשרות "חסימת אוליגו Tm חיזוי".
      2. הדבק את הרצף של תבנית WT כי הוא רצוי להיחסם לתיבה "רצף אוליגו". הוספה "+" מול בסיסי כדי לציין בסיסים חוסמים.
      3. בחר בלחצן "חשב" כדי לקבוע את m T המשוער של היברידי DNA-החוסמת.
    3. עיצוב אוליגו החסימה כדי למנוע היווצרות מבנה משנייה או-הדימרים עצמיים.
      1. נווט אל אתר אינטרנט כלי אוליגו (ראה טבלה של חומרים) ובחר את "ייעול אוליגו חסימה" הכלי.
      2. הדבק את הרצף של תבנית WT כי הוא רצוי להיחסם לתיבה. הוספה "+" מול בסיסי כדי לציין חסימת בסיסים.
      3. בחר את שתי הקופסאות עבור "המבנה המשני" ו "עצמי בלבד". לחץ על לחצן לנתח לסקור אוליגו עבור מבנים משניים בעייתיים פוטנציאלי או-הדימרים עצמיים.
        הערה: הציונים מייצגים הערכות גסות מאוד של "T מ 'ים של מבנים מהשניים-הדימרים עצמיים. ציונים נמוכים ולכן אופטימלית יכולים להיות מושגת על ידי הגבלת זיווג חוסם חוסם. Oligonucleotide חסימת עבור MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] נועד לכסות-I266 Q262 חומצות אמינו וכולל 3'-הפוכה dT לעכב הן הרחבה ידי DNA פולימרז והשפלה ידי 3'-exonuclease. אוליגו ספציפי חסימת זהו 17mer עם 10 בסיסי חסימה אשר מסומנים כמו "+ N". 7 הבסיסים הנותרים הם דנ"א רגיל.
  3. הגדרת WTB-PCR ו Thermocycling
    1. הכן מייל מאסטר WTB-PCRx (MMX) באמצעות חיץ התגובה 2.5 μL PCR 10x w / 20 מ"מ 2 MgCl, 250 מיקרומטר dNTPs, קדימה 0.2 מיקרומטר ו פריימר הפוכה, 1.2 מיקרומטר MYD88blocker ו DNAse, RNAse ללא, אולטרה-טהור H 2 O ליצור הסופי נפח פתרון של 21.75 μL לכל תגובה.
      הערה: ריכוזי עבודה הם עבור נפח התגובה הסופי של 25 μL (לאחר תוספת של תבנית דנ"א פולימראז). הקונבנציונלי PCR MMX מוכן פשוט על ידי השמטת התוספת של חוסם. כל צעדי הפרוטוקול נשארים זהים עבור שני WTB ו PCR הקונבנציונלי. זה יכול לשמש אימות והעשרה בקביעת מושגת על ידי תוספת של חוסם.
      1. בעת חישוב כמות MMX להכין לוודא לתת דין וחשבון על 3 תגובות נוספות (בקרות חיוביות ושליליות ושלט ללא תבנית כדי לבדוק זיהום) ולפחות 1 תגובה נוספת עבור השגיאה pipetting.
    2. וורטקס MMX ביסודיות. ה- MMX ניתן לאחסן -80 ° C עד ayאֹזֶן.
    3. מוסיפים 0.25 μL תקי DNA פולימראז לכל תגובה ל MMX ו להפוך לערבב. לאחר פולימראז נוספה אל MMX, לשמור אותו על הקרח.
    4. שים 96 חדש גם צלחת PCR על צלחת קרה פיפטה 22 μL של MMX עם פולימראז לתגובה כל טוב.
    5. להוסיף 3 הדנ"א הגנומי μL (50 - 100 ng / μL לכל אחד בארות המכיל את MMX עם פולימראז.
    6. חותם את בקצרה צלחת צנטריפוגות כדי להבטיח את הפתרון מגיע לתחתית של כל טוב.
    7. טען את הצלחת ה- PCR על thermocycler.
      1. קבע את תנאי thermocycling עבור תגובת WTB-PCR כדלקמן: denaturation הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות; 40 מחזורים של denaturation על 95 מעלות צלזיוס למשך 30 s, חישול תחל ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 s, והרחבה על 72 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה 20 שניות; הארכה סופית ב 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
        הערה: השיטה המומלצת כרוכה בהשלמת יתרת הפרוטוקול באזור נפרד פיזי כדי למנוע זיהום amplicon iהגדרות בעתיד n.
  4. בצעו ג'ל אלקטרופורזה פי פרוטוקולים תיאר בעבר 14 כדי לקבוע אם WTB-PCR היה מוצלח וכדי לאשר חוסר הגברה בבקרה הלא התבנית.
  5. טיהור של מוצרי PCR ידי חרוזים מגנטיים
    1. הסר חרוזים מגנטיים מ 4 מעלות צלזיוס ולהביא לטמפרטורת החדר.
    2. העבר 10 μL PCR המוצר לצלחת PCR חדש.
    3. וורטקס חרוזים מגנטיים במרץ כדי להשעות את החלקיקים המגנטיים במלואה.
    4. להוסיף 18 μL חרוזים מגנטיים היטב כל על הצלחת החדשה. פיפטה לערבב 10 פעמים.
    5. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    6. מניחים את צלחת PCR לצלחת מגנט בחצאיות צד עבור 2 דקות כדי חרוזים נפרד מפתרון.
    7. לשאוב supernatant עם טפטפת רב, הימנעות גלולה חרוז.
    8. לוותר 150 אתנול 70% μL לתוך זה היטב דגירה בטמפרטורת החדר FOr לפחות 30 s. לשאוב את אתנול עם טפטפת רב וזורקים טיפים. חזור על הליך זה לשטוף פעם נוספת.
    9. בעזרת פיפטה רבה 20 μL לשאוב אתנול הנותר מכל טובה וזורקי טיפים.
    10. ברגע בארות יבשות (~ 10 דקות), לפנות מהצלחת מגנט ולהוסיף 40 μL מים nuclease ללא כל תערובת היטב פיפטה 15 פעמים או מערבולת בעדינות.
    11. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    12. מניח את צלחת PCR לצלחת שואבת 1 דקות כדי חרוזים נפרדים מפתרון.
    13. העברה 35 μL של מוצר מטוהר לצלחת PCR חדשה. זהו מוצר PCR מטוהר הוא עכשיו מוכן להמשיך עם רצף דו-כיווני או ניתן לאחסן -20 ° C עד צורך.
      הערה: כאשר לפיתוח assay חדש, כימות של מוצר מטוהר PCR שתידרש. 1 - 3 ng / DNA amplicon μL הוא אופטימלי עבור סידור דו-כיוונית. אם ריכוז נמוך באופן עקבי, להגדיל PCR המוצר מגנטי חרוזים proportionally (1: 1.8). אם הריכוז גבוה באופן עקבי, elute עם נפח גדול יותר של מים.

סידור 3. של מוצרי WTB-PCR

  1. סידור בכיווניות
    הערה: הפרוטוקול הבא הוא צורה שונה של הוראות היצרן, כי כבר מותאמת לשימוש ריאגנטים פחות.
    1. כן קדימה הפוך תגובת סידור מתערבבת עם 0.25 μL המוכן לערבב תגובה, 1.88 חוצץ רצף μL, 1.78 מיקרומטר M13-F או M13-R פריימרים רצף ולהוסיף ו DNAse, RNAse ללא, אולטרה-טהור H 2 O כדי ליצור פתרון סופי נפח של 9 μL לכל תגובה. תערובת תגובת סידור זה ניתן לאחסן -20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה.
    2. פיפטה 9 μL של תמהיל תגובת סידור קדימה לבאר כל צלחת 96 חדשה היטב PCR עבור תגובת הסידור קדימה. חזור על צלחת נפרדת עבור תגובת הסידור ההפוכה.
    3. להוסיף 1 μL של t המוצר WTB-PCR מטוהריםo כל טוב הוא קדימה ולהפוך וצלחות.
    4. חותם את בקצרה צלחת צנטריפוגות כדי להבטיח את הפתרון מגיע לתחתית של כל טוב.
    5. טען את הצלחת ה- PCR על thermocycler.
      1. קבע את תנאי thermocycling עבור תגובת הסידור כדלקמן: 96 מעלות צלזיוס למשך 1 דקה; 30 מחזורים של 96 מעלות צלזיוס למשך 10 s, 50 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים, 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות; להחזיק ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן טיהור.
  2. לטהר מוצרי רצף
    1. כן פתרון 01:25 טרי של 3 M יצטט נתרן (5.2 pH) ו 100% אתנול.
    2. כן פתרון אתנול 70% טרי.
    3. להוסיף 30 μL של נתרן אצטט / 100% פתרון אתנול היטב כל שני קדימה ולהפוך וצלחות רצף פיפטה לערבב 5 פעמים.
    4. יש לחתום מחדש את הצלחת דגירה בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
    5. צנטריפוגה את הצלחת ב 2250 XG במשך 15 דקות.
    6. הסר את אוטם הצלחת להפוך מעל בזבוזמְכוֹלָה.
      הערה: היפוך רק פעם או גלולה עשויה לרופף מתחתיות היטב.
    7. מניחים את צלחת הפוכה על מגבת נייר צנטריפוגה נקי ב XG 150 עבור 1 דקות.
    8. הוספת 150 μL 70% אתנול היטב כל אחד.
    9. יש לחתום מחדש את הצלחת ספין על 2250 XG במשך 5 דקות.
    10. חזור על שלבים 3.2.6 3.2.7.
    11. אם הבארות אינן יבשות לחלוטין, לאפשר להם להתייבש באוויר בטמפרטורת חדר. ודא הדגימות מוגנות מפני אור תוך ייבוש.
    12. להוסיף 10 μL Formamide לכל לערבב היטב פיפטה 10 פעמים. יש לחתום מחדש את הצלחת.
    13. לפגל על ​​thermocycler ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ואחריו 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    14. לאחר denaturing, להחליף את אוטם צלחת עם המחיצה ורצף על פלטפורמת סידור על פי הוראות היצרן 15.

ניתוח 4. תוצאות רצף

  1. דמיינו עקבות רצף באמצעות DAT סידורתוכנה לניתוח על פי הוראות יצרן 16 וליישר את רצפי התייחסות בהתאמה. יישר MYD88 כדי רצף ההתייחסות צמח השדה "NM_002468".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

סקירה מושגית של WTB-PCR במהלך ההארכה מוצגת באיור 1. בגלל חוסר התאמה של נוקלאוטיד יחיד ההיברידי החוסם-DNA מקטינה טמפרטורת ההתכה שלה מאוד (ΔT מ = 20 - 30 מעלות צלזיוס), הגברה של אלל WT חסום בזמן DNA תבנית מוטציה אינה כרוכה בתשלום כדי להשלים ארכה 17. באופן זה, ה- DNA מוטציה מוגבר אקספוננציאלית בזמן WT דנ"א מוגבר באופן ליניארי.

הפגנה של העשרת המוטציה המושגת על ידי WTB-PCR מוצגת באיור 2. הדנ"א הגנומי חולה עם ובלי מוטציות נבדק על ידי קונבציונאלי WTB-PCR ולאחר מכן רצף כדי להדגים את ההעשרה טיפוס השגה על ידי WTB-PCR וחוסר חיוביות שגויה ב WT DNA. ריכוז העבודה של חוסם המשמש WTB-PCR MMX צריך להיקבע על ידי ניסויי טיטרציה ו יםhould להשיג את הרמה הרצויה של העשרת מוטציה בעוד לא וכתוצאה מכך תוצאות חיוביות שגויות או חסימת הגברה של WT DNA לחלוטין. סידור ניתוח של מוצר WTB-PCR מדגים העשרה אלל מוטנטי ומגבלה של זיהוי העולה אלל מוטנטי 0.5% בשנת רקע של WT לעומת 16% ב PCR 3 קונבנציונאלי.

ההשפעות של גידול זה רגישות בבדיקה קלינית עשויות להשתנות בהתאם לכמות היחסית של תאי נאופלסטיות בדגימות שנבדקו. במחקר שיטות השוואה, assay WTB-PCR המתואר כאן הוכיח כי 64% של מוטציות MYD88 יורגשו על ידי בדיקות קונבנציונליות של חולים עם WM או MGUS 3.

ירידה- off מאפיין בעוצמת אות (איור 3) נתפס לעתים קרובות אם גבוה מדי ריכוז של חוסם משמש או אם פוסט-PCR purification הצליח להסיר חוסם לפני הרצף דו-כיוונית. זה האחרון הוכיח כאשר טיהור חרוז מגנטית מוחלפת עבור טיהור האנזימטית. למרות טיהור האנזימטית היא אופציה אטרקטיבית כאשר עובדים עם מספרים מדגם גדול יותר, אין זה ראוי ליישום עם WTB-PCR כפי שהוא מצליח להסיר חוסם מפתרון לפני ריצוף.

דוגמה חפצים רצף נמצא לעיתים קרובות DNA FFPE הנגזרות כתוצאה ציטוזין דיאמינציה (C: G> T: א) מוצגים באיור 4 3, 18, 19, 20. למרות הסיבות בפועל של דיאמינציה ציטוזין הם הבינו היטב, כל assay המבוסס PCR מעשיר עבור אללים מוטנטים יזהה חפצים בתדירות הנמוכים אלה 21, 22. תוצאות חיוביות שגויות עקב DEAmination נמנע טוב ביותר על ידי הפעלה עם חומר תבנית באיכות גבוהה; במקרים רבים בהם הדבר אינו אפשרי, טיפול עם glycosylase DNA אורציל (UDG) במהלך החילוץ יכול לסייע הגבלת התדירות והעוצמה של חפצים דיאמינציה. UDG לטיפול ברקמת FFPE במהלך החילוץ (כחלק של ערכת DNA FFPE) בלו deaminated שאריות ציטוזין ובכך למנוע C המושרה באופן מלאכותי: G> T: A מוטציות. עם זאת, 5-methylcytosine שאריות המתרחשות בתדירות גבוהה בבית dinucleotides CPG הם deaminated כדי תימין, אשר לא ניתן נכרת על ידי UDG. ממצאי הסידור וכתוצאה מהן אינם מוכרים למדי ולעתים קרובות מופיעים כמו מוטציות טנדם כפי שניתן לראות באיור 4. אם דגימות כבר חילוץ, טיפול UDG יכול להיות מיושם חילוץ משני עם אובדן DNA נמוך יחסית.

איור 1
איור 1: אובה רעיוניתrview של WTB-PCR. חוסר התאמה של נוקלאוטיד יחיד ההיברידי-DNA החוסם פוחתת T מ בשיעור של עד 30 מעלות צלזיוס. על ידי תכנון oligonucleotide חסימת יש T מ 'של 10 - 15 מעלות צלזיוס מעל לטמפרטורה במהלך הארכה, הגברה של WT DNA חסומה ובמקביל לאפשר הגברה של DNA מוטציה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: הדנ"א הגנומי חולה עם ובלי מוטציות נבדק על ידי קונבציונאלי WTB-PCR ולאחר מכן רצף כדי להדגים את ההעשרה טיפוס השגה על ידי WTB-PCR. הריכוז הסופי של חוסם המשמש להשגת WTB-PCR נבחר כדי להשיג העשרה מוטציה מקסימלית בזמן לא גרימת תוצאות חיוביות שגויות ב DNA WT או חסימת amplification של WT DNA לחלוטין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: מאפיין החזרה בעוצמת אות לראות כאשר טיהור אנזימטי PCR משמשת במקום חרוזים מגנטיים. הסיבה לכך היא כנראה טיהור אנזימטי לא מצליחה להסיר חוסם לפני הרצף דו-כיוונית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: C: G> T: A חפצים סידור להתעורר ברקמת FFPE כאשר ציטוזין או ציטוזין מפוגל הם deaminated נקיבוע בפורמלין IA כדי אורציל או תימין, בהתאמה. אורציל DNA glycosylase (UDG) יכול לכרות אורציל לפני WTB-PCR עוזר להפחית חפצים רצף. עם זאת, תימין הנובעים 5-methylcytosine deaminated, אשר מתרחשת בתדירות גבוהה על איים CPG, לא ניתן נכרת על ידי UDG. הקטנת הריכוז של חוסם המשמש WTB-PCR עשויה לעזור להפחית את ההתרחשות של חפצי סידור כי לא יתוקנו על ידי טיפול UDG. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

את assay WTB-PCR המתואר כאן משתמשת בסדרה הגנרית של פריימרים עם אוליגו חסימת נועד לחסום הגברה של DNA WT במהלך הארכה (איור 1). מוצר WTB-PCR הוא רצף אז עבור ניתוח מוטאציות. כלי השירות של WTB-PCR / סאנגר טמון בפשטותה, רגישות גבוהה, ו-תפוקה גבוהה. באמצעות ההנחיות המתוארות כאן, רוב מבחני הקיימים המבוססים סאנגר ניתן לשנות בפשטות באמצעות תוספת של oligonucleotide חסימת להגדיל בהרבה רגישות. ב assay בדוגמה המוצגת כאן תוספת של oligonucleotide חסימת יחיד PCR הגדילה את המגבלה של זיהוי מכ אלל מוטנטי 16% בתוך הרקע של WT עבור assay קונבנציונלי> 0.5% ב assay WTB-PCR 3. השפעת המהווה הפחתת 64% ב שלילי שווא לראות ניסויים קליניים 3. המאשר את נוכחותו של מוטציות MYD88 יש impl אבחון פרוגנוסטי משמעותיications; דיווח כוזב מקרה כשלילי עלולים להיות השלכות חמורות על טיפול הכולל וניהול חולה. בדיקה עם WTB-PCR ולכן הוא בעל חשיבות רבה, במיוחד בחולים עם cellularity החריג נמוך יחסית.

טכניקות WTB-PCR להשתנות במידה ניכרת ולפעמים מכונות לסירוגין עם LNA, BNA, או הידוק PCR בתיווך PNA או מבחני PCR מהדק-Probe 2, 4, 23, 24. כמה וריאציות ניצול WTB-PCR כרוך assay qPCR המצריך תכנון בדיקת ניאון נוסף עבור כל מוטציה ספציפית. אתגר משמעותי הקשורים טכניקה זו כוללת את הצורך לפתח חלליות מחייב תחרותי המפלים במדויק בין אללים WT ו מוטציה. יתר על כן, מכיוון בדיקה ספציפית מוטציה נדרשה, גישת qPCR חסרה את היכולת לזהות mutatio הידועNS. עוד וריאציה של הגברת WT בלוקי WTB-PCR באופן אלל ספציפית. במקום להשתמש פריימרים ספציפיים מוטציה זאת, ספציפית חסימת בדיקה עבור אלל WT מעכב תחל שלם מחייב. גישה זו אמנם אינה מחייבת בדיקה ספציפית-מוטציה כמו qPCR, זה לא מצליח להבדיל בין מוטציות שגיאות המושרה פולימראז יכול להוביל חיוביות שגויות מוגברות. הגברת מעריכים של שגיאות מושרות אלה פולימראז באמצעות PCR עלולה לטשטש את זיהוי של אירועים מוטאציות נדירים. כל גישה המשתמשת הגברת PCR להעשיר עבור מוטציות יש הדיוק שלה מוגבלת על ידי התדירות של שגיאות PCR 25, 26, 27. יתרון בסיסי של WTB-PCR / סאנגר מעל מתודולוגיות רגישות גבוהה רבה אחרת הוא שהוא מונע הגברה של שניהם תבנית WT ו מוטנטים תבנית אשר מוטציות המתרחשים מחוץ לאזור הגן הממוקד ידי oligonucleoti החסימהדה. לכן, שגיאות PCR הציג polymerases מסוננות החוצה ביעילות יחד עם WT DNA. אולם בניגוד AS-PCR או qPCR, העשרה נשמרת עבור מוטציות ידועות המתרחשות בתוך האזור המכוסה על ידי אוליגו החסימה. במקרה של MYD88, WTB-PCR אפשר זיהוי של שתי מוטציות L265P ו R264 * 3. אחרים באופן דומה דיווחו על הגילוי של מוטציות רבות, בתדירות נמוכה עם שימוש WTB-PCR 4, 28. זה עושה WTB-PCR אידיאלי הוא למטרות מחקר קליניות.

יחד עם רגישות גבוהה ובקרות פנימיות טבועות עבור ביטול תוצאות חיוביות שגויות, הגמישות של WTB-PCR עבור בהתאמת assay רצף קיים עם צעדים נוספים מעט מאוד עם עיצוב חוסם להפוך אותו לאופציה אטרקטיבית עבור מעבדות רבות עם מבחנים הוקמו. את אותה קבוצה של פריימרים PCR משמש assay קונבנציונלית בדרך כלל ניתן להשתמש בוריאציה WTB-PCR. otשינויים בפרוטוקול לה כי הם המומלצים ביותר עבור WTB-PCR-כולל טיפול UDG של רקמות FFPE וטיהור פוסט-PCR מתאים מתודולוגיות-הם להעברה באופן שווה. עיצוב חוסם, ולכן הוא מרכיב קריטי ביישום assay WTB-PCR. למרות ההנחיות שהוצגו בפרוטוקול זה מייצגים את הגורמים הרלוונטיים ביותר בעיצוב כי, oligonucleotides חסימה שונה צריך להיבדק כדי למצוא אחד כי הגברה בלוקים WT ביעילות ללא תופעות משניות PCR. זה כולל הוספה או סר של בסיסים חוסמים להתאים T מ ', הסטה את מיקומה של אוליגו חסימה לתבנית WT, ושינוי אורכו הכולל של אוליגו. ניסויי טיטרציה חוסמים צריכים להיות מועסקים גם להקים איזון בין מופעים המקובלים של חפצי סידור ולהגביל של זיהוי.

בחירת מתודולוגיה מתאימה לאיתור מוטציות שנמצאות שברי תא דקים מאוד תלויה היישום דואר וסוגי מחלות / מוטציה. אם כימותי מוטציה הוא רצויים, qPCR או הדיגיטלי PCR עשוי להציע פתרונות קיימא יותר WTB-PCR / סנגרתי. למרות WTB-PCR הוא assay איכותי בעיקר, אפשר לקבוע הערכה גסה של תדירות אלל מוטנטי ידי בדיקת מדגם עם קונבנציונאלי WTB-PCR במקביל. בגלל המגבלה של זיהוי עבור assay הקונבנציונלי היא ~ 10 - 20% אלל מוטנטי רקע של WT, ראוי להסיק כי מוטציות זוהו על ידי assay WTB-PCR אך לא הקונבנציונלי נוכחים בריכוז נמוך מהמגבלה של זיהוי עבור assay הקונבנציונלי. מבחני מעטים מציעים את הגמישות, הפשטות, וחוסנם של WTB-PCR. העלות הנמוכה וזמן אספקה ​​קצר הופכים אותו לאידיאלי עבור הערכת מחלה שיורית לאחר טיפול או מעקב אחר מוטציות עמידות המתעוררות במהלך טיפול. בנוסף, היכולת לזהות מוטציות שטרם תוארו בעבר לעשות WTB-PCR אידיאלי למטרות מחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes Eppendorf 05-402-25
100% alcohol VWR 89370-084 Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer ABI or equivalent
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils GeneMate T-2451-1 For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit Life Technologies 4337455 For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series Eppendorf A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates Eppendorf Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM) Invitrogen 10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027 For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute  Sigma E7023 200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) Roche 12032937001 With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus 2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit  Qiagen 180134 Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide ABI 4311320 For sequencing.
LNA oligonucleotide Exiqon 500100 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer ABI 5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer ABI 5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler Eppendorf E950030020
Microcentrifuge Model 5430 Eppendorf FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer IDT 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer IDT 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates GeneMate T-3107-1
Pipettors 20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well ABI 4315933
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304 For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0 ABI 4474978 For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)  Sigma S7899
Sterile filtered pipette tips 20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C  Eppendorf 5382000023
Vortex genie Scientific Industries SI-0236
Wash reservoir ~ 1,000 mL
Xylene VWR 89370-088 Histology grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
  3. Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
  4. Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
  5. Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
  6. Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
  7. Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
  8. Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
  9. Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
  10. Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
  11. Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
  12. Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
  13. Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  15. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
  16. Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
  17. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
  18. Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
  19. Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
  20. Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
  21. Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
  22. Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
  23. Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
  24. Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
  25. Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
  26. Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
  27. Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
  28. Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 121 WTB-PCR wild-type חסימת PCR חסימת oligonucleotide רגישות גבוהה ריצוף מוטציה FFPE MYD88 Macroglobulnemia של Waldenström מפוזר לימפומה של תאי B גדולים
חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M.… More

Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter