Abstract
Presis deteksjon og identifikasjon av lavfrekvens-mutasjoner kan være problematisk ved vurdering av restsykdom etter behandling, screening for vekst resistensmutasjonene under behandling, eller når pasientene har noen sirkulerende tumorceller. Vill-type blokkerende PCR etterfulgt av sekvensanalyse gir høy følsomhet, fleksibilitet og enkelhet som en metode for å påvise disse lavfrekvente mutasjoner. Ved å legge til en spesialdesignet låst nukleinsyre oligonukleotid til en ny eller tidligere etablert konvensjonell PCR-sekvenseringsanalyse, kan følsomheten til omtrent 1 mutant allel i en bakgrunn av 1000 WT alleler bli oppnådd (1: 1000). Sekvenserings gjenstander forbundet med deaminering hendelser som vanligvis finnes i formalinfikserte paraffininnstøpte vev kan delvis avhjelpes ved bruk av uracil-DNA glycosylase under ekstraksjonstrinnene. Den optimaliserte protokollen her er spesifikk for påvisning av MyD88 mutasjon, men kan tjene som en mal for å konstruere et hvilket som helstWTB-PCR-analyse. Fordeler med den WTB-PCR-analyse i forhold til andre vanlig anvendte analyser for påvisning av lavfrekvens-mutasjoner, inkludert allele spesifikk PCR og real-time kvantitativ PCR omfatter færre tilfeller av falske positiver, større fleksibilitet og enkel implementering, og evnen til å detektere både kjente og ukjente mutasjoner.
Introduction
Sanger-sekvensering har tradisjonelt vært gullstandarden i testing for både kjente og ukjente somatiske mutasjoner. En av begrensningene ved Sanger-sekvensering er deteksjonsgrensen (~ 10 - 20% mutant allel i en bakgrunn av WT) 1. Dette nivået av følsomhet er upassende for å detektere lavt nivå somatiske mutasjoner som kan være tilstede i prøver fra pre-maligne vev eller pasienter med noen sirkulerende tumorceller, eller når benmarg (BM) er usammenhengende. Dette gjør også vurdere restsykdom etter terapi eller detektering av vekst resistens mutasjoner i løpet av behandlingen vanskelig ved konvensjonelle sekvensering alene 2. Ved å erstatte konvensjonelle PCR med låst nukleinsyre (LNA) -mediert villtype-blokkerende PCR (WTB-PCR) i Sanger-sekvensering, følsomheter på opp til 0,1% mutant allel i en bakgrunn av WT kan oppnås 2, 3, 4. IWTB-PCR, er berikelse for mutante alleler oppnås via tilsetning av et kort (~ 10 - 14 NT) blokkering (LNA) oligonukleotid som bindes fortrinnsvis til WT-DNA for derved å forhindre forsterkning av WT-DNA. Den mutante anrikede WTB-PCR-produktet kan deretter bli sekvensert. Ved å blokkere WT-DNA i stedet for å selektere for spesifikke mutasjoner WTB-PCR tillater anrikning av både kjente og ukjente mutasjoner er tilstede i små cellefraksjoner.
Flere fremgangsmåter er for tiden benyttes for å påvise mutasjoner i små celler fraksjoner. Dette omfatter allel-spesifikk PCR-amplifikasjon-ildfast mutasjon system (ARMS), denaturerende væskekromatografi med høy ytelse (DHPLC), perler, emulsjoner, forsterkning, og Magnetics (strålte), elektrisk felt-indusert frigjøring og måling (EFIRM), høyoppløsnings smeltepunkt og andre. Imidlertid er de fleste av disse fremgangsmåter begrenset av falsk-positive og evnen til bare å påvise en mutasjon som analysen ble konstruert for fire 5, 6.
Her viser vi økningen i følsomhet oppnås ved WTB-PCR i screening for mutasjoner i den myeloide differensieringsfaktor 88-genet, som beskrevet ved Albitar et al. 3 MyD88 mutations er viktige diagnostiske og prognostiske faktorer i Waldenstrøms makroglobulinemi (WM), IgM monoklonal gammopati av ukjent betydning (IgM-MGUS), miltens marginalsone lymfom (SMZL), og diffus stor B-celle lymfom (DLBCL). MyD88 mutasjoner er funnet i nesten alle tilfeller av WM og ca 50% av pasientene med immunglobulin M (IgM) -secreting MGUS. I kontrast til dette, er MyD88 mutasjoner funnet i bare 0-6% av pasientene med SMZL og er fraværende i multippel myelom 7, 8. Fordi overlappende morfologiske, immunophenotypic, cytogenetisk, og kliniske karakteristika mellom WM og SMZL eller IgM-multippelt myelom kan ofte komplisere differensialdiagnoser, kan tilstedeværelsen av en mutasjon MyD88 tjene som en nyttig å identifisere faktor 9. MyD88 mutasjoner har også vært forbundet med større sykdomsbyrde hos pasienter med DLBCL og dårlig total overlevelse etter behandlingen 7, 10. I tillegg, fordi MyD88 mutasjoner er mer hyppig finnes i aktiverte B-celle-lignende (ABC) DLBCL enn germinalsenter B-celle-lignende (GCB) DLBCL eller primær mediastinalt B-celle lymfom (PMBL), kan MyD88 mutasjons status tjene som en surrogatmarkør for ABC-subtype 11, 12.
Den detaljerte protokoll som fremlegges her tjener som en mal som nye analyser kan utvikles eller de fleste eksisterende sekvenseringsanalyser kan enkelt tilpasses for nøyaktig bestemmelse av lavfrekvens-mutasjoner i forskjellige prøvetyper. Tilnærmingen kan også brukes for å overvåke og detektere motstandsdyktig mutasjoner som kan utvikle seg i tumorer eller bakterier som kan utvikle seg, mens pasienter som behandles med målrettet terapi eller antibiotika. Videre omhandler det og remedier mange av problemene forbundet med mutasjon berikelse, spesielt i formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: All testing av humane prøver ble utført etter å skaffe Institutional Review Board (IRB) godkjennelse.
1. DNA-ekstraksjon fra FFPE Tissue, perifert blod, og benmargsaspirat
- For benmarg FFPE vevet med DNA FFPE ekstraksjonssett
- Begynn med FFPE vev fra ufargede bakker (5 - 10 seksjoner ved 5 - 10 um tykkelse).
MERK: Hvis starten med vev spon, bruke 3 - 6 deler ved 5 - 10 um tykkelse og går videre til trinn 1.1.6. - Plasser glir i en glide kurv og forberede fire vaske reservoarer (to for xylen og to for 100% alkohol). Legg til et minimalt volum av 600 ml av løsning til hver kurv.
- Deparaffinize lysbildene ved å gjøre en 5 min xylen vask i den første brett. Overfør glir til andre xylen vaskereservoar i ytterligere 5 min.
- Etter deparaffinization, vaske objektglassene med 100% alkohol i 5 min. Overfør glir til den annenalkohol vaskereservoar i ytterligere 5 min.
- Tillat lysbildene tørke fullstendig under en hette før skrape dem med et barberblad inn i et mikrosentrifugerør.
MERK: Hvis en H & E lysbilde med tumor-regionen antydet er tilgjengelig ved å plassere de glir og skrape bare tumorområdet. - Fortsett med instruksjoner fra produsenten handout inkludert i kit.
- Begynn med FFPE vev fra ufargede bakker (5 - 10 seksjoner ved 5 - 10 um tykkelse).
- For BM aspirer og perifert blod
- Pakk i henhold til produsentens instruksjoner handout med disse spesifikasjonene.
Merk: Det er mange kommersielt tilgjengelige sett og fremgangsmåter for DNA-ekstraksjon fra FFPE-vev og celler. Praktisk talt, alt kan brukes. Bruke en metode som er etablert i laboratoriet.- Bruk 200 ul perifert blod (PB) eller 100 pl BM + 100 ul PBS.
- Bruk 4 mL RNase En stamløsning.
- Eluer med 100 uL elueringsbuffer.
- Pakk i henhold til produsentens instruksjoner handout med disse spesifikasjonene.
- DNA Kvantifisering
- Mål DNA-konsentrasjoner ved hjelp av et spektrofotometer som sikrer en 260 nm / 280 nm-forholdet på tilnærmet 1,8 (for ren DNA). Hvis forholdet er betydelig lavere, kan det indikere tilstedeværelse av protein, fenol, eller andre forurensninger som kan interferere med nedstrømsapplikasjoner.
- Juster DNA-konsentrasjoner på omtrent 50 til 100 ng / ul med passende elueringsbuffer.
2. Wild-Type Blokkering PCR
- primer design
- Design og skaffe primere for gener av interesse i henhold til tidligere beskrevne generelle retningslinjer av PCR-primeren utforming 13. Inkluder M13-forover og bakover universelle sekvense primere i PCR-primere.
MERK: MyD88-analyse ble utviklet for å amplifisere exon 5 av MyD88 (G259 - N291) og 110 nukleotider lokalisert i 5'-intronområdet for å dekke spleisesetet og en del av intronet 4. forover og revers primere ble utformet med en 5' -M13 sekvens (M13 fremover: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-revers: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) for å tillate for gløding av komplementære sekvenseringsprimere (se Materialer tabell).
- Design og skaffe primere for gener av interesse i henhold til tidligere beskrevne generelle retningslinjer av PCR-primeren utforming 13. Inkluder M13-forover og bakover universelle sekvense primere i PCR-primere.
- Stengte Nucleic Acid oligonukleotid Design
- Utforme sperre oligonukleotid til å være omtrent 10 - 15 baser i lengde og komplementær til WT malen hvor mutant anrikning er ønsket.
MERK: En kortere oligo vil forbedre mismatch diskriminering. For å oppnå høy target spesifisitet, er det viktig å ikke bruke for mye blokkerer nukleotider siden dette kan resultere i en veldig "klissete" oligonukleotid. Innholdet og lengden og blokkerende nukleotid bør å være optimal i henhold til den spesifikke nukleotid som må blokkeres. Det er viktig for å oppnå høy bindingsspesifisitet uten at sekundærstruktur og risikere selv-komplementaritet. - Utforme sperre oligo å ha en T m 10 - 15 ° C over forlengelsen temure under termo. T m justere ved å legge til eller fjerne blokkerende baser eller ved å erstatte blokkerende baser for DNA og samtidig unngå lange strekninger (3 - 4 baser) for å blokkere G eller C-baser.
- Naviger til oligo verktøy nettsted (se tabell for material) og velg "blokkerer Oligo Tm Tippe" -verktøyet.
- Lim sekvensen til WT malen som er ønsket å bli blokkert i "Oligo Sekvens" -boksen. Legg til "+" foran baser for å indikere blokkering baser.
- Velg "Beregn" -knappen for å bestemme den omtrent T m av DNA-blokkering hybrid.
- Utforme den blokkerende oligonukleotidet for å unngå sekundærstrukturdannelse eller selv-dimerer.
- Naviger til oligo verktøy nettsted (se tabell for material) og velg "blokkerer Oligo Optimizer" -verktøyet.
- Lim sekvensen til WT malen som er ønsket å bli blokkert inn i boksen. Legg til "+" foran baser for å indikere blokkering baser.
- Velg de to boksene på "Secondary struktur" og "Self Only". Trykk på Analyser for å gjennomgå den oligo for potensielt problematiske sekundære strukturer eller selv-dimerer.
MERK: Stillingen representere meget grove anslag av T m 's av de sekundære strukturer og selv-dimerer. Lavere score er derfor optimalt og kan oppnås ved å begrense blokkering blokker sammenkobling. Den blokkerende oligonukleotid for MyD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] ble utformet for å dekke aminosyrene Q262-I266, og har en 3'-invertert dT til å inhibere både forlengelse av DNA-polymerase og nedbryting ved 3'-eksonuklease. Denne spesifikke blokkerende oligo er en 17mer med 10-blokkerende baser som blir betegnet som "+ N". De gjenværende 7-baser er vanlige DNA-nukleotider.
- Utforme sperre oligonukleotid til å være omtrent 10 - 15 baser i lengde og komplementær til WT malen hvor mutant anrikning er ønsket.
- WTB-PCR oppsett og termo
- Fremstill en WTB-PCR stam mix (MMX) ved anvendelse av 2,5 pl PCR-reaksjonsbuffer 10x w / 20 mM MgCl2, 250 uM dNTP, 0,2 pM forover og revers primer, 1,2 mM MYD88blocker, og DNAse, RNase-fritt, ultrarent H2O for å lage en endelig oppløsningsvolum på 21.75 mL per reaksjon.
MERK: Arbeide konsentrasjoner er for den endelig reaksjonsvolum på 25 ul (etter tilsetning av DNA-templat og polymerase). Konvensjonell PCR MMX fremstilles ved ganske enkelt å utelate tilsetningen av stopperen. Alle protokolltrinn forblir identisk for både WTB og konvensjonelle PCR. Dette kan brukes i validering og bestemmelse av anriking oppnås ved tilsetning av blokkering.- Ved beregning av mengden av MMX for å forberede sørge for å ta hensyn til 3 ytterligere reaksjoner (positive og negative kontroller og en ikke-templat-kontroll for å se etter kontaminering) og minst en ytterligere reaksjons for pipetteringsfeil.
- Vortex MMX grundig. Den MMX kan oppbevares ved -80 ° C i opp til ayøre.
- Legg 0,25 pl Taq DNA-polymerase per reaksjon på den MMX og inverteres for å blande. Når polymerase har blitt lagt til MMX, holde det på is.
- Sette en ny 96-brønners PCR-plate på en kald plate og pipette 22 ul av MMX med polymerase til hver reaksjon brønn.
- Tilsett 3 mL genomisk DNA (50 - 100 ng / pl til hver av brønnene som inneholdt den MMX med polymerase.
- Forsegl platen og sentrifugen kort stund for å sikre at løsningen når bunnen av hver brønn.
- Installering av PCR-plate på en termosykler.
- Angi de termosyklerbetingelser for WTB-PCR-reaksjon som følger: innledende denaturering ved 95 ° C i 6 minutter; 40 cykler med denaturering ved 95 ° C i 30 s, primerannealing ved 56 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 1 min 20 s; finale ekstensjon ved 72 ° C i 10 min.
MERK: Beste praksis innebærer fullføre resten av protokollen i et fysisk atskilt område for å unngå fragment forurensning in fremtidige oppsett.
- Angi de termosyklerbetingelser for WTB-PCR-reaksjon som følger: innledende denaturering ved 95 ° C i 6 minutter; 40 cykler med denaturering ved 95 ° C i 30 s, primerannealing ved 56 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 1 min 20 s; finale ekstensjon ved 72 ° C i 10 min.
- Fremstill en WTB-PCR stam mix (MMX) ved anvendelse av 2,5 pl PCR-reaksjonsbuffer 10x w / 20 mM MgCl2, 250 uM dNTP, 0,2 pM forover og revers primer, 1,2 mM MYD88blocker, og DNAse, RNase-fritt, ultrarent H2O for å lage en endelig oppløsningsvolum på 21.75 mL per reaksjon.
- Utføre gel-elektroforese i henhold til tidligere beskrevne protokoller 14 for å bestemme om WTB-PCR var vellykket og for å bekrefte mangel på forsterkning i den ikke-templat kontroll.
- Rensing av PCR-produktet ved magnetiske kuler
- Fjern magnetiske kuler fra 4 ° C og bringe til romtemperatur.
- Overfør 10 ul PCR-produktet til en ny PCR-plate.
- Vortex de magnetiske kuler kraftig for å fullstendig resuspendere de magnetiske partikler.
- Legg 18 ul magnetiske kuler til hver brønn på den nye plate. Pipette blande 10 ganger.
- Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
- Plasser PCR-platen på den side-gikk langs magnetplate i 2 min for å separer perler fra løsning.
- Aspirer supernatanten med en multikanal pipette, unngår vulsten pellet.
- Dispensere 150 ul 70% etanol til hver brønn og inkuber ved værelsestemperatur for i minst 30 sek. Aspirer etanol med en multikanalspipette og kast tips. Gjenta dette vaskeprosedyren igjen.
- Ved hjelp av en 20 ul multikanalspipette aspirere den gjenværende etanol fra hver brønn og kast tips.
- Når brønnene er tørre (~ 10 min), fjernes fra magnetplaten og tilsett 40 pl nuklease fritt vann til hver brønn, og blandingen pipette 15 ganger eller vortex forsiktig.
- Inkuber ved romtemperatur i 2 min.
- Plasser PCR-platen på magnetplaten i 1 min for å separer perler fra løsning.
- Overføring 35 mL av renset produkt i en ny PCR-plate. Dette ble renset PCR-produkt er nå klar til å gå videre med toveis sekvensering eller kan lagres ved -20 ° C inntil behov.
MERK: Ved utvikling av en ny analyse, kan være nødvendig for kvantifisering av renset PCR-produkt. 1 - 3 ng / pl DNA fragment er optimal for toveis sekvensering. Hvis konsentrasjonen er gjennomgående lav, øke PCR-produkt og magnetiske kuler proportionally (1: 1,8). Hvis konsentrasjonen er gjennomgående høy, elueres med et større volum av vann.
3. Sekvensering av WTB-PCR produkt
- Toveis Sekvense
MERK: Den følgende protokoll er en modifisert form av produsentens instruksjoner som har blitt optimalisert for å bruke færre reagenser.- Forbered forover og revers-sekvenseringsreaksjon blander med 0,25 mL Ready Reaction blanding, 1,88 ul Sekvense buffer, 1,78 ^ M M13-F eller M13-R sekvenseringsprimere og legg og DNAse, RNase-fritt, ultrarent H2O for å lage en sluttløsning volum av 9 mL per reaksjon. Denne sekvenseringsreaksjonsblandingen, kan lagres ved -20 ° C i opp til ett år.
- Pipetter 9 mL av den fremre sekvenseringsreaksjonsblandingen i hver brønn i en ny 96-brønners PCR-plate for foroversekvenseringsreaksjonen. Gjenta på en separat plate for den omvendte sekvenseringsreaksjonen.
- Tilsett 1 pl av den rensede WTB-PCR-produkt to hver brønn på både forover- og retur platene.
- Forsegl platen og sentrifugen kort stund for å sikre at løsningen når bunnen av hver brønn.
- Installering av PCR-plate på en termosykler.
- Angi de termosyklerbetingelser for sekvenseringsreaksjonen som følger: 96 ° C i 1 min; 30 sykluser med 96 ° C i 10 s, 50 ° C i 5 s, 60 ° C i 4 minutter; hold ved 4 ° C inntil de er klare for rensing.
- Rense Sekvense Produkter
- Fremstill en frisk 01:25 oppløsning av 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 100% etanol.
- Fremstill en frisk 70% etanoloppløsning.
- Tilsett 30 pl natriumacetat / 100% etanol-løsning til hver brønn av både forover- og reverssekvenserende plater og pipette blanding 5 ganger.
- Forsegl platen og inkuber i mørke ved romtemperatur i 20 min.
- Sentrifuger plate ved 2250 xg i 15 min.
- Fjern platen sealer og invertere over en søppelcontainer.
MERK: Invert bare en gang eller pellet kan løsne fra brønn bunner. - Plasser den snudde plate på et rent papirhåndkle og sentrifuger ved 150 xg i 1 min.
- Tilsett 150 ul 70% etanol til hver brønn.
- Forsegl platen og sentrifugering ved 2250 xg i 5 min.
- Gjenta trinn 3.2.6 og 3.2.7.
- Dersom brønnene ikke er helt tørre, tillater dem å lufttørke ved romtemperatur. Sørg for at prøvene er beskyttet mot lys under tørking.
- Tilsett 10 mL Formamide til hver brønn og pipette mix 10 ganger. Forsegle plate.
- Denatureres på termo ved 95 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 4 ° C i 5 min.
- Etter denaturering, bytt plate sealer med skillevegger og rekkefølge på sekvense plattform i henhold til produsentens instruksjoner 15.
4. Analyse av Sekvenseringsresultater
- Visualiser sekvense spor ved hjelp av en sekvense daten analyse programvaren i henhold til produsentens instruksjoner 16 og justere for de respektive referansesekvenser. Juster MyD88 til NCBI referansesekvens "NM_002468".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et begrepsmessig oversikt over WTB-PCR under utvidelsen er presentert i figur 1. Fordi et enkelt nukleotid mistilpasning i blokkerings-DNA hybrid sterkt reduserer dets smeltetemperatur (aT m = 20 - 30 ° C), forsterkning av WT allelet er sperret mens mutant templat-DNA er fri til å fullføre forlengelsen 17. På denne måte blir mutant-DNA amplifiseres eksponentielt, mens WT-DNA blir amplifisert lineært.
En demonstrasjon av mutant anriking oppnås ved WTB-PCR er presentert i figur 2. Genomisk DNA fra pasienter med og uten mutasjoner ble testet ved både konvensjonelle og WTB-PCR og deretter sekvensert for å vise den typiske anriking oppnås ved WTB-PCR og mangel på falske positiver i WT-DNA. Arbeids Konsentrasjonen av blokker anvendt i WTB-PCR MMX bør bestemmes ved titrering eksperimenter og should oppnå det ønskede nivået av mutant anriking mens ikke fører til falske positiver eller blokkering amplifisering av WT-DNA fullstendig. Sekvensanalyse av WTB-PCR-produkt viser anrikning for det mutante allel og en påvisningsgrense som overstiger 0,5% mutant allel i en bakgrunn av WT, sammenlignet med 16% i konvensjonelle PCR-3.
Effekten av denne økning av følsomheten ved klinisk utprøvning, kan variere avhengig av den relative mengde av neoplastiske celler i prøvene som ble testet. I en sammenligningsstudie fremgangsmåter, har den WTB-PCR-assay som er beskrevet her viste at 64% av MyD88 mutasjoner ville bli savnet ved konvensjonell testing av pasienter med WM eller MGUS 3.
Et karakteristisk drop-off i signalintensitet (figur 3) blir ofte sett hvis en for høy konsentrasjon av blokkering blir anvendt eller dersom post-PCR purificasjon mislyktes i å fjerne blokkeringen før toveis sekvensering. Den sistnevnte blir demonstrert når magnetiske kuler rensing er substituert for enzymatisk rensing. Selv enzymatisk rensing er et attraktivt alternativ når det arbeides med større prøvenummer, er det uegnet for anvendelse med WTB-PCR som det ikke klarer å fjerne blokkeringen fra oppløsningen før sekvensering.
Et eksempel på sekvens gjenstander som ofte finnes i FFPE-avledet DNA som et resultat av cytosin deaminering (C: G> T: A) er presentert i figur 4 3, 18, 19, 20. Selv om de faktiske årsaker til cytosin deaminering er dårlig forstått, vil eventuelle PCR-basert analyse som beriker for mutante alleler oppdage disse lavfrekvente gjenstander 21, 22. Falske positive på grunn av deaIMINERING unngås best ved å starte med høy kvalitet mal materiale; i mange tilfeller hvor dette ikke er mulig, kan behandling med uracil-DNA-glykosylase (UDG) under uttrekking hjelpe til med å begrense hyppigheten og intensiteten av deaminering gjenstander. UDG behandling av FFPE vev under ekstraksjon (som en del av DNA-FFPE kit) excises deaminert cytosinrestene for derved å forhindre kunstig indusert C: G> T: A mutasjoner. Imidlertid er 5-metylcytosin-rester som ofte forekommer på CpG-dinukleotider deamineres til tymin, som ikke kan skjæres ut ved UDG. De resulterende sekvense gjenstander er ganske gjenkjennelig og ofte fremstå som tandem mutasjoner som vist i figur 4. Hvis prøvene har allerede blitt trukket ut, kan UDG behandling gjennomføres i et sekundært ekstraksjon med forholdsvis lav DNA-tap.
Figur 1: Konsept Overview av WTB-PCR. En enkelt nukleotid mismatch i Blocker-DNA hybrid reduseres T m med opp til 30 ° C. Ved å utforme sperre oligonukleotid for å ha en Tm på 10 - 15 ° C over temperaturen under utvidelsen, er amplifikasjon av WT-DNA blokkeres samtidig som den tillater amplifisering av mutant DNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Genomisk DNA fra pasienter med og uten mutasjoner ble testet ved både konvensjonelle og WTB-PCR og deretter sekvensert for å vise den typiske anriking oppnås ved WTB-PCR. Den endelige konsentrasjonen av blokker brukes for å oppnå WTB-PCR ble valgt for å oppnå maksimal mutant anriking mens ikke forårsaker falske positiver i WT-DNA eller blokkerer amplificasjon av WT-DNA fullstendig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Karakteristisk drop-off i signalintensitet sees ved enzymatisk PCR rensing anvendes i stedet for magnetiske kuler. Dette er sannsynligvis fordi enzymatisk rensing ikke klarer å fjerne blokker før toveis sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: C: G> T: A sekvenseringsartifakter oppstå i FFPE-vev når cytosin eller metylert cytosin blir deaminert vIA formalin fiksering til uracil eller thymin, henholdsvis. Uracil-DNA-glykosylase (UDG) kan skjære uracil før WTB-PCR bidrar til å redusere sekvenseringsartifakter. Men tymin følge deaminert 5-metylcytosin, som ofte oppstår ved CpG øyer, ikke kan skjæres ut av UDG. Redusere konsentrasjonen av blokker anvendt i WTB-PCR kan bidra til å redusere forekomsten av sekvenserende gjenstander som ikke er avhjulpet ved UDG behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WTB-PCR-assay som er beskrevet her anvender en generisk sett av primere med en blokkerende oligo utformet for å blokkere amplifikasjon av WT-DNA under forlengelse (figur 1). WTB-PCR-produktet blir deretter sekvensert for mutasjonsanalyse. Anvendeligheten av WTB-PCR / Sanger ligger i dens enkelhet, høy følsomhet og høy gjennomstrømming. Ved å bruke de retningslinjer som er beskrevet her, kan de fleste eksisterende Sanger-baserte analyser på enkel måte modifiseres ved tilsetning av et blokkerings oligonukleotid for å øke følsomheten. I eksempelet analysen er presentert her tilsetningen av en enkelt blokkerende oligonukleotid til PCR øket deteksjonsgrensen fra omtrent 16% mutant allel i en bakgrunn av WT for den konvensjonelle analysen til> 0,5% i WTB-PCR assay 3. Effekten av dette er en 64% reduksjon av falske negativer sett i klinisk testing 3. Bekrefter tilstedeværelsen av mutasjoner i MyD88 har betydelig diagnostisk og prognostisk implgrader; feilaktig rapportering en sak som negativt kan få alvorlige konsekvenser for helhetlig behandling og pasienthåndtering. Testing med WTB-PCR er derfor av stor betydning, spesielt i pasienter med forholdsvis lav abnorm cellularitet.
WTB-PCR-teknikker varierer betydelig og er noen ganger referert til hverandre med LNA, BNA, eller PNA-mediert PCR klem eller PCR-klemme-probe-assay-2, 4, 23, 24. Noen variasjoner som benytter WTB-PCR innebære en qPCR-analyse som nødvendiggjør en ytterligere utforming av fluorescerende probe for hver spesifikk mutasjon. En betydelig utfordring i forbindelse med denne teknikken innbefatter behovet for å utvikle kompetitiv binding prober som skille nøyaktig mellom WT og mutante alleler. Videre, fordi en mutasjon spesifikk probe er nødvendig, mangler qPCR tilnærming evnen til å oppdage ukjente mutations. En annen variant av WTB-PCR blokker WT-amplifikasjon i en allel-spesifikk måte. I stedet for å bruke mutasjonsspesifikke primere imidlertid en blokkerende sonde spesifikk for WT allele inhiberer fullstendig primerbinding. Mens denne tilnærmingen ikke krever en mutasjon-spesifikk probe som qPCR, ikke klarer å skille mellom mutasjoner og polymerase indusert feil kan føre til økt falske positiver. Eksponensiell amplifikasjon av de polymerase indusert feil gjennom PCR kan tilsløre påvisning av sjeldne mutasjonstilfeller. Enhver metode som benytter PCR-amplifikasjon for å anrike for mutasjoner har sin nøyaktighet begrenset av hyppigheten av PCR-feil 25, 26, 27. En grunnleggende fordel med WTB-PCR / Sanger fremfor mange andre med høy følsomhet metoder er at det hindrer amplifisering av både WT templat og mutant templat som har mutasjoner fore utenfor genet Området som målsøkes ved hjelp av sperre oligonucleotide. Derfor er PCR-feil som introduseres av polymeraser effektivt filtrert ut sammen med WT-DNA. I motsetning til AS-PCR eller qPCR imidlertid anrikning beholdes for ukjente mutasjoner som forekommer innenfor det området som dekkes av det blokkerende oligo. I tilfelle av MyD88, WTB-PCR tillot påvisning av både L265P og R264 * mutasjoner 3. Andre har rapportert tilsvarende påvisning av multiple, lavfrekvente mutasjoner med bruk av WTB-PCR 4, 28. Dette gjør WTB-PCR ideell for både forskning og kliniske formål.
Sammen med høy følsomhet og iboende interne kontroller for å eliminere falske positiver, WTB-PCR fleksibilitet for å tilpasse en eksisterende sekvense analysen med svært få ekstra trinn med blocker design gjør det attraktivt alternativ for mange laboratorier med etablerte analyser. Det samme sett av PCR-primere som brukes i en konvensjonell analyse kan vanligvis benyttes i den WTB-PCR variasjon. Othennes protokoll endringer som er sterkt anbefalt for WTB-PCR-UDG inkludert behandling av FFPE vev og hensiktsmessige post-PCR-rensemetoder-er like overføres. Blokkering utforming, er derfor kritisk element i å implementere en WTB-PCR-analyse. Selv om de retningslinjer som presenteres i denne protokollen representerer de mest relevante faktorer i denne utforming, bør ulike blokkerende oligonukleotider bli testet for å finne en som blokkerer WT forsterkning effektivt uten sekundære effekter til PCR. Dette omfatter tilsetning eller fjerning av blokkering av baser for å justere T m, skifter stilling sperre oligo forhold til WT malen, og å endre den totale lengde av oligo. Blokke titreringseksperimenter bør også benyttes for å etablere en balanse mellom akseptable forekomster av sekvensering av gjenstander og deteksjonsgrense.
Valg av en passende metode for å detektere mutasjoner som er til stede i liten cellefraksjoner avhenger i stor grad på the søknad og sykdom / mutasjonstyper. Hvis mutant kvantifisering er ønskelig, kan qPCR eller digitalt PCR tilby mer gjennomførbare løsninger enn WTB-PCR / Sanger. Selv om WTB-PCR er i første rekke en kvalitativ bestemmelse, er det mulig å bestemme et grovt estimat av mutant allel frekvens ved testing av en prøve med konvensjonelle og WTB-PCR i parallell. På grunn av at påvisningsgrensen for den konvensjonelle analysen er ~ 10 - 20% mutant allel i en bakgrunn av WT, er det hensiktsmessig å konkludere med at mutasjoner som registreres av WTB-PCR-analyse, men som ikke er den vanlige er til stede i en konsentrasjon lavere enn grenseverdien deteksjons~~POS=TRUNC for den konvensjonelle analysen. Noen analyser tilby allsidigheten, enkelhet og robusthet for WTB-PCR. Den lave kostnader og kort behandlingstid gjør det ideelt for å bedømme restsykdom etter terapi eller kartleggingen av nye resistente mutasjoner under behandlingen. I tillegg er evnen til å oppdage tidligere ubeskrevet mutasjoner gjøre WTB-PCR ideell for forskningsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) | Roche | 12032937001 | With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
