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Genetics

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

doi: 10.3791/55130 Published: March 29, 2017

Abstract

Eine genaue Erfassung und Identifizierung von Niederfrequenzmutationen können problematisch sein, wenn Resterkrankung nach der Therapie die Beurteilung, Screening für neue Resistenzmutationen während der Therapie, oder wenn die Patienten haben wenige zirkulierende Tumorzellen. Wildtyp durch Sequenzanalyse gefolgt PCR Blockierung bietet eine hohe Empfindlichkeit, Flexibilität und Einfachheit als Methode, diese niedrigen Frequenz Mutationen zu detektieren. Durch das Hinzufügen eines benutzerdefinierten Nukleinsäure-Oligonukleotid an ein neuen oder zuvor etablierten konventionellen PCR basierten Sequenzierungsassay entworfen verriegelte, Empfindlichkeiten von etwa 1 mutanten Allels in einem Hintergrund von 1000 WT Allele (: 1000 1) erreicht werden. Sequenzierungsartefakten im Zusammenhang mit Ereignissen Desaminierung üblicherweise in Formalin fixierten Paraffin eingebetteten Geweben teilweise durch die Verwendung von Uracil-DNA-Glycosylase während Extraktionsschritte behoben werden kann. Das optimierte Protokoll hier ist spezifisch zum Nachweis MYD88 Mutation, sondern kann als Vorlage dient jeden entwerfenWTB-PCR-Assays. Die Vorteile des WTB-PCR-Test gegenüber anderen häufig verwendeten Tests zum Nachweis von niedrigen Frequenz Mutationen einschließlich Allel-spezifische PCR und quantitative Echtzeit-PCR weniger Vorkommen von Fehlalarmen sind, eine größere Flexibilität und eine einfache Implementierung und die Fähigkeit zu erkennen, sowohl bekannte als und unbekannte Mutationen.

Introduction

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Sanger-Sequenzierung ist traditionell der Goldstandard in der Erkennung von bekannten und unbekannten somatischen Mutationen. Eine der Einschränkungen der Sanger - Sequenzierung ist die Nachweisgrenze (~ 10 - 20% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT) 1. Dieses Maß an Empfindlichkeit ungeeignet ist für geringe somatische Mutationen erfassen, die in Proben von Geweben oder prämalignen Patienten mit wenigen zirkulierenden Tumorzellen vorhanden sein können, oder, wenn Knochenmark (BM) sind lückenhaft. Dies macht auch Resterkrankung nach der Therapie oder zum Nachweis von Schwellenresistenzmutationen während der Therapie schwierig durch konventionelle Sequenzierung allein 2 zu beurteilen. Durch Ersetzen der konventionelle PCR mit verschlossenen Nukleinsäure (LNA) -vermittelten Wildtyp - blockierende PCR (WTB-PCR) in Sanger - Sequenzierung, Empfindlichkeiten von bis zu 0,1% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT 2, 3, 4 erreicht werden. ImWTB-PCR, Anreicherung für mutante Allele wird über die Zugabe eines kurzen erreicht (~ 10 bis 14 NT) Blocking (LNA) Oligonukleotid, das bevorzugt an WT DNA wodurch verhindert Amplifikation von WT DNA bindet. Die Mutante angereicherte WTB-PCR-Produkt kann dann sequenziert werden. WT DNA anstelle der Auswahl für spezifische Mutationen WTB-PCR ermöglicht die Anreicherung von bekannten und unbekannten Mutationen in winzigen Zellfraktionen durch die Blockierung.

Mehrere Verfahren sind zum Nachweis von Mutationen in kleinen Zellen Fraktionen derzeit verwendet. Dazu gehören allelspezifische PCR Amplifikation-Refractory Mutation System (ARMS), denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC), Perlen, Emulsionen, Amplifikation und Magnetics (beaming), elektrisches Feld induzierte Freisetzung und Messung (Efirm), hochauflösende Schmelzpunkt und andere. Allerdings sind die meisten dieser Methoden begrenzt durch falsch-positive und die Fähigkeit, nur eine Mutation nachzuweisen , dass der Assay entwickelt wurde 4 5, 6.

Hier zeigen wir die Steigerung der Empfindlichkeit erreicht durch WTB-PCR in Screening auf Mutationen in dem myeloischen Differenzierungsfaktor 88 - Gen , wie durch Albitar et al. 3 MYD88 mutations sind wichtige diagnostische und prognostische Faktoren in Morbus Waldenström (WM), IgM monoklonaler Gammopathie unklarer Signifikanz (IgM-MGUS), Milz- Randzone Lymphom (SMZL) und diffusen großzelligen B-Zell-Lymphom (DLBCL). MYD88 Mutationen sind in fast allen Fällen von WM und etwa 50% der Patienten mit Immunoglobulin M (IgM) -sezernierenden MGUS gefunden. Im Gegensatz dazu sind MYD88 Mutationen in nur 0-6% der Patienten mit SMZL und fehlt bei multiplem Myelom 7, 8 gefunden. Da überlappende morphologischen, immunphänotypische, zytogenetischen und klinische Charakteristika zwischen WM und SMZL oder IgM-multiplem Myelom häufig Differentialdiagnosen können, das Vorhandensein einer Mutation MYD88 komplizieren kann als nützlich identifiziert Faktor 9 dienen. MYD88 Mutationen auch mit einem größeren Krankheitsbelastung bei Patienten mit DLBCL und schlechter Gesamtüberlebenszeit nach der Therapie 7, in Verbindung gebracht worden 10. Darüber hinaus, da MYD88 Mutationen sind häufiger in aktivierten B-Zell-like (ABC) DLBCL als Keimzentrum-B-Zell-like (GCB) DLBCL oder primärer mediastinalen B-Zell-Lymphom (PMBL), MYD88 Mutationsstatus als dienen kann gefunden Surrogatmarker für das ABC - Subtyp 11, 12.

Das detaillierte Protokoll hier zur Verfügung gestellten dient als Vorlage, aus denen neue Tests entwickelt werden können, oder die meisten bestehenden Sequenzierung Assays können leicht genau angepasst werden, um Niederfrequenz Mutationen in verschiedenen Probentypen zu erkennen. Der Ansatz kann auch zur Überwachung und Erfassung resistente Mutationen verwendet werden, die in Tumoren oder sogar Bakterien entwickeln können, die sie entwickeln kann, während Patienten mit gezielter Therapie oder Antibiotika behandelt werden. Darüber hinaus richtet sie und Abhilfen viele der Probleme mit der Mutation Anreicherung verbunden sind, insbesondere in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe in Formalin fixiert.

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Protocol

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Ethik Statement: Alle Tests von menschlichen Proben wurden durchgeführt, nachdem Institutional Review Board (IRB) die Genehmigung zu erhalten.

1. DNA Extraktion aus FFPE Tissue, peripherem Blut und Knochenmark-Aspirat

  1. Für FFPE Gewebe Knochenmark mit DNA-Extraktions-Kits FFPE
    1. Beginne mit FFPE Geweben von ungefärbten Folien (von 5 bis 10 Abschnitte mit einem 5 - 10 um Dicke).
      HINWEIS: Bei Beginn mit Gewebespänen verwenden 3 bis 6 Abschnitte mit einer 5 - 10 um Dicke und überspringt zu Schritt 1.1.6.
    2. Legen Sie Folien in einer Dia-Korb und bereiten vier Waschwasserbecken (zwei für Xylen und zwei für 100% Alkohol). In jeden Korb ein Mindestvolumen von 600 ml Lösung.
    3. Deparaffinisieren die Folien durch in der ersten Schale 5 min Xylol waschen zu tun. Die Objektträger in der zweiten Xylol Spülwanne für weitere 5 min.
    4. Nach Entparaffinierung, waschen Sie die Folien mit 100% Alkohol 5 min. Die Objektträger in der zweitenAlkohol Spülwanne für weitere 5 min.
    5. Lassen Sie die Folien vor dem Abschaben sie mit einer Rasierklinge in ein Mikrozentrifugenröhrchen vollständig unter einer Abzugshaube trocknen.
      HINWEIS: Wenn ein H & E Schlitten mit Tumorregion angegeben zur Verfügung steht, die Folien ausrichten und nur die Tumorregion kratzen.
    6. Gehen Sie mit den Anweisungen des Herstellers Handout im Bausatz enthalten.
  2. Für BM absaugen und peripherem Blut
    1. Extrahieren Sie nach den Anweisungen des Herstellers Handout mit diesen Spezifikationen.
      HINWEIS: Es gibt zahlreiche im Handel erhältliche Kits und Verfahren zur DNA-Extraktion aus FFPE Geweben und Zellen. Praktisch können alle verwendet werden. Verwendet ein Verfahren, das im Labor hergestellt wird.
      1. Verwenden 200 & mgr; l peripheres Blut (PB) oder 100 ul BM + 100 & mgr; l PBS.
      2. Verwenden Sie 4 & mgr; l RNase A-Stammlösung.
      3. Eluieren mit 100 & mgr; l Elutionspuffer.
  3. DNA-Quantifizierung
    1. Messung von DNA-Konzentrationen unter Verwendung einen Spektralphotometers ein 260 nm / 280 nm-Verhältnis von etwa 1,8 (bei reiner DNA) zu gewährleisten. Wenn das Verhältnis wesentlich niedriger ist, kann sie die Anwesenheit von Protein, Phenol oder anderen Verunreinigungen zeigen, die mit Downstream-Anwendungen stören können.
    2. Justieren DNA-Konzentrationen auf etwa 50 bis 100 ng / & mgr; L mit dem entsprechenden Elutionspuffer.

2. Wildtyp-PCR-Blocking

  1. Primer-Design
    1. Design und erhalten Primer für die Gene von Interesse nach zuvor beschriebenen allgemeinen Richtlinien des PCR - Primer - Designs 13. Fügen Sie M13-Vorwärts- und Rückwärts-Universal-Sequenzierungs-Primer in PCR-Primer.
      HINWEIS: Der Assay MYD88 Exon 5 von MYD88 zu amplifizieren entwickelt (G259 - N291) und 110 in der 5' befindet Nukleotide intronischen Region, die die Spleißstelle und ein Teil von Intron 4 zu bedecken die Vorwärts- und Rückwärtsprimer wurden entwickelt, um mit einem 5' -M13-Sequenz (M13-forward: tgt aaa ACG ACG GCC AGT; M13-Rückwärts: CAG GAA ACA GCT ATG ACC) für das Annealing von komplementären Sequenzierungsprimern (siehe Materialien Table) zu ermöglichen.
  2. Locked Nucleic Acids Oligonukleotid-Entwurf
    1. Entwerfen des blockierende Oligonukleotid etwa 10 bis - 15 Basen lang und komplementär zu der WT-Vorlage, wo mutanten Anreicherung gewünscht wird.
      HINWEIS: Eine kürzere Oligo wird Mismatchdiskriminierung verbessern. Um eine hohe Zielspezifität zu erreichen, ist es wichtig, nicht zu viel zu verwenden, blockiert Nukleotiden, da diese in einem sehr „klebrig“ Oligonukleotid führen kann. Der Inhalt und die Länge und die blockierende Nucleotid sollte entsprechend der spezifischen Nukleotid optimieren werden, die blockiert werden müssen. Es ist wichtig, eine hohe Bindungsspezifität zu erreichen, ohne Sekundärstruktur zu beeinträchtigen und Selbst Komplementarität zu riskieren.
    2. Entwerfen der blockierenden Oligo eine T m 10 haben - 15 ° C über der Verlängerung temperature während Thermozyklisierung. Stellen Sie die T m durch Hinzufügen oder Entfernen von blockierenden Basen oder durch Basen für die DNA - Blockierung bei gleichzeitiger Vermeidung lange Strecken Einsetzen von (3 bis 4 Basen) des Blockierens G oder C - Basen.
      1. Navigieren Sie zu dem Oligo - Tools - Website (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die „Blockierung Oligo Tm Prediction“ -Tool.
      2. Einfügen der Sequenz der WT-Vorlage, die gewünscht wird, in die „Oligo Sequence“ abgeblockt wird. Add „+“ vor Basen-Blocker Basen anzuzeigen.
      3. Wählen Sie den „Berechnen“ , um die ungefähre Tm der DNA-Blocker - Hybrid zu bestimmen.
    3. Entwerfen Sie die Blockierung Oligo Sekundärstrukturbildung oder Selbst Dimere zu vermeiden.
      1. Navigieren Sie zu dem Oligo - Tools - Website (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die „Blockierung Oligo Optimizer“ -Tool.
      2. Einfügen der Sequenz der WT-Vorlage, die gewünscht wird, in die Box blockiert werden. Add „+“ vor Basen blockiert Basen anzuzeigen.
      3. Wählen Sie die beiden Boxen für „Sekundärstruktur“ und „Nur selbst“. Drücken Sie die Taste, um die Analyse Oligo für potenziell störende Nebenstrukturen oder Selbst Dimere zu überprüfen.
        HINWEIS: Die Noten repräsentieren sehr grobe Schätzungen der T m ‚s der Sekundärstrukturen und Selbst Dimere. Niedrigere Werte sind daher optimal und können durch eine Begrenzung Blocker-Blocker Paarung erreicht werden. Die Blockierungs-Oligonucleotid für MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + G + T + A + T + CC / invdT /)] wurde entwickelt, um die Aminosäuren Q262-I266 zu bedecken und verfügt über ein 3'-invertierten dT sowohl Verlängerung durch DNA-Polymerase und Abbau durch 3'-Exonuclease zu hemmen. Diese spezifische blockierende oligo ist ein 17-mer mit 10 blockierenden Basen, die als „+ N“ bezeichnet sind. Die verbleibenden 7 Basen sind gewöhnliche DNA-Nucleotide.
  3. WTB-PCR-Setup und Thermocycling
    1. Bereiten Sie einen WTB-PCR Master mix (MMX) 2,5 & mgr; l PCR - Reaktionspuffer 10x w / 20 mM MgCl 2, 250 & mgr; M dNTPs, 0,2 & mgr; M Vorwärts und Rückwärtsprimer, 1.2 uM MYD88blocker und DNAse, RNAse-frei, ultrareines H 2 O , um eine endgültige zu schaffen unter Verwendung von Lösungsvolumen von 21,75 & mgr; l pro Reaktion.
      HINWEIS: Die Arbeitskonzentrationen sind für die endgültigen Reaktionsvolumen von 25 & mgr; l (nach der Zugabe von DNA-Matrize und Polymerase). Herkömmliche PCR MMX wird durch einfaches Weglassen der Zugabe von Blocker hergestellt. Alle Protokollschritte bleiben identisch für beide WTB und konventionelle PCR. Dies kann bei der Validierung und Bestimmung Anreicherung durch Zugabe von Blocker erreicht werden.
      1. Wenn die Menge der MMX Berechnung vorzubereiten für 3 zusätzliche Reaktionen (positive und negative Kontrollen und eine nicht-Kontrolle zu überprüfen, für die Kontamination) und zumindest 1 weitere Reaktion zum Pipettieren Fehler zu berücksichtigen, stellen Sie sicher.
    2. Vortex MMX gründlich. Die MMX kann bei -80 ° C gelagert werden bis ayOhr.
    3. Zugabe von 0,25 & mgr; l Taq DNA-Polymerase pro Reaktion auf den MMX und Invertzucker zu mischen. Sobald die Polymerase an die MMX hinzugefügt wurde, halten Sie es auf Eis.
    4. Legen Sie eine neue 96-Well-PCR-Platte auf einer kalten Platte und Pipette 22 ul MMX mit Polymerase zu jeder Well Reaktion.
    5. Fügen 3 ul genomische DNA (50 bis 100 ng / & mgr; l zu jedem der Vertiefungen mit dem MMX-Polymerase enthalten.
    6. Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge kurz die Lösung erreicht den Boden jeder Vertiefung zu gewährleisten.
    7. Laden Sie die PCR-Platte auf einem Thermocycler.
      1. Stellen Sie die thermozyklischen Bedingungen für die WTB-PCR-Reaktion wie folgt: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 6 min; 40 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, Primer-Annealing bei 56 ° C für 30 s und Verlängerung bei 72 ° C für 1 min 20 s; letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 min.
        HINWEIS: Beste Praxis beinhaltet in einem räumlich getrennten Bereich, den Rest des Protokolls abgeschlossen Amplikonkontamination zu vermeiden in Zukunft Setups.
  4. Perform - Gelelektrophorese nach vorher beschriebenen Protokollen 14, um zu bestimmen , ob WTB-PCR erfolgreich war , und einen Mangel an Verstärkung in dem nicht-Templat zu bestätigen.
  5. Aufreinigung von PCR-Produkt von magnetischen Kügelchen
    1. Entfernen magnetische Kügelchen von 4 ° C und bringt auf Raumtemperatur.
    2. Übertragen Sie 10 & mgr; l PCR-Produkt zu einer neuen PCR-Platte.
    3. Vortex kräftig die magnetischen Kügelchen vollständig die magnetischen Partikel resuspendieren.
    4. In 18 ul magnetische Kügelchen zu jeder Vertiefung auf die neue Platte. Pipette 10 Mal mischen.
    5. Inkubiere bei Raumtemperatur für 5 min.
    6. Platzieren Sie die PCR-Platte auf der Seite Röcke Magnetplatte für 2 Minuten zur Trennung Perlen aus der Lösung.
    7. Den Überstand aspirieren mit einer Mehrkanalpipette, um den Wulst Pellet zu vermeiden.
    8. Dispense 150 & mgr; l 70% Ethanol in jede Vertiefung und Inkubieren bei Raumtemperatur for mindestens 30 s. Saugen Sie das Ethanol mit einer Mehrkanalpipette und Tipps verwerfen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang noch einmal.
    9. Unter Verwendung einer 20 & mgr; l Mehrkanalpipette die verbleibende Ethanol aus jeder Vertiefung verworfen und Spitzen abzusaugen.
    10. Sobald Vertiefungen trocken (~ 10 min) sind, von der Magnetplatte zu entfernen, und 40 & mgr; l Nuklease freies Wasser zu jeder Vertiefung und Pipettenmischung 15-mal oder vortex sanft hinzuzufügen.
    11. Inkubiere bei Raumtemperatur für 2 min.
    12. Platzieren Sie die PCR-Platte auf Magnetplatte für 1 min auf getrennte Perlen aus der Lösung.
    13. Transfer 35 ul gereinigtes Produkt eine neue PCR-Platte. Dies ist gereinigte PCR-Produkt nun bereit ist, mit bidirektionaler Sequenzierung, um fortzufahren oder können, bis sie benötigt bei -20 ° C gelagert werden.
      HINWEIS: Wenn Sie einen neuen Test zu entwickeln, die Quantifizierung des gereinigten PCR-Produkts erforderlich. Von 1 bis 3 ng / & mgr; l DNA-Amplikon ist optimal für die bidirektionale Sequenzierung. Wenn Konzentration konstant niedrig ist, erhöht PCR-Produkt und magnetische Kügelchen proportional (1: 1.8). Wenn Konzentration konstant hoch ist, mit einem größeren Volumen Wasser eluieren.

3. Sequenzierung des WTB-PCR-Produkt

  1. Bidirektionale Sequenzierung
    HINWEIS: Das folgende Protokoll eine modifizierte Form der Anweisungen des Herstellers, die optimiert wurde weniger Reagenzien zu verwenden.
    1. Bereiten Vorwärts- und Rückwärts - Sequenzierungsreaktion vermischt sich mit 0,25 & mgr; l Ready Reaction Mix, 1,88 & mgr; l Sequenzierungspuffer, 1,78 & mgr; M M13-F oder M13-R - Sequenzierungsprimer und fügen und DNAse, RNAse-frei, ultrareines H 2 O , um eine endgültige Lösung zu schaffen Volumen von 9 & mgr; l pro Reaktion. Diese Sequenzierung Reaktionsmischung kann bis zu einem Jahr bei -20 ° C gelagert werden.
    2. Pipette 9 ul der Vorwärts-Sequenzierungsreaktionsmischung in jede Vertiefung einer neuen 96-Well-PCR-Platte für die Vorwärtssequenzierungsreaktion. Wiederholen Sie auf einer separaten Platte für die Rückwärtssequenzierungsreaktion.
    3. 1 & mgr; l des gereinigten WTB-PCR-Produkt to jede Vertiefung auf sowohl die Vorwärts- und Rückwärts-Platten.
    4. Verschließen Sie die Platte und Zentrifuge kurz die Lösung erreicht den Boden jeder Vertiefung zu gewährleisten.
    5. Laden Sie die PCR-Platte auf einem Thermocycler.
      1. Stellen Sie die thermozyklischen Bedingungen für die Sequenzierungsreaktion wie folgt: 96 ° C für 1 min; 30 Zyklen von 96 ° C für 10 s, 50 ° C für 5 s, 60 ° C für 4 min; zur Reinigung bei 4 ° C, bis sie bereit halten.
  2. Reinige Sequenzierungsprodukte
    1. Eine frische Lösung von 01.25 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 100% igem Ethanol.
    2. Bereiten Sie eine frische 70% Ethanollösung.
    3. Zugabe von 30 & mgr; l Natriumacetat / 100% Ethanol-Lösung zu jeder Vertiefung sowohl die Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzierungsplatten und Pipetten Mischung 5 mal.
    4. die Platte wieder zu verschließen und für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Zentrifugieren der Platte bei 2.250 xg für 15 min.
    6. Entfernen Sie die Abklebefolie und invertieren über einen AbfallContainer.
      HINWEIS: Invert nur einmal oder das Pellet aus den Vertiefungsböden lösen kann.
    7. Legen Sie die umgedrehte Platte auf einem sauberen Papiertuch und Zentrifuge bei 150 × g für 1 min.
    8. In 150 & mgr; l 70% Ethanol zu jeder Vertiefung.
    9. Reseal die Platte und Spin bei 2.250 × g für 5 min.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.6 und 3.2.7.
    11. Wenn die Vertiefungen nicht vollständig trocken sind, damit sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Stellen Sie sicher, dass die Proben vor Licht geschützt werden, während Trocknen.
    12. In 10 & mgr; l Formamid in jede Vertiefung und Pipette Mix 10-mal. Reseal die Platte.
    13. Denaturieren auf Thermocycler bei 95 ° C für 3 min um 4 ° C für 5 min.
    14. Nach Denaturieren Ersetzen auf Sequenzierung Plattform die Plattenversiegelung mit Septen und Sequenz gemäß den Anweisungen des Herstellers 15.

4. Analyse der Sequenzierungsergebnisse

  1. Visualisieren Sequenzierung Spuren eine Sequenzierung dat miteine Analysesoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers 16 und zu den jeweiligen Referenzsequenzen auszurichten. Richten MYD88 zu NCBI Referenzsequenz „NM_002468“.

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Representative Results

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Eine konzeptionelle Übersicht über WTB-PCR während der Extension ist in Abbildung 1 dargestellt. Da eine einzelne Nukleotid Fehlpaarung in dem Blocker-DNA - Hybrid seine Schmelztemperatur stark abnimmt (& Delta; T m = 20 - 30 ° C), die Amplifikation des WT Allel blockiert wird , während mutieren Template - DNA frei ist Verlängerung abzuschließen 17. Auf diese Weise wird mutierte DNA amplifiziert exponentiell während WT DNA linear verstärkt wird.

Eine Demonstration der mutierten Anreicherung von WTB-PCR erreicht wird in Abbildung 2 dargestellt. Genomische DNA von Patienten mit und ohne Mutationen wurden getestet, indem sowohl konventionelle als auch WTB-PCR und dann die typische Anreicherung erreichbar durch WTB-PCR und Fehlalarme in WT DNA zu demonstrieren sequenziert. Die Arbeitskonzentration von Sperrer, das verwendet in WTB-PCR MMX sollte durch Titration und s bestimmt werdenhould das gewünschte Niveau der mutierten Anreicherung erreichen, während nicht vollständig zu falsch positiven oder blockierende Verstärkung von WT DNA führt. Sequenzanalyse von WTB-PCR - Produkt zeigt die Anreicherung für das mutierte Allel und eine Nachweisgrenze von über 0,5% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT verglichen mit 16% in konventioneller PCR 3.

Die Auswirkungen dieser Erhöhung der Empfindlichkeit in klinischen Tests können auf der relativen Menge von neoplastischen Zellen in den getesteten Proben variieren. In einer Vergleichsstudie Methoden beschriebene WTB-PCR - Assay hier hat gezeigt , dass 64% der MYD88 Mutationen durch herkömmliche Tests von Patienten mit WM oder MGUS 3 verfehlt werden würde.

Eine charakteristische Abfall der Signalintensität (Figur 3) wird oft , wenn eine zu hohe Konzentration von blocker gesehen verwendet wird , oder wenn nach der PCR Purification fehlgeschlagen Blocker vor der bi-direktionale Sequenzierung zu entfernen. Letzteres zeigt sich, wenn magnetische bead Reinigung für enzymatische Reinigung ersetzt wird. Obwohl die enzymatische Reinigung eine attraktive Option ist, wenn sie mit größeren Probenzahlen arbeiten, ist es für die Anwendung mit WTB-PCR ungeeignet, da es Blocker aus der Lösung der Sequenzierung zu entfernen, bevor ausfällt.

Ein Beispiel für eine Sequenz Artefakte häufig in FFPE abgeleitete DNA als Ergebnis Cytosin Desaminierung gefunden (C: G> T: A) sind in Abbildung 4 3, 18, 19, 20. Obwohl die tatsächlichen Ursachen für Cytosin Desaminierung schlecht verstanden sind, kann jede PCR - basierten Assays , die für die mutierten Allele anreichert wird diese Niederfrequenzartefakte 21, 22 erfassen. Falsch positive Ergebnisse aufgrund deamung am besten vermieden werden mit qualitativ hochwertigen Templatmaterials durch Starten; in den vielen Fällen, in denen dies nicht möglich ist, die Behandlung mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) während der Extraktion kann bei der Begrenzung der Häufigkeit und Intensität von Desaminierung Artefakte unterstützen. UDG-Behandlung von FFPE Gewebe während der Extraktion (als Teil der DNA FFPE kit) Akzisen desaminiert Cytosinreste dadurch künstlich induzierten C verhindert: G> T: A-Mutationen. Jedoch 5-Methylcytosin-Reste, die häufig an CpG Dinukleotiden auftreten, werden zu Thymin desaminiert, die nicht durch UDG exzidiert werden. Die resultierenden Sequenzierungsartefakte sind ziemlich erkennbar und erscheinen oft als Tandem - Mutationen , wie in Abbildung 4 zu sehen. Wenn Proben werden bereits extrahiert worden ist, kann UDG-Behandlung in einer sekundären Extraktion mit relativ niedrigem DNA Verlust realisiert werden.

Abbildung 1
Abbildung 1: Konzeptionelle Overview von WTB-PCR. Eine einzelne Nukleotid - Fehlpaarung in dem Blocker-DNA - Hybrids nimmt T m um bis zu 30 ° C. Durch die Ausbildung des Blockierungs - Oligonucleotid einen T m von 10 zu haben , - 15 ° C über die Temperatur während des Ausfahrens, Amplifikation von WT DNA blockiert wird , während die Amplifikation von mutierten DNA ermöglicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Genomic DNA von Patienten mit und ohne Mutationen wurden getestet , indem sowohl konventionelle als auch WTB-PCR und dann die typische Anreicherung erreichbar durch WTB-PCR nachzuweisen sequenziert. Die Endkonzentration des Blockers verwendet WTB-PCR zu erreichen, wurde maximale mutanten Anreicherung zu erzielen, während nicht ausgewählte falsch Positiven in WT DNA verursachen oder amplifica Blockiertion von WT DNA vollständig. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Charakteristische Abfall der Signalintensität beobachtet , wenn die enzymatische PCR Purification anstelle von magnetischen Kügelchen verwendet wird. Dies ist wahrscheinlich, weil die enzymatische Reinigung Blocker zu entfernen, bevor die bidirektionale Sequenzierung versagt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: C: G> T: Sequenzierungsartefakte in FFPE Gewebe entstehen , wenn Cytosin oder Cytosin methylierte sind desaminiert via Formalinfixierung zu Uracil oder Thymin, respectively. Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) kann Uracil vor dem WTB-PCR helfen auszuschneiden Sequenzierungsartefakte zu reduzieren. Allerdings Thymin aus deaminierte 5-Methylcytosin, die häufig bei CpG-Inseln auftreten, kann nicht durch UDG ausgeschnitten werden. die Konzentration des Blockers in abnehm WTB-PCR verwendet werden, kann dazu beitragen, das Auftreten von Sequenzierungsartefakte zu reduzieren, die durch UDG-Behandlung nicht beseitigt werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Die WTB-PCR - Assay beschrieben hier verwendet einen generischen Satz von Primern mit einem blockierenden Oligo während des Ausfahrens (Figur 1) zu blockieren Amplifikation von WT DNA konstruiert. Das WTB-PCR-Produkt wird dann für Mutationsanalyse sequenziert. Die Nützlichkeit der WTB-PCR / Sanger liegt in seiner Einfachheit, hohe Empfindlichkeit und hohen Durchsatz. Mit den hier beschriebenen Richtlinien, die meisten bestehenden Sanger basierte Assays können einfach über die Zugabe eines blockierenden Oligonukleotid modifiziert werden Empfindlichkeit erheblich zu erhöhen. Im Beispiel hier Assay die Zugabe eines einzigen Blockierungs - Oligonucleotids auf PCR präsentiert erhöhte die Nachweisgrenze von etwa 16% mutanten Allels in einem Hintergrund von WT für den herkömmlichen Assay auf> 0,5% in der WTB-PCR - Assay 3. Der Effekt davon ist eine 64% ige Reduktion der falsch - negative Ergebnisse in klinischen Tests 3 zu sehen. Bestätigen der Anwesenheit von Mutationen in MYD88 hat signifikante diagnostische und prognostische implikationen; fälschlich berichtet einen Fall, als negative schwerwiegende Folgen für die Gesamttherapie und Patientenmanagement haben kann. Testen mit WTB-PCR ist daher von großer Bedeutung, insbesondere bei Patienten mit relativ niedriger abnormal Zellularität.

WTB-PCR - Techniken sind sehr unterschiedlich und werden manchmal austauschbar mit LNA bezeichnet, BNA, oder PNA-vermittelter PCR Klemm- oder PCR-clamp-Sondenassays 2, 4, 23, 24. Einige Variationen Verwendung WTB-PCR beinhalten eine qPCR-Assay, der eine zusätzliche fluoreszierende Sonde für jede spezifische Mutation erfordert entwerfen. Eine wesentliche Herausforderung mit dieser Technik verbunden schließt die Notwendigkeit kompetitiv bindende Sonden zu entwickeln, die zwischen WT und Mutanten-Allele genau unterscheiden. Da darüber hinaus eine Mutation spezifische Sonde erforderlich ist, fehlt es der qPCR Ansatz die Fähigkeit unbekannt mutatio zu erkennenns. Eine weitere Variante der WTB-PCR-Blöcke WT-Amplifikation in einer Allel-spezifischen Art und Weise. Anstelle der aber mutationsspezifischen Primer, eine blockierende Sonde, die spezifisch für den WT Allel hemmt vollständige Primerbindung. Während dieser Ansatz keine mutationsspezifische Sonde wie qPCR erfordern, schlägt es zwischen Mutationen und Polymerase-induzierten Fehlern zu unterscheiden, kann zu einer erhöhten Fehlalarme führen. Exponentielle Amplifikation dieser Polymerase induzierte Fehler durch PCR kann die Detektion von seltenen Mutationsereignisse verschleiern. Jeder Ansatz , die PCR - Amplifikation verwendet für Mutationen zu bereichern seine Genauigkeit durch die Häufigkeit der PCR - Fehler begrenzt 25, 26, 27. Ein wesentlicher Vorteil der WTB-PCR / Sanger gegenüber vielen anderen hochempfindliche Methoden ist, dass sie sowohl die Amplifikation von WT und Mutanten template Vorlage, der Mutationen auftreten, außerhalb der Genregion gezielt durch die Blockierung verhindert oligonucleotide. Daher werden durch Polymerasen eingeführt PCR-Fehler effektiv zusammen mit WT DNA herausgefiltert. Im Gegensatz jedoch zu AS-PCR oder qPCR, Anreicherung für unbekannte Mutationen erhalten, die durch die Blockierung Oligo bedeckt innerhalb der Region auftreten. Im Fall von MYD88, erlaubte WTB-PCR den Nachweis beiden L265P und R264 * Mutationen 3. Andere haben in ähnlicher Weise die Detektion von mehreren, niederfrequente Mutationen , die mit der Verwendung von WTB-PCR 4, 28 berichten. Dies macht WTB-PCR ideal für Forschung und klinische Zwecke.

Zusammen mit hohen Empfindlichkeit und inhärenten internen Kontrollen zur Eliminierung von Fehlalarmen WTB-PCR der Flexibilität zur Anpassung einer bestehende Sequenzierung Assay mit nur sehr wenigen zusätzlichen Schritten mit blocker Design macht es attraktive Option für viele Labore mit etablierten Assays. Der gleiche Satz von PCR-Primern in einem herkömmlichen Assay verwendet werden, kann typischerweise in der WTB-PCR Variation verwendet werden. Otihre Protokolländerungen, die sehr zu empfehlen für WTB-PCR-einschließlich UDG Behandlung von FFPE Geweben und geeigneten post-PCR-Reinigungs-Methoden-gleichermaßen übertragbar sind. Blocker Design, daher ist das kritische Element einen WTB-PCR-Tests bei der Umsetzung. Obwohl die in diesem Protokoll präsentierten Leitlinien für die wichtigsten Faktoren in diesem Design, verschiedene blockiert Oligonukleotide darstellen sollte man, dass die Blöcke WT Verstärkung effizient und ohne Nebenwirkungen zu PCR finden getestet werden. Dies umfasst das Hinzufügen oder Entfernen von Basen Blocker T m, Verschieben der Position des Blockier oligo relativ zur WT - Vorlage, und die Änderung der Gesamtlänge des Oligo einzustellen. Blocker Titrationsexperimente sollte auch eine Balance zwischen akzeptabler Vorkommen von Sequenzierungsartefakten und Nachweisgrenze zu schaffen, verwendet werden.

eine geeignete Methodik der Auswahl für Nachweis von Mutationen, die in winzigen Zellfraktionen vorhanden sind, hängt stark von the Anwendung und Krankheit / Mutationstypen. Wenn mutierte Quantifizierung gewünscht ist, qPCR oder digitale PCR kann mehr tragfähige Lösungen als WTB-PCR / Sanger bieten. Obwohl WTB-PCR in erster Linie ein qualitativer Assay ist, ist es möglich, eine grobe Abschätzung der mutierten Allels Frequenz zu bestimmen, indem eine Probe in parallel mit konventionellen und WTB-PCR-Test. Da die Nachweisgrenze für den herkömmlichen Assay ~ 10 ist - in einem Hintergrund von WT 20% mutanten Allels ist es angebracht, zu schließen, daß durch die WTB-PCR-Assay nachgewiesen Mutationen aber nicht die herkömmlichen in einer Konzentration vorhanden ist, kleiner als der Grenzwert die Detektion für den herkömmlichen Assay. Nur wenige Assays bieten die Vielseitigkeit, Einfachheit und Robustheit des WTB-PCR. Die niedrig Kosten und kurze Durchlaufzeit machen es ideal für Resterkrankung nach der Therapie Beurteilung oder Beobachtung neue Resistenzmutationen während der Therapie. Zusätzlich zu der Fähigkeit, bisher nicht beschriebene Mutationen zu erkennen macht WTB-PCR ideal für Forschungszwecke.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes Eppendorf 05-402-25
100% alcohol VWR 89370-084 Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer ABI or equivalent
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils GeneMate T-2451-1 For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit Life Technologies 4337455 For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series Eppendorf A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates Eppendorf Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM) Invitrogen 10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027 For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute  Sigma E7023 200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) Roche 12032937001 With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus 2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit  Qiagen 180134 Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide ABI 4311320 For sequencing.
LNA oligonucleotide Exiqon 500100 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer ABI 5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer ABI 5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler Eppendorf E950030020
Microcentrifuge Model 5430 Eppendorf FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer IDT 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer IDT 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates GeneMate T-3107-1
Pipettors 20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well ABI 4315933
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304 For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0 ABI 4474978 For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)  Sigma S7899
Sterile filtered pipette tips 20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C  Eppendorf 5382000023
Vortex genie Scientific Industries SI-0236
Wash reservoir ~ 1,000 mL
Xylene VWR 89370-088 Histology grade

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References

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Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen
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Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).More

Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).

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