Abstract
A detecção precisa e identificação de mutações de baixa frequência pode ser problemática quando se avalia doença residual após terapia, o rastreio de mutações de resistência emergente durante a terapia, ou quando os pacientes têm poucas células tumorais circulantes. De tipo selvagem bloqueio de PCR seguido por análise de sequenciação oferece alta sensibilidade, flexibilidade e simplicidade como uma metodologia para detectar essas mutações de baixa frequência. Ao adicionar um projetado bloqueado oligonucleótido ácido nucleico para um ensaio de sequenciação baseada em PCR convencional novo ou previamente estabelecida, sensibilidades de aproximadamente um alelo mutante de um fundo de 1.000 alelos WT pode ser conseguida (1: 1000). artefactos de sequenciação associados com eventos de desaminação comumente encontrados em tecidos embebidos em parafina fixados com formalina pode ser parcialmente remediada pela utilização de glicosilase de uracilo de ADN durante os passos de extracção. O protocolo optimizado aqui é específico para a detecção de mutação MyD88, mas pode servir como um modelo para conceber qualquerensaio WTB-PCR. As vantagens do ensaio de WTB-PCR em relação a outros ensaios vulgarmente utilizados para a detecção de mutações de baixa frequência, incluindo alelo específico PCR e PCR em tempo real quantitativo incluem menos ocorrências de falsos positivos, maior flexibilidade e facilidade de aplicação, e a capacidade para detectar tanto conhecida e mutações desconhecidas.
Introduction
Sanger de sequenciação tem sido, tradicionalmente, o padrão de ouro em ambos os testes para mutações somáticas conhecidos e desconhecidos. Uma das limitações de Sanger de sequenciação é o seu limite de detecção (~ 10 - 20% alelo mutante em um fundo de WT) 1. Este nível de sensibilidade é inadequado para a detecção de mutações somáticas de baixo nível, que podem estar presentes em amostras a partir de tecidos pré-malignas ou doentes com algumas células tumorais em circulação, ou quando a medula óssea (BM) é irregular. Isto também faz com que a avaliação de doença residual após terapia ou detecção de mutações resistentes emergentes durante a terapia difícil por sequenciação convencional sozinho 2. Através da substituição de PCR convencional com ácido nucleico bloqueado (LNA) mediada de tipo selvagem bloqueio de PCR (WTB-PCR), na sequenciação de Sanger, sensibilidades de até 0,1% alelo mutante em um fundo de WT pode ser obtida 2, 3, 4. DentroWTB-PCR, o enriquecimento para os alelos mutantes é conseguido através da adição de uma pequena (~ 10-14 NT) de bloqueio (LNA) oligonucleótido que se liga preferencialmente ao ADN WT impedindo assim a amplificação de ADN WT. O produto WTB-PCR enriquecido mutante pode em seguida ser sequenciados. Ao bloquear ADN WT em vez de seleccionar para mutações específicas WTB-PCR permite o enriquecimento de ambas as mutações conhecidas e desconhecidas presentes em fracções celulares hora.
Vários métodos são actualmente utilizados para a detecção de mutações em fracções de células pequenas. Isto inclui por PCR, do sistema específico de alelo amplificação refractário mutação (ARMS), desnaturante cromatografia líquida de alta eficiência (DHPLC), grânulos, emulsões, amplificação, e magnetos (radiante), libertação induzida por um campo eléctrico e de medição (Efirm), de alta resolução ponto de fusão e outros. No entanto, a maioria desses métodos são limitados por falsos positivos e a capacidade de detectar apenas uma mutação que o ensaio foi concebido para quatro 5, 6.
Aqui demonstramos o aumento da sensibilidade obtida por WTB-PCR em rastreio de mutações no gene de diferenciação mielóide factor de 88, tal como descrito por Albitar et al. Mutatio 3 MyD88ns são factores de diagnóstico e prognóstico importantes em Macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), IgM monoclonal gamopatia de significado desconhecido (IgM-MGUS), linfoma da zona marginal esplénica (SMZL), e linfoma difuso de grandes células B (DLBCL). MyD88 mutações são encontrados em quase todos os casos de WM e aproximadamente 50% dos pacientes com Imunoglobulina M (IgM) secretores MGUS. Em contraste, as mutações MyD88 são encontrados em apenas 0-6% dos doentes com SMZL e estão ausentes no mieloma múltiplo 7, 8. Porque morfológica sobreposição, imunofenotípicas, citogenética, e características clínicas entre WM e SMZL ou mieloma múltiplo IgM muitas vezes pode complicar o diagnóstico diferencial, a presença de uma mutação MyD88 pode servir como um factor de identificação útil 9. MyD88 mutações também têm sido associadas com uma maior carga da doença em pacientes com DLBCL e sobrevivência global pobre seguintes terapia 7, 10. Além disso, porque as mutações MyD88 são mais frequentemente encontrados na célula B semelhante (ABC) DLBCL activada do que o centro germinal B-célula-like (GCB) DLBCL ou linfoma de células B do mediastino primário (PMBL), estado de mutação MyD88 pode servir como um marcador substituto para o subtipo de ABC 11, 12.
O protocolo detalhado fornecida aqui serve como um molde a partir do qual novos ensaios podem ser desenvolvidos ou a maioria dos ensaios de sequenciação existentes podem ser facilmente adaptadas para detectar com precisão as mutações de baixa frequência em vários tipos de amostras. A abordagem também pode ser utilizada para monitorar e detectar mutações resistentes que podem desenvolver-se tumores ou mesmo bactérias que podem desenvolver enquanto os pacientes estão a ser tratados com terapia direcionada ou antibióticos. Além disso, aborda e remédios muitos dos problemas associados com o enriquecimento de mutação, especialmente no tecido embebido em parafina fixado em formalina (FFPE).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Declaração de Ética: Todos os testes de amostras humanas foi realizada após a obtenção Institutional Review Board aprovação (IRB).
1. Extracção de DNA a partir de FFPE tecido, sangue periférico, medula óssea e Aspirar
- Para osso tecido FFPE medula com o kit de extracção de ADN FFPE
- Comece com o tecido FFPE de lâminas não coradas (5 - 10 em secções de 5 - 10? M de espessura).
NOTA: Se início com aparas de tecido, usar 3 - 6 secções de 5 - 10? M de espessura e avance para o passo 1.1.6. - Colocar as lâminas em um carrinho deslizante e preparar quatro reservatórios de lavagem (duas por xileno e duas para 100% de álcool). Adicionar um volume mínimo de 600 ml de solução para cada carrinho.
- Desparafinar as lâminas fazendo uma lavagem de xileno 5 min na primeira bandeja. Transferir as lâminas para o segundo reservatório de lavagem xileno durante um adicional de 5 min.
- Após desparafinizao, lavar as lâminas com uma álcool 100% durante 5 min. Transferir as lâminas para a segundareservatório de lavagem de álcool durante um adicional de 5 min.
- Permitir que as lâminas secar completamente sob uma capa antes raspando-as com uma lâmina de barbear para um tubo de microcentrífuga.
NOTA: Se um slide de H & E com a região do tumor indicado está disponível, alinhar as lâminas e raspar apenas a região do tumor. - Prossiga com as instruções do fabricante folheto incluídos no kit.
- Comece com o tecido FFPE de lâminas não coradas (5 - 10 em secções de 5 - 10? M de espessura).
- Para BM aspirado e sangue periférico
- Extracto de acordo com as instruções folheto do fabricante com estas especificações.
NOTA: Existem numerosos conjuntos e métodos de extracção de ADN a partir de tecidos e células FFPE disponíveis comercialmente. Praticamente, todos podem ser utilizados. Use um método que é criada em laboratório.- Use 200 uL de sangue periférico (PB) ou 100 ul BM + 100 uL de PBS.
- Use 4 uL de RNase A solução estoque.
- Eluir com 100 mL de tampão de eluição.
- Extracto de acordo com as instruções folheto do fabricante com estas especificações.
- Quantificação de DNA
- Medir as concentrações de ADN, utilizando um espectrofotómetro de assegurar um / A280 nm 260 nm de aproximadamente 1,8 (para o ADN puro). Se a proporção é sensivelmente menor, que pode indicar a presença de proteína, de fenol, ou outros contaminantes que podem interferir com as aplicações a jusante.
- Ajustar as concentrações de ADN de, aproximadamente, 50 - 100 ng / mL com tampão de eluição adequado.
2. Bloqueio de Tipo Selvagem de PCR
- projeto Primer
- Concepção e obtenção de iniciadores para genes de interesse de acordo com o anteriormente descrito orientações gerais do projecto de iniciador de PCR 13. Incluem-M13 para frente e reverso iniciadores de sequenciação universais em iniciadores de PCR.
NOTA: O ensaio de MyD88 foi desenvolvido para amplificar o exão 5 de MyD88 (G259 - N291) e 110 nucleótidos localizados na região 5' intrónica para cobrir o local de splicing e parte do intr 4. O directo e inverso foram concebidos iniciadores com um 5' -M13 sequência (H13-forward: tgt aaa ACG ACG gcc agt; M13-reverso: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) para permitir a hibridação dos iniciadores de sequenciação complementares (ver Materiais Tabela).
- Concepção e obtenção de iniciadores para genes de interesse de acordo com o anteriormente descrito orientações gerais do projecto de iniciador de PCR 13. Incluem-M13 para frente e reverso iniciadores de sequenciação universais em iniciadores de PCR.
- Ácido nucléico bloqueado Oligonucleotide projeto
- Desenhar o oligonucleótido de bloqueio para ser de aproximadamente 10 - 15 bases de comprimento e complementar ao modelo WT, onde é desejado o enriquecimento mutante.
NOTA: Um oligo mais curto irá melhorar a discriminação incompatibilidade. Para alcançar alta especificidade alvo, é importante para não usar demais nucleotídeos bloqueio pois isso pode resultar em um oligonucleotídeo muito "pegajoso". O conteúdo e o comprimento de nucleótidos e bloqueio deve ser optimizar de acordo com as sequências de nucleótidos específicas que têm de ser bloqueados. É importante para conseguir a especificidade de ligação de elevada sem comprometer a estrutura secundária e correr o risco de auto-complementaridade. - Conceber o oligo de bloqueio para ter uma Tm de 10 - 15 ° C acima da temperat extensãoure durante ciclos tmicos. Ajustar a Tm por adição ou remoção de bases de bloqueio ou por substituição de bases de bloqueio para o ADN, evitando trechos longos (3 - 4 bases) de bloqueio de bases G ou C.
- Navegar até o site ferramentas de oligo (ver Tabela de Materiais) e selecione o "bloqueio Oligo Tm Prediction" ferramenta.
- Colar a sequência do molde WT que é desejado para ser bloqueado na caixa "Oligo Sequência". Adicionar "+" na frente de bases para indicar bases bloqueador.
- Selecione o botão "Calcular" para determinar o aproximada T m do híbrido de ADN-Blocker.
- Conceber o oligo de bloqueio para evitar a formação de estruturas secundárias ou auto-dímeros.
- Navegar até o site ferramentas de oligo (ver Tabela de Materiais) e selecione o "bloqueio Oligo Optimizer" ferramenta.
- Colar a sequência do molde WT que é desejado para ser bloqueado na caixa. Adicionar "+" na frente de bases para indicar o bloqueio bases.
- Selecione as duas caixas para "estrutura secundária" e "Self Only". Pressione o botão Analisar para analisar o oligo de estruturas secundárias potencialmente problemáticos ou auto-dímeros.
NOTA: As pontuações representam estimativas muito grosseiras da T m 's das estruturas secundárias e auto-dímeros. As pontuações mais baixas são portanto ideal e pode ser conseguida limitando bloqueador-bloqueador de emparelhamento. O oligonucleótido bloqueador para MyD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + D + G + A + T + CC / invdT /)] foi concebida para cobrir aminoácidos Q262-I266 e apresenta uma 3'-invertida dT para inibir tanto a extensão por polimerase de ADN e da degradação por 3'-exonuclease. Este oligo bloqueio específico é um 17-mero com 10 bases de bloqueio que são denotados como "+ N". Os restantes 7 bases são nucleótidos de ADN comuns.
- Desenhar o oligonucleótido de bloqueio para ser de aproximadamente 10 - 15 bases de comprimento e complementar ao modelo WT, onde é desejado o enriquecimento mutante.
- Configuração WTB-PCR e ciclos de temperatura
- Preparar um WTB-PCR mi mestrex (MMX) utilizando 2,5 mL de PCR de tampão de reacção 10 x w / 20 mM de MgCl2, 250 ^ M de dNTP, 0,2 uM iniciador directo e inverso, 1,2 uM MYD88blocker, e DNAse, RNAse-livre, ultra-pura H2O para criar uma definitiva volume da solução de 21,75 mL por reacção.
NOTA: Trabalhando concentrações referem-se ao volume de reacção final de 25 ul (após a adição de DNA molde e polimerase). PCR convencional MMX é preparado por simplesmente omitindo a adição do bloqueador. Todos os passos do protocolo permanecem idênticas para ambos WTB e PCR convencional. Isso pode ser usado em validação e determinação de enriquecimento alcançado pela adição de bloqueador.- Ao calcular a quantidade de MMX para preparar a certificar-se de que são responsáveis por reacções adicionais 3 (controlos positivos e negativos e um controlo não-modelo para verificar se há contaminação) e pelo menos uma reacção adicional para erros de pipetagem.
- Vortex MMX completamente. A MMX pode ser armazenado a -80 ° C durante até ayorelha.
- Adicionar 0,25 mL de Taq DNA polimerase por reacção à MMX e invertido para misturar. Uma vez que a polimerase foi adicionado à MMX, mantê-lo em gelo.
- Colocar uma nova placa de 96 poços de PCR sobre uma placa fria e pipeta de 22 uL da MMX com polimerase, para cada cavidade de reacção.
- Adiciona-se 3 mL de ADN genómico (50 - 100 ng / mL para cada um dos poços que contêm a MMX com polimerase.
- Selar a placa e Centrifugar brevemente para garantir que a solução atinge o fundo de cada poço.
- Carregar a placa de PCR num termociclador.
- Definir as condições de termociclização para a reacção WTB-PCR como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 6 minutos; 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 s, emparelhamento de iniciador a 56 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 1 min 20 s; extensão final a 72 ° C durante 10 min.
NOTA: Melhor prática envolve completar o restante do protocolo em uma área separada fisicamente para evitar a contaminação amplicon in futuras configurações.
- Definir as condições de termociclização para a reacção WTB-PCR como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 6 minutos; 40 ciclos de desnaturação a 95 ° C durante 30 s, emparelhamento de iniciador a 56 ° C durante 30 s e extensão a 72 ° C durante 1 min 20 s; extensão final a 72 ° C durante 10 min.
- Preparar um WTB-PCR mi mestrex (MMX) utilizando 2,5 mL de PCR de tampão de reacção 10 x w / 20 mM de MgCl2, 250 ^ M de dNTP, 0,2 uM iniciador directo e inverso, 1,2 uM MYD88blocker, e DNAse, RNAse-livre, ultra-pura H2O para criar uma definitiva volume da solução de 21,75 mL por reacção.
- Efectuar a electroforese de gel de acordo com protocolos anteriormente descritos 14, a fim de determinar se WTB-PCR foi bem sucedida e para confirmar a falta de amplificação no controlo não-molde.
- Purificação de PCR produtos por esferas magnéticas
- Remover esferas magnéticas a partir de 4 ° C e trazer para a temperatura ambiente.
- Transferir 10 uL do produto de PCR para uma nova placa de PCR.
- Vortex as esferas magnéticas vigorosamente para voltar a suspender totalmente as partículas magnéticas.
- Adicionar 18 mL esferas magnéticas a cada poço na nova placa. Pipeta misturar 10 vezes.
- Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Colocar a placa de PCR para a placa de íman contornado-lado durante 2 minutos para separar as pérolas da solução.
- Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de canais múltiplos, evitando-se o sedimento de grânulo.
- Dispensar 150 uL de 70% de etanol a cada poço e incubar à temperatura ambiente for pelo menos 30 s. Aspirar o etanol com uma pipeta multicanal e descartar dicas. Repetir este procedimento de lavagem mais uma vez.
- Usando uma pipeta de múltiplos canais 20 uL aspirar o etanol remanescente a partir de cada cavidade e descartar dicas.
- Depois dos poços são secos (~ 10 min), remover da placa íman e adicionar 40 uL de água livre de nuclease a cada poço e mistura pipeta 15 vezes ou vórtice suavemente.
- Incubar à temperatura ambiente durante 2 min.
- Colocar a placa de PCR no prato íman durante 1 min para separar as pérolas a partir de solução.
- Transferência de 35 uL de produto purificado para uma nova placa de PCR. Este produto de PCR é purificado é agora pronto para prosseguir com a sequenciação bidireccional ou pode ser armazenado a -20 ° C até ser necessário.
Nota: Quando o desenvolvimento de um novo ensaio, a quantificação de produto de PCR purificado pode ser necessária. 1-3 ng de ADN amplic / uL é ideal para sequenciação bi-direccional. Se a concentração é consistentemente baixa, aumentar o produto de PCR e magnéticos grânulos proportionally (1: 1,8). Se a concentração é consistentemente elevado, elui-se com um maior volume de água.
3. Sequência de WTB-PCR produtos
- Sequenciamento Bi-direcional
NOTA: O protocolo seguinte é uma forma modificada de instruções do fabricante que foi optimizado para usar menos reagentes.- Preparar para a frente e reverso reacção de sequenciação mistura-se com 0,25 mL Pronto mistura de reacção, 1,88 mL Sequenciação Tampão, 1,78 uM M13-F ou M13-R iniciadores de sequenciação e adicionar e DNAse, RNAse-livre, ultra-pura H2O para criar uma solução final volume de 9 mL por reacção. Esta mistura de reacção de sequenciação pode ser armazenado a -20 ° C durante até um ano.
- Pipeta 9 pL da mistura de reacção de sequenciação para a frente em cada poço de uma nova placa de 96 poços de PCR para a reacção de sequenciação para a frente. Repetir em uma placa separada para a reacção de sequenciação reversa.
- Adicionar 1 mL do produto purificado t WTB-PCRO cada poço em ambas as placas para a frente e reverso.
- Selar a placa e Centrifugar brevemente para garantir que a solução atinge o fundo de cada poço.
- Carregar a placa de PCR num termociclador.
- Definir as condições de termociclização para a reacção de sequenciação como se segue: 96 ° C durante 1 min; 30 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 50 ° C durante 5 segundos, 60 ° C durante 4 min; manter a 4 ° C até estar pronta para purificação.
- Purificar Sequencing produtos
- Prepara-se uma solução 01:25 de acetato de fresco de sódio 3M (pH 5,2) e etanol a 100%.
- Prepara-se uma solução fresca de etanol a 70%.
- Adicionar 30 ul de acetato de sódio / solução de etanol a 100% a cada poço de ambas as placas para a frente e inverso de sequenciação e mistura pipeta de 5 vezes.
- Selar a placa e incubar no escuro à temperatura ambiente durante 20 min.
- Centrifugar a placa a 2250 xg durante 15 min.
- Remova o vedante de placa e inverta sobre um desperdíciorecipiente.
NOTA: Inverter apenas uma ou a pelota pode soltar a partir do fundo bem. - Colocar a placa invertida sobre uma toalha de papel limpa e centrifugar a 150 xg durante 1 min.
- Adicionar 150? L de 70% etanol a cada poço.
- Selar a placa e girar a 2250 xg durante 5 min.
- Repita os passos 3.2.6 e 3.2.7.
- Se os poços não são completamente seca, permitir-lhes secar ao ar à temperatura ambiente. Certifique-se as amostras são protegidas da luz durante a secagem.
- Adicionar 10 mL de formamida a cada poço e pipeta mix 10 vezes. Selar a placa.
- Desnaturar no termociclador a 95 ° C durante 3 minutos seguido de 4 ° C durante 5 min.
- Após desnaturação, substituir o vedante de placa com um septo e a sequência na plataforma de sequenciação de acordo com as instruções do fabricante 15.
4. Análise dos Resultados Sequencing
- Visualizar os traços de sequenciação utilizando um dat sequenciaçãoum software de análise de acordo com as instruções do fabricante 16 e alinham com as respectivas sequências de referência. MyD88 alinhar a sequcia de refercia do NCBI "NM_002468".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma visão geral conceitual de WTB-PCR durante a extensão é apresentado na Figura 1. Uma vez que um único nucleótido mal emparelhado o híbrido ADN-bloqueador diminui consideravelmente a sua temperatura de fus (? T m = 20 - 30 ° C), a amplificação do alelo WT é bloqueado enquanto ADN molde mutante é livre para completar a extensão 17. Neste modo, o DNA mutante é amplificada exponencialmente, enquanto ADN WT é amplificado linearmente.
Uma demonstração do enriquecimento mutante obtida por WTB-PCR é apresentado na Figura 2. O ADN genómico de pacientes com e sem as mutações foram testados por tanto convencional e WTB-PCR e, em seguida, sequenciados para demonstrar o enriquecimento típico realizável por WTB-PCR e uma falta de falsos positivos em ADN WT. A concentração de trabalho de bloqueadores usado em WTB-PCR MMX deve ser determinado por experiências de titulação e should alcançar o nível desejado de enriquecimento mutante enquanto não resultam em falsos positivos ou bloqueando a amplificação de ADN WT inteiramente. A análise de sequenciação de produto WTB-PCR demonstra o enriquecimento para o alelo mutante e um limite de detecção de excesso de 0,5% alelo mutante em um fundo de WT em comparação com 16% em PCR convencional 3.
Os efeitos deste aumento na sensibilidade em testes clínicos podem variar dependendo da quantidade relativa de células neoplásicas nas amostras testadas. Em um estudo de comparação de métodos, o ensaio de PCR-WTB aqui descrito demonstrou que 64% das mutações MyD88 iria ser dispensada por meio de testes convencionais de pacientes com WM ou MGUS 3.
Um drop-off característica na intensidade do sinal (Figura 3) é visto muitas vezes, se uma concentração demasiado elevada de bloqueador é utilizado ou se pós-PCR Purificação não conseguiu remover bloqueador antes da sequenciação bi-direcional. Este último é demonstrada quando purificação pérola magnética é substituído para purificao enzimica. Embora purificação enzimática é uma opção atraente quando se trabalha com um número maior de amostras, não é apropriado para aplicação com WTB-PCR, uma vez que não consegue remover o bloqueador de solução antes da sequenciação.
Um exemplo de artefactos de sequência frequentemente encontrada em ADN FFPE-derivado como um resultado da citosina desaminação (C: G> T: A) são apresentados na Figura 4 3, 18, 19, 20. Embora as causas reais de desaminação da citosina está mal compreendida, qualquer ensaio baseado em PCR que enriquece para alelos mutantes irá detectar estes artefactos de baixa frequência 21, 22. Os falsos positivos devido a deaminação são evitados melhor, começando com material de modelo de alta qualidade; em muitos casos onde isto não é possível, o tratamento com glicosilase de uracilo de ADN (UDG) durante a extraco pode ajudar a limitar a frequência e intensidade de artefactos de desaminação. tratamento com UDG de tecido FFPE durante a extracção (como parte do kit de ADN FFPE) excises desaminado resíduos de citosina, impedindo assim induzida artificialmente de C: G> T: A mutações. No entanto, os resíduos de 5-metilcitosina que frequentemente ocorrem em dinucleidos CpG são desaminados para a timina, o que não pode ser excisado por UDG. Os artefactos de sequenciação resultantes são bastante reconhecível e frequentemente aparecem como mutações em tandem como se vê na Figura 4. Se as amostras já ter sido extraído, o tratamento com UDG pode ser implementada em uma extracção secundária com perda de ADN relativamente baixo.
Figura 1: conceptual Overview de WTB-PCR. A incompatibilidade de um único nucleótido no híbrido Bloqueador-ADN diminui Tm até 30 ° C. Ao desenhar o oligonucleótido bloqueador para ter uma Tm de 10 - 15 ° C acima da temperatura durante a extensão, a amplificação de ADN WT é bloqueado, permitindo a amplificação de ADN mutante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O DNA genómico de pacientes com e sem as mutações foram testados por tanto convencional e WTB-PCR e, em seguida, sequenciados para demonstrar o enriquecimento típico realizável por WTB-PCR. A concentração final de bloqueador utilizados para alcançar WTB-PCR foi seleccionado para alcançar o enriquecimento máximo mutante apesar de não causar falsos positivos em ADN WT ou bloqueando amplificação de WT DNA inteiramente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Característica queda na intensidade do sinal quando visto de purificação de PCR enzimática é usada em vez de esferas magnéticas. Isto é provavelmente porque purificação enzimática não consegue remover bloqueador antes da sequenciação bi-direccional. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: C: G> T: v A artefactos de sequenciação surgir no tecido FFPE quando citosina metilada ou citosina são desaminadosIA formalina fixação de uracilo ou timina, respectivamente. Uracil-ADN-glicosilase (UDG) pode excisar uracilo antes WTB-PCR ajudando a reduzir os artefactos de sequenciação. No entanto, timina resultante da desaminado 5-metilcitosina, que freqüentemente ocorre em ilhas CpG, não pode ser retirado por UDG. Diminuir a concentração de bloqueadores usado em WTB-PCR pode ajudar a reduzir a ocorrência de artefactos de sequenciação que não sejam remediadas por tratamento com UDG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ensaio WTB-PCR descrita aqui utiliza um conjunto genérico de iniciadores com um oligo de bloqueio concebido para bloquear a amplificação de ADN WT durante a extensão (Figura 1). O produto WTB-PCR é, em seguida, sequenciados para análise mutacional. O utilitário de WTB-PCR / Sanger reside na sua simplicidade, de alta sensibilidade, e de alto rendimento. Usando as diretrizes descritas aqui, a maioria dos ensaios baseados em Sanger existentes podem ser simplesmente modificadas por meio da adição de um oligonucleótido bloqueador para aumentar grandemente a sensibilidade. No exemplo aqui apresentado ensaio a adição de um único oligonucleótido bloqueador para PCR aumentou o limite de detecção de aproximadamente 16% alelo mutante em um fundo de WT para o ensaio convencional de> 0,5% no ensaio de PCR WTB-3. O efeito de que é uma redução de 64% em falsos negativos observados em testes clínicos 3. Confirmando a presença de mutações em MyD88 tem impl diagnóstico e prognóstico significativoications; falsamente relatar um caso como negativo pode ter consequências graves sobre a terapia global e gestão paciente. Testando com WTB-PCR é, portanto, de grande importância, particularmente em pacientes com relativamente baixa celularidade anormal.
Técnicas WTB-PCR variar consideravelmente e são por vezes referidos indiferentemente com LNA, BNA, ou ensaios de fixação de PCR ou PCR-clamp-sonda de PNA-mediadas 2, 4, 23, 24. Algumas variações utilizando WTB-PCR envolvem um ensaio qPCR o que torna necessário conceber uma sonda fluorescente adicional para cada mutação específica. Um desafio significativo associado com esta técnica inclui a necessidade de desenvolver sondas de ligação competitivos com precisão que discriminam entre alelos WT e mutantes. Além disso, porque uma sonda específica mutação é necessária, a abordagem qPCR não tem a capacidade de detectar mutatio desconhecidons. Outra variação de WTB-PCR amplificação blocos WT de uma forma específica para o alelo. Em vez de utilizar os iniciadores específicos de mutações no entanto, uma sonda específica de bloqueio para o alelo WT inibe a ligação do iniciador completo. Embora esta abordagem não requer uma sonda específica para a mutação como qPCR, ele não consegue discriminar entre mutações e erros de polimerase induzida pode levar a um aumento de falsos positivos. amplificação exponencial destas polimerases de erros induzidos por PCR podem obscurecer a detecção de eventos mutacionais raras. Qualquer abordagem que utiliza amplificação por PCR para enriquecer mutações tem sua precisão limitada pela frequência de erros de PCR 25, 26, 27. Uma vantagem fundamental da WTB-PCR / Sanger longo de muitas outras metodologias de alta sensibilidade é que ele evita a amplificação tanto molde WT e molde mutante cujas mutações ocorrem fora da região do gene alvo pelo bloqueio oligonucleotide. Portanto, os erros de PCR introduzidas por polimerases são efectivamente filtrados para fora juntamente com o ADN WT. Contrariamente ao AS-PCR ou qPCR no entanto, o enriquecimento é retido para mutações desconhecidos que ocorrem dentro da região coberta pelo oligo bloqueio. No caso de MyD88, WTB-PCR permitiu a detecção de ambos os L265P e R264 * 3 mutações. Outros relataram semelhante a detecção de mutações múltiplas, de baixa frequência, com o uso de PCR WTB-4, 28. Isso faz com que WTB-PCR ideal tanto para fins clínicos e de investigação.
Juntamente com alta sensibilidade e controlos internos inerentes para eliminar falsos positivos, a flexibilidade do WTB-PCR para a adaptação de um ensaio de sequenciação existentes com muito poucos passos adicionais de criação bloqueador tornam opção atraente para muitos laboratórios com ensaios estabelecidos. O mesmo conjunto de iniciadores de PCR utilizados num ensaio convencional pode ser tipicamente utilizada na variação WTB-PCR. Otsuas alterações de protocolo que são altamente recomendadas para WTB-PCR, incluindo o tratamento com UDG de tecido FFPE e purificação de pós-PCR apropriados metodologias são igualmente transferíveis. Bloqueador de criação, por conseguinte, é o elemento crítico na implementação de um ensaio WTB-PCR. Embora as orientações apresentadas neste protocolo representam os factores mais importantes no que desenho, vários oligonucleótidos bloqueadores devem ser testados para encontrar um que bloqueia WT amplificação eficiente sem efeitos secundários para PCR. Isto inclui a adição ou a remoção de bases bloqueador para ajustar Tm, deslocando a posição do oligo de bloqueio em relação ao modelo de WT, e mudando o comprimento global do oligo. Bloqueador de experiências de titulação devem também ser utilizado para estabelecer um equilíbrio entre ocorrências aceitáveis de artefactos de sequenciação e limite de detecção.
Seleccionar uma metodologia apropriada para a detecção de mutações que estão presentes nas fracções celulares hora depende grandemente the aplicação e tipos de doença / mutação. Se quantificação mutante é desejada, qPCR ou digital de PCR pode oferecer soluções mais viável que WTB-PCR / Sanger. Embora WTB-PCR é principalmente um ensaio qualitativo, é possível determinar uma estimativa grosseira da frequência do alelo mutante por teste de uma amostra com convencional e WTB-PCR em paralelo. Uma vez que o limite de detecção para o ensaio convencional é de aproximadamente 10-20% do alelo mutante em um fundo de WT, que é adequado para concluir que as mutações detectadas pelo ensaio WTB-PCR, mas não o convencional estão presentes numa concentração inferior ao limite de detecção para o ensaio convencional. Alguns ensaios de oferecer a versatilidade, simplicidade e robustez da WTB-PCR. O baixo custo e tempo de resposta curto torna-a ideal para a avaliação de doença residual após terapia ou monitorização mutações resistentes emergentes durante a terapia. Além disso, a capacidade de detectar mutações anteriormente undescribed fazer WTB-PCR ideal para fins de pesquisa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) | Roche | 12032937001 | With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
