Abstract
rilevazione accurata identificazione di mutazioni a bassa frequenza possono essere problematico nel valutare malattia residua dopo la terapia, screening per mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia, o quando i pazienti hanno poche cellule tumorali circolanti. Wild-type blocco PCR seguita da analisi di sequenziamento offre alta sensibilità, flessibilità e semplicità come una metodologia per individuare queste mutazioni a bassa frequenza. Con l'aggiunta di un costume disegnato bloccato oligonucleotide acido nucleico ad una nuova o precedentemente stabilito saggio di sequenziamento PCR convenzionale, sensibilità di circa 1 allele mutante in un fondo di 1.000 alleli WT possono essere raggiunti (1: 1.000). artefatti sequenziamento associati ad eventi deaminazione trovano comunemente nei tessuti paraffina fissate in formalina può essere parzialmente ovviato dall'utilizzo di uracile glicosilasi DNA durante fasi di estrazione. Il protocollo ottimizzato qui è specifico per la rilevazione MYD88 mutazione, ma può servire come modello per la progettazione di qualsiasisaggio di WTB-PCR. Vantaggi del test WTB-PCR su altri saggi comunemente utilizzati per la rivelazione di mutazioni a bassa frequenza incluse allele specifico PCR e real-time PCR quantitativa comprendono meno occorrenze di falsi positivi, una maggiore flessibilità e facilità di implementazione, e la capacità di rilevare sia noto e mutazioni sconosciute.
Introduction
Sanger sequenziamento è stato tradizionalmente il gold standard in fase di test per entrambi noti e sconosciuti mutazioni somatiche. Uno dei limiti di sequenziamento Sanger è il suo limite di rilevabilità (~ 10 - 20% allele mutante in un contesto di WT) 1. Questo livello di sensibilità è appropriato per rivelare mutazioni somatiche basso livello che possono essere presenti nei campioni di tessuti precancerose o pazienti con poche cellule tumorali circolanti, o quando midollo osseo (BM) è irregolare. Questo rende anche valutare malattia residua dopo la terapia o la rilevazione di mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia difficile mediante sequenziamento convenzionale solo 2. Sostituendo PCR convenzionale con acido nucleico bloccato (LNA) mediata wild-type blocco PCR (WTB-PCR) in Sanger sequenziamento, sensibilità fino allo 0,1% allele mutante in uno sfondo di WT può essere raggiunto 2, 3, 4. InWTB-PCR, arricchimento per alleli mutanti è ottenuta tramite l'aggiunta di una breve (~ 10 - 14 NT) blocco (LNA) oligonucleotide che si lega preferenzialmente WT DNA impedendo così l'amplificazione del DNA WT. Il prodotto WTB-PCR arricchito mutante può quindi essere sequenziato. Bloccando WT DNA piuttosto che selezionare per mutazioni specifiche WTB-PCR permette l'arricchimento di entrambe le mutazioni conosciute e non presenti nelle frazioni cellulari minute.
Più metodi attualmente utilizzati per la rilevazione di mutazioni in piccole celle frazioni. Questo include PCR, amplificazione refrattaria sistema allele-specifica mutazione (ARMS), denaturazione cromatografia liquida ad alta prestazione (DHPLC), perline, emulsioni, amplificazione, e magnetismo (raggiante), rilascio indotta dal campo elettrico e misura (Efirm), alta risoluzione punto di fusione e altri. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono limitati dai falsi positivi e la capacità di rilevare solo una mutazione che il test è stato progettato per 4 5, 6.
Qui mostriamo l'aumento della sensibilità raggiunto da WTB-PCR in screening per mutazioni nel differenziamento mieloide fattore di 88 geni come descritto da Albitar et al. 3 MYD88 mutations sono importanti fattori diagnostici e prognostici in Macroglobulinemia di Waldenström (WM), IgM gammopatia monoclonale di significato sconosciuto (IgM MGUS), della milza linfoma della zona marginale (SMZL), e linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL). mutazioni MYD88 si trovano in quasi tutti i casi di WM e circa il 50% dei pazienti con immunoglobuline M (IgM) -secernenti MGUS. Contrastingly, mutazioni MyD88 si trovano solo 0-6% dei pazienti con SMZL e sono assenti nel mieloma multiplo 7, 8. Poiché morfologica sovrapposte, immunofenotipica, citogenetica, e caratteristiche cliniche tra WM e SMZL o mieloma multiplo IgM spesso può complicare diagnosi differenziale, la presenza di una mutazione MYD88 può servire come un fattore che identifica utile 9. Mutazioni MYD88 sono stati associati con una maggiore carico di malattia nei pazienti con DLBCL e la scarsa sopravvivenza globale dopo la terapia 7, 10. Inoltre, poiché le mutazioni MYD88 sono più frequentemente trovati in attivo (ABC) DLBCL B-cell-like di centro germinale B-cell-like (GCB) DLBCL o linfoma primario del mediastino cellule B (PMBL), MYD88 stato mutazionale può servire come marker surrogato per il sottotipo ABC 11, 12.
Il protocollo dettagliato qui fornito serve come modello da cui nuovi saggi possono essere sviluppati o maggior saggi sequenziamento esistenti possono essere facilmente adattati per rilevare accuratamente mutazioni a bassa frequenza in vari tipi di campioni. L'approccio può essere utilizzato anche per monitorare e rilevare mutazioni resistenti che possono svilupparsi nei tumori o anche batteri che possono svilupparsi mentre i pazienti sono stati trattati con la terapia mirata o antibiotici. Inoltre, si rivolge e rimedi molti dei problemi connessi con l'arricchimento di mutazione, in particolare nel tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE).
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Protocol
Etica Dichiarazione: Tutti i test di campioni umani è stata eseguita dopo aver ottenuto l'approvazione Institutional Review Board (IRB).
1. Estrazione del DNA da FFPE tessuto, sangue periferico, e aspirato midollare
- Per midollo osseo tessuto FFPE con kit di estrazione del DNA FFPE
- Iniziare con FFPE tessuto dai vetrini non colorati (5 - 10 sezioni: 5 - 10 um di spessore).
NOTA: Se inizio con trucioli di tessuto, usare 3 - 6 sezioni a 5 - 10 micron di spessore e passare al punto 1.1.6. - Posizionare i vetrini in un cestino scivolo e preparare quattro serbatoi di lavaggio (due per xilene e due per il 100% alcol). Aggiungere un volume minimo di 600 mL di soluzione per ciascun cestello.
- Deparaffinare i vetrini effettuando un lavaggio xilene 5 min in prima vaschetta. Trasferire i vetrini al secondo serbatoio di lavaggio xilene per altri 5 minuti.
- Dopo deparaffinazione, lavare i vetrini con 100% di alcol per 5 min. Trasferire i vetrini al secondoSerbatoio lavaggio alcool per altri 5 minuti.
- Lasciare le diapositive asciugare completamente sotto cappa prima raschiando con una lama di rasoio in una provetta.
NOTA: Se uno scivolo H & E con regione tumorale indicato è disponibile, per allineare le diapositive e raschiare solo la regione tumore. - Procedere con le istruzioni dal produttore volantino inclusi nel kit.
- Iniziare con FFPE tessuto dai vetrini non colorati (5 - 10 sezioni: 5 - 10 um di spessore).
- Per BM aspirare e sangue periferico
- Estrarre secondo le istruzioni dispensa del produttore con queste specifiche.
NOTA: Ci sono numerosi kit e metodi di estrazione del DNA da tessuti e cellule FFPE disponibili in commercio. Praticamente, tutti possono essere utilizzati. Utilizzare un metodo che viene stabilito in laboratorio.- Utilizzare 200 microlitri di sangue periferico (PB) o 100 microlitri BM + 100 microlitri di PBS.
- Utilizzare 4 microlitri RNasi una soluzione di riserva.
- Eluire con 100 microlitri di tampone di eluizione.
- Estrarre secondo le istruzioni dispensa del produttore con queste specifiche.
- La quantificazione del DNA
- Misurare concentrazioni di DNA utilizzando uno spettrofotometro garantire un / 280 nm 260 nm rapporto di circa 1,8 (per DNA puro). Se il rapporto è sensibilmente inferiore, esso può indicare la presenza di proteine, fenolo, o altri contaminanti che possono interferire con le applicazioni a valle.
- Regolare concentrazioni di DNA a circa 50 - 100 ng / ml con tampone di eluizione appropriato.
2. wild-type di blocco PCR
- Progettazione Primer
- Progettazione e ottenere primer per i geni di interesse in base alla precedenza descritte le linee guida generali della PCR Primer progettazione 13. Includi M13-forward e reverse primer di sequenziamento universali di primer PCR.
NOTA: Il saggio MYD88 è stato sviluppato per amplificare esone 5 di MYD88 (G259 - N291) e 110 nucleotidi si trova nella regione 5' intronic per coprire il sito di splice e parte di introne 4. L'avanti e retromarcia primer sono stati progettati con un 5' -M13 sequenza (M13-forward: TGT aaa ACG ACG gcc agt; M13-reverse: CAG GAA GCT aca ATG acc) per consentire appaiamento dei primer sequenziamento complementari (vedi Materiali Tabella).
- Progettazione e ottenere primer per i geni di interesse in base alla precedenza descritte le linee guida generali della PCR Primer progettazione 13. Includi M13-forward e reverse primer di sequenziamento universali di primer PCR.
- Locked Nucleic Acid oligonucleotidi design
- Progettare l'oligonucleotide blocco per essere di circa 10 - 15 basi di lunghezza e complementare al modello WT in cui si desidera arricchimento mutante.
NOTA: Un oligo più breve migliorerà la discriminazione non corrispondente. Per raggiungere alta specificità di destinazione, è importante non usare troppo nucleotidi che bloccano dal momento che questo può comportare un oligonucleotide molto "appiccicoso". Il contenuto e la lunghezza e bloccando nucleotidica dovrebbe essere ottimizzare secondo nucleotide specifico che deve essere bloccato. È importante per ottenere un'elevata specificità di legame senza compromettere la struttura secondaria e rischiare auto-complementarità. - Progettare l'oligo di blocco per avere un T m 10 - 15 ° C sopra la temperat estensioneUre durante il ciclo termico. Regolare la T m aggiungendo o rimuovendo basi bloccanti o sostituendo basi blocco per DNA evitando tratti lunghi (3 - 4 basi) di blocco basi G e C.
- Accedere al sito web strumenti di oligo (vedi Tabella dei Materiali) e selezionare la funzione "blocco Oligo Tm Prediction".
- Incollare la sequenza del modello WT che si desidera bloccare nella casella "Oligo Sequenza". Aggiungere "+" davanti basi per indicare le basi bloccanti.
- Selezionare il pulsante "Calcola" per determinare l'approssimativa T m dell'ibrido DNA-Blocker.
- Progettare l'oligo di bloccaggio per evitare la formazione di strutture secondarie o auto-dimeri.
- Accedere al sito web strumenti di oligo (vedi Tabella dei Materiali) e selezionare la funzione "blocco Oligo Optimizer".
- Incollare la sequenza del modello WT che si desidera essere bloccato in area. Aggiungere "+" davanti basi per indicare il blocco basi.
- Selezionare le due caselle per "struttura secondaria" e "Self Only". Premere il pulsante Analizzare di valutare l'oligo di strutture secondarie potenzialmente problematici o auto-dimeri.
NOTA: I punteggi rappresentano stime molto approssimative del T m 's delle strutture secondarie e auto-dimeri. punteggi più bassi sono quindi ottimali e possono essere raggiunti limitando bloccante-bloccante accoppiamento. L'oligonucleotide blocco per MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] è stato progettato per coprire aminoacidi Q262-I266 e dispone di una 3'-invertita dT di inibire sia l'estensione dalla DNA polimerasi e degradazione 3'-esonucleasi. Questo specifico oligo di blocco è un 17mer con 10 basi di blocco che sono indicati come "+ N". I restanti 7 basi sono normali nucleotidi del DNA.
- Progettare l'oligonucleotide blocco per essere di circa 10 - 15 basi di lunghezza e complementare al modello WT in cui si desidera arricchimento mutante.
- Setup WTB-PCR e termocicli
- Preparare una WTB-PCR Master mix (MMX) con 2,5 ml PCR tampone di reazione 10x w / 20 mM MgCl 2, 250 mM dNTP, 0,2 uM avanti e indietro primer 1,2 pM MYD88blocker e DNAsi, RNasi-free, ultra-pura H 2 O per creare una finale volume della soluzione di 21.75 microlitri per reazione.
NOTA: Lavorare concentrazioni sono per il volume di reazione finale di 25 ml (dopo l'aggiunta del modello di DNA e polimerasi). PCR convenzionale MMX viene preparata semplicemente omettendo l'aggiunta del bloccante. Tutte le fasi del protocollo rimangono identiche sia WTB e PCR convenzionale. Questo può essere utilizzato in convalida e arricchimento determinare ottenuto con l'aggiunta di bloccante.- Nel calcolare la quantità di MMX per preparare assicurarsi per tenere conto di 3 reazioni supplementari (controlli positivi e negativi e un controllo non-template per controllare contaminazione) e almeno 1 reazione aggiuntivo per errori di pipettamento.
- Vortex MMX accuratamente. Il MMX può essere conservato a -80 ° C fino a ayorecchio.
- Aggiungere 0,25 ml di Taq DNA polimerasi per reazione alla MMX e miscelare. Una volta che la polimerasi è stato aggiunto al MMX, tenerlo in ghiaccio.
- Mettere un nuovo 96 pozzetti PCR su un piatto freddo e pipettare 22 ml di MMX con polimerasi a ciascun pozzetto di reazione.
- Aggiungere 3 ml di DNA genomico (50 - 100 ng / ml a ciascuno dei pozzetti contenenti il MMX con polimerasi.
- Sigillare la piastra e centrifugare brevemente per assicurare la soluzione raggiunge il fondo di ciascun pozzetto.
- Caricare la piastra PCR su un termociclatore.
- Impostare le condizioni per la reazione termociclaggio WTB-PCR come segue: denaturazione iniziale a 95 ° C per 6 min; 40 cicli di denaturazione a 95 ° C per 30 s, Primer ricottura a 56 ° C per 30 s, e estensione a 72 ° C per 1 min 20 s; estensione finale a 72 ° C per 10 min.
NOTA: Le migliori pratiche coinvolge completando il resto del protocollo in una zona fisicamente separati per evitare la contaminazione da amplicon in configurazioni future.
- Impostare le condizioni per la reazione termociclaggio WTB-PCR come segue: denaturazione iniziale a 95 ° C per 6 min; 40 cicli di denaturazione a 95 ° C per 30 s, Primer ricottura a 56 ° C per 30 s, e estensione a 72 ° C per 1 min 20 s; estensione finale a 72 ° C per 10 min.
- Preparare una WTB-PCR Master mix (MMX) con 2,5 ml PCR tampone di reazione 10x w / 20 mM MgCl 2, 250 mM dNTP, 0,2 uM avanti e indietro primer 1,2 pM MYD88blocker e DNAsi, RNasi-free, ultra-pura H 2 O per creare una finale volume della soluzione di 21.75 microlitri per reazione.
- Eseguire elettroforesi su gel secondo protocolli precedentemente descritte 14 per determinare se WTB-PCR ha avuto successo e confermare una mancanza di amplificazione nel controllo non-template.
- Purificazione di PCR Prodotto da sfere magnetiche
- Rimuovere sfere magnetiche da 4 ° C e portare a temperatura ambiente.
- Trasferire 10 ml di prodotto PCR per una nuova piastra PCR.
- Vortex le perline magnetiche vigorosamente per risospendere completamente le particelle magnetiche.
- Aggiungere 18 ml sfere magnetiche ad ogni bene sulla nuova piastra. Pipetta mescolare 10 volte.
- Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Posizionare la piastra PCR sulla piastra magnete laterale skirted per 2 minuti a perline separati dalla soluzione.
- Aspirare il surnatante con una pipetta multicanale, evitando il pellet tallone.
- Versare 150 ml di etanolo 70% in ciascun pozzetto ed incubare a temperatura ambiente for almeno 30 s. Aspirare l'etanolo con una pipetta multicanale e scartare punte. Ripetere questa procedura di lavaggio una volta di più.
- Utilizzando un 20 microlitri pipetta multicanale aspirare l'etanolo restante da ciascun pozzetto e scartare punte.
- Una volta che i pozzi sono asciutti (~ 10 min), togliere dal piatto magnete e aggiungere 40 microlitri di acqua priva di nucleasi ad ogni mix bene e pipetta 15 volte o vortice delicatamente.
- Incubare a temperatura ambiente per 2 min.
- Posizionare la piastra PCR sulla piastra calamita per 1 min per perline separati dalla soluzione.
- Trasferimento 35 ml di prodotto purificato ad una nuova piastra PCR. Ciò è prodotto di PCR purificato è pronto per procedere con sequenziamento bidirezionale o può essere conservato a -20 ° C fino al momento dell'uso.
NOTA: Quando si sviluppa un nuovo test, la quantificazione del prodotto purificato della PCR può essere richiesto. 1 - 3 ng / ml amplicon DNA è ottimale per il sequenziamento bidirezionale. Se la concentrazione è sempre bassa, aumentare la PCR prodotti e magnetici perline proportionally (1: 1,8). Se la concentrazione è elevata e costante, eluire con un maggior volume di acqua.
3. Il sequenziamento del WTB-PCR prodotto
- Bi-direzionale Sequencing
NOTA: Il seguente protocollo è una forma modificata di istruzioni del produttore, che è stato ottimizzato per utilizzare un minor numero di reagenti.- Preparare in avanti e all'indietro reazione di sequenziamento si mescola con 0,25 ml Ready Mix di reazione, 1,88 ml Sequencing Buffer, 1,78 mM M13-F o M13-R primer di sequenziamento e aggiungere e DNAsi, RNasi-free, ultra-pura H 2 O per creare una soluzione definitiva volume di 9 microlitri per reazione. Questo mix reazione di sequenziamento può essere conservato a -20 ° C per un massimo di un anno.
- Pipettare 9 ml della miscela di reazione di sequenziamento in avanti in ciascun pozzetto di una nuova piastra da 96 pozzetti PCR per la reazione di sequenziamento in avanti. Ripetere su un piatto a parte per la reazione di sequenziamento inverso.
- Aggiungere 1 ml di purificato WTB-PCR t prodottoo ciascun pozzetto sia avanti e retromarcia piastre.
- Sigillare la piastra e centrifugare brevemente per assicurare la soluzione raggiunge il fondo di ciascun pozzetto.
- Caricare la piastra PCR su un termociclatore.
- Impostare le condizioni termociclaggio per la reazione di sequenziamento come segue: 96 ° C per 1 min; 30 cicli di 96 ° C per 10 s, 50 ° C per 5 s, 60 ° C per 4 minuti; tenere a 4 ° C fino al momento per la purificazione.
- Purificare Sequencing Products
- Preparare una soluzione fresca 01:25 di 3 M acetato di sodio (pH 5,2) e il 100% di etanolo.
- Preparare una soluzione fresca di etanolo al 70%.
- Aggiungere 30 ml di acetato di sodio / 100% soluzione etanolica a ciascun pozzetto di entrambi avanti e retromarcia piastre sequenziamento e mix pipetta 5 volte.
- Risigillare la piastra e incubare al buio a temperatura ambiente per 20 min.
- Centrifugare la piastra a 2.250 xg per 15 min.
- Rimuovere la pellicola sigillante e capovolgere sopra uno sprecocontenitore.
NOTA: Inverti solo una volta o il pellet potrebbe allentarsi dal fondo bene. - Posizionare la piastra capovolta su un tovagliolo di carta pulito e centrifugare a 150 xg per 1 min.
- Aggiungere 150 microlitri di etanolo al 70% in ogni pozzetto.
- Richiudere la piastra e far girare a 2.250 xg per 5 min.
- Ripetere i punti 3.2.6 e 3.2.7.
- Se i pozzi non sono completamente asciutti, lasciare asciugare a temperatura ambiente. Assicurarsi che i campioni sono protetti dalla luce durante l'asciugatura.
- Aggiungere 10 microlitri formammide in ciascun pozzetto e pipetta mix 10 volte. Sigillare il piatto.
- Denaturare il termociclatore a 95 ° C per 3 min seguito da 4 ° C per 5 min.
- Dopo denaturazione, sostituire il sigillante piatto con un setti e la sequenza sulla piattaforma di sequenziamento secondo le istruzioni del produttore 15.
4. Analisi dei risultati di sequenziamento
- Visualizzare le tracce di sequenziamento utilizzando un sequenziamento datun software di analisi secondo le istruzioni del produttore 16 e allineare le rispettive sequenze di riferimento. Allineare MYD88 di sequenza di riferimento NCBI "NM_002468".
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Representative Results
Una panoramica concettuale di WTB-PCR durante l'estensione è presentato in Figura 1. Poiché un singolo nucleotide disadattamento nell'ibrido bloccante-DNA diminuisce notevolmente la sua temperatura di fusione (AT m = 20 - 30 ° C), amplificazione dell'allele WT è bloccato mentre DNA stampo mutante è libero di completare l'estensione 17. In questo modo, il DNA mutante è amplificato esponenzialmente mentre WT DNA viene amplificato linearmente.
Una dimostrazione della arricchimento mutante raggiunti da WTB-PCR è presentato in Figura 2. DNA genomico da pazienti con e senza mutazioni sono stati esaminati con convenzionale e WTB-PCR e quindi sequenziato per dimostrare l'arricchimento tipico ottenibili con WTB-PCR e la mancanza di falsi positivi in WT DNA. La concentrazione di lavoro del bloccante utilizzato in WTB-PCR MMX dovrebbe essere determinata da esperimenti di titolazione e should raggiungere il livello desiderato di arricchimento mutante pur non causando falsi positivi o bloccando l'amplificazione di DNA WT interamente. Analisi di sequenziamento del prodotto WTB-PCR dimostra arricchimento per l'allele mutante e un limite di rilevazione superiore al 0,5% allele mutante in uno sfondo di WT rispetto al 16% in PCR convenzionale 3.
Gli effetti di questo aumento di sensibilità in test clinici possono variare a seconda della quantità relativa di cellule neoplastiche nei campioni testati. In uno studio comparativo metodi, il saggio WTB-PCR qui descritta ha dimostrato che il 64% delle mutazioni MyD88 sarebbe perdere per prove convenzionali di pazienti con WM o MGUS 3.
Una caratteristica drop-off dell'intensità del segnale (figura 3) è spesso visto se troppo elevata concentrazione di bloccante è usato o post-PCR purificazione non è riuscito a rimuovere bloccanti prima di sequenziamento bidirezionale. Quest'ultimo è dimostrata quando purificazione perlina magnetica è sostituito per la purificazione enzimatica. Anche se la purificazione enzimatica è un'opzione attraente quando si lavora con un numero maggiore di campioni, non è opportuno per l'applicazione con WTB-PCR in quanto non riesce a rimuovere bloccante dalla soluzione prima del sequenziamento.
Un esempio di manufatti sequenza frequente in DNA FFPE-derivato come risultato della citosina deaminazione (C: G> T: A) sono presentati in Figura 4 3, 18, 19, 20. Sebbene le reali cause della citosina deaminazione sono poco conosciuti, qualsiasi saggio basato PCR che arricchisce per alleli mutanti rileverà questi artefatti bassa frequenza 21, 22. I falsi positivi dovuti alla Deaminazione è meglio evitare partendo da modello di materiale di alta qualità; in molti casi in cui ciò non sia possibile, il trattamento con glicosilasi uracil DNA (UDG) durante l'estrazione può aiutare a limitare la frequenza e l'intensità di artefatti deaminazione. trattamento UDG di tessuto FFPE durante l'estrazione (come parte del kit DNA FFPE) asporta deaminato residui di citosina impedendo perciò C artificialmente indotto: G> T: A mutazioni. Tuttavia, i residui 5 Methylcytosine che si verificano spesso in dinucleotidi CpG sono deaminato a timina, che non può essere asportato dal UDG. I manufatti sequenziamento risultanti sono abbastanza riconoscibili e spesso appaiono come mutazioni tandem, come mostrato nella figura 4. Se i campioni sono già stati estratti, trattamento UDG può essere implementato in un'estrazione secondario con perdita relativamente bassa DNA.
Figura 1: Ove concettualerview di WTB-PCR. Un singolo nucleotide mancata corrispondenza nell'ibrido Blocker-DNA diminuisce T m fino a 30 ° C. Progettando l'oligonucleotide blocco abbia una Tm di 10 - 15 ° C la temperatura durante l'estensione, l'amplificazione del DNA WT viene bloccata pur consentendo l'amplificazione di DNA mutante. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: DNA genomico da pazienti con e senza mutazioni sono stati esaminati con convenzionale e WTB-PCR e quindi sequenziato per dimostrare l'arricchimento tipico ottenibili con WTB-PCR. La concentrazione finale di bloccante utilizzato per realizzare WTB-PCR è stato scelto per ottenere la massima arricchimento mutante senza causare falsi positivi WT DNA o il blocco amplificazione di WT DNA del tutto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caratteristico drop-off dell'intensità del segnale visibile quando enzimatica purificazione PCR è usato al posto di biglie magnetiche. Ciò è probabilmente perché la purificazione enzimatica non riesce a rimuovere bloccanti prima di sequenziamento bidirezionale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: C: G> T: v A artefatti sequenziamento sorgono nel tessuto FFPE quando citosina o citosina metilata sono deaminatiia formalina fissaggio rispettivamente uracile o timina,. Uracile DNA glicosilasi (UDG) può asportare uracile prima WTB-PCR contribuendo a ridurre gli artefatti di sequenziamento. Tuttavia, timina risultanti da deaminato 5-metilcitosina, che si verifica frequentemente in isole CpG, non può essere asportato da UDG. Diminuendo la concentrazione di bloccante utilizzato in WTB-PCR può contribuire a ridurre il verificarsi di artefatti di sequenziamento che non vengono corrette mediante trattamento UDG. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il saggio WTB-PCR qui descritto utilizza una serie generica di primer con un oligo blocco progettato per bloccare l'amplificazione di DNA WT durante l'estensione (Figura 1). Il prodotto di WTB-PCR viene quindi sequenziato per l'analisi mutazionale. L'utilità di WTB-PCR / Sanger risiede nella sua semplicità, ad alta sensibilità e alta produttività. Utilizzando le indicazioni descritte qui, la maggior parte dei saggi basati Sanger esistenti possono essere facilmente modificati tramite l'aggiunta di un oligonucleotide di blocco per aumentare notevolmente la sensibilità. Nel saggio Nell'esempio qui presentato l'aggiunta di un singolo blocco oligonucleotide per PCR aumentato il limite di rilevamento da circa il 16% allele mutante in uno sfondo di WT per il saggio convenzionale> 0,5% nel saggio WTB-PCR 3. Il cui effetto è una riduzione del 64% in falsi negativi visto in test clinici 3. Confermando la presenza di mutazioni in MYD88 ha una significativa impl diagnostico e prognosticoications; segnalazione falsamente un caso come negativo può avere gravi conseguenze sulla terapia generale e la gestione del paziente. Test con WTB-PCR è quindi di grande importanza, soprattutto in pazienti con relativamente bassa cellularità anormale.
Tecniche WTB-PCR variano notevolmente e sono talvolta indicato intercambiabile con LNA, BNA, o saggi PCR serraggio o PCR-clamp-sonda PNA-mediate 2, 4, 23, 24. Alcune varianti utilizzano WTB-PCR comportano un saggio qPCR che richiede la progettazione di una sonda fluorescente supplementare per ogni specifica mutazione. Una sfida significativa associata a questa tecnica comprende la necessità di sviluppare sonde competitivo vincolanti che discriminano in modo accurato tra alleli WT e mutanti. Inoltre, poiché è necessaria una sonda specifica mutazione, l'approccio qPCR non ha la capacità di rilevare sconosciuta mutations. Un'altra variante di WTB-PCR blocchi WT in modo allele-specifica. Invece di utilizzare primer specifici mutazione tuttavia, una specifica sonda di blocco per l'allele WT inibisce Primer completa vincolante. Anche se questo approccio non richiede una sonda specifica mutazione come qPCR, non riesce a discriminare tra mutazioni e gli errori polimerasi indotta può portare ad un aumento dei falsi positivi. amplificazione esponenziale di quegli errori polimerasi indotta mediante PCR possono oscurare la rilevazione di eventi mutazionali rare. Qualsiasi approccio che utilizza l'amplificazione PCR per arricchire le mutazioni è la sua precisione limitata dalla frequenza di PCR errori 25, 26, 27. Un vantaggio fondamentale di WTB-PCR / Sanger rispetto a molti altri metodi ad alta sensibilità è che impedisce l'amplificazione di entrambi modello WT e il modello mutante cui mutazioni si verificano al di fuori della regione del gene bersaglio dal oligonucleoti bloccode. Pertanto, PCR errori introdotti dal polimerasi vengono filtrati in modo efficace insieme WT DNA. Contrariamente a comunque AS-PCR o qPCR, l'arricchimento viene mantenuta per le mutazioni sconosciute che si verificano all'interno della regione interessata dal oligo blocco. Nel caso di MYD88, WTB-PCR ha permesso la rilevazione di entrambe le mutazioni L265P e r264 * 3. Altri hanno riferito allo stesso modo l'individuazione di più, mutazioni a bassa frequenza con l'uso di WTB-PCR 4, 28. Questo rende WTB-PCR ideale sia per la ricerca e scopi clinici.
Insieme con alta sensibilità e controlli interni inerenti per eliminare i falsi positivi, la flessibilità di WTB-PCR per adattare un test di sequenziamento esistente con pochissimi passaggi aggiuntivi dal design bloccante rendono un'opzione attraente per molti laboratori con dosaggi stabiliti. La stessa serie di primer PCR utilizzati in un saggio convenzionale può essere tipicamente usato nella variazione WTB-PCR. Oti suoi cambiamenti di protocollo che sono altamente raccomandati per WTB-PCR-compreso il trattamento UDG di FFPE tessuti e adeguati di depurazione post-PCR metodologie-sono ugualmente trasferibili. disegno bloccante, quindi è l'elemento critico nella realizzazione di un saggio di WTB-PCR. Anche se le linee guida presentate in questo protocollo rappresentano i fattori più rilevanti in quel disegno, vari oligonucleotidi bloccanti dovrebbero essere testati per trovare uno che l'amplificazione blocchi WT efficiente senza effetti secondari per PCR. Questo include l'aggiunta o la rimozione di basi bloccanti per regolare T m, spostando la posizione del oligo blocco relativo al modello WT, e modificando la lunghezza complessiva del oligo. esperimenti di titolazione bloccanti dovrebbero essere impiegati per stabilire un equilibrio tra occorrenze accettabili di manufatti sequenziamento e limite di rilevabilità.
Selezione di una metodologia appropriata per rilevare mutazioni che sono presenti in frazioni cellulari minute dipende molto the applicazioni e tipi di malattia / mutazione. Se quantificazione mutante si desidera, qPCR o digitale PCR possono offrire soluzioni più valide di WTB-PCR / Sanger. Sebbene WTB-PCR è principalmente un test qualitativo, è possibile determinare una stima approssimativa della frequenza allele mutante analizzando un campione con convenzionale e WTB-PCR in parallelo. Poiché il limite di rilevamento per il dosaggio convenzionale è ~ 10 - 20% allele mutante in uno sfondo di WT, è opportuno concludere che le mutazioni rilevate mediante il saggio WTB-PCR, ma non convenzionale sono presenti ad una concentrazione inferiore al limite di rilevamento per il test convenzionali. Pochi saggi offrono la versatilità, la semplicità e la robustezza di WTB-PCR. Il basso costo e tempi di risposta brevi rende ideale per valutare malattia residua dopo la terapia o monitoraggio mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia. Inoltre, la capacità di rilevare le mutazioni in precedenza undescribed rendere WTB-PCR ideale per scopi di ricerca.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) | Roche | 12032937001 | With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
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