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Genetics

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

doi: 10.3791/55130 Published: March 29, 2017

Abstract

治療、治療中に耐性変異を出現するためのスクリーニング、または場合患者が少数の循環腫瘍細胞を有していた後に残存病変を評価する場合、低周波変異の正確な検出と識別が問題となり得ます。配列決定分析に続くPCRブロッキング野生型は、これらの低周波数の変異を検出するための方法として、高感度、柔軟性、および単純さを提供しています。新しいまたは以前に確立された従来のPCRに基づく配列決定アッセイにカスタム設計されたロックされた核酸、オリゴヌクレオチドを添加することにより、1000個のWT対立遺伝子のバックグラウンドで約1変異対立遺伝子の感度は、(1,000 1)を達成することができます。一般的に、ホルマリン固定パラフィン包埋組織で見出さ脱アミノ化イベントに関連付けられたシーケンシングアーチファクトが部分的に抽出工程中のウラシルDNAグリコシラーゼを使用することによって改善することができます。ここで最適化されたプロトコルは、MYD88の変異を検出するための具体的であるが、任意のを設計するためのテンプレートとして機能することができWTB-PCRアッセイ。対立遺伝子特異的PCR及びリアルタイム定量PCRを含む低頻度変異の検出のための他の一般的に利用されるアッセイオーバーWTB-PCRアッセイ法の利点は、偽陽性の少ない発生、柔軟性と実装の容易さ、および検出する能力を含む既知の両方および未知の変異。

Introduction

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サンガー配列決定は、伝統的に、既知および未知の体細胞変異の検査でゴールドスタンダードとなっています。 ( - WTのバックグラウンド中の20%の変異対立〜10)1サンガー配列決定の制限の1つは、検出の限界です。感度のこのレベルは、いくつかの循環腫瘍細胞、又は骨髄(BM)は、斑状のときと前悪性組織または患者からの試料中に存在し得る低レベルの体細胞変異を検出するためには不適切です。これはまた、治療後の残存疾患を評価する単独2従来の配列決定により困難な治療中に新たな耐性変異を検出することができます。ロックされた核酸(LNA)と、従来のPCRを置き換えることによって、サンガー配列決定にPCR(WTB-PCR)をブロックする野生型の媒介、WTの背景で最大0.1%突然変異対立遺伝子の感度は、2、3、4達成することができます。にこれにより、WT DNAの増幅を防止WT DNAに優先的に結合する(LNA)、オリゴヌクレオチドをブロック - (14 NT〜10)WTB-PCRは、変異体対立遺伝子について富化は短いの添加を介して達成されます。変異体富化WTB-PCR産物は、次いで、配列決定することができます。 WT DNAを遮断ではなく、特定の変異について選択することによってWTB-PCRは、微小細胞画分中に存在する既知および未知の変異の濃縮を可能にします。

複数の方法は、現在、小細胞画分における変異を検出するために使用されます。これは、高速液体クロマトグラフィー(DHPLC)、ビーズ、エマルジョン、増幅、および磁気(のBEAMing)、電界誘起放出および測定(EFIRM)、高分解能変性、対立遺伝子特異的PCR、増幅不応性変異システム(ARMS)を含みます融点など。しかし、これらの方法のほとんどは偽陽性とのみアッセイは4のために設計された一つの変異を検出する能力によって制限されています5、6のための問題を提起することができます。

ここでは、Albitar によって記載されているように骨髄分化因子88遺伝子の突然変異のスクリーニングにWTB-PCRによって達成感度の増加を示します。 3 MYD88のmutatioNSは、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)未知の重要性(IgMでMGUS)の、IgMモノクローナル免疫グロブリン血症、脾臓辺縁帯リンパ腫(SMZL)における重要な診断および予後因子であり、大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)を拡散します。 MYD88の変異は、WMとMGUSを分泌する免疫グロブリンM(IgM抗体)の患者の約50%のほぼすべてのケースで発見されました。対照的に、MYD88突然変異はSMZL患者の唯一の0から6パーセントに見られ、多発性骨髄腫7,8に存在しないされています。重複形態学、免疫表現型、細胞遺伝学的、およびWM及びSMZL又はIgM、多発性骨髄腫との間の臨床的特徴は、多くの場合、鑑別診断を複雑にすることができるので、MYD88変異の存在は、有用な同定因子9として機能することができます。 MYD88の変異はまた治療7次DLBCLと貧しい全体的な生存患者においてより大きな疾病負担と関連しています10。また、MYD88突然変異はより頻繁に活性化B細胞様(ABC)DLBCLで発見されているのでBが細胞様(GCB)DLBCLまたは原発性縦隔B細胞リンパ腫(PMBL)、MYD88の変異状態として働くことができる胚中心ABCサブタイプ11、12の代理マーカー。

ここで提供される詳細なプロトコルは、新しいアッセイを開発することができるか、またはほとんどの既存の配列決定アッセイを容易に正確に様々な試料タイプにおける低頻度変異を検出するように構成することが可能なテンプレートとして役立ちます。アプローチはまた、モニタリング及び腫瘍または患者は標的療法または抗生物質で治療されている間に発生することがあっても、細菌で発症し得る耐性変異を検出するために使用することができます。さらに、それは特にホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織では、変異濃縮に関連する問題の多くに対処し、救済。

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Protocol

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倫理文:ヒトサンプルのすべてのテストは、治験審査委員会(IRB)の承認を得た後に行われました。

1. FFPE組織からのDNA抽出、末梢血、及び骨髄吸引

  1. DNA FFPE抽出キットと骨髄FFPE組織のための
    1. ( - 5時10節 - 10μmの厚さ5)未染色スライドからのFFPE組織で始まります。
      注:組織の削りくずとの始まりは、3つを使用する場合 - 5で6セクションを - 10ミクロンの厚さと1.1.6に進みます。
    2. スライドバスケットにスライドを置き四の洗浄リザーバ(キシレンための2つの100%アルコールのための2つ)を調製。各バスケットに対する解決策の600ミリリットルの最小容積を追加します。
    3. 第1トレイにおける5分間のキシレン洗浄を行うことによってスライドを脱パラフィン。さらに5分間、第二キシレン洗浄槽にスライドを転送します。
    4. 脱パラフィン後、5分間100%アルコールでスライドを洗浄します。第二に、スライドを転送さらに5分間アルコール洗浄槽。
    5. スライドはマイクロ遠心チューブにカミソリの刃でそれらをこする前に、ボンネットの下に完全に乾燥することができます。
      注:示された腫瘍領域とH&Eスライドが利用可能な場合、スライドを整列のみ腫瘍領域をこすり。
    6. キットに含まれているメーカーの配布資料からの指示に進みます。
  2. BM吸引および末梢血のために
    1. これらの仕様とメーカーの説明書の配布資料に基づいて抽出します。
      注:FFPE組織や細胞からのDNA抽出のための多数の市販のキット及び方法があります。実際には、すべてを使用することができます。実験室で確立された方法を使用してください。
      1. 200μLの末梢血(PB)又は100μLのBM +100μLのPBSを使用します。
      2. 4μLのRNase Aストック溶液を使用してください。
      3. 100μLの溶出緩衝液で溶出します。
  3. DNAの定量化
    1. (純粋なDNAの場合)約1.8の260nmで/ 280 nmの比率を確保する分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。比がかなり低い場合には、下流アプリケーションに干渉する可能性タンパク質、フェノール、または他の汚染物質の存在を示すことができます。
    2. 適切な溶出緩衝液で100 ng /μLで - 約50にDNA濃度を調整します。

2.野生型PCRブロッキング

  1. プライマー設計
    1. 設計と以前にPCRプライマー設計13の一般的なガイドラインを説明に従って目的の遺伝子のためのプライマーを得ます。 M13フォワードを含めると、PCRプライマーにユニバーサル配列決定プライマーをリバース。
      注:MYD88アッセイはMYD88のエクソン5を増幅するために開発された(G259 - N291)5' に位置し、110個のヌクレオチドプライマーをイントロン4前方のスプライス部位と一部を覆い、逆にイントロン領域5' を用いて設計しました-M13シーケンス(M13フォワード:TGT AAA ACG ACG GCC AGT。 M13リバース:CAG GAA ACA GCT ATG ACC)相補的配列決定プライマーのアニーリングを可能にする( 材料表を参照)。
  2. ロックされた核酸、オリゴヌクレオチドのデザイン
    1. 約10であることをブロッキングオリゴヌクレオチドを設計 - 長さが15塩基および変異体濃縮が望まれるWTテンプレートに相補。
      注:短いオリゴは、ミスマッチ識別が向上します。これは非常に「粘着性」オリゴヌクレオチドにつながることができるので、高い標的特異性を達成するために、あまりにも多くのブロッキングヌクレオチドを使用しないことが重要です。コンテンツの長さとブロッキングヌクレオチドを遮断する必要がある特定のヌクレオチドに応じて最適化されるようにすべきです。二次構造を損なうことと、自己相補性を危険にさらすことなく、高い結合特異性を達成することが重要です。
    2. 拡張temperat上方15°C - T mの10を有するようにブロッキングオリゴを設計熱サイクリング中にURE。 GまたはC塩基を遮断- (4塩基3)ブロッキング塩基を追加または削除することによって、又は長いストレッチを回避しながら、DNAのためのブロッキングの塩基を置換することにより、T mを調整します。
      1. オリゴツールのウェブサイトに移動します( 材料の表を参照)、「オリゴTmの予測をブロッキング」ツールを選択します。
      2. 「オリゴシーケンス」ボックスにブロックされることが望まれるWTテンプレートの配列を貼り付けます。ブロッカー拠点を示すために、拠点の前に「+」を追加します。
      3. DNA-ブロッカーハイブリッドのおおよそのT mを決定するために、「計算」ボタンを選択します。
    3. 二次構造形成や自己二量体を避けるために、ブロッキングオリゴを設計します。
      1. オリゴツールのウェブサイトに移動します( 材料の表を参照)、「オリゴOptimizerをブロッキング」ツールを選択します。
      2. ボックスにブロックされることが望まれるWTテンプレートの配列を貼り付け。拠点を遮断示すために、拠点の前に「+」を追加します。
      3. 「二次構造」と「自己のみ」の2つのボックスを選択します。潜在的に厄介な二次構造または自己二量体のためのオリゴを検討する分析ボタンを押してください。
        注:スコアは、二次構造および自己二量体のT m「sを非常に粗い推定値を表します。低いスコアは、したがって最適であり、ブロッカーブロッカーペアを制限することによって達成することができます。 MYD88 [MYD88blocker(TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T +のCC / invdT /)]のためのブロッキングオリゴヌクレオチドはQ262、I266アミノ酸をカバーするように設計されており、反転3 'を備えましたdTの3'-エキソヌクレアーゼによってDNAポリメラーゼおよび分解の両方によって伸長を阻害します。この特定のブロッキングオリゴは「+ N」と表記されている10のブロック塩基と17マーです。残りの7つの塩基は、通常のDNAヌクレオチドです。
  3. WTB-PCRセットアップおよび熱サイクル
    1. WTB-PCRマスターマイルを準備X(MMX)フォワード10X W / 20mMのMgCl 2を 、250μMのdNTP、0.2μM2.5μLPCR反応緩衝液を使用し、リバースプライマー、1.2μMMYD88blocker、およびDNアーゼ、RNアーゼを含まない、超純H 2 Oは、最終を作成します反応あたり21.75μLの液量。
      注:作業濃度は25μL(DNA鋳型とのポリメラーゼの添加後)の最終反応容量のためのものです。従来のPCR MMXは、単にブロッカーの添加を省略することにより調製されます。すべてのプロトコル手順はWTBと従来のPCRの両方に対して同一のままです。これは、検証に使用されるとブロッカーの添加によって達成濃縮を決定することができます。
      1. MMXの量を計算する際に3つの追加反応(陽性および陰性対照および非テンプレートコントロール汚染をチェックする)とピペッティングエラーのための少なくとも1つの追加の反応を考慮してください調製しました。
    2. 徹底的にボルテックスMMX。 MMXはAYまでのために-80℃で保存することができます耳。
    3. MMXに反応当たり0.25μLのTaq DNAポリメラーゼを加え、混合して反転。ポリメラーゼはMMXに追加された後、氷の上に保管してください。
    4. 各反応ウェルにコールドプレートピペットポリメラーゼとMMXの22μLに新しい96ウェルPCRプレートを置きます。
    5. ポリメラーゼでMMXを含む各ウェルに100 ng /μLで - 3μLゲノムDNA(50加えます。
    6. 溶液は、各ウェルの底に到達確実にするために簡単にプレートと遠心分離をシール。
    7. サーモサイクラー上でPCRプレートを読み込みます。
      1. 次のようにWTB-PCR反応の熱サイクル条件を設定:6分間95℃での初期変性; 30秒間95℃での変性、30秒間56℃でのプライマーアニーリング、および1分20秒間72℃での伸長の40サイクル。 10分間72℃で最終伸長。
        注:ベストプラクティスは、アンプリコンの汚染を避けるために、物理的に独立した領域に、プロトコルの残りを完了含まInは将来のセットアップ。
  4. WTB-PCRが成功したかどうかを判断し、非鋳型対照における増幅の欠如を確認するために、以前に記載されたプロトコル14に従ってゲル電気泳動を行います。
  5. 磁気ビーズによるPCR生成物の精製
    1. 4°Cから磁気ビーズを取り出し、室温に持って来ます。
    2. 新しいPCRプレートに10μLのPCR産物を転送します。
    3. 渦磁気ビーズを激しく完全に磁性粒子を再懸濁します。
    4. 新しいプレート上の各ウェルに18μLに磁気ビーズを追加します。ピペットを10回混ぜます。
    5. 5分間室温でインキュベートします。
    6. 溶液から別のビーズに2分間サイドスカート磁石プレート上にPCRプレートを置きます。
    7. ビーズペレットを避け、マルチチャンネルピペットで上清を吸引除去します。
    8. 各ウェルに150μLの70%エタノールを分配し、foは室温でインキュベートRは、少なくとも30秒。マルチチャンネルピペットでエタノールを吸引し、ヒントを捨てます。もう一度この洗浄手順を繰り返します。
    9. 20μLのマルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルからの残りのエタノールを吸引し、チップを廃棄します。
    10. ウェルを(約10分間)乾燥されると、磁石プレートから除去し、穏やかに各ウェルにピペットミックスに40μLを15回又は渦をヌクレアーゼフリー水を加えます。
    11. 2分間、室温でインキュベートします。
    12. 溶液から別のビーズに1分間磁石板上PCRプレートを置きます。
    13. 新しいPCRプレートに精製された生成物の35μLを移します。これは、精製されたPCR産物は、現在、双方向の配列決定を続行する準備ができているか、必要になるまで-20℃で保存することが可能です。
      注:新規アッセイを開発する場合、精製されたPCR産物の定量化が必要とされ得ます。 1から3 ng /μLでアンプリコンのDNAは、双方向の配列決定のために最適です。濃度が一貫して低い場合、PCR産物及び磁性ビーズを高めるproportionally(1:1.8)。濃度が一貫して高い場合、水のより大きな容積で溶出します。

WTB-PCR産物の3シーケンシング

  1. 双方向シーケンシング
    注:以下のプロトコルは、より少ない試薬を使用するために最適化された製造業者の使用説明書の改変された形態です。
    1. フォワード準備と逆方向配列決定反応は、最終的な溶液を作成するために追加して、DNアーゼ、RNアーゼを含まない、超純H 2 O 0.25μLレディ反応混合物、1.88μL配列決定緩衝液、1.78μMM13-F又はM13-R配列決定プライマーとと混合します反応あたり9μLのボリューム。この配列決定反応ミックスは年まで-20℃で保存することができます。
    2. 順方向配列決定反応のための新しい96ウェルPCRプレートの各ウェルに順方向配列決定反応混合物のピペット9μL。逆方向配列決定反応のために別々のプレート上で繰り返します。
    3. 精製したWTB-PCR産物トンの1μLを追加各Oウェルの両方前方プレートを逆に。
    4. 溶液は、各ウェルの底に到達確実にするために簡単にプレートと遠心分離をシール。
    5. サーモサイクラー上でPCRプレートを読み込みます。
      1. 次のように配列決定反応のための熱サイクル条件を設定:96℃を1分間; 10秒間96℃の30サイクル、5秒50℃、4分間60°C。浄化のための準備が整うまで4℃で保持します。
  2. シーケンシング製品を精製
    1. 3M酢酸ナトリウム(pH5.2)および100%エタノールの新鮮な1時25溶液を調製します。
    2. 新鮮な70%エタノール溶液を調製します。
    3. 酢酸ナトリウムの30μL/フォワードおよびシーケンシングプレートを逆にし、ピペットミックス5回の両方の各ウェルに100%エタノール溶液を加えます。
    4. プレートを再シールし、20分間室温で暗所でインキュベートします。
    5. 15分間2,250×gでプレートを遠心します。
    6. プレートシーラーを取り外し、廃棄物の上に反転コンテナ。
      注:一度だけ反転またはペレットはウェル底部から緩むことがあります。
    7. 1分間150×gで清潔なペーパータオルと遠心分離機に反転プレートを置きます。
    8. 各ウェルに150μLの70%エタノールを追加します。
    9. プレートを再シールし、5分間、2,250×gでスピン。
    10. 繰り返しは3.2.6と3.2.7を繰り返します。
    11. ウェルが完全に乾燥していない場合は、室温で空気乾燥させます。乾燥しながら、サンプルを光から保護されていることを確認してください。
    12. 各ウェルピペットミックスに10回を10μLホルムアミドを追加します。プレートを再シール。
    13. 5分間、4℃で、続いて3分間95℃でサーモサイクラーで変性。
    14. 変性後、メーカーの指示15に従ってシーケンシングプラットフォームにセプタムおよび配列とプレートシーラーを交換してください。

配列決定結果の分析4。

  1. シーケンシングのDATを使用してシーケンシングトレースを可視化製造業者の説明書16とそれぞれの基準配列に整列に従って解析ソフトウェア。 NCBI参照配列「NM_002468」にMYD88を合わせます。

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Representative Results

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拡張時WTB-PCRの概念の概要は、 図1に示されています。ブロッカー-DNAハイブリッド中の一塩基ミスマッチが大きく、その融解温度低下するため(ΔTM = 20から30°C)の変異鋳型DNAは、拡張17を完成するのに自由であるが、WT対立遺伝子の増幅が阻止されます。 WT DNAが直線的に増幅されている間、このように、変異体DNAを指数関数的に増幅されます。

WTB-PCRによって達成変異体濃縮の実証は、図2に示されています。変異を有するおよび有しない患者からのゲノムDNAをWTB-PCRおよびWT DNAにおける偽陽性の欠如によって達成可能な典型的な濃縮を実証するために、従来とWTB-PCR、次いで配列決定の両方によって試験しました。 WTB-PCR MMXに使用ブロッカーの使用濃度は、滴定実験およびsによって決定されるべきです偽陽性を生じる又は全くWT DNAの増幅をブロックしていないながらhouldは、変異体富化の所望のレベルを達成します。 WTB-PCR産物の配列決定分析は、変異体対立遺伝子について富化し、従来のPCR 3における16%と比較してWTの背景0.5%突然変異対立遺伝子の過剰における検出限界を示します。

臨床試験における感度の増加の効果は、試験サンプル中の新生物細胞の相対量に依存して変化し得ます。方法の比較研究では、ここに記載WTB-PCRアッセイは、MYD88突然変異の64%は、WMまたはMGUS 3を有する患者の従来の試験によって見逃されるであろうことを示しました。

PCR後のpurifica場合ブロッカーの高すぎる濃度が使用されるか、またはされた場合に信号強度( 図3)における特性のドロップオフがしばしば見られますンは双方向シーケンシング前にブロッカーを削除することができませんでした。磁気ビーズ精製は酵素精製のために置換されている場合、後者が実証されます。酵素精製は、より大きなサンプル番号で作業魅力的なオプションですが、それは溶液からの配列決定前にブロッカーを削除するために失敗したとして、それはWTB-PCRを使用してアプリケーションには不適当です。

(:G> T:C A)、シトシン脱アミノ化の結果として頻繁FFPE由来のDNAに見出される配列アーチファクトの例を図4 3、18、19、20に示されています。シトシン脱アミノ化の実際の原因はほとんど理解されているが、変異体対立遺伝子について富化任意のPCRベースのアッセイは、これらの低周波数のアーチファクト21、22検出します。 DEAによる偽陽性minationは最高の高品質のテンプレート材料で始まるによって回避されます。これが可能でない多くの場合、抽出時ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)での処置は、脱アミノ化アーチファクトの周波数および強度を制限するのを助けることができます。 (DNA FFPEキットの一部として)抽出中FFPE組織のUDG処理切除は、それによって人工的に誘導されたC防止シトシン残基を脱アミノ化:G> T:A変異を。しかし、頻繁にCpGジヌクレオチドで発生5-​​メチルシトシン残基はUDGによって切除することができないチミンに脱アミノ化されています。結果のシーケンシングアーチファクトがかなり認識可能であり、多くの場合、 図4に見られるように、タンデム変異として表示されます。サンプルは既に抽出された場合、UDG処理は、比較的低いDNA損失の二次抽出で実施することができます。

図1
図1:概念オベWTB-PCRのrview。ブロッカー-DNAハイブリッド中の一塩基ミスマッチは最大30°CによるT mを減少させます。ブロッキングオリゴヌクレオチドを設計する10のT mを有するようにすることにより-伸長時の温度よりも15°Cの変異DNAの増幅を可能にしながら、WT DNAの増幅が阻止されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2:変異を有するおよび有しない患者からのゲノムDNAをWTB-PCRによって達成可能な典型的な濃縮を実証するために、従来とWTB-PCR、次いで配列決定の両方によって試験しました。 WTB-PCRを達成するために使用ブロッカーの最終濃度は、WT DNAまたはブロッキングamplificaに偽陽性を生じないながら最大変異体富化を達成するために選択しました。完全WT DNAのン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3: 酵素PCR精製代わりに磁気ビーズを用いているときに信号強度の特性ドロップオフが見られます。酵素の精製は、双方向シーケンシング前にブロッカーを除去するのに失敗したので、これは可能性があります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4:C:G> T:シーケンシングアーチファクトがFFPE組織において生じるシトシンまたはメチル化シトシンは脱アミノ化され、Vそれぞれ、ウラシルまたはチミンにホルマリン固定をイア。ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)前WTB-PCRは、シーケンシングアーチファクトを低減するために助けることにウラシルを切除することができます。しかし、頻繁にCpGアイランドで生じる脱アミノ5-メチルシトシン、チミン起因は、UDGによって切除することができません。 WTB-PCRで使用されるブロッカーの濃度を低下させることはUDG処理によって改善されていないシーケンシングアーティファクトの発生を低減するのを助けることができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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WTB-PCRアッセイは、ここで説明する拡張( 図1)の間にWT DNAの増幅をブロックするように設計されたブロッキングオリゴプライマーの一般的なセットを使用します。 WTB-PCR産物は、次いで、変異解析のために配列決定されます。 WTB-PCR /サンガーの有用性は、その単純性、高感度、高スループットです。ここで説明するガイドラインを使用して、ほとんどの既存のサンガーベースのアッセイは、単純に大きく感度を増加させるためにブロッキングオリゴヌクレオチドの添加によって修飾することができます。ここで提示された例のアッセイにおいてPCRに単一のブロッキングオリゴヌクレオチドの添加はWTB-PCRアッセイ3> 0.5%の従来のアッセイのためにWTのバックグラウンドで約16%の突然変異対立遺伝子の検出の限界を増加させました。効果は、臨床試験3で見られる偽陰性64%の減少です。 MYD88の変異の存在を確認することは重要な診断および予後のimplを持っていますications;偽陰性としてケースを報告することは、全体的な治療と患者管理に重大な結果をもたらす可能性があります。 WTB-PCRでのテストは、特に、比較的低い異常な細胞性の患者において、非常に重要なことです。

WTB-PCR技術はかなり変化し、時にはLNA、BNA、またはPNA媒介性PCRクランピングまたはPCRクランププローブアッセイ2、4、23、24と互換的に呼ばれます。 WTB-PCRを利用したいくつかの変形例は、それぞれ特異的突然変異のための追加の蛍光プローブを設計する必要のqPCRアッセイを含みます。この技術に関連した重要な課題は、正確にWT及び突然変異対立遺伝子を区別競合的に結合するプローブを開発する必要性を含みます。変異特異的プローブが必要とされているのでさらに、定量PCRアプローチは、未知のmutatioを検出する能力に欠けていますNS。対立遺伝子特異的様式でWTB-PCRブロックWT増幅の別のバリエーション。代わりに、しかし突然変異特異的プライマーを使用する、WT対立遺伝子に特異的ブロッキングプローブは、結合の完全なプライマーを阻害します。このアプローチは、定量PCRのような突然変異特異的プローブを必要としませんが、それは増加した偽陽性につながる可能性変異およびポリメラーゼ起因するエラーを区別するために失敗しました。 PCRを介してこれらのポリメラーゼ誘導誤差の指数関数的増幅は、稀な突然変異事象の検出を不明瞭にすることができます。変異を濃縮するためにPCR増幅を使用する任意のアプローチは、PCRエラー25、26、27の周波数によってその精度が制限されています。他の多くの高感度の方法論上WTB-PCR /サンガーの基本的な利点は、WTテンプレートとその変異ブロッキングoligonucleotiによって標的遺伝子領域の外側に発生する変異体テンプレートの両方の増幅を防止するということですデ。したがって、ポリメラーゼによって導入されたPCRエラーを効果的にWT DNAと一緒に除外されています。しかし、AS-PCRまたはqPCRのに反して、濃縮は、ブロッキングオリゴによってカバーされる領域内で発生し、未知の変異のために保持されます。 MYD88の場合には、WTB-PCRの両方L265PおよびR264 *変異3の検出を可能にしました。その他は同様WTB-PCR 4、28を用いて複数の低周波変異の検出を報告しています。これは、研究および臨床の両方の目的のためにWTB-PCRに最適です。

高感度と偽陽性を排除するための固有の内部統制に加えて、ブロッカーのデザインと非常にいくつかの追加の手順で、既存のシーケンシングアッセイを適合させるためのWTB-PCRの柔軟性は、確立されたアッセイで、多くのラボにとって魅力的な選択肢を作ります。従来のアッセイにおいて使用されるPCRプライマーの同じセットは、典型的には、WTB-PCRの変形において使用することができます。 OT高度にFFPE組織のUDG処理および適切なPCR後の精製WTB-PCR-などのために推奨されている彼女のプロトコルの変更も同様に譲渡方法論は、です。ブロッカーの設計は、従ってWTB-PCRアッセイを実施する上で重要な要素です。このプロトコルで提示ガイドラインは、そのデザインに最も関連性の高い要素を表すのに、種々のブロッキングオリゴヌクレオチドは、PCRの二次的効果なしに効率的に1つをブロックWT増幅を見つけるためにテストされるべきです。これは、追加または削除T mを調整するためブロッカー塩基、WTテンプレートにブロッキングオリゴの位置をずらし、そしてオリゴ全体の長さを変更することを含みます。ブロッカー滴定実験はまた、シーケンシングアーティファクトと検出限界の許容発生の間のバランスを確立するために使用されなければなりません。

微小細胞画分に存在する変異を検出するための適切な方法を選択すると、目に大きく依存します電子アプリケーションおよび疾患/突然変異種。変異体の定量が所望される場合、定量PCRまたはデジタルPCRはWTB-PCR /サンガー以上の実行可能なソリューションを提供することができます。 WTB-PCRは主に定性アッセイであるが、並行して、従来とWTB-PCRを用いて試料を試験することによって変異対立遺伝子頻度の概算を決定することが可能です。従来のアッセイの検出限界は約10であるため - WTのバックグラウンドで20%変異対立遺伝子は、WTB-PCRアッセイによって検出された突然変異が、従来のではないが、限界未満の濃度で存在していると結論することが適切です従来のアッセイの検出。いくつかのアッセイはWTB-PCRの汎用性、単純性、及び堅牢性を提供します。低コストと短いターンアラウンドタイムは、治療後の残存疾患を評価するか、治療中に新たな耐性変異を監視するために理想的です。また、以前に未記載の変異を検出する能力は、研究目的のためにWTB-PCRに最適です。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes Eppendorf 05-402-25
100% alcohol VWR 89370-084 Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer ABI or equivalent
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils GeneMate T-2451-1 For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit Life Technologies 4337455 For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series Eppendorf A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates Eppendorf Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100 mM) Invitrogen 10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet Thermo Fisher Scientific 12027 For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute  Sigma E7023 200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) Roche 12032937001 With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus 2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit  Qiagen 180134 Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide ABI 4311320 For sequencing.
LNA oligonucleotide Exiqon 500100 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer ABI 5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer ABI 5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler Eppendorf E950030020
Microcentrifuge Model 5430 Eppendorf FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer IDT 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer IDT 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates GeneMate T-3107-1
Pipettors 20, 200, 1,000 µL
Plate septa, 96 well ABI 4315933
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen 51304 For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0 ABI 4474978 For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)  Sigma S7899
Sterile filtered pipette tips 20, 200, 1,000 µL
Thermomixer C  Eppendorf 5382000023
Vortex genie Scientific Industries SI-0236
Wash reservoir ~ 1,000 mL
Xylene VWR 89370-088 Histology grade

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References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96, (16), 9236-9241 (1999).
  2. Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55, (4), 632-640 (2009).
  3. Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38, (2), 133-140 (2016).
  4. Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24, (45), 6830-6834 (2005).
  5. Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7, (3), 1313-1332 (2015).
  6. Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15, (8), 420 (2014).
  7. Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121, (13), 2522-2528 (2013).
  8. Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121, (11), 2051-2058 (2013).
  9. Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87, (5), 503-510 (2012).
  10. Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124, (21), 1690-1690 (2014).
  11. Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470, (7332), 115-119 (2011).
  12. Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43, (9), 830-837 (2011).
  13. Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3, (3), S30-S37 (1993).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  15. Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. (2014).
  16. Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. (2012).
  17. Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3, (1), 27-38 (2003).
  18. Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4, (1), (2004).
  19. Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29, (3), 257-264 (2007).
  20. Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12, (5), 3191-3204 (2011).
  21. Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40, (14), e107-e107 (2012).
  22. Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59, (9), 1376-1383 (2013).
  23. Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128, (2), 398-402 (2008).
  24. Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17, (2), 179-184 (2015).
  25. Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387, (2), 97-121 (1997).
  26. Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33, (1), 129-139 (2002).
  27. Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17, (5), 365-374 (2002).
  28. Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126, (23), 716 (2015).
低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型
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Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).More

Albitar, A. Z., Ma, W., Albitar, M. Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations. J. Vis. Exp. (121), e55130, doi:10.3791/55130 (2017).

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