Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

من النوع البري منع PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كوسيلة الحساسة بشدة للكشف عن التردد المنخفض الجسدية الطفرات

doi: 10.3791/55130 Published: March 29, 2017

Abstract

كشف دقيق وتحديد الطفرات التردد المنخفض يمكن أن يكون مشكلة عند تقييم مرض المتبقية بعد العلاج، والكشف عن الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج، أو عند المرضى الذين لديهم عدد قليل من تعميم الخلايا السرطانية. النوع البري منع PCR تليها تحليل التسلسل يوفر حساسية عالية، والمرونة، والبساطة كمنهجية للكشف عن هذه الطفرات التردد المنخفض. بإضافة مصممة خصيصا مقفل الحمض النووي النوكليوتيد لفحص تسلسل PCR أساس تقليدي جديد أو سابقا المعمول بها، الحساسيات ما يقرب من 1 أليل متحولة في خلفية من 1000 الأليلات WT يمكن أن يتحقق (1: 1000). التحف التسلسل المرتبطة بالأحداث نزع الأمين توجد عادة في الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة يمكن معالجتها جزئيا عن طريق استخدام glycosylase DNA اليوراسيل خلال خطوات استخراج. بروتوكول الأمثل هنا هو محدد للكشف عن MYD88 الطفرة، ولكن يمكن أن تكون بمثابة نموذج لتصميم أيWTB-PCR الفحص. مزايا الفحص WTB-PCR على فحوصات أخرى تستخدم عادة للكشف عن الطفرات ذات التردد المنخفض بما فيها أليل محددة PCR في الوقت الحقيقي والكمي PCR تشمل الحوادث أقل من ايجابيات كاذبة، وزيادة المرونة وسهولة التنفيذ، والقدرة على كشف كل معروف والطفرات غير معروفة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وكان سانجر تسلسل تقليديا معيار الذهب في اختبار لكل من الطفرات الجسدية المعروفة وغير المعروفة. واحد من أوجه القصور في سانجر التسلسل هو الحد الأقصى لها من الكشف (~ 10-20٪ أليل متحولة في خلفية WT) 1. هذا المستوى من الحساسية غير مناسب للكشف عن الطفرات الجسدية المستوى المنخفض التي قد تكون موجودة في عينات من أنسجة ما قبل سرطان أو المرضى الذين يعانون من بعض تعميم الخلايا السرطانية، أو عندما نخاع العظم (BM) غير متجانس. وهذا أيضا يجعل تقييم المرض المتبقية بعد العلاج أو الكشف عن الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج الصعبة التي التسلسل التقليدي وحده 2. من خلال استبدال PCR التقليدية مع الحمض النووي مقفل (LNA) بوساطة من النوع البري منع PCR (WTB-PCR) في سانجر تسلسل والحساسيات تصل إلى 0.1٪ أليل متحولة في خلفية WT يمكن أن يتحقق 2 و 3 و 4. فيWTB-PCR، ويتحقق إثراء لالأليلات متحولة عن طريق إضافة قصيرة (~ 10-14 NT) منع (LNA) النوكليوتيد التي ترتبط بشكل تفضيلي WT DNA وبالتالي منع التضخيم من WT DNA. والتخصيب المنتج WTB-PCR متحولة يمكن بعد ذلك التسلسل. من خلال منع WT DNA بدلا من اختيار للطفرات محددة WTB-PCR يسمح لتخصيب كل من الطفرات المعروفة وغير المعروفة الموجودة في أجزاء الخلية دقيقة.

وتستخدم أساليب متعددة في الوقت الحالي للكشف عن الطفرات في خلايا صغيرة كسور. وهذا يشمل PCR، التضخيم الحرارية نظام أليل محددة طفرة (ARMS)، تغيير طبيعة عالية الأداء اللوني السائل (DHPLC)، والخرز، والمستحلبات، والتضخيم، والمغناطيسية (مبتهجا)، الكهربائية الإفراج الناجم عن الميدان والقياس (EFIRM)، وارتفاع القرار نقطة انصهار وغيرها. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب تقتصر كل ايجابيات كاذبة والقدرة على كشف فقط طفرة واحدة التي تم تصميمها الفحص لمدة 4 6.

نحن هنا لشرح الزيادة في الحساسية WTB-PCR الذي تحقق في الكشف عن الطفرات في التمايز النخاعي عامل 88 الجين كما وصفها البيطار وآخرون. 3 MYD88 mutatioنانوثانية هي العوامل التشخيصية والنذير مهمة في مرض فالدنشتروم (WM)، الغلوبولين المناعي وحيدة النسيلة اعتلال غامائي من أهمية مجهولة (الغلوبولين المناعي-MGUS)، الطحال الغدد الليمفاوية منطقة هامشية (SMZL)، ومنتشر كبير سرطان الغدد الليمفاوية B-الخلية (DLBCL). تم العثور على الطفرات MYD88 تقريبا في جميع حالات WM، وحوالي 50٪ من المرضى الذين يعانون المناعي M (الغلوبولين المناعي) -secreting MGUS. متضارب، تم العثور على الطفرات MYD88 في المائة فقط 0-6 المرضى الذين يعانون من SMZL وغائبة في المايلوما المتعددة 7 و 8. بسبب تداخل المورفولوجية، immunophenotypic، خلوي، والخصائص السريرية بين WM وSMZL أو المايلوما الغلوبولين المناعي-متعددة يمكن في كثير من الأحيان إلى تعقيد تشخيصات تفريقية، وجود طفرة MYD88 قد يكون بمثابة عامل تحديد المفيد 9. كما تم المرتبطة الطفرات MYD88 مع عبئا أكبر المرض في المرضى الذين يعانون من DLBCL وضعف البقاء على قيد الحياة بعد العلاج 10. بالإضافة إلى ذلك، لأن الطفرات MYD88 هي أكثر كثيرا ما وجدت في مثل B-الخلية (ABC) DLBCL تفعيلها من مركز جرثومي B-الخلية مثل (GCB) DLBCL أو الأساسي سرطان الغدد الليمفاوية المنصفية B-الخلية (PMBL)، MYD88 وضع طفرة قد تكون بمثابة علامة بديلة لنوع فرعي ABC 11 و 12.

بروتوكول مفصل المقدمة هنا بمثابة القالب الذي يمكن تطويرها فحوصات جديدة أو معظم فحوصات تسلسل القائمة يمكن أن تتكيف بسهولة مع الكشف بدقة الطفرات التردد المنخفض في مختلف أنواع العينة. ويمكن أيضا أن النهج أن تستخدم لرصد واكتشاف الطفرات المقاومة التي قد تتطور في أورام أو حتى البكتيريا التي قد تتطور بينما يعالج المرضى مع العلاج الموجه أو المضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك، فإنه يتناول وسائل الانتصاف العديد من القضايا المرتبطة بتخصيب طفرة، ولا سيما في الأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أخلاقيات الإعلان: تم تنفيذ جميع اختبار العينات البشرية بعد الحصول المؤسسي مجلس مراجعة (IRB) موافقة.

1. استخراج الحمض النووي من FFPE الأنسجة، الدم المحيطي، ونخاع العظم نضح

  1. لالعظام الأنسجة نخاع FFPE مع DNA FFPE عدة استخراج
    1. تبدأ الأنسجة FFPE من الشرائح غير ملوثين (5-10 أقسام في 5-10 سمك ميكرون).
      ملاحظة: إذا بداية مع حلاقات الأنسجة، واستخدام 3-6 أقسام في 5-10 ميكرون سمك وانتقل إلى الخطوة 1.1.6.
    2. وضع الشرائح في سلة الشرائح وإعداد أربعة خزانات غسيل (اثنان للالزيلين واثنين لمدة 100٪ كحول). إضافة حد أدنى لحجم 600 مل من محلول لكل سلة.
    3. Deparaffinize الشرائح عن طريق القيام غسل زيلين 5 دقائق في علبة الأولى. نقل الشرائح إلى الثاني خزان غسل الزيلين لمدة 5 دقائق إضافية.
    4. بعد deparaffinization، وغسل الشرائح مع 100٪ الكحول لمدة 5 دقائق. نقل الشرائح إلى الثانيالكحول خزان غسل لمدة 5 دقائق إضافية.
    5. السماح للشرائح حتى يجف تماما تحت غطاء قبل إلغاء منهم بشفرة حلاقة في أنبوب microcentrifuge.
      ملاحظة: إذا كان شريحة H & E مع منطقة الورم أشارت متاح، والمواءمة بين الشرائح وكشط فقط منطقة الورم.
    6. المضي قدما تعليمات من صدقة المصنعة المدرجة في المجموعة.
  2. لBM نضح والدم المحيطي
    1. استخراج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة صدقة مع هذه المواصفات.
      ملاحظة: هناك العديد من مجموعات وطرق استخراج الحمض النووي من الأنسجة والخلايا FFPE المتاحة تجاريا. عمليا، يمكن للجميع استخدامها. استخدام أسلوب التي يتم تأسيسها في المختبر.
      1. استخدام 200 ميكرولتر الدم المحيطي (PB) أو 100 ميكرولتر BM + 100 ميكرولتر PBS.
      2. استخدام 4 ميكرولتر ريبونوكلياز حل الأسهم.
      3. أزل مع شطف العازلة 100 ميكرولتر.
  3. الكمي DNA
    1. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام معمل ضمان 260 نانومتر / 280 نيوتن متر من نسبة ما يقرب من 1.8 (لDNA النقي). وإذا كانت النسبة أقل بشكل ملحوظ، قد تشير إلى وجود بروتين، الفينول، أو غيرها من الملوثات التي قد تتداخل مع تطبيقات المصب.
    2. ضبط تركيز الحمض النووي لحوالي 50-100 نانوغرام / ميكرولتر مع شطف العازلة المناسبة.

2. البرية من نوع حجب PCR

  1. التصميم التمهيدي
    1. ووصفت تصميم والحصول على الاشعال للجينات الفائدة وفقا لسبق المبادئ التوجيهية العامة من PCR التصميم التمهيدي 13. تشمل M13 إلى الأمام وعكس الاشعال التسلسل العالمية في الاشعال PCR.
      "تم تصميم المنطقة intronic تتضاعف لتغطية لصق موقع وجزء من إنترون 4. إلى الأمام وعكس الاشعال مع 5" و 110 النيوكليوتيدات الموجودة في 5 - وقد تم تطوير هذا الفحص MYD88 لتضخيم اكسون 5 من MYD88 (N291 G259): ملاحظة -M13 تسلسل (M13 إلى الأمام: TGT AAA ACG ACG دول مجلس التعاون الخليجي AGT. M13-الاتجاه المعاكس: CAG غا هيئة مكافحة الفساد GCT ATG ACC) للسماح الصلب من الاشعال التسلسل التكميلية (انظر المواد الجدول).
  2. مغلق الحمض النووي تصميم قليل النوكليوتيد
    1. تصميم النوكليوتيد منع أن ما يقرب من 10-15 قواعد في طول ومكملة لقالب WT حيث هو المطلوب تخصيب متحولة.
      ملاحظة: سوف جزئية أقصر تحسين التمييز عدم تطابق. لتحقيق درجة عالية من الدقة الهدف، فمن المهم عدم استخدام الكثير من النيوكليوتيدات حجب لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى النوكليوتيد جدا "لزجة". محتوى وطول ومنع النوكليوتيدات ينبغي أن يكون تحسين وفقا لالنوكليوتيدات المحددة التي تحتاج إلى المحظورة. ومن المهم لتحقيق خصوصية ملزمة عالية دون المساس هيكل الثانوي والمخاطرة التكامل الذاتي.
    2. تصميم بنسبة ضئيلة منع أن يكون T م 10-15 ° C فوق temperat تمديدلدى عودتهم خلال التدوير الحراري thermocycling. ضبط T م وذلك بإضافة أو إزالة قواعد منع أو عن طريق استبدال قواعد حظر ل DNA مع تجنب فترات طويلة (3-4 قواعد) بعرقلة G أو C القواعد.
      1. انتقل إلى موقع أدوات بنسبة ضئيلة (انظر جدول المواد) وحدد أداة "عرقلة جزئية تيم التنبؤ".
      2. لصق تسلسل القالب WT هذا هو المطلوب ليكون قد تم حظره في مربع "جزئية تسلسل". إضافة "+" أمام قواعد للإشارة إلى قواعد مانع.
      3. حدد زر "حساب" لتحديد تقريبي T م الهجين DNA-مانع.
    3. تصميم بنسبة ضئيلة عرقلة لتجنب تشكيل هيكل الثانوي أو dimers الذاتي.
      1. انتقل إلى موقع أدوات بنسبة ضئيلة (انظر جدول المواد) وحدد أداة "عرقلة محسن جزئية".
      2. لصق تسلسل القالب WT هذا هو المطلوب ليكون قد تم حظره في مربع. إضافة "+" أمام قواعد للإشارة إلى عرقلة القواعد.
      3. حدد خانات اثنين ل "هيكل الثانوي" و "النفس فقط". اضغط على زر تحليل لمراجعة جزئية لهياكل الثانوية يحتمل أن تكون مزعجة أو dimers الذاتي.
        ملاحظة: عشرات تمثل تقديرات تقريبية جدا من T م الصورة من الهياكل الثانوية وdimers الذاتي. انخفاض درجات بالتالي فهي أفضل ويمكن أن يتحقق عن طريق الحد من مانع مانع الاقتران. قليل النوكليوتيد عرقلة لMYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] وقد صمم لتغطية الأحماض الأمينية Q262-I266 ويتميز 3'مقلوب DT لمنع كل من التمديد البلمرة DNA والتدهور التي كتبها 3'-نوكلياز خارجية. هذه جزئية حجب محددة هي 17mer مع 10 قواعد منع والتي يرمز لها "+ N". 7 قواعد المتبقية هي النيوكليوتيدات DNA العادية.
  3. إعداد WTB-PCR والتدوير الحراري thermocycling
    1. إعداد WTB-PCR ميل الماجستيرس (MMX) باستخدام 2.5 ميكرولتر PCR رد فعل العازلة 10X ث / 20 ملي MgCl 250 ميكرومتر dNTPs، 0.2 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيدي، 1.2 ميكرومتر MYD88blocker، والدناز، خالية من ريبونوكلياز، H فائقة النقي 2 O لخلق النهائي حجم حل من 21.75 ميكرولتر في رد الفعل.
      ملاحظة: العمل التركيزات لحجم رد الفعل النهائي من 25 ميكرولتر (بعد إضافة قالب DNA والبلمرة). يتم إعداد التقليدية PCR MMX ببساطة عن طريق حذف إضافة مانع. تبقى جميع الخطوات بروتوكول متطابقة لكلا WTB وPCR التقليدية. وهذا يمكن أن تستخدم في التحقق من صحة وتحديد تخصيب يتحقق عن طريق إضافة مانع.
      1. عند حساب كمية MMX للتحضير للتأكد من حساب لمدة 3 ردود الفعل إضافية (الضوابط الإيجابية والسلبية والتحكم غير القالب للتحقق من التلوث) وعلى الأقل 1 رد فعل إضافي للخطأ pipetting ل.
    2. دوامة MMX بدقة. ويمكن تخزين MMX في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى ayالأذن.
    3. إضافة 0.25 البلمرة ميكرولتر طق DNA في رد فعل على MMX وعكس إلى المزيج. مرة واحدة تم إضافة البلمرة إلى MMX، ويبقيه على الجليد.
    4. وضع 96 لوحة PCR جيدا جديدة على طبق من ذهب الباردة وماصة 22 ميكرولتر من MMX مع البلمرة إلى كل رد فعل جيدا.
    5. إضافة 3 ميكرولتر الحمض النووي الجيني (50-100 نانوغرام / ميكرولتر إلى كل من الآبار التي تحتوي على MMX مع البلمرة.
    6. ختم لوحة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لضمان حل يصل الجزء السفلي من كل بئر.
    7. تحميل لوحة PCR على thermocycler.
      1. تهيئة الظروف التدوير الحراري thermocycling للتفاعل WTB-PCR على النحو التالي: تمسخ الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. 40 دورات تمسخ في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، التمهيدي الصلب عند 56 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والإرشاد عند 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة 20 ثانية. تمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
        ملاحظة: تتضمن أفضل الممارسات استكمال ما تبقى من البروتوكول في منطقة منفصلة جسديا لتجنب التلوث amplicon طن الاجهزة المستقبلية.
  4. أداء هلام الكهربائي وفقا لبروتوكولات الموصوفة سابقا 14 من أجل تحديد ما إذا كان WTB-PCR ناجحة ولتأكيد عدم وجود تضخيم في السيطرة غير القالب.
  5. تنقية PCR المنتج من حبات مغناطيسية
    1. إزالة حبات مغناطيسية من 4 ° C وتقديمهم إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. نقل 10 ميكرولتر منتج PCR إلى لوحة PCR جديدة.
    3. دوامة حبات مغناطيسية بقوة لإعادة تعليق كامل الجسيمات المغناطيسية.
    4. إضافة 18 ميكرولتر حبات مغناطيسية إلى كل بئر على لوحة جديدة. ماصة مزيج 10 مرات.
    5. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    6. وضع لوحة PCR على لوحة المغناطيس-تلتف الجانب لمدة 2 دقيقة إلى حبات منفصلة عن حل.
    7. نضح طاف مع ماصة الأقنية، وتجنب بيليه حبة.
    8. الاستغناء عن 150 ميكرولتر الايثانول 70٪ في كل بئر ويحضن في درجة حرارة الغرفة FOص لا يقل عن 30 ثانية. نضح الإيثانول مع ماصة الأقنية وتجاهل النصائح. كرر هذا الإجراء الغسيل مرة أخرى.
    9. باستخدام 20 ميكرولتر ماصة الأقنية نضح الإيثانول المتبقية من كل بئر وتجاهل النصائح.
    10. مرة واحدة آبار جافة (~ 10 دقيقة)، وترفع من لوحة المغناطيس وإضافة 40 ميكرولتر المياه مجانا نوكلياز إلى كل المزيج جيدا وماصة 15 مرات أو دوامة بلطف.
    11. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    12. وضع لوحة PCR على لوحة المغناطيس لمدة 1 دقيقة إلى حبات منفصلة عن حل.
    13. نقل 35 ميكرولتر من الناتج النقي إلى لوحة PCR جديدة. هذا هو تنقية المنتج PCR هو الآن على استعداد للشروع في التسلسل ثنائي الاتجاه أو يمكن تخزينها في -20 ° C لحين الحاجة إليها.
      ملاحظة: عند تطوير فحص جديد، قد تكون هناك حاجة الكمي من الناتج PCR المنقى. 1-3 نانوغرام / ميكرولتر amplicon DNA هو الأمثل لتسلسل ثنائية الاتجاه. إذا تركيز منخفض باستمرار، وزيادة المنتجات والمغناطيسية الخرز PCR proportionally (1: 1.8). إذا تركيز مرتفع باستمرار، أزل مع كمية أكبر من المياه.

3. تسلسل WTB-PCR المنتج

  1. ثنائي الاتجاه تسلسل
    ملاحظة: بروتوكول التالي هو صيغة معدلة من إرشادات الشركة المصنعة التي تم الأمثل لاستخدام عدد أقل من المواد الكيميائية.
    1. إعداد الأمام وعكس رد فعل التسلسل يمزج مع 0.25 ميكرولتر جاهزة مزيج من ردود الفعل، 1.88 ميكرولتر تسلسل العازلة، 1.78 ميكرومتر M13-F أو M13-R الاشعال التسلسل وإضافة والدناز، ريبونوكلياز خالية، H فائقة النقي 2 O لإيجاد حل نهائي حجم 9 ميكرولتر في رد الفعل. هذا المزيج رد فعل التسلسل يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل الى عام.
    2. ماصة 9 ميكرولتر من مزيج رد فعل التسلسل إلى الأمام في كل بئر من 96 لوحة PCR جيدا جديدة للتفاعل التسلسل إلى الأمام. كرر على لوحة منفصلة للتفاعل التسلسل العكسي.
    3. إضافة 1 ميكرولتر من تنقية ر المنتج WTB-PCRس كل بئر على حد سواء إلى الأمام وعكس لوحات.
    4. ختم لوحة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لضمان حل يصل الجزء السفلي من كل بئر.
    5. تحميل لوحة PCR على thermocycler.
      1. تهيئة الظروف التدوير الحراري thermocycling للتفاعل التسلسل على النحو التالي: 96 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. 30 دورات من 96 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 5 ثوان، 60 ° C لمدة 4 دقائق. عقد في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للتنقية.
  2. تنقية تسلسل المنتجات
    1. إعداد 1:25 حل جديد من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) والإيثانول بنسبة 100٪.
    2. إعداد 70٪ من محلول الإيثانول النقي.
    3. إضافة 30 ميكرولتر من خلات الصوديوم / 100٪ محلول الإيثانول إلى كل بئر على حد سواء إلى الأمام وعكس لوحات التسلسل ومزيج ماصة 5 مرات.
    4. ختم لوحة واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    5. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 2250 x ج لمدة 15 دقيقة.
    6. إزالة سداده لوحة وعكس مدى النفاياتحاوية.
      ملاحظة: عكس مرة واحدة فقط أو بيليه قد تخفف من قيعان جيدا.
    7. وضع لوحة مقلوب على منشفة ورقية نظيفة وأجهزة الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 1 دقيقة.
    8. إضافة 150 ميكرولتر الايثانول 70٪ على كل جانب.
    9. ختم لوحة وتدور في 2250 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. كرر الخطوات من 3.2.6 و3.2.7.
    11. إذا الآبار ليست جافة تماما، والسماح لهم الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. تأكد من العينات محمية من الضوء في حين التجفيف.
    12. إضافة 10 ميكرولتر الفورماميد إلى كل المزيج جيدا وماصة 10 مرات. ختم اللوحة.
    13. تفسد على thermocycler في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تليها 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    14. بعد تغيير طبيعة، يستعاض عن سداده لوحة مع الحاجز وتسلسل على منصة التسلسل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 15.

4. تحليل النتائج تسلسل

  1. تصور آثار التسلسل باستخدام دات التسلسلبرنامج تحليل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 16 و محاذاة إلى متواليات إشارة منها. محاذاة MYD88 إلى NCBI تسلسل المرجعية "NM_002468".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقدم لمحة المفاهيمية للWTB-PCR خلال التمديد في الشكل 1. بسبب عدم تطابق النوكليوتيدات واحد في هجين مانع DNA يقلل إلى حد كبير درجة حرارة انصهاره (ΔT م = 20 - 30 ° C)، والتضخيم من الأليل WT يتم حظر حين متحولة DNA قالب حر في استكمال تمديد 17. وبهذه الطريقة، يتم تضخيمه DNA متحولة بشكل كبير في حين يتم تضخيمه WT DNA خطيا.

ويرد دليل على تخصيب متحولة من قبل WTB-PCR المحرز في الشكل 2. تم اختبار الحمض النووي الجيني من المرضى الذين يعانون من الطفرات ودون كل من التقليدية وWTB-PCR ومن ثم تسلسل للتدليل على تخصيب نموذجية للتحقيق من قبل WTB-PCR وعدم وجود ايجابيات كاذبة في WT DNA. ينبغي تحديد تركيز عمل مانع المستخدمة في WTB-PCR MMX من خلال التجارب المعايرة والصورةhould معها تحقيق المستوى المطلوب من تخصيب متحولة في حين لا يؤدي إلى ايجابيات كاذبة أو حجب التضخيم من WT DNA تماما. تحليل تسلسل المنتج WTB-PCR يوضح تخصيب للأليل متحولة والحد من الكشف ما يزيد على 0.5٪ أليل متحولة في خلفية WT مقارنة مع 16٪ في PCR التقليدية 3.

قد تختلف آثار هذه الزيادة في الحساسية في التجارب السريرية اعتمادا على الكمية النسبية للخلايا الورمية في العينات التي تم اختبارها. في دراسة أساليب المقارنة، وقد أثبتت فحص WTB-PCR هو موضح هنا أن 64٪ من الطفرات MYD88 سيتم غاب عن الاختبار التقليدي للمرضى الذين يعانون من WM أو MGUS 3.

وغالبا ما ينظر الى مميزة الانزال في إشارة شدة (الشكل 3) إذا تركيز عالية جدا من مانع يستخدم أو إذا كان في مرحلة ما بعد PCR purificaفشل نشوئها لإزالة مانع قبل التسلسل ثنائية الاتجاه. ويتجلى هذا الأخير عندما يتم استبدال تنقية حبة المغناطيسي لتنقية الأنزيمية. على الرغم من تنقية الأنزيمية هي خيارا جذابا عند العمل مع أرقام عينة أكبر، فإنه من غير المناسب للتطبيق مع WTB-PCR كما فشل في إزالة مانع من حل قبل التسلسل.

مثال على القطع الأثرية تسلسل كثيرا ما وجد في DNA المستمدة FFPE-نتيجة السيتوزين نزع الأمين (C: G> T: A) وترد في الشكل 4 18، 19، 20. على الرغم من أن الأسباب الفعلية لنزع الأمين السيتوزين غير مفهومة، فإن أي فحص PCR أساس أن يثري لأليل متحولة اكتشاف هذه القطع الأثرية ذات التردد المنخفض 21 و 22. ايجابيات كاذبة بسبب كالة مكافحة المخدراتمن الأفضل تجنب mination من خلال البدء مع المواد قالب عالية الجودة؛ في كثير من الحالات حيث لم يكن ذلك ممكنا، والمعاملة مع glycosylase اليوراسيل DNA (UDG) خلال استخراج يمكن أن تساعد في الحد من وتيرة وشدة القطع الأثرية نزع الأمين. deaminated العلاج UDG من الأنسجة FFPE خلال استخراج (كجزء من مجموعة DNA FFPE) المكوس بقايا السيتوزين وبالتالي منع اصطناعي C: G> T: A الطفرات. ومع ذلك، يتم deaminated بقايا 5-ميثيل سيتوزين التي تحدث بشكل متكرر في dinucleotides الدليل السياسي الشامل لالثايمين، والتي لا يمكن رفعه من قبل UDG. القطع الأثرية التسلسل الناتجة التعرف إلى حد ما، وغالبا ما تظهر كما الطفرات جنبا إلى جنب كما رأينا في الشكل (4). إذا تم بالفعل استخراج عينات والعلاج UDG يمكن تنفيذها في استخراج الثانوي مع فقدان DNA منخفضة نسبيا.

شكل 1
الشكل 1: المفاهيمي اوفهrview من WTB-PCR. عدم تطابق النوكليوتيدات واحد في هجين مانع-DNA يقلل T م بنسبة تصل إلى 30 ° C. من خلال تصميم النوكليوتيد منع أن يكون T م من 10-15 ° C أعلى من درجة الحرارة خلال التمديد، يتم حظر التضخيم من WT DNA بينما يسمح تضخيم DNA متحولة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
تم اختبار الحمض النووي الجيني من المرضى الذين يعانون من الطفرات ودون كل من التقليدية وWTB-PCR ومن ثم تسلسل للتدليل على تخصيب نموذجية للتحقيق من قبل WTB-PCR: الشكل 2. وقد تم اختيار تركيز النهائي من مانع استخدامها لتحقيق WTB-PCR لتحقيق أقصى قدر من تخصيب متحولة في حين لا تسبب ايجابيات كاذبة في WT DNA أو عرقلة amplificaنشوئها WT DNA تماما. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): المميزة الانزال في كثافة إشارة ينظر عند استخدام تنقية PCR الأنزيمية بدلا من حبات مغناطيسية. وهذا هو الأرجح بسبب فشل تنقية الأنزيمية لإزالة مانع قبل التسلسل ثنائية الاتجاه. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: C: G> T: A التحف التسلسل تنشأ في الأنسجة FFPE عندما السيتوزين أو السيتوزين ميثليته وdeaminatedالجيش العراقي الفورمالين التثبيت لاليوراسيل أو ثايمين، على التوالي. اليوراسيل DNA glycosylase (UDG) يمكن استئصال اليوراسيل قبل WTB-PCR المساعدة على الحد من التحف التسلسل. ومع ذلك، ثايمين الناتجة عن deaminated 5-ميثيل سيتوزين، والذي يحدث في كثير من الأحيان في الجزر الدليل السياسي الشامل، لا يمكن رفعه من قبل UDG. خفض تركيز مانع المستخدمة في WTB-PCR قد تساعد على تقليل حدوث التحف التسلسل التي لم يتم علاجها عن طريق العلاج UDG. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

فحص WTB-PCR الموصوفة هنا يستخدم مجموعة عامة من الاشعال مع جزئية منع يهدف إلى منع التضخيم من WT DNA خلال تمديد (الشكل 1). ثم التسلسل المنتج WTB-PCR لتحليل طفرية. فائدة WTB-PCR / سانجر تكمن في بساطته، ذات حساسية عالية، والإنتاجية العالية. باستخدام الإرشادات الموضحة هنا، فإن معظم المقايسات القائمة سانجر أساس يمكن تعديلها ببساطة عن طريق إضافة قليل النوكليوتيد حجب لزيادة كبيرة في الحساسية. في المثال فحص المقدمة هنا زادت إضافة قليل النوكليوتيد الحجب واحد لPCR الحد من الكشف عن حوالي 16٪ أليل متحولة في خلفية WT للمقايسة التقليدية إلى> 0.5٪ في فحص WTB-PCR 3. وأثر ذلك هو تخفيض 64٪ في السلبيات كاذبة ينظر في الاختبارات السريرية 3. مؤكدا وجود طفرات في MYD88 ديه impl التشخيص والنذير كبيرications. بلاغ كاذب عن القضية بأنها سلبية قد تكون له عواقب خطيرة على العلاج الشامل والتعامل مع المرضى. اختبار مع WTB-PCR ذلك من أهمية كبيرة، خاصة في المرضى الذين يعانون الخلوية غير الطبيعية منخفضة نسبيا.

تقنيات WTB-PCR تختلف إلى حد كبير ويشار أحيانا إلى بالتبادل مع LNA، BNA، أو بوساطة السلطة الوطنية الفلسطينية-PCR لقط أو PCR-المشبك مسبار المقايسات 2 و 4 و 23 و 24. بعض الاختلافات الاستفادة WTB-PCR تنطوي على فحص QPCR الذي يستوجب تصميم التحقيق الفلورسنت إضافي لكل طفرة معينة. يتضمن تحديا كبيرا المرتبطة مع هذه التقنية الحاجة إلى تطوير تحقيقات ملزمة تنافسية التي تميز بدقة بين الأليلات WT ومتحولة. وعلاوة على ذلك، لأنه لا بد من تحقيق طفرة محددة، ونهج QPCR يفتقر إلى القدرة على الكشف عن mutatio غير معروفنانو ثانية. اختلاف آخر من WTB-PCR كتل WT التضخيم بطريقة-أليل معين. بدلا من استخدام بادئات-طفرة معينة ومع ذلك، محددة عرقلة التحقيق لالأليل WT يمنع التمهيدي الكامل ملزمة. في حين لا يتطلب هذا النهج تحقيق-طفرة معينة مثل QPCR، فإنه فشل في التمييز بين الطفرات والأخطاء الناجمة عن البلمرة يمكن أن يؤدي إلى زيادة ايجابيات كاذبة. التضخيم الهائل من تلك الأخطاء البلمرة التي يسببها من خلال PCR قد تخفي الكشف عن أحداث طفرة وراثية نادرة. أي نهج يستخدم PCR التضخيم لإثراء للطفرات ودقتها محدودة بسبب تكرار أخطاء PCR 25 و 26 و 27. وهناك ميزة أساسية من WTB-PCR / سانجر على العديد من المنهجيات ذات حساسية عالية الأخرى هو أنه يمنع التضخيم كل قالب WT ومتحولة القالب الذي يحدث خارج المنطقة الجينات المستهدفة من قبل oligonucleoti حجب الطفراتدي. لذلك، يتم تصفيتها الأخطاء PCR الذي عرضته بلمرة بفعالية جنبا إلى جنب مع WT DNA. وخلافا للAS-PCR أو QPCR ومع ذلك، يتم الاحتفاظ تخصيب للطفرات غير معروفة التي تحدث داخل المنطقة بنسبة ضئيلة منع تغطيتها. في حالة MYD88، سمح WTB-PCR للكشف عن كل من L265P وR264 * الطفرات 3. وأفادت الآخرين بالمثل كشف متعددة، والطفرات التردد المنخفض مع استخدام WTB-PCR 28. وهذا يجعل WTB-PCR مثالية لكل من البحث وأغراض الطبية.

جنبا إلى جنب مع حساسية عالية والضوابط الداخلية الكامنة للقضاء على ايجابيات كاذبة، والمرونة WTB-PCR لتكييف مقايسة تسلسل القائمة مع عدد قليل جدا من خطوات إضافية مع تصميم مانع جعلها خيارا جذابا لكثير من مختبرات مع المقايسات المعمول بها. يمكن عادة نفس مجموعة الاشعال PCR تستخدم في فحص التقليدي أن تستخدم في الاختلاف WTB-PCR. بعد التمديدالتغييرات بروتوكول لها ويوصى بشدة لWTB-PCR-بما في ذلك العلاج UDG من الأنسجة FFPE وتنقية ما بعد PCR المناسبة منهجيات وللتحويل على حد سواء. تصميم مانع، لذلك هو عنصر حاسم في تنفيذ فحص WTB-PCR. على الرغم من أن المبادئ التوجيهية الواردة في هذا البروتوكول تمثل أهم العوامل ذات الصلة في هذا التصميم، وينبغي اختبار مختلف أليغنوكليوتيد حجب العثور على واحد الذي يمنع WT التضخيم بكفاءة دون آثار الثانوية لPCR. يتضمن هذا إضافة أو إزالة القواعد مانع لضبط T م، تحول موقف بنسبة ضئيلة حجب نسبة إلى قالب WT، وتغيير الطول الإجمالي للبنسبة ضئيلة. وينبغي أيضا أن تستخدم مانع التجارب المعايرة لإقامة توازن بين الحوادث مقبولة من التحف التسلسل والحد من الكشف.

اختيار منهجية ملائمة للكشف عن الطفرات التي تكون موجودة في أجزاء الخلية الدقيقة يعتمد إلى حد كبير على التطبيق البريد وأنواع المرض / الطفرة. إذا كان المطلوب الكمي متحولة، QPCR أو رقمية PCR قد تقدم حلولا أكثر قدرة على البقاء من WTB-PCR / سانجر. على الرغم من WTB-PCR هو في المقام الأول الفحص النوعي، فمن الممكن لتحديد تقدير تقريبي للتردد أليل متحولة عن طريق اختبار عينة مع التقليدية وWTB-PCR في نفس الوقت. لأن الحد من الكشف عن الفحص التقليدي ~ 10 - أليل متحولة 20٪ في خلفية WT، فمن المناسب أن نخلص إلى أن الطفرات الكشف عنها بواسطة الفحص WTB-PCR ولكن ليس التقليدية موجودة بتركيز أقل من الحد الكشف عن الفحص التقليدي. بضعة فحوصات توفر التنوع والبساطة ومتانة WTB-PCR. منخفضة التكلفة والفترة الزمنية قصيرة يجعلها مثالية لتقييم مرض المتبقية بعد العلاج أو مراقبة الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج. بالإضافة إلى ذلك، القدرة على الكشف عن الطفرات غير موصوف سابقا تجعل WTB-PCR مثالية لأغراض البحث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes Eppendorf 05-402-25
100% alcohol VWR 89370-084 Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer ABI or equivalent
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils GeneMate T-2451-1 For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit Life Technologies 4337455 For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series Eppendorf A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates Eppendorf Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM) Invitrogen 10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027 For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute  Sigma E7023 200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) Roche 12032937001 With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus 2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit  Qiagen 180134 Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide ABI 4311320 For sequencing.
LNA oligonucleotide Exiqon 500100 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer ABI 5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer ABI 5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler Eppendorf E950030020
Microcentrifuge Model 5430 Eppendorf FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer IDT 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer IDT 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates GeneMate T-3107-1
Pipettors 20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well ABI 4315933
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304 For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0 ABI 4474978 For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)  Sigma S7899
Sterile filtered pipette tips 20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C  Eppendorf 5382000023
Vortex genie Scientific Industries SI-0236
Wash reservoir ~ 1,000 mL
Xylene VWR 89370-088 Histology grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96, (16), 9236-9241 (1999).
  2. Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55, (4), 632-640 (2009).
  3. Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38, (2), 133-140 (2016).
  4. Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24, (45), 6830-6834 (2005).
  5. Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7, (3), 1313-1332 (2015).
  6. Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15, (8), 420 (2014).
  7. Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121, (13), 2522-2528 (2013).
  8. Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121, (11), 2051-2058 (2013).
  9. Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87, (5), 503-510 (2012).
  10. Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124, (21), 1690-1690 (2014).
  11. Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470, (7332), 115-119 (2011).
  12. Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43, (9), 830-837 (2011).
  13. Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3, (3), S30-S37 (1993).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  15. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. (2014).
  16. Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. (2012).
  17. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3, (1), 27-38 (2003).
  18. Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4, (1), (2004).
  19. Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29, (3), 257-264 (2007).
  20. Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12, (5), 3191-3204 (2011).
  21. Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40, (14), e107-e107 (2012).
  22. Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59, (9), 1376-1383 (2013).
  23. Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128, (2), 398-402 (2008).
  24. Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17, (2), 179-184 (2015).
  25. Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387, (2), 97-121 (1997).
  26. Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33, (1), 129-139 (2002).
  27. Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17, (5), 365-374 (2002).
  28. Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126, (23), 716 (2015).
من النوع البري منع PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كوسيلة الحساسة بشدة للكشف عن التردد المنخفض الجسدية الطفرات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).More

Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter