Abstract
Nauwkeurige detectie en identificatie van laagfrequente mutaties kan problematisch zijn bij de beoordeling residuele ziekte na therapie screenen op opkomende resistentie mutaties tijdens de therapie, of wanneer patiënten hebben weinig circulerende tumorcellen. Wildtype blokkerende PCR en sequentieanalyse biedt een hoge gevoeligheid, flexibiliteit en eenvoud een methode voor detecteren van deze laagfrequente mutaties. Door een speciaal ontworpen vergrendeld nucleïnezuur oligonucleotide een nieuwe of eerder vastgestelde conventionele PCR sequencing assay kan gevoeligheden van ongeveer 1 mutant allel in een achtergrond van 1000 WT allelen worden bereikt (1: 1000). Sequencing artefacten geassocieerd met deaminering gebeurtenissen die algemeen in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsels kan gedeeltelijk verholpen door het gebruik van uracil DNA glycosylase gedurende extractiestappen. De geoptimaliseerde protocol hier specifiek is voor het detecteren MyD88 mutatie, maar kan als een sjabloon voor elk model te dienenWTB-PCR-bepaling. Eigenschappen WTB-PCR-test op andere gewoonlijk gebruikte bepalingen voor het detecteren van lage frequentie mutaties waaronder allelspecifieke PCR en real-time kwantitatieve PCR onder minder voorkomen van valse positieven, grotere flexibiliteit en gemak van implementatie en het vermogen zowel bekende detecteren en onbekende mutaties.
Introduction
Sanger sequencing is van oudsher de gouden standaard in het testen voor zowel bekende als onbekende somatische mutaties geweest. Een van de beperkingen van Sanger sequentiebepaling is de detectiegrens (~ 10-20% mutant allel in een achtergrond van WT) 1. Dit niveau van gevoeligheid is niet geschikt voor het detecteren van lage somatische mutaties die in de monsters aanwezig kan zijn van premaligne weefsels of patiënten met weinig circulerende tumorcellen, of wanneer beenmerg (BM) is fragmentarisch. Dit maakt het ook de beoordeling van residuele ziekte na de behandeling of het opsporen van opkomende resistentie mutaties tijdens de behandeling bemoeilijkt door alleen 2 conventionele sequencing. Door vervanging van conventionele PCR met gesloten nucleïnezuur (LNA) gemedieerde wildtype blokkerende PCR (WTB-PCR) Sanger sequentiebepaling, gevoeligheden van maximaal 0,1% mutante allel in een achtergrond van WT worden gerealiseerd 2, 3, 4. InWTB-PCR, verrijking van mutante allelen wordt bereikt door de toevoeging van een korte (~ 10-14 NT) blokkeren (LNA) oligonucleotide dat bij voorkeur bindt aan WT DNA waardoor voorkomen amplificatie van WT DNA. De mutant-verrijkte WTB PCR-product kan daarna worden gesequenst. Door het blokkeren WT DNA in plaats van het selecteren op mutaties WTB-PCR maakt verrijking van zowel bekende als onbekende mutaties aanwezig in minieme celfracties.
Meerdere methoden worden momenteel gebruikt voor het detecteren van mutaties in kleine cellen fracties. Dit omvat allelspecifieke PCR-amplificatie-refractaire mutatiesysteem (ARMS), denaturerende vloeistofchromatografie (DHPLC), korrels, emulsies, amplificatie en magnetisme (stralend), elektrisch veld geïnduceerde afgifte en meting (Efirm), hoge resolutie smeltpunt en anderen. Echter, de meeste van deze methoden zijn beperkt door vals-positieven en de mogelijkheid om slechts één mutatie dat de test is ontworpen voor 4 sporen 5, 6.
Hier laten we zien de toename van de gevoeligheid verkregen door WTB-PCR screenen op mutaties in de myeloïde differentiatie factor 88 gen zoals beschreven door Albitar et al. 3 MyD88 mutations zijn belangrijke diagnostische en prognostische factoren in Waldenström Macroglobulinemia (WM), IgM monoclonale gammopathie van onbekende betekenis (IgM-MGUS), milt marginale zone lymfoom (SMZL) en diffuus grootcellig B-cellymfoom (DLBCL). MyD88 mutaties gevonden in bijna alle gevallen van WM en ongeveer 50% van de patiënten met immunoglobuline M (IgM) -secreting MGUS. Daartegenover zijn MyD88 mutaties gevonden in slechts 0-6% van de patiënten met SMZL en afwezig zijn bij multipel myeloom 7, 8. Omdat overlappende morfologische, immuunfenotypische, cytogenetische en klinische kenmerken tussen WM en SMZL of IgM-multiple myeloom vaak bemoeilijken differentiaaldiagnoses kan de aanwezigheid van een mutatie MyD88 een nuttig identificeren factor 9. MyD88 mutaties zijn ook geassocieerd met een grotere ziektelast bij patiënten met DLBCL en slechte algemene overleving na behandeling 7, 10. Bovendien, omdat MyD88 mutaties voorkomen bij geactiveerde B-cel-achtige (ABC) DLBCL dan kiemcentrum B-cel-achtige (GCB) DLBCL of primaire mediastinale B-cellymfoom (PMBL) kan MyD88 mutatiestatus als dienst surrogaat marker voor de ABC-subtype 11, 12.
De gedetailleerde protocol die hier als een matrijs waaruit nieuwe assays kunnen worden ontwikkeld en de meeste bestaande sequentie bepalingen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan laagfrequente mutaties in diverse soorten monsters nauwkeurig te detecteren. De benadering kan ook worden gebruikt voor het bewaken en detecteren van resistente mutaties die kunnen ontwikkelen tumoren of zelfs bacteriën die kan optreden terwijl patiënten behandeld met gerichte therapie of antibiotica. Verder behandelt het en rechtsmiddelen veel van de problemen in verband met mutatie verrijking, met name in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle testen van menselijke monsters werd uitgevoerd na het verkrijgen van Institutional Review Board (IRB) goedkeuring.
1. DNA-extractie uit FFPE weefsel, perifeer bloed en beenmergaspiraat
- Beenmerg FFPE weefsel met DNA FFPE extractiekit
- Beginnen FFPE weefsel van ongekleurd slides (5-10 secties 5-10 urn dikte).
Opmerking: Als begin met weefsel spaanders, gebruik 3-6 secties 5-10 urn dikte en verder met stap 1.1.6. - Plaats dia's in een dia mand en voor te bereiden vier wassen reservoirs (twee voor xyleen en twee voor 100% alcohol). Voeg een minimumvolume van 600 ml oplossing voor elke mand.
- Deparaffinize de objectglaasjes door het doen van een 5 min xyleen wassen in de eerste bak. Breng de objectglaasjes tweede xyleen wasreservoir gedurende nog 5 min.
- Na deparaffineren Was de dia's met 100% alcohol gedurende 5 minuten. Breng de dia's naar de tweedealcoholwassing reservoir gedurende nog 5 min.
- Laat de objectglaasjes volledig drogen in een zuurkast voor hen schrapen met een scheermesje in een microcentrifugebuis.
OPMERKING: Indien een H & E dia met tumorgebied aangegeven beschikbaar is, verplaats de geleiders en schraap alleen tumorgebied. - Ga verder met de instructies van de fabrikant handout opgenomen in de kit.
- Beginnen FFPE weefsel van ongekleurd slides (5-10 secties 5-10 urn dikte).
- Voor BM aspireren en perifere bloed
- Extract volgens de fabrikant instructies van hand-out met deze specificaties.
LET OP: Er zijn tal van commercieel verkrijgbare kits en methoden voor DNA-extractie uit FFPE weefsels en cellen. Vrijwel alle kunnen worden gebruikt. Gebruik een methode die is vastgelegd in het laboratorium.- Met 200 pi van perifeer bloed (PB) of 100 pl BM + 100 pi PBS.
- Met 4 pi RNase A voorraadoplossing.
- Elueer met 100 ul elutiebuffer.
- Extract volgens de fabrikant instructies van hand-out met deze specificaties.
- DNA kwantificering
- DNA concentraties meet met behulp van een spectrofotometer zorgen voor een 260 nm / 280 nm verhouding van ongeveer 1,8 (bij zuiver DNA). Wanneer de verhouding aanzienlijk lager is, kan de aanwezigheid van eiwitten, fenol of andere verontreinigingen die kunnen interfereren met verdere toepassingen geven.
- Passen DNA concentraties ongeveer 50-100 ng / ul met geschikte elutiebuffer.
2. wildtype blokkeren PCR
- primer ontwerp
- Ontwerpen verkrijgen primers voor genen van belang volgens de eerder beschreven algemene richtlijnen PCR primer ontwerp 13. Omvatten M13-voorwaartse en achterwaartse universele sequencing primers in PCR primers.
OPMERKING: De MyD88 assay ontwikkeld tot exon 5 van MyD88 amplificeren (G259 - N291) en 110 nucleotiden in het 5' gebied intronische de splitsingsplaats en een deel van intron 4. De voorwaartse en achterwaartse primers bedekken ontworpen met een 5' -M13 sequentie (M13-forward: TGT aaa acg acg gcc agt; M13-omgekeerde: cag gaa ACA GCT ATG acc) mogelijk te maken voor hybridisatie van complementaire sequencing primers (zie Materials Table).
- Ontwerpen verkrijgen primers voor genen van belang volgens de eerder beschreven algemene richtlijnen PCR primer ontwerp 13. Omvatten M13-voorwaartse en achterwaartse universele sequencing primers in PCR primers.
- Locked Nucleic Acid Oligonucleotide ontwerp
- Het ontwerp van de blokkerende oligonucleotide op ongeveer 10-15 basen lang en complementair met de WT matrijs waarin mutant verrijking gewenst.
OPMERKING: Een kortere oligo zal mismatch discriminatie te verbeteren. Om een hoge specificiteit te bereiken, is het belangrijk te veel blokkeren van nucleotiden niet te gebruiken, omdat dit kan leiden tot een zeer "sticky" oligonucleotide. De inhoud en de lengte en nucleotide blokkering moet worden geoptimaliseerd op basis van de specifieke nucleotide die moeten worden geblokkeerd. Het is belangrijk om hoge bindingsspecificiteit bereiken zonder afbreuk secondaire structuur en riskeren zelf-complementariteit. - Ontwerp het blokkeerorgaan oligo een Tm hebben 10-15 ° C boven het verlengstuk temperature tijdens thermocycli. Pas de Tm door het toevoegen of verwijderen blokkerende basen of door vervanging blokkeren basen DNA met vermijding van lange stukken (3-4 basen) blokkeren G of C basen.
- Navigeer naar de oligo gereedschappen website (zie tabel van Materialen) en selecteer de "blokkerende Oligo Tm Prediction" tool.
- Plak de sequentie van het template WT die gewenst is geblokkeerd in het vak "Oligo Sequence". Add "+" voor bases te blocker bases aan te geven.
- Selecteer de "Bereken" knop om de geschatte Tm van de DNA-Blocker hybride te bepalen.
- Ontwerp de blokkerende oligo om de vorming van secundaire structuur of self-dimeren te vermijden.
- Navigeer naar de oligo gereedschappen website (zie tabel van Materialen) en selecteer de "blokkerende Oligo Optimizer" tool.
- Plak de sequentie van het template WT die gewenst is geblokkeerd in het vak. Add "+" voor bases aan te geven blokkeren bases.
- Selecteer de twee vakken voor "Secundaire structuur" en "Self Only". Druk op de knop Analyseren om de oligo voor potentieel lastige secundaire structuren of zelf-dimeren te herzien.
LET OP: De scores vertegenwoordigen zeer ruwe schattingen van de T m 's van de secundaire structuren en zelf-dimeren. Lagere scores zijn dus optimaal en kan worden gerealiseerd door de blocker-blocker koppelen. De blokkerende oligonucleotide voor MyD88 [MYD88blocker (TCAGA AG + + C + G + A + C + G + T + A + T + CC / invdT /)] ontworpen aminozuren Q262-I266 bedekken en heeft een 3'-omgekeerde dT beide verlenging door DNA-polymerase en afbraak door 3'-exonuclease remmen. Deze specifieke blokkerende oligo is een 17-meer met 10 blokkerende basen die worden aangeduid als "+ N". De resterende 7 basen zijn normale DNA nucleotiden.
- Het ontwerp van de blokkerende oligonucleotide op ongeveer 10-15 basen lang en complementair met de WT matrijs waarin mutant verrijking gewenst.
- WTB-PCR Setup en Thermocycling
- Bereid een WTB-PCR meester mix (MMX) met 2,5 ui PCR-reactiebuffer 10x w / 20 mM MgCl2, 250 uM dNTPs, 0,2 uM voorwaartse en reverse primer, 1,2 uM MYD88blocker en DNAse, RNAse-vrij, ultrazuivere H2O ter verkrijging van een uiteindelijke creëren oplossing volume van 21,75 gl per reactie.
OPMERKING: Bedriifsconcentraties zijn voor het uiteindelijke reactievolume van 25 pl (na toevoeging van DNA template en polymerase). Conventionele PCR MMX wordt bereid door eenvoudig weglaten van de toevoeging van blokker. Alle stappen protocol blijft voor beide WTB en conventionele PCR. Dit kan worden gebruikt bij de validatie en het bepalen van de verrijking bereikt door toevoeging van blokker.- Bij de berekening van MMX voorbereiding ervoor zorgen om rekening te houden met 3 extra reacties (positieve en negatieve controles en een niet-template controle om te controleren op contaminatie) en ten minste nog 1 reactiemengsel voor pipetteerfout.
- Vortex MMX grondig. De MMX kan worden opgeslagen bij -80 ° C tot ayoor.
- Voeg 0,25 ul Taq DNA polymerase per reactie op de MMX en zwenken om te mengen. Zodra de polymerase is toegevoegd aan de MMX, houd het op ijs.
- Plaats een nieuwe 96 well PCR plaat op een koude plaat en pipetteer 22 pl met MMX polymerase aan elk reactieputje.
- Voeg 3 ul genomisch DNA (50-100 ng / ul aan elk van de putjes die de MMX met polymerase.
- Dicht de platen en centrifuge kort te zorgen voor de oplossing de bodem van elke put bereikt.
- Laad de PCR plaat op een thermocycler.
- Stel de temperatuurrondvoercondities voor WTB-PCR-reactie als volgt: initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 6 min; 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s, primer annealing bij 56 ° C gedurende 30 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min 20 s; laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
OPMERKING: Best practice betreft het invullen van de rest van het protocol in een fysiek gescheiden ruimte om amplicon besmetting te voorkomen in toekomst setups.
- Stel de temperatuurrondvoercondities voor WTB-PCR-reactie als volgt: initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 6 min; 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 30 s, primer annealing bij 56 ° C gedurende 30 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min 20 s; laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
- Bereid een WTB-PCR meester mix (MMX) met 2,5 ui PCR-reactiebuffer 10x w / 20 mM MgCl2, 250 uM dNTPs, 0,2 uM voorwaartse en reverse primer, 1,2 uM MYD88blocker en DNAse, RNAse-vrij, ultrazuivere H2O ter verkrijging van een uiteindelijke creëren oplossing volume van 21,75 gl per reactie.
- Voeren gelelektroforese volgens eerder beschreven protocollen 14 om te bepalen of WTB-PCR succesvol was en een gebrek aan amplificatie in de niet-matrijsstreng controle bevestigen.
- Zuivering van PCR product door magnetische beads
- Verwijder magnetische korrels bij 4 ° C en breng aan kamertemperatuur.
- Breng 10 pl PCR product aan een nieuwe PCR-plaat.
- Vortex de magnetische korrels krachtig volledig resuspenderen van de magnetische deeltjes.
- Voeg 18 ul magnetische bolletjes aan elk goed op de nieuwe plaat. Pipet mengen 10 keer.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Plaats de PCR-plaat op de zijde rokken magneetplaat gedurende 2 min te scheiden beads uit de oplossing.
- Zuig het supernatant met een meerkanaalspipet, vermijden de kraal pellet.
- Afzien 150 pl 70% ethanol in elk putje en incuberen bij kamertemperatuur for ten minste 30 s. Zuig het ethanol met een multichannel pipet en tips te verwijderen. Herhaal deze wasprocedure eens te meer.
- Toepassing van een 20 pi multikanaalspipet zuig het resterende ethanol uit elk putje en tips ontdoen.
- Zodra putjes droog (~ 10 min) verwijderen uit magneetplaat en voeg 40 ul nuclease-vrij water aan elk putje en pipet mix 15 keer of wervel voorzichtig.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
- Plaats de PCR-plaat op magneetplaat gedurende 1 min tot afzonderlijke korrels uit de oplossing.
- Overdracht 35 pi gezuiverd produkt een nieuwe PCR-plaat. Dit gezuiverde PCR-product kan nu doorgaan met bidirectionele sequentiebepaling of kan worden opgeslagen bij -20 ° C totdat het nodig is.
OPMERKING: Bij de ontwikkeling van een nieuw assay kan kwantificatie van gezuiverde PCR-product vereist. 1-3 ng / ul amplicon DNA optimaal is voor bidirectionele sequentiebepaling. Indien concentratie constant laag verhogen PCR product en magnetische korrels proportionally (1: 1,8). Indien concentratie constant hoog, elueer met een groter volume water.
3. Sequencing van WTB-PCR-product
- Bi-Directional Sequencing
OPMERKING: Het volgende protocol is een gemodificeerde vorm van de instructies van de fabrikant die is geoptimaliseerd om minder reagentia gebruiken.- Bereid voorwaartse en omgekeerde sequentiereactie mengt met 0,25 gl Ready Reaction mix, 1,88 pl Sequencing Buffer, 1,78 uM M13-F of M13-R sequencing primers en voeg en DNAse, RNAse-vrij, ultrazuivere H2O ter verkrijging van een uiteindelijke oplossing te creëren volume van 9 pi per reactie. Deze sequentie reactiemengsel kan tot een jaar opgeslagen bij -20 ° C.
- Pipet 9 ul van de voorwaartse sequentie reactiemengsel in elk putje van een nieuwe 96-puts PCR platen voor de voorwaartse sequentie reactie. Herhaal op een afzonderlijke plaat voor de omgekeerde sequentiereactie.
- Voeg 1 ul van het gezuiverde PCR-product WTB to elk putje van zowel de voorwaartse en achterwaartse platen.
- Dicht de platen en centrifuge kort te zorgen voor de oplossing de bodem van elke put bereikt.
- Laad de PCR plaat op een thermocycler.
- Stel de temperatuurrondvoercondities de sequentie reactie als volgt: 96 ° C gedurende 1 min; 30 cycli van 96 ° C gedurende 10 s, 50 ° C gedurende 5 seconden, 60 ° C gedurende 4 min; houden op 4 ° C tot gereed voor zuivering.
- Zuiver Sequencing Producten
- Bereid een verse 1:25 oplossing van 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 100% ethanol.
- Bereid een verse 70% ethanol-oplossing.
- Voeg 30 ul natriumacetaat / 100% ethanol oplossing in elk putje van zowel de voorwaartse en teruggaande sequentie borden en pipet mengsel 5 maal.
- Bedek de plaat en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Centrifugeer de plaat bij 2250 xg gedurende 15 min.
- Verwijder het plaatafsluiter en zwenken over een verspillingcontainer.
LET OP: Omkeren slechts één of de korrel kan los te maken uit de put bodems. - Plaats de omgekeerde plaat op een schone papieren handdoek en centrifugeer bij 150 xg gedurende 1 minuut.
- Voeg 150 ul 70% ethanol aan elk putje.
- Bedek de plaat en draaien bij 2250 xg gedurende 5 minuten.
- Herhaal stap 3.2.6 en 3.2.7.
- Als de putten zijn niet helemaal droog, laat ze aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de monsters worden beschermd tegen het licht tijdens het drogen.
- Voeg 10 pi formamide aan elk putje en pipet mix 10 keer. Bedek de plaat.
- Denatureren op thermocycler bij 95 ° C gedurende 3 min gevolgd door 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Na denaturering vervangen plaatafdichter met een septum en reeks aan sequentiebepaling platform volgens instructies van de fabrikant 15.
4. Analyse van sequentiebepalingsresultaten
- Visualiseren sequencing sporen met behulp van een sequentie DATeen analyse software volgens de instructies van de fabrikant en lijn 16 met de respectievelijke referentiesequenties. Uitlijnen MyD88 naar NCBI referentiesequentie "NM_002468".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een conceptueel overzicht van WTB-PCR gedurende het doortrekken wordt in Figuur 1. Omdat een enkele nucleotide mismatch in de blocker-DNA-hybride aanzienlijk verlaagt de smelttemperatuur (ATm = 20-30 ° C), amplificatie van het WT allel geblokkeerd terwijl mutant template DNA vrij verlengstuk 17 te voltooien. Op deze wijze wordt mutant DNA exponentieel geamplificeerd terwijl WT DNA lineair geamplificeerd.
Een demonstratie van de mutant verrijking bereikt door WTB-PCR is weergegeven in figuur 2. Genomisch DNA van patiënten met en zonder mutaties werden getest door zowel conventionele als WTB-PCR en vervolgens gesequenced om de typische verrijking bereikt door WTB-PCR en weinig valse positieven in WT DNA aan te tonen. De werkconcentratie van blokker gebruikt WTB-PCR MMX worden bepaald door titratie-experimenten en should bereiken van de gewenste mate van verrijking mutant terwijl het niet leidt tot valse positieven of blokkerende amplificatie van WT DNA volledig. Sequentieanalyse van WTB-PCR-product toont verrijking voor het mutante allel en een detectiegrens dan 0,5% mutante allel in een achtergrond van WT tegen 16% bij conventionele PCR 3.
De effecten van deze verhoging van de gevoeligheid in klinische testen kan variëren afhankelijk van de relatieve hoeveelheid van neoplastische cellen in de geteste monsters. In een vergelijkende studie werkwijzen heeft de WTB-PCR-test beschreven aangetoond dat 64% van MyD88 mutaties gemist zouden worden door gebruikelijke testen van patiënten met WM of MGUS 3.
Kenmerkend drop-off in signaalintensiteit (figuur 3) wordt vaak gezien als te hoge concentratie van blokker of bij gebruik van post-PCR Purificatie niet blocker voorafgaand aan de bi-directionele sequencing te verwijderen. Dit laatste blijkt, wanneer magnetische korrel zuivering wordt vervangen enzymatisch zuiveringsproces. Hoewel enzymatische zuivering is een aantrekkelijke optie bij het werken met grotere aantallen monsters, het is niet geschikt voor toepassing met WTB-PCR als het er niet in slaagt om blocker te verwijderen uit de oplossing voorafgaand aan sequencing.
Een voorbeeld van sequentie-artefacten vaak gevonden in FFPE-afgeleide DNA als gevolg van cytosine deaminering (C: G> T: A) zijn weergegeven in Figuur 4 3, 18, 19, 20. Hoewel de feitelijke oorzaken van cytosine deaminering slecht begrepen, zullen alle PCR gebaseerde assay die verrijkt voor mutante allelen deze lage frequentieartefacten 21, 22 detecteren. Valse positieven als gevolg van deaMINATIE worden best vermeden door te beginnen met een hoge kwaliteit template materiaal; in de vele gevallen waarin dit niet mogelijk is, kan behandeling met uracil DNA glycosylase (UDG) tijdens de extractie helpen bij het beperken van de frequentie en intensiteit van deaminering artefacten. UDG behandeling van FFPE weefsel gedurende extractie (als deel van het DNA FFPE kit) accijns gedesamineerd cytosineresiduen daardoor kunstmatig geïnduceerde preventie C: G> T: A mutaties. Echter, 5-methylcytosine residuen die vaak voorkomen op CpG dinucleotiden worden gedeamineerd naar thymine, die niet kunnen worden uitgesneden door UDG. De resulterende sequentie artefacten vrij herkenbaar en gedrag verschijnen tandem mutaties zoals in figuur 4. Indien reeds monsters zijn gewonnen, kan UDG behandeling in een tweede extractie met een relatief lage verliezen DNA worden uitgevoerd.
Figuur 1: Conceptueel OverView van WTB-PCR. Een enkele nucleotide mismatch in de Blocker-DNA-hybride verlaagt Tm tot 30 ° C. Door het ontwerpen van de blokkerende oligonucleotide met een Tm van 10 nodig - 15 ° C boven de temperatuur tijdens extensie wordt amplificatie van WT DNA geblokkeerd terwijl amplificatie van mutant DNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Genomisch DNA van patiënten met en zonder mutaties werden getest door zowel conventionele als WTB-PCR en vervolgens gesequenced om de typische verrijking bereikt door WTB-PCR demonstreren. De eindconcentratie van blokker gebruikt WTB-PCR bereiken werd gekozen om maximale mutant verrijking bereiken, terwijl geen valse positieven veroorzaken in WT DNA of blokkeren amplificatie van WT DNA volledig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakteristiek drop-off in signaalintensiteit waargenomen wanneer enzymatische PCR zuivering gebruikt in plaats van magnetische korrels. Dit komt waarschijnlijk omdat enzymatische zuivering niet in slaagt om blocker voorafgaand aan de bi-directionele sequencing te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: C: G> T: A sequencing artefacten ontstaan FFPE weefsel wanneer cytosine of gemethyleerde cytosine worden gedeamineerd via formalinefixatie uracil of thymine respectievelijk. Uracil DNA glycosylase (UDG) kan uracil uitsnijden vóór WTB-PCR sequencing helpen artefacten te reduceren. Echter, thymine als gevolg van gedeamineerde 5-methylcytosine, die vaak optreedt bij CpG eilanden, kan niet worden uitgesneden door UDG. Verlagen van de concentratie van blokker gebruikt WTB-PCR kan helpen om het optreden van artefacten die sequentie niet heeft verholpen UDG behandeling te verminderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De WTB-PCR-test beschreven maakt gebruik van een generieke reeks primers met een blokkerende oligo ontworpen om amplificatie van WT DNA blokkeren tijdens verlenging (Figuur 1). De WTB-PCR-product wordt vervolgens gesequenced voor mutatie-analyse. De bruikbaarheid van WTB-PCR / Sanger ligt in de eenvoud, hoge gevoeligheid en hoge doorvoer. Met de hier beschreven richtlijnen kunnen de meeste bestaande Sanger gebaseerde testen eenvoudig gemodificeerd worden door de toevoeging van een blokkerend oligonucleotide aan gevoeligheid sterk toenemen. In het voorbeeld test hier gepresenteerde toevoeging van een blokkerend oligonucleotide PCR verhoogde de detectielimiet van ongeveer 16% mutante allel in een achtergrond van WT voor het conventionele assay> 0,5% in de WTB-PCR-test 3. Het effect daarvan is een vermindering van 64% vals negatieven Tijdens klinisch onderzoek 3. Bevestiging van de aanwezigheid van mutaties in MyD88 heeft belangrijke diagnostische en prognostische implications; ten onrechte melding van een geval als negatief kan ernstige gevolgen hebben op de totale therapie en behandeling van de patiënt te hebben. Testen met WTB-PCR is daarom van groot belang, met name bij patiënten met een relatief lage abnormale cellulariteit.
WTB-PCR-technieken verschillend en worden soms uitwisselbaar met LNA, BNA of PNA-gemedieerde PCR klem- of PCR-clamp-probetesten 2, 4, 23, 24. Sommige varianten gebruik WTB-PCR leiden tot een qPCR assay die vereist dat het ontwerpen van een extra fluorescente probe voor elke mutatie. Een belangrijke uitdaging waaraan deze techniek omvat de noodzaak om competitief bindende probes die nauwkeurig onderscheid tussen WT en mutante allelen ontwikkelen. Bovendien, omdat een mutatie specifieke probe gewenst is, de qPCR aanpak ontbreekt de mogelijkheid om onbekende mutatio detecterenNS. Een andere variatie van WTB-PCR blokken WT amplificatie in een allel-specifieke wijze. In plaats van mutatie-specifieke primers echter een blokkerende probe specifiek voor het WT allel remt volledig primer binding. Hoewel deze aanpak een mutatie-specifieke probe, zoals qPCR niet nodig is, ontbreekt het onderscheid te maken tussen mutaties en polymerase geïnduceerde fouten kunnen leiden tot een verhoogde valse positieven. Exponentiële amplificatie van de polymerase geïnduceerde fouten door middel van PCR kan het detecteren van zeldzame mutationele gebeurtenissen verhullen. Elke benadering die PCR amplificatie gebruikt om te verrijken mutaties heeft de nauwkeurigheid beperkt door de frequentie van PCR-fouten 25, 26, 27. Een fundamenteel voordeel van WTB-PCR / Sanger over vele andere hooggevoelige methoden is dat het voorkomt amplificatie van zowel WT en mutant template template waarvan mutaties optreden buiten het gen doelwit van de blokkerende oligonucleotide. Derhalve worden fouten geïntroduceerd door PCR polymerasen effectief uitgefilterd met WT DNA. Anders dan AS-PCR of qPCR echter verrijking bewaard onbekende mutaties die optreden binnen het gebied waarop het blokkeerdeel oligo. Bij MyD88, WTB-PCR kon de detectie van zowel L265P en R264 * 3 mutaties. Anderen hebben meldden gelijkaardig de detectie van meerdere laagfrequente mutaties met gebruik van PCR-WTB 4, 28. Dit maakt WTB-PCR ideaal voor zowel onderzoek en klinische doeleinden.
Samen met een hoge gevoeligheid en de inherente interne controles voor het elimineren van valse positieven, WTB-PCR flexibiliteit voor de aanpassing van een bestaande sequencing test met zeer weinig extra stappen met blocker ontwerp maken het aantrekkelijke optie voor veel laboratoria met gevestigde assays. Dezelfde set PCR-primers die bij een gebruikelijke bepaling kan kenmerkend worden gebruikt in de PCR-WTB variatie. othaar protocolveranderingen die sterk aanbevolen voor WTB-PCR-waaronder UDG behandeling van FFPE weefsels en geschikte post-PCR zuivering methoden zijn even-overdraagbaar. Blocker ontwerp, daarom is het essentieel onderdeel van de uitvoering een WTB-PCR-test. Hoewel de in dit protocol richtsnoeren vormen de meest relevante factoren dat ontwerp dient verschillende blokkerende oligonucleotiden worden getest om die blokken WT amplificatie efficiënter zonder neveneffecten PCR. Dit omvat het toevoegen of verwijderen blokker basen Tm passen, verschuift de positie van de blokkering oligo WT ten opzichte van de matrijs, en het veranderen van de totale lengte van de oligo. Blocker titratie dienen ook te worden toegepast om een evenwicht tussen aanvaardbaar optreden van artefacten en sequencing detectiegrens vast.
Selecteren van een geschikte methode voor het detecteren van mutaties die in kleine celfracties zijn sterk afhankelijk the toepassing en types ziekte / mutatie. Als mutant kwantificering gewenst is, kan qPCR of digitale PCR meer haalbare oplossingen dan WTB-PCR / Sanger bieden. Hoewel WTB-PCR hoofdzakelijk een kwalitatieve test, is het mogelijk om een ruwe schatting van het mutante allel frequentie te bepalen door het testen van een monster met conventionele en WTB-PCR parallel. Omdat de detectiegrens voor het conventionele assay ~ 10-20% mutant allel in een achtergrond van WT, moet worden geconcludeerd dat mutaties gedetecteerd door de WTB-PCR-test, maar niet de gebruikelijke aanwezig in een concentratie lager dan de limiet waarnemingsdrempel de conventionele analyse. Enkele assays bieden de veelzijdigheid, eenvoud en robuustheid van WTB-PCR. De lage kosten en de korte doorlooptijd maakt het ideaal voor het beoordelen van de resterende ziekte na therapie of het volgen van nieuwe resistentie mutaties tijdens de behandeling. Daarnaast is de mogelijkheid om niet eerder beschreven mutaties te detecteren maken WTB-PCR ideaal voor onderzoeksdoeleinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) | Roche | 12032937001 | With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
