Abstract
la détection et l'identification précise des mutations à basse fréquence peut être problématique lors de l'évaluation de maladie résiduelle après le traitement, le dépistage des nouvelles mutations de résistance au cours du traitement, ou lorsque les patients ont peu de cellules tumorales circulantes. PCR blocage de type sauvage suivi par une analyse de séquençage offre une sensibilité élevée, la flexibilité et la simplicité comme une méthodologie permettant de détecter ces mutations à basse fréquence. En ajoutant un oligonucleotide conçu sur mesure d'acide nucléique verrouillé dans une nouvelle ou déjà établie essai de séquençage à base de PCR classique, des sensibilités de l'ordre de 1 allele mutant dans un fond de 1000 WT alleles peuvent être atteints (1: 1000). artefacts de séquençage associés à des événements de désamination généralement trouvés dans des tissus inclus dans la paraffine fixés au formol peut être remédié en partie par l'utilisation de l'uracile glycosylase d'ADN au cours des étapes d'extraction. Le protocole optimisé de détection est spécifique ici pour la mutation MyD88, mais peut servir de modèle pour concevoir toutedosage WTB-PCR. Avantages du test WTB-PCR sur les autres essais couramment utilisés pour la détection de mutations à basse fréquence incluant allèle spécifique PCR et PCR en temps réel quantitative comprennent moins les occurrences de faux positifs, une plus grande souplesse et la facilité de mise en œuvre, et la capacité de détecter à la fois connue et des mutations inconnues.
Introduction
Le séquençage Sanger a toujours été l'étalon-or dans les tests pour les mutations somatiques connues et inconnues. L' une des limitations de séquençage de Sanger est sa limite de détection (~ 10 - allèle mutant de 20% dans un fond de WT) 1. Ce niveau de sensibilité est inapproprié pour la détection de mutations somatiques de bas niveau qui peuvent être présents dans des échantillons de tissus de patients prémalignes ou avec peu de cellules tumorales circulantes, ou lorsque la moelle osseuse (BM) est inégale. Cela rend également l' évaluation de la maladie résiduelle après le traitement ou la détection des mutations de résistance émergents au cours du traitement par séquençage conventionnel seul difficile 2. En remplaçant la PCR classique avec un acide nucléique verrouillé (LNA) médiée par PCR de blocage de type sauvage (WTB-PCR) dans le séquençage de Sanger, les sensibilités allant jusqu'à 0,1% allèle mutant dans un fond de WT peuvent être obtenus 2, 3, 4. DansWTB-PCR, l'enrichissement pour les alleles mutants est réalisée par l'addition d'un court (~ 10 - 14 NT) de blocage (LNA) oligonucléotide qui se lie préférentiellement à l'ADN WT empêchant ainsi l'amplification de l'ADN WT. Le mutant enrichi produit WTB-PCR peut être séquencée. En bloquant l'ADN WT plutôt que de sélectionner des mutations spécifiques WTB-PCR permet l'enrichissement des deux mutations connues et inconnues présentes dans les fractions cellulaires minute.
Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées pour détecter des mutations dans les petites fractions de cellules. Ceci inclut le système de mutation allèle-spécifique PCR, réfractaire amplification (ARMS), la dénaturation Chromatographie en phase liquide à haute performance (DHPLC), des billes, des émulsions, l'amplification et le magnétisme (ensouplage), la libération du champ induit électrique et de mesure (EFIRM), haute résolution point de fusion et d'autres. Cependant, la plupart de ces méthodes sont limitées par des faux positifs et la capacité de détecter une seule mutation que le test a été conçu pour 4 amplicons-5, 6.
Ici , nous démontrons l'augmentation de la sensibilité obtenue par WTB-PCR dans le dépistage des mutations dans le facteur de différenciation myéloïde 88 gène tel que décrit par Albitar et al. 3 MYD88 mutations sont importants facteurs diagnostiques et pronostiques dans la macroglobulinémie de Waldenström (WM), gammapathie monoclonal IgM de signification inconnue (IgM-MGUS), le lymphome splénique de la zone marginale (SMZL) et lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL). mutations MyD88 se trouvent dans presque tous les cas de WM et environ 50% des patients avec des immunoglobulines M (IgM) sécrétant GMSI. Par contraste, les mutations MyD88 se trouvent dans seulement 0-6% des patients atteints de SMZL et sont absents dans le myélome multiple 7, 8. Parce morphologiques qui se chevauchent, immunophénotypique, cytogénétique, et les caractéristiques cliniques entre WM et SMZL ou multiple IgM de myélome peuvent souvent compliquer le diagnostic différentiel, la présence d'une mutation MyD88 peut servir de facteur d' identification utile 9. Mutations MyD88 ont également été associés à une plus grande charge de morbidité chez les patients atteints DLBCL et une mauvaise survie globale après un traitement 7, 10. De plus, parce que les mutations MyD88 sont plus fréquemment trouvés dans activé cellules B comme (ABC) DLBCL que centre germinatif B-alvéolaire (GCB) DLBCL ou de lymphome à cellules B médiastinale primaire (PMBL), le statut de mutation MYD88 peut servir marqueur de substitution pour le sous - type ABC 11, 12.
Le protocole détaillé fourni ici sert de modèle à partir duquel de nouveaux tests peuvent être mis au point ou la plupart des tests de séquençage existants peuvent être facilement adaptés pour détecter avec précision les mutations à basse fréquence dans différents types d'échantillons. L'approche peut également être utilisé pour la surveillance et la détection de mutations résistantes qui peuvent se développer dans les tumeurs ou même les bactéries qui peuvent se développer alors que les patients sont traités avec la thérapie ciblée ou des antibiotiques. En outre, il traite et des remèdes beaucoup des problèmes liés à l'enrichissement de mutation, en particulier dans les paraffine fixés au formol (FFPE) tissus.
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Protocol
Déclaration éthique: Tous les tests des échantillons humains a été réalisée après obtention de l'approbation Institutional Review Board (IRB).
1. Extraction de l'ADN à partir de tissu FFPE, du sang périphérique et de moelle osseuse Aspirer
- Pour la moelle osseuse du tissu FFPE avec le kit d'extraction d'ADN FFPE
- Commencer avec le tissu FFPE de lames non colorées (5 - 10 parties à 5 - épaisseur de 10 um).
REMARQUE: si début de copeaux de tissu, utiliser 3 - 6 sections à 5 - épaisseur de 10 pm et passer à l'étape 1.1.6. - Placez les diapositives dans un panier de diapositives et de préparer quatre réservoirs de lavage (deux pour Xylène et deux pour 100% d'alcool). Ajouter un volume minimum de 600 ml de solution à chaque panier.
- Déparaffiner les diapositives en faisant un lavage de xylène 5 min dans le premier plateau. Placer les lames dans le second réservoir de lavage de xylène pendant 5 minutes supplémentaires.
- Après déparaffinage, laver les lames avec 100% d'alcool pendant 5 min. Transférer les lames au deuxièmeréservoir de lavage à l'alcool pendant 5 minutes supplémentaires.
- Laisser les lames sécher complètement sous une hotte avant de les gratter avec une lame de rasoir dans un tube à centrifuger.
NOTE: Si une diapositive H & E avec la région de la tumeur indiquée est disponible, aligner les diapositives et gratter seulement la région de la tumeur. - Procéder aux instructions du document du fabricant inclus dans le kit.
- Commencer avec le tissu FFPE de lames non colorées (5 - 10 parties à 5 - épaisseur de 10 um).
- Pour BM aspirez et le sang périphérique
- Extrait selon les instructions du fabricant du document avec ces spécifications.
NOTE: Il existe de nombreux kits disponibles dans le commerce et les méthodes d'extraction d'ADN à partir de tissus FFPE et les cellules. Pratiquement, tous peuvent être utilisés. Utilisez une méthode qui est établie dans le laboratoire.- Utiliser 200 ul de sang périphérique (PB) ou de 100 uL BM + 100 ul de PBS.
- Utilisez 4 pi RNase une solution mère.
- Eluer avec du tampon d'élution de 100 ul.
- Extrait selon les instructions du fabricant du document avec ces spécifications.
- ADN Quantification
- Mesurer les concentrations d'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre assurant un rapport 260 nm / 280 nm d'environ 1,8 (pour l'ADN pur). Si le rapport est sensiblement plus faible, cela peut indiquer la présence de la protéine, du phénol, ou d'autres contaminants qui peuvent interférer avec les applications en aval.
- Ajuster la concentration d'ADN à environ 50 - 100 ng / ul avec un tampon d'élution approprié.
2. Blocage PCR de type sauvage
- Conception primaire
- Conception et obtenir des amorces pour les gènes d'intérêt selon l' une décrit précédemment orientations générales de conception d'amorces de PCR 13. Inclure M13-avant et arrière des amorces de séquençage universelles dans les amorces de PCR.
NOTE: L'essai MyD88 a été développé pour amplifier l'exon 5 de MYD88 (G259 - N291) et 110 nucleotides situés dans la région 5' intronique pour couvrir le site d'épissage et une partie de l'intron 4. Les amorces directes et inverses ont été conçues avec un 5' -M13 séquence (M13-forward: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-inverse: cag gaa aca gct atg acc) pour permettre une hybridation des amorces de séquençage complémentaire (voir Matériaux tableau).
- Conception et obtenir des amorces pour les gènes d'intérêt selon l' une décrit précédemment orientations générales de conception d'amorces de PCR 13. Inclure M13-avant et arrière des amorces de séquençage universelles dans les amorces de PCR.
- Verrouillé Nucleic Acid Oligonucleotide Conception
- Conception de l'oligonucléotide de blocage à être d'environ 10 - 15 bases de long et complémentaires de la matrice WT où l'on souhaite enrichissement mutant.
NOTE: Une plus courte oligo- améliorer la discrimination mismatch. Pour obtenir une grande spécificité de la cible, il est important de ne pas utiliser trop de nucléotides de blocage car cela peut entraîner un oligonucléotide très « collante ». Le contenu et la longueur et nucléotides blocage doivent être optimiser selon le nucléotide spécifique qui doit être bloqué. Il est important d'obtenir une spécificité de liaison élevée sans compromettre la structure secondaire et de risquer une auto-complémentarité. - Concevoir le blocage d'avoir un oligo T m 10 - 15 ° C au-dessus de l'extension température pendant thermocyclage. Ajuster le T m en ajoutant ou supprimant des bases de blocage ou par substitution des bases de blocage pour l' ADN tout en évitant les longues (3 - 4 bases) de blocage de bases G ou C.
- Accédez au site Web Oligo outils (voir le tableau des matériaux) et sélectionnez l'outil « blocage Oligo Tm prédiction ».
- Coller la séquence de la matrice WT qui est désiré pour être bloqué dans la case « Oligo Sequence ». Ajouter « + » devant des bases pour indiquer les bases de blocage.
- Sélectionnez le bouton « Calculer » pour déterminer le T m environ de l'hybride ADN-bloqueur.
- Concevoir le blocage pour éviter oligo- formation de structure secondaire ou auto-dimères.
- Accédez au site Web Oligo outils (voir le tableau des matériaux) et sélectionnez l'outil « blocage Oligo Optimizer ».
- Coller la séquence de la matrice WT qui est désiré pour être bloqué dans le boîtier. Ajouter « + » en face des bases pour indiquer le blocage des bases.
- Sélectionnez les deux cases pour « Structure secondaire » et « Self Only ». Appuyez sur le bouton Analyser pour examiner les structures secondaires pour oligo- potentiellement gênants ou auto-dimères.
NOTE: Les scores représentent des estimations très approximatives de l » T m des structures secondaires et auto-dimères. Des scores plus faibles sont donc optimales et peuvent être obtenus en limitant l'appariement bloqueur-bloquant. L'oligonucléotide de blocage pour MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] a été conçu pour couvrir Q262-I266 acides aminés et possède une extrémité 3 'inversée dT pour inhiber à la fois l'extension par polymerase d'ADN et de la dégradation par une exonucléase 3 '. Cet oligo blocage spécifique est un 17mère avec 10 bases de blocage qui sont désignés par « + N ». Les 7 bases restantes sont des nucléotides d'ADN ordinaires.
- Conception de l'oligonucléotide de blocage à être d'environ 10 - 15 bases de long et complémentaires de la matrice WT où l'on souhaite enrichissement mutant.
- Configuration WTB-PCR et Thermocyclage
- Préparer un maître WTB-PCR mix (MMX) en utilisant 2,5 ul de tampon de réaction de PCR 10x w / 20 mM de MgCl2, 250 uM de dNTP, vers l' avant de 0,2 uM et l' amorce inverse, 1,2 pM MYD88blocker et DNase, RNase-free, H ultra-pure 2 O pour créer une finale volume de solution de 21,75 ul par réaction.
NOTE: Les concentrations de travail sont pour le volume final de réaction de 25 ul (après addition de matrice d'ADN et polymérase). PCR conventionnelle MMX est préparée en omettant simplement l'ajout de blocage. Toutes les étapes du protocole restent identiques pour les deux WTB et PCR classique. Ceci peut être utilisé dans la validation et l'enrichissement détermination réalisée par addition de blocage.- Lors du calcul de la quantité de MMX pour préparer faire en sorte de rendre compte de 3 réactions supplémentaires (contrôles positifs et négatifs et un témoin non-modèle pour vérifier la contamination) et au moins une réaction supplémentaire de l'erreur de pipetage.
- Vortex MMX à fond. Le MMX peut être stocké à -80 ° C jusqu'à ayoreille.
- Ajouter 0,25 ul Taq polymérase ADN par réaction au MMX et mélanger par inversion. Une fois que la polymérase a été ajouté à la MMX, le garder sur la glace.
- Mettre une nouvelle plaque à 96 puits PCR sur une plaque froide et la pipette 22 ul de polymerase avec MMX à chaque puits réactionnel.
- Ajouter 3 pl d'ADN génomique (50 - 100 ng / ul de chacun des puits contenant le MMX avec la polymerase.
- Sceller brièvement la plaque et centrifugeuse pour assurer que la solution atteigne le fond de chaque puits.
- Charger la plaque PCR sur un thermocycleur.
- Définir les conditions de thermocyclage pour la réaction WTB-PCR comme suit: dénaturation initiale à 95 ° C pendant 6 min; 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 30 s, annelage d'amorce à 56 ° C pendant 30 s et extension à 72 ° C pendant 1 min 20 s; extension finale à 72 ° C pendant 10 min.
NOTE: Les meilleures pratiques consiste à remplir le reste du protocole dans une zone physiquement séparée pour éviter toute contamination amplicon in configurations futures.
- Définir les conditions de thermocyclage pour la réaction WTB-PCR comme suit: dénaturation initiale à 95 ° C pendant 6 min; 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 30 s, annelage d'amorce à 56 ° C pendant 30 s et extension à 72 ° C pendant 1 min 20 s; extension finale à 72 ° C pendant 10 min.
- Préparer un maître WTB-PCR mix (MMX) en utilisant 2,5 ul de tampon de réaction de PCR 10x w / 20 mM de MgCl2, 250 uM de dNTP, vers l' avant de 0,2 uM et l' amorce inverse, 1,2 pM MYD88blocker et DNase, RNase-free, H ultra-pure 2 O pour créer une finale volume de solution de 21,75 ul par réaction.
- Effectuer une électrophorèse sur gel selon les protocoles décrits précédemment 14 afin de déterminer si WTB-PCR a réussi et pour confirmer l'absence d'amplification dans le contrôle non matrice.
- La purification du produit PCR par des billes magnétiques
- Retirer les billes magnétiques de 4 ° C et porter à la température ambiante.
- Transfert produit PCR 10 ul à une plaque PCR.
- Vortex les billes magnétiques vigoureusement pour remettre en suspension les particules magnétiques complètement.
- Ajouter 18 pi de billes magnétiques à chaque puits sur la nouvelle plaque. Pipette mélanger 10 fois.
- Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Placer la plaque PCR sur la plaque d'aimant côté-jupe pendant 2 min à des billes séparées de la solution.
- Aspirer le surnageant avec une pipette multicanaux, en évitant le culot de billes.
- Distribuer 150 pl d'éthanol à 70% dans chaque puits et incuber à température ambiante for au moins 30 s. Aspirer l'éthanol avec une pipette à canaux multiples et jeter des conseils. Répétez cette procédure de lavage une fois de plus.
- À l'aide d'une pipette à canaux multiples de 20 ul Aspirer l'éthanol restant de chaque puits et jeter des conseils.
- Une fois que les puits sont secs (~ 10 min), retirer de la plaque magnétique et ajouter 40 ul d'eau sans nuclease à chaque puits et le mélange pipette 15 fois ou légèrement vortex.
- Incuber à température ambiante pendant 2 min.
- Placer la plaque PCR sur plaque magnétique pendant 1 min à des billes séparées de la solution.
- Transfert de 35 pi de produit purifié à une nouvelle plaque PCR. Ce produit est purifié par PCR est maintenant prêt à procéder à un séquençage bidirectionnel ou peut être conservé à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
REMARQUE: Lors de l'élaboration d'un nouveau test, la quantification du produit de PCR purifié peut être nécessaire. 1-3 ADN ng / uL amplicon est optimale pour le séquençage bidirectionnel. Si la concentration est toujours faible, augmenter les perles de produits et magnétiques PCR proportionnellement (1: 1,8). Si la concentration est élevée et constante, éluer avec un plus grand volume d'eau.
3. Le séquençage du produit WTB-PCR
- Le séquençage bidirectionnel
NOTE: Le protocole suivant est une forme modifiée des instructions du fabricant qui a été optimisé pour utiliser moins réactifs.- Préparer avant et arrière réaction de séquençage se mélange avec 0,25 ul Prêt mélange de réaction, 1,88 ul de séquençage tampon, 1,78 uM M13-F ou des amorces de séquençage M13-R et ajouter et DNase, RNase-free, H ultra-pure 2 O pour créer une solution finale volume de 9 pi par réaction. Ce mélange de réaction de séquençage peut être conservé à -20 ° C pendant jusqu'à un an.
- Pipette 9 ul du mélange de réaction de séquençage de l'avant dans chaque puits d'une nouvelle plaque à 96 puits PCR pour la réaction de séquençage de l'avant. Répéter l'opération sur une plaque séparée pour la réaction de séquençage inverse.
- Ajouter 1 pl du t produit purifié WTB-PCRo chaque puits sur les deux plaques avant et arrière.
- Sceller brièvement la plaque et centrifugeuse pour assurer que la solution atteigne le fond de chaque puits.
- Charger la plaque PCR sur un thermocycleur.
- Définir les conditions de thermocyclage pour la réaction de séquençage de la manière suivante: 96 ° C pendant 1 min; 30 cycles de 96 ° C pendant 10 s, 50 ° C pendant 5 s, 60 ° C pendant 4 min; maintenir à 4 ° C jusqu'au moment de la purification.
- Purifier les produits de séquençage
- Préparer une solution fraîche de 01:25 3 M d'acétate de sodium (pH 5,2) et 100% d'éthanol.
- Préparer une solution d'éthanol à 70% frais.
- Ajouter 30 ul d'acétate de sodium / 100% d'une solution d'éthanol à chaque puits des deux l'avant et arrière des plaques de séquençage et un mélange de pipette 5 fois.
- Refermer la plaque et incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 20 min.
- Centrifuger la plaque à 2250 xg pendant 15 min.
- Retirez le scellant de plaque et inverser sur une perterécipient.
REMARQUE: inverti une seule fois ou le culot peut détacher du fond de puits. - Placer la plaque inversée sur une serviette en papier propre et centrifuger à 150 g pendant 1 min.
- Ajouter 150 pi 70% d'éthanol à chaque puits.
- Refermer la plaque et un essorage à 2250 xg pendant 5 min.
- Répétez les étapes 3.2.6 et 3.2.7.
- Si les puits ne sont pas complètement secs, les laisser sécher à l'air à la température ambiante. Assurez-vous que les échantillons sont protégés de la lumière pendant le séchage.
- Ajouter 10 ul formamide à chaque mélange de puits et pipette 10 fois. Refermer la plaque.
- Dénaturer le thermocycleur à 95 ° C pendant 3 min, puis de 4 ° C pendant 5 min.
- Après dénaturation, remplacer l'agent de scellement en forme de plaque avec un septum et la séquence sur la plate-forme de séquençage selon les instructions du fabricant 15.
4. Analyse des résultats de séquençage
- Visualiser les traces de séquençage en utilisant une dat de séquençaged' un logiciel d'analyse selon les instructions du fabricant 16 et aligner les séquences de référence respectives. Aligner MYD88 à la séquence de référence NCBI « NM_002468 ».
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Representative Results
Une vue d' ensemble conceptuelle de WTB-PCR lors de l' extension est présentée sur la figure 1. Étant donné qu'un seul mésappariement de nucleotide dans l'hybride ADN-bloqueur diminue considérablement sa température de fusion (AT m = 20 - 30 ° C), l' amplification de l'allèle WT est bloqué tandis que l' ADN matrice mutant est libre de compléter l' extension 17. De cette manière, l'ADN mutant est amplifié de façon exponentielle tandis que WT ADN est amplifié linéairement.
Est présenté à la figure 2 Une démonstration de l'enrichissement mutant obtenu par WTB-PCR. L'ADN génomique de patients avec et sans mutations ont été testées par les deux classiques et WTB-PCR puis séquencés pour démontrer l'enrichissement typique réalisable par WTB-PCR et un manque de faux positifs dans l'ADN WT. Il convient de déterminer la concentration de travail bloquant utilisé dans MMX WTB-PCR par des expériences de titrage et should atteindre le niveau souhaité d'enrichissement mutant tout en ne donnant pas lieu à des faux positifs ou de bloquer l'amplification de l'ADN WT entièrement. Analyse de séquençage du produit WTB-PCR démontre l' enrichissement pour l'allèle mutant et une limite de détection supérieure à allèle mutant à 0,5% dans un contexte de WT par rapport à 16% dans la PCR conventionnelle 3.
Les effets de cette augmentation de la sensibilité dans les essais cliniques peuvent varier en fonction de la quantité relative de cellules néoplasiques dans les échantillons testés. Dans une étude de comparaison des méthodes, le dosage WTB-PCR décrit ici a démontré que serait manqué 64% des mutations de MyD88 par des tests classiques de patients avec une MW ou MGUS 3.
Une goutte d'arrêt caractéristique de l'intensité du signal (figure 3) est souvent considérée si une concentration trop élevée de bloqueur est utilisée ou si la purifica post-PCRtion n'a pas réussi à éliminer les bloquant avant le séquençage bidirectionnel. Cette dernière est mise en évidence lors de la purification des billes magnétiques est substitué à une purification enzymatique. Bien que la purification enzymatique est une option intéressante lorsque l'on travaille avec plus grand nombre d'échantillons, il est inapproprié pour une application avec WTB-PCR comme il ne parvient pas à supprimer bloqueur de solution avant le séquençage.
Un exemple d'artefacts de séquence fréquemment dans l' ADN dérivé de FFPE à la suite de la désamination de la cytosine (C: G> T: A) sont présentés sur la figure 4 3, 18, 19, 20. Bien que les causes réelles de désamination de la cytosine sont mal connues, tout essai basé sur une PCR qui enrichit pour des alleles mutants détecte ces artefacts de basse fréquence 21, 22. Les faux positifs dus à deamination sont à éviter en commençant par un matériau de modèle de haute qualité; dans les nombreux cas où cela est impossible, le traitement avec l'uracile ADN glycosylase (UDG) lors de l'extraction peut aider à limiter la fréquence et l'intensité des artefacts de désamination. traitement du tissu FFPE UDG lors de l'extraction (dans le cadre du kit ADN FFPE) excise désaminés résidus cytosine, empêchant ainsi artificiellement induite C: G> T: A mutations. Cependant, les résidus 5-méthylcytosine qui se produisent fréquemment à dinucléotides CpG sont désaminés à thymine, qui ne peut être excisée par UDG. Les artefacts de séquençage qui en résultent sont assez reconnaissables et apparaissent souvent comme des mutations en tandem comme le montre la figure 4. Si les échantillons ont déjà été extraits, le traitement UDG peut être mis en œuvre dans une extraction secondaire à la perte d'ADN relativement faible.
Figure 1: Conceptual Overview de WTB-PCR. Un mésappariement d' un seul nucléotide dans l'hybride ADN-T diminue Blocker m jusqu'à 30 ° C. En concevant l'oligonucléotide de blocage pour avoir un T m de 10 - 15 ° C supérieure à la température lors de l' extension, l' amplification de l' ADN bloqué par le WT est , tout en permettant l' amplification de l' ADN mutant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: L' ADN génomique de patients avec et sans mutations ont été testées par les deux classiques et WTB-PCR puis séquencés pour démontrer l'enrichissement typique réalisable par WTB-PCR. La concentration finale de bloquant utilisé pour réaliser WTB-PCR a été choisi pour réaliser l'enrichissement mutant maximale tout en ne provoquant pas de faux positifs dans l'ADN WT ou le blocage de l'ampleur àtion de l'ADN WT entièrement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Caractéristiques de dépose de l'intensité du signal observé lorsque la PCR purification enzymatique est utilisée à la place des billes magnétiques. Ceci est probablement parce que la purification enzymatique ne parvient pas à supprimer bloquant avant le séquençage bidirectionnel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: C: G> T: A artefacts de séquençage se posent dans le tissu FFPE lorsque cytosine ou cytosine méthylée sont désaminés via fixation au formol à l' uracile ou la thymine, respectivement. Uracile ADN glycosylase (UDG) peut exciser uracile avant WTB-PCR en aidant à réduire les artefacts de séquençage. Cependant, la thymine résultant de désaminé 5-méthylcytosine, qui se produit fréquemment dans les îles CpG, ne peut pas être excisée par UDG. La diminution de la concentration de blocage utilisé dans WTB-PCR peut aider à réduire l'apparition d'artefacts de séquençage qui ne sont pas corrigées par un traitement UDG. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le dosage WTB-PCR décrit ici utilise un ensemble générique d'amorces avec un oligo blocage conçu pour bloquer l' amplification de l' ADN WT pendant l' extension (Figure 1). Le produit WTB-PCR est ensuite séquencée pour l'analyse mutationnelle. L'utilité de WTB-PCR / Sanger réside dans sa simplicité, de haute sensibilité, et à haut débit. En utilisant les directives décrites ici, la plupart des tests basés sur Sanger existants peuvent être simplement modifiés par l'ajout d'un oligonucléotide de blocage pour augmenter considérablement la sensibilité. Dans l'essai d'exemple présenté ici l'addition d'un oligonucléotide de blocage unique de PCR a augmenté la limite de détection de l' allèle mutant d' environ 16% dans un fond de WT pour le dosage classique à> 0,5% dans le dosage WTB-PCR 3. L'effet est une réduction de 64% des faux négatifs observés dans les essais cliniques 3. Confirmation de la présence de mutations dans MYD88 a significative impl diagnostique et pronostiqueications; signaler faussement un cas négatif peut avoir de graves conséquences sur le traitement et la gestion globale des patients. Test avec WTB-PCR est donc d'une grande importance, en particulier chez les patients atteints cellularité anormale relativement faible.
Techniques WTB-PCR varient considérablement et sont parfois désignés de manière interchangeable avec LNA, BNA, ou serrage PCR à médiation par l' ANP ou des dosages PCR-pince-sonde 2, 4, 23, 24. Certaines variantes utilisant WTB-PCR impliquent une analyse qPCR ce qui nécessite la conception d'une sonde fluorescente supplémentaire pour chaque mutation spécifique. Un défi important lié à cette technique comprend la nécessité de développer des sondes de liaison compétitive qui discriminent avec précision entre les allèles mutants et WT. De plus, comme une sonde spécifique de mutation est nécessaire, l'approche qPCR n'a pas la capacité de détecter mutatio inconnuens. Une autre variante de blocs WTB-PCR amplification de WT d'une manière spécifique d'un allèle. Au lieu d'utiliser la mutation spécifique des amorces cependant, une sonde spécifique de blocage pour l'allèle WT inhibe la liaison primaire complète. Bien que cette approche ne nécessite pas une sonde spécifique mutation comme qPCR, il ne parvient pas à discriminer entre les mutations et la polymérase erreurs induites peuvent conduire à croissant de faux positifs. l'amplification exponentielle de ces polymerase erreurs induites par PCR peut obscurcir la détection d'événements mutationnels rares. Toute approche qui utilise l' amplification par PCR pour enrichir les mutations a sa précision limitée par la fréquence des erreurs de PCR 25, 26, 27. Un avantage fondamental de WTB-PCR / Sanger sur de nombreuses autres méthodes de haute sensibilité est qu'il empêche l'amplification à la fois de gabarit WT et mutant modèle dont les mutations se produisent en dehors de la région du gène ciblé par le oligonucleoti de blocagede. Par conséquent, les erreurs introduites par PCR polymérases sont efficacement filtrés avec l'ADN WT. Contrairement à l'AS-PCR ou qPCR cependant, l'enrichissement est conservée pour des mutations inconnues qui se produisent dans la région couverte par le blocage oligo-. Dans le cas de MyD88 WTB-PCR a permis la détection des deux mutations L265P et R264 * 3. D' autres ont également fait état de la détection de multiples mutations à basse fréquence avec l'utilisation de 4 WTB-PCR, 28. Cela rend idéal WTB-PCR pour la recherche et des fins cliniques.
Avec une sensibilité élevée et des contrôles internes inhérents à l'élimination des faux positifs, la flexibilité de WTB-PCR pour adapter un essai de séquençage existant avec très peu d'étapes supplémentaires avec la conception de bloqueur rendent option attrayante pour de nombreux laboratoires avec des tests établis. Le même ensemble d'amorces PCR utilisées dans un test classique peut typiquement être utilisé dans la variation WTB-PCR. otses changements de protocole qui sont fortement recommandés pour le traitement WTB-PCR, y compris UDG de tissu FFPE et de purification post-PCR appropriées méthodologies sont également cessible. conception Blocker, est donc l'élément essentiel dans la mise en œuvre d'un essai WTB-PCR. Bien que les lignes directrices présentées dans ce protocole représentent les facteurs les plus pertinents dans cette conception, divers oligonucléotides de blocage doivent être testés pour trouver un que l'amplification des blocs WT efficacement sans effets secondaires à la PCR. Cela inclut l' ajout ou le retrait des bases de blocage pour ajuster T m, en déplaçant la position du blocage par rapport à l'oligonucléotide matrice WT, et en changeant la longueur totale de l'oligo. Bloqueur des expériences de titrage devraient également être utilisés pour établir un équilibre entre les occurrences acceptables des artefacts de séquençage et la limite de détection.
La sélection d'une méthodologie appropriée pour la détection de mutations qui sont présents dans les fractions cellulaires minute dépend fortement de thapplication e et types maladie / mutation. Si la quantification mutant est souhaitée, qPCR ou PCR numérique peut offrir des solutions plus viables que WTB-PCR / Sanger. Bien que WTB-PCR est d'abord une analyse qualitative, il est possible de déterminer une estimation grossière de la fréquence de l'allèle mutant en testant un échantillon avec classique et WTB-PCR en parallèle. Étant donné que la limite de détection pour le dosage classique est d'environ 10 - allèle mutant de 20% dans un contexte de WT, il convient de conclure que les mutations détectées par le test WTB-PCR, mais pas le classique sont présents à une concentration inférieure à la limite de détection pour le dosage classique. Peu de tests offrent la polyvalence, la simplicité et la robustesse de WTB-PCR. Le faible coût et peu de temps d'exécution, il est idéal pour l'évaluation de la maladie résiduelle après le traitement ou le suivi des mutations de résistance émergentes au cours du traitement. En outre, la capacité de détecter des mutations précédemment indécrits rendent idéales WTB-PCR à des fins de recherche.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) | Roche | 12032937001 | With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
