Abstract
Noggrann detektering och identifiering av lågfrekventa mutationer kan vara problematiskt vid bedömningen kvarvarande sjukdom efter terapi, screening för nya resistensmutationer under terapi, eller när patienter har några cirkulerande tumörceller. Vildtyp blockerande PCR följt av sekvensanalys erbjuder hög känslighet, flexibilitet och enkelhet som en metod för att upptäcka dessa lågfrekventa mutationer. Genom att lägga till en specialdesignad låst nukleinsyra oligonukleotid till en ny eller tidigare fastställts konventionell PCR-baserad sekvense analys kan känslig approximativt en mutant allel i en bakgrund av 1000 WT alleler uppnås (1: 1000). Sekvense artefakter associerade med deaminering händelser förekommer allmänt i formalinfixerade paraffininbäddade vävnader kan delvis åtgärdas genom användning av uracil-DNA-glykosylas under extraktionssteg. Den optimerade protokollet här är specifikt för detektion MyD88 mutation, men kan fungera som en mall för att utforma någonWTB-PCR-analys. Fördelar med WTB-PCR-analysen jämfört med andra vanligen använda analyser för detektering av lågfrekventa mutationer, inklusive allelspecifik PCR och kvantitativ realtids-PCR inkluderar färre förekomster av falska positiva, större flexibilitet och enkel implementering, och förmågan att detektera både kända och okända mutationer.
Introduction
Sanger-sekvensering har traditionellt varit guldmyntfoten i tester för både kända och okända somatiska mutationer. En av begränsningarna av Sanger-sekvensering är dess detektionsgräns (~ 10 - 20% mutant allel i en bakgrund av WT) 1. Denna nivå av känslighet är olämpligt för detektering av somatiska mutationer på låg nivå som kan vara närvarande i prover från premaligna vävnader eller patienter med få cirkulerande tumörceller, eller när benmärg (BM) är bristfällig. Detta gör också att pröva återstående sjukdom efter terapi eller detektering emerging resistensmutationer under terapi svårt genom konventionell sekvensering enbart två. Genom att ersätta konventionell PCR med låst nukleinsyra (LNA) -medierad vildtyp blockerande PCR (WTB-PCR) i Sånger-sekvensering, känsligheter för upp till 0,1% mutanta allelen i en bakgrund av WT kan uppnås 2, 3, 4. IWTB-PCR, anrikning för mutanta alleler uppnås via tillsatsen av en kort (~ 10-14 NT) blockering (LNA) oligonukleotid som företrädesvis binder till WT-DNA för att därigenom förhindra amplifiering av WT-DNA. Mutanten anrikade WTB-PCR-produkten kan sedan sekvenseras. Genom att blockera WT-DNA snarare än att välja för specifika mutationer WTB-PCR medger anrikning av både kända och okända mutationer som förekommer i små fraktioner cell.
Flera metoder används för närvarande för att detektera mutationer i små celler fraktioner. Detta inkluderar allel-specifik PCR, amplifiering-Refractory Mutation System (ARMS), denaturering högprestandavätskekromatografi (DHPLC), pärlor, emulsioner, amplifiering, och magnetiska (fluorescerande), elektriskt fält-inducerad frisättning och mätning (EFIRM), hög upplösning smältpunkt och andra. Dock de flesta av dessa metoder är begränsade av falskt positiva och möjligheten att endast detektera en mutation att analysen var avsedd för fyra 5, 6.
Här kan vi visa den ökning i känslighet uppnås genom WTB-PCR i screening för mutationer i den myeloida differentieringsfaktor 88 genen såsom beskrivits av Albitar et al. 3 MyD88 mutations är viktiga diagnostiska och prognostiska faktorer i makroglobulinemi (WM), IgM monoklonal gammopati av okänd signifikans (IgM-MGUS), mjälten marginalzon lymfom (SMZL), och diffus stort B-cell-lymfom (DLBCL). MyD88 mutationer återfinns i nästan alla fall av WM och ungefär 50% av patienter med immunglobulin m (IgM) -secreting MGUS. I motsats är MyD88 mutationer som finns i endast 0-6% av patienterna med SMZL och är frånvarande i multipelt myelom 7, 8. Eftersom överlappande morfologisk, immunophenotypic, cytogenetiskt, och kliniska egenskaper mellan WM och SMZL eller IgM-multipelt myelom kan ofta komplicera differentialdiagnoser, kan närvaron av en MyD88 mutation fungera som en användbar identifierande faktor 9. MyD88 mutationer har också förknippats med större börda sjukdom hos patienter med DLBCL och dålig överlevnad efter terapi 7, 10. Dessutom, eftersom MyD88 mutationer mer ofta i aktiverade B-celliknande (ABC) DLBCL än germinal center B-celliknande (GCB) DLBCL eller primär mediastinala B-cell-lymfom (PMBL), kan MyD88-mutationsstatus tjäna som en surrogatmarkör för ABC subtyp 11, 12.
Den detaljerade protokoll som tillhandahålls här tjänar som en mall från vilken nya analyser kan utvecklas eller de flesta existerande sekvensbestämningsanalyser kan enkelt anpassas att noggrant detektera lågfrekventa mutationer i olika provtyper. Det tillvägagångssätt kan också användas för att övervaka och detektera resistenta mutationer som kan utvecklas i tumörer eller även bakterier som kan utvecklas medan patienter behandlas med riktad terapi eller antibiotika. Dessutom tar det och åtgärder många av de frågor som är förknippade med mutation anrikning, särskilt i formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: All kontroll av mänskliga prover utfördes efter att ha inhämtat Institutional Review Board (IRB) godkännande.
1. DNA-extraktion från FFPE Tissue, perifert blod, och benmärgsaspirat
- För benmärgs FFPE vävnad med DNA FFPE extraktionssats
- Börja med FFPE vävnad från ofärgade objektglas (5 - 10 sektioner vid 5 - 10 | im tjocklek).
OBS: Om början med vävnads spån, använd 3 - 6 sektioner vid 5 - 10 um tjocklek och vidare till steg 1.1.6. - Placera objektglasen i en glid korg och förbereda fyra tvätt reservoarer (två för Xylen och två för 100% alkohol). Lägg till en minimivolym av 600 ml lösning till varje korg.
- Avparaffinera objektglasen genom att göra en 5 min xylen tvätt i det första magasinet. Överför objektglasen till det andra xylen tvättbehållaren under ytterligare 5 min.
- Efter avparaffinering, tvätta objektglasen med 100% alkohol under 5 min. Överför bilderna till den andraalkohol tvättbehållaren under ytterligare 5 min.
- Tillåta objektglasen torka helt under en huv innan skrapning dem med ett rakblad till ett mikrocentrifugrör.
OBS: Om en H & E slid med tumör region som anges är tillgänglig, rikta bilderna och skrapa endast tumörregionen. - Fortsätt med instruktioner från tillverkaren allmosor ingår i kit.
- Börja med FFPE vävnad från ofärgade objektglas (5 - 10 sektioner vid 5 - 10 | im tjocklek).
- För BM aspirera och perifert blod
- Extrakt enligt tillverkarens anvisningar allmosor med dessa specifikationer.
OBS: Det finns många kommersiellt tillgängliga kit och metoder för DNA-extraktion från FFPE vävnader och celler. I praktiken kan alla användas. Använd en metod som är etablerad i laboratoriet.- Använda 200 mikroliter perifert blod (PB) eller 100 | il BM + 100 mikroliter PBS.
- Använda 4 pl RNas A stamlösning.
- Eluera med 100 | il elueringsbuffert.
- Extrakt enligt tillverkarens anvisningar allmosor med dessa specifikationer.
- DNA Kvantifiering
- Mäta DNA-koncentrationer med användning av en spektrofotometer säkerställa en 260 nm / 280 nm-förhållande av ca 1,8 (för ren DNA). Om förhållandet är avsevärt lägre, kan det indikera närvaron av protein, fenol, eller andra föroreningar som kan störa efterföljande tillämpningar.
- Justera DNA-koncentrationer till ungefär 50 - 100 ng / | il med lämplig elueringsbuffert.
2. Wild-Type Blockering PCR
- primer Design
- Design och erhålla primrar för gener av intresse i enlighet med tidigare beskrivna allmänna riktlinjer av PCR-primer konstruktion 13. Inkludera M13-framåt och bakåt universella sekvenseringsprimrar i PCR-primers.
OBS: MyD88 analys utvecklades för att amplifiera exon 5 av MyD88 (G259 - N291) och 110 nukleotider som ligger i 5' intronregionen för att täcka splitsstället och en del av intron 4. framåt och bakåt primrar utformades med ett 5' -M13 sekvens (M13-framåt: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-omvänd: cag gaa aca GCT atg acc) för att medge hybridisering av komplementära sekvenseringsprimrar (se Material tabell).
- Design och erhålla primrar för gener av intresse i enlighet med tidigare beskrivna allmänna riktlinjer av PCR-primer konstruktion 13. Inkludera M13-framåt och bakåt universella sekvenseringsprimrar i PCR-primers.
- Låst nukleinsyra Oligonucleotide Design
- Utforma den blockerande oligonukleotid för att vara ungefär 10 - 15 baser i längd och är komplementär till WT mallen där mutanta berikning önskas.
OBS: En kortare oligo kommer att förbättra obalans diskriminering. För att uppnå hög mål specificitet, är det viktigt att inte använda för mycket blockerande nukleotider eftersom detta kan resultera i en mycket "klibbig" oligonukleotid. Innehållet och längden och blockerande nukleotid skall vara optimera enligt den specifika nukleotiden som måste blockeras. Det är viktigt för att uppnå hög bindningsspecificitet utan att kompromissa sekundärstruktur och riskera själv komplementaritet. - Utforma den blockerande oligo att ha ett Tm 10-15 ° C över förlängningstempure under termocykling. Justera Tm genom att lägga till eller ta bort blockerings baser eller genom att ersätta blockerande baser för DNA samtidigt undvika långa sträckor (3 - 4 baser) av blockering G eller C-baser.
- Navigera till oligo Tools hemsida (se tabell of Materials) och välj "blockerar Oligo Tm Prediction" verktyg.
- Klistra sekvensen av WT-mall som är önskvärt att vara blockerad i "Oligo Sekvens" låda. Lägg till "+" framför baser för att indikera blockerare baser.
- Välj "Beräkna" för att bestämma den ungefärliga Tm av DNA-Blocker hybrid.
- Utforma den blockerande oligo att undvika sekundär strukturbildning eller själv dimerer.
- Navigera till oligo Tools hemsida (se tabell of Materials) och välj "blockerar Oligo Optimizer" verktyg.
- Klistra sekvensen av WT-mall som är önskvärt att vara blockerad i lådan. Lägg till "+" framför baser för att indikera att blockera baser.
- Välj de två rutorna för "sekundär struktur" och "Self Only". Tryck på Analysera knappen för att granska oligo för potentiellt besvärliga sekundära strukturer eller själv dimerer.
OBS: Poängen representerar mycket grova uppskattningar av Tm: s av de sekundära strukturer och själv dimerer. Lägre poäng är därför optimalt och kan uppnås genom att begränsa blockerare blockerare parning. Den blockerande oligonukleotid för MyD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] utformades för att täcka aminosyrorna Q262-I266 och har en 3'-inverterade dT inhibera både förlängning genom DNA-polymeras och nedbrytning genom 3'-exonukleas. Denna specifika blockerande oligo är en 17mer med 10 blockerande baser vilka betecknas som "+ N". De återstående 7 baser är vanliga DNA-nukleotider.
- Utforma den blockerande oligonukleotid för att vara ungefär 10 - 15 baser i längd och är komplementär till WT mallen där mutanta berikning önskas.
- WTB-PCR Setup och termo
- Förbered en WTB-PCR Master mix (MMX) med användning av 2,5 | il PCR-reaktionsbuffert 10x w / 20 mM MgCl2, 250 | iM dNTP, 0,2 ^ M framåt och bakåt primer, 1,2 uM MYD88blocker, och DNAs, RNAs-fri, ultrarent H2O för att skapa en slutlig lösningsvolym av 21,75 mikroliter per reaktion.
OBS: Arbets koncentrationer är för den slutliga reaktionsvolymen av 25 mikroliter (efter tillsats av DNA-templat och polymeras). Konventionell PCR MMX framställs genom att helt enkelt utelämna tillsatsen av blockerare. Alla protokollsteg förblir identiska för både WTB och konventionell PCR. Detta kan användas i validering och bestämning berikning uppnås genom tillsats av blockerare.- Vid beräkning av mängden av MMX att förbereda se till att ta hänsyn till 3 ytterligare reaktioner (positiva och negativa kontroller och en icke-mall-kontroll för att kontrollera kontaminering) och åtminstone en ytterligare reaktion för pipettering fel.
- Vortex MMX noggrant. MMX kan lagras vid -80 ° C i upp till ayöra.
- Lägga 0,25 pl Taq-DNA-polymeras per reaktion till MMX och invertera att blanda. När polymeraset har lagts till MMX, hålla den på is.
- Sätta en ny 96 väl PCR-platta på en kall platta och pipett 22 ul av MMX med polymeras till varje reaktionsbrunn.
- Lägg 3 mikroliter genom-DNA (50-100 ng / mikroliter till varje brunn innehållande MMX med polymeras.
- Försegla kort plattan och centrifugera för att säkerställa att lösningen når botten av varje brunn.
- Ladda PCR plattan på en termocykler.
- Ställa in termocyklingsvillkor för WTB-PCR-reaktionen som följer: initial denaturering vid 95 ° C under 6 min; 40 cykler av denaturering vid 95 ° C under 30 s, primerhybridisering vid 56 ° C under 30 s och förlängning vid 72 ° C under 1 min 20 s; slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 min.
OBS: Bästa praxis innebär att fylla resten av protokollet i en fysiskt separat område för att undvika kontaminering amplikon in framtida uppställningar.
- Ställa in termocyklingsvillkor för WTB-PCR-reaktionen som följer: initial denaturering vid 95 ° C under 6 min; 40 cykler av denaturering vid 95 ° C under 30 s, primerhybridisering vid 56 ° C under 30 s och förlängning vid 72 ° C under 1 min 20 s; slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 min.
- Förbered en WTB-PCR Master mix (MMX) med användning av 2,5 | il PCR-reaktionsbuffert 10x w / 20 mM MgCl2, 250 | iM dNTP, 0,2 ^ M framåt och bakåt primer, 1,2 uM MYD88blocker, och DNAs, RNAs-fri, ultrarent H2O för att skapa en slutlig lösningsvolym av 21,75 mikroliter per reaktion.
- Utför gelelektrofores enligt tidigare beskrivna protokoll 14 för att bestämma om WTB-PCR var framgångsrik och att bekräfta en brist på förstärkning i den icke-mallkontroll.
- Rening av PCR-produkt av magnetiska pärlor
- Avlägsna magnetiska kulor från 4 ° C och sätta till rumstemperatur.
- Överför 10 mikroliter PCR-produkt till en ny PCR-platta.
- Virvel de magnetiska pärlorna kraftigt för att helt resuspendera de magnetiska partiklarna.
- Lägg 18 mikroliter magnetiska kulor till varje brunn på den nya plattan. Pipett blanda 10 gånger.
- Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Placera PCR-plattan på den sida-kjolar magnetplatta för 2 min till separata kulor från lösning.
- Aspirera supernatanten med en multikanalpipett, undvika pärlpelleten.
- Dispensera 150 ul 70% etanol till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur for minst 30 s. Aspirera etanol med en multikanalpipett och kasta tips. Upprepa detta tvätta proceduren en gång till.
- Med användning av en 20 mikroliter multikanalpipett aspirera återstående etanol från varje brunn och kassera tips.
- Gång brunnarna är torra (~ 10 min), ta bort från magnetplattan och tillsätt 40 | il nukleas fritt vatten till varje brunn och pipett mix 15 gånger eller vortex försiktigt.
- Inkubera vid rumstemperatur under 2 min.
- Placera PCR-plattan på magnetplatta för en min till separata kulor från lösning.
- Överföring 35 mikroliter av renad produkt i ett annat PCR-platta. Detta är renad PCR-produkt är nu redo att fortsätta med dubbelriktad sekvensering eller kan lagras vid -20 ° C tills de behövdes.
OBS: När man utvecklar en ny analys kan kvantifiering av renade PCR-produkten krävas. 1 - 3 ng / ul-amplikon-DNA är optimal för dubbelriktad sekvensering. Om koncentrationen är konsekvent låg, öka PCR-produkt och magnetiska pärlor proportionally (1: 1,8). Om koncentrationen är genomgående hög, eluera med en större volym av vatten.
3. Sekvensering av WTB-PCR Product
- Dubbelriktad Sequencing
OBS: Följande protokoll är en modifierad form av tillverkarens instruktioner som har optimerats för att använda färre reagens.- Förbereda framåt och bakåt sekvensbestämningsreaktion blandas med 0,25 mikroliter Ready Reaction blandning, 1,88 | il Sequencing Buffer, 1,78 pM M13-F eller M13-R sekvenseringsprimrar och lägga till och DNAs, RNAs-fri, ultrarent H2O för att skapa en slutlösning volym av 9 mikroliter per reaktion. Denna sekvensereaktionsblandning kan lagras vid -20 ° C i upp till ett år.
- Pipettera 9 mikroliter av den framåtsekvense-reaktionsblandningen i varje brunn av en ny 96 väl PCR-platta för framåtsekvenseringsreaktion. Upprepa på en separat platta för den omvända sekvenseringsreaktion.
- Tillsätt 1 pl av det renade WTB-PCR-produkt to varje brunn på både fram- och back plattor.
- Försegla kort plattan och centrifugera för att säkerställa att lösningen når botten av varje brunn.
- Ladda PCR plattan på en termocykler.
- Ställa in termocyklingsvillkor för sekvenseringsreaktionen enligt följande: 96 ° C under 1 min; 30 cykler av 96 ° C under 10 s, 50 ° C under 5 s, 60 ° C under 4 min; håll vid 4 ° C tills redo för rening.
- Rena sekvenseringsprodukter
- Förbereda en färsk 01:25 lösning av 3 M natriumacetat (pH 5,2) och 100% etanol.
- Förbereda en färsk 70% etanollösning.
- Lägga 30 mikroliter av natriumacetat / 100% etanol-lösning till varje brunn av både den framåtriktade och bakåtsekvenseplattor och pipett mix 5 gånger.
- Återförslut plattan och inkubera i mörker vid rumstemperatur under 20 min.
- Centrifugera plattan vid 2250 xg under 15 min.
- Avlägsna plattan sealer och vänd över ett slöseribehållare.
OBS: Vänd bara en gång eller pellets kan lossna från brunnen bottnar. - Placera den inverterade plattan på en ren pappershandduk och centrifugera vid 150 xg under 1 min.
- Lägga 150 mikroliter 70% etanol till varje brunn.
- Återförslut plattan och centrifugera vid 2250 xg under 5 min.
- Upprepa steg 3.2.6 och 3.2.7.
- Om brunnarna inte är helt torr, tillåta dem att lufttorka vid rumstemperatur. Se till att proverna skyddas från ljus medan torkning.
- Tillsätt 10 mikroliter Formamid till varje brunn och pipett mix 10 gånger. Återförslut plattan.
- Denaturera på termocykler vid 95 ° C under 3 min följt av 4 ° C under 5 min.
- Efter denaturering, byt plattan sealer med en septa och sekvens på sekvense plattform enligt tillverkarens anvisningar 15.
4. Analys av Sekvenseringsresultat
- Visualisera sekvense spår med hjälp av en sekvenserings daten analysmjukvara enligt tillverkarens anvisningar 16 och anpassa till de respektive referenssekvenserna. Rikta MyD88 till NCBI referenssekvens "NM_002468".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En konceptuell översikt av WTB-PCR under utsträckning presenteras i figur 1. Eftersom en enda nukleotid felparning i blockeraren-DNA-hybriden kraftigt minskar dess smälttemperatur (AT ^ = 20 - 30 ° C), amplifiering av WT-allelen är blockerad medan mutant mall-DNA är fri att fullborda förlängningen 17. På detta sätt, är mutant-DNA amplifieras exponentiellt medan WT DNA amplifieras linjärt.
En demonstration av den mutanta berikning uppnås genom WTB-PCR presenteras i figur 2. Genomiskt DNA från patienter med och utan mutationer testades med både konventionella och WTB-PCR och därefter sekvenserades för att påvisa den typiska anrikning uppnås genom WTB-PCR och en avsaknad av falska positiva i WT-DNA. Den arbetskoncentration av blockerare används i WTB-PCR MMX bör bestämmas genom titrering experiment och should uppnå den önskade nivån av mutant anrikning samtidigt inte leder till falska positiva eller blockera amplifiering av WT-DNA helt. Sekvenseringsanalys av WTB-PCR-produkten visar anrikning för den mutanta allelen och en detektionsgräns på över 0,5% mutant allel i en bakgrund av WT jämfört med 16% i konventionell PCR 3.
Effekterna av denna ökning i känslighet i klinisk testning kan variera beroende på den relativa kvantiteten av neoplastiska celler i de testade proverna. I ett metoder jämförelse studie har WTB-PCR-analys som beskrivs här visade att 64% av MyD88 mutationer skulle missas genom konventionell testning av patienter med WM eller MGUS 3.
Ett karakteristiskt drop-off i signalintensitet (Figur 3) ses ofta, om en alltför hög koncentration av blockerare används eller om efter PCR purification misslyckades med att ta bort blockerare före dubbelriktad sekvensering. Den senare demonstreras när magnetisk pärla rening är substituerad för enzymatisk rening. Även om enzymatisk rening är ett attraktivt alternativ när man arbetar med större provnummer, är det olämpligt för tillämpning med WTB-PCR såsom den misslyckas med att ta bort blockerare från lösningen före sekvensering.
Ett exempel på sekvensartefakter hittas ofta i FFPE-härledda DNA som ett resultat av cytosin deaminering (C: G> T: A) presenteras i Figur 4 3, 18, 19, 20. Även om de verkliga orsakerna till cytosin deaminering är dåligt förstådda, kommer alla PCR-baserad analys som berikar för mutanta alleler upptäcka dessa lågfrekventa artifakter 21, 22. Falska positiva på grund av deaställandet är bäst undvikas genom att starta med hög kvalitet schablonmaterialet; i de många fall där detta inte är möjligt, kan behandling med uracil-DNA-glykosylas (UDG) under extraktion lätta begränsning av frekvensen och intensiteten av deaminering artefakter. UDG behandling av FFPE vävnad under extraktion (som en del av DNA-FFPE kit) punktskatter deamineras cytosinrester därigenom förhindra artificiellt inducerad C: G> T: A mutationer. Men 5-metylcytosin rester som ofta förekommer vid CpG-dinukleotider deamineras till tymin, som inte kan skäras av UDG. De resulterande sekvenserings artefakter är ganska igenkännbar och ofta visas som tandem mutationer såsom framgår av fig 4. Om prov redan har extraherats, kan UDG-behandling implementeras i en sekundär extraktion med relativt låg DNA-förlust.
Figur 1: Conceptual Oversikt av WTB-PCR. En enda nukleotid felparning i Blocker-DNA-hybriden minskar Tm med upp till 30 ° C. Genom utformning av blockerande oligonukleotid för att ha en Tm på 10 - 15 ° C över temperaturen under utsträckning, är amplifiering av WT-DNA blockerad medan den tillåter amplifiering av mutanta DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Genomiskt DNA från patienter med och utan mutationer testades med både konventionella och WTB-PCR och därefter sekvenserades för att påvisa den typiska anrikning uppnås genom WTB-PCR. Den slutliga koncentrationen av blockerare används för att uppnå WTB-PCR valdes för att uppnå maximal mutant anrikning samtidigt inte orsakar falska positiva i WT DNA eller blockerande amplification av WT-DNA helt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Karakteristisk drop-off i signalintensitet ses när enzymatisk PCR-rening används istället för magnetiska pärlor. Detta är sannolikt på grund av enzymatisk rening inte att ta bort Blocker innan dubbelriktad sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: C: G> T: En sekvense artefakter uppstår i FFPE vävnad när cytosin eller metylerat cytosin är deamineras via formalinfixering till uracil eller tymin, respektive. Uracil-DNA-glykosylas (UDG) kan skära ut uracil före WTB-PCR hjälper till att minska sekvense artefakter. Emellertid tymin som resulterar från deaminerade 5-metylcytosin, som ofta inträffar vid CpG-öar, kan inte skäras av UDG. Minskning av koncentrationen av blockeraren användes i WTB-PCR kan bidra till att minska förekomsten av sekvenserings artefakter som inte avhjälpas genom UDG-behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den WTB-PCR-analys som beskrivs här använder en generisk uppsättning primrar med en blockerande oligo utformade för att blockera amplifiering av WT-DNA under utsträckning (Figur 1). Den WTB-PCR-produkten sedan sekvens för mutationsanalys. Användbarheten av WTB-PCR / Sanger ligger i dess enkelhet, hög känslighet och hög genomströmning. Med användning av de riktlinjer som beskrivs här, kan de flesta befintliga Sanger baserade analyser enkelt modifieras via tillsats av en blockerande oligonukleotid för att kraftigt öka känsligheten. I exemplet analysen presenteras här tillägget av en enda blockerande oligonukleotid för PCR ökade detektionsgränsen från approximativt 16% mutant allel i en bakgrund av WT för den konventionella analysen till> 0,5% i WTB-PCR-analysen 3. Vars effekt är en minskning av falska negativa ses i klinisk testning 3 64%. Att bekräfta närvaron av mutationer i MyD88 har betydande diagnostisk och prognostisk implIKATION; felaktigt rapporterar ett fall som negativt kan få allvarliga konsekvenser för den totala terapi och patienthantering. Testning med WTB-PCR är därför av stor betydelse, särskilt hos patienter med relativt låg onormal cellularitet.
WTB-PCR-tekniker variera avsevärt och betecknas ibland omväxlande med LNA, BNA, eller PNA-medierade PCR-kläm eller PCR-clamp-probanalyser 2, 4, 23, 24. Vissa variationer som utnyttjar WTB-PCR involverar en qPCR analys som nödvändiggör att utforma en ytterligare fluorescerande prob för varje specifik mutation. En stor utmaning i samband med denna teknik inkluderar behovet av att utveckla konkurrenskraftiga bindande sonder som exakt diskriminerar mellan WT och muterade alleler. Dessutom eftersom en mutation specifik sond krävs saknar qPCR tillvägagångssätt förmågan att upptäcka okända mutations. En annan variant av WTB-PCR blockerar WT amplifiering i en allel-specifikt sätt. Istället för att använda mutationsspecifika primers dock en blockerande sond specifik för WT-allelen hämmar fullständig primer bindande. Även om detta tillvägagångssätt inte kräver en mutation specifik sond som qPCR, misslyckas det att skilja mellan mutationer och polymeras inducerade fel kan leda till ökad falska positiva. Exponentiell amplifiering av dessa polymeras inducerade fel genom PCR kan skymma detektionen av sällsynta mutationshändelser. Varje metod som använder PCR-amplifiering för att berika för mutationer har dess riktighet begränsas av frekvensen av PCR-fel 25, 26, 27. En grundläggande fördel med WTB-PCR / Sanger över många andra högkänsliga metoder är att det förhindrar amplifiering av både WT-mall och mutant mall vars mutationer inträffar utanför genregionen måltavla blockerings oligonucleotide. Därför är PCR-fel som införs genom polymeraser effektivt filtreras bort tillsammans med WT DNA. I motsats till AS-PCR eller qPCR dock anrikning behålls för okända mutationer som förekommer inom det område som täcks av den blockerande oligo. I fallet med MyD88, WTB-PCR tillät detektion av både L265P och R264 * mutationer 3. Andra har på liknande sätt rapporterat detekteringen av multipla, lågfrekventa mutationer med användning av WTB-PCR 4, 28. Detta gör WTB-PCR idealisk för både forskning och kliniska ändamål.
Tillsammans med hög känslighet och inneboende interna kontroller för att eliminera falska positiva, WTB-PCR flexibilitet för att anpassa en befintlig sekvense analys med mycket få ytterligare steg med blockerare design gör det attraktivt alternativ för många laboratorier med etablerade analyser. Samma uppsättning av PCR-primrar som användes i en konventionell analys kan typiskt användas i WTB-PCR variation. OThennes protokollförändringar som starkt rekommenderas för WTB-PCR-inklusive UDG behandling av FFPE vävnad och lämpliga post-PCR-reningsmetoder-är lika överföras. Blockerare utformning, är därför den kritiskt element i genomförandet av en WTB-PCR-analys. Även om riktlinjerna som presenteras i detta protokoll representerar de mest relevanta faktorer att design, bör olika blockerande oligonukleotider testas för att hitta en som blockerar WT förstärkning effektivt utan sekundära effekter på PCR. Detta inkluderar att lägga till eller ta bort blockerings baser för att justera Tm, skiftning av positionen för den blockerande oligo förhållande till WT-mall, och ändra den totala längden av oligo. Blockerings titrering experiment bör också användas för att skapa en balans mellan acceptabla förekomster av sekvense artefakter och detektionsgräns.
Välja en lämplig metod för detektion av mutationer som är närvarande i små fraktioner cell beror mycket på the ansökan och sjukdom / mutationstyper. Om mutant kvantifiering önskas kan qPCR eller digital PCR erbjuda mer hållbara lösningar än WTB-PCR / Sanger. Fastän WTB-PCR är i första hand en kvalitativ analys, är det möjligt att bestämma en grov uppskattning av den mutanta allelen frekvensen genom att testa ett prov med konventionella och WTB-PCR parallellt. Eftersom detektionsgränsen för den konventionella analysen är ~ 10 - 20% mutant allel i en bakgrund av WT, är det lämpligt att dra slutsatsen att mutationer detekteras av WTB-PCR-analysen, men inte den konventionella är närvarande vid en koncentration som är mindre än den gräns av detektion av det konventionella testet. Några analyser erbjuder mångsidighet, enkelhet och robusthet WTB-PCR. Den låga kostnaden och korta handläggningstider gör det idealiskt för att bedöma kvarvarande sjukdom efter terapi eller uppföljning av nya resistensmutationer under behandlingen. Dessutom, förmågan att upptäcka tidigare obeskrivna mutationer gör WTB-PCR idealisk för forskningsändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µL) | Roche | 12032937001 | With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3 M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1,000 µL | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~ 1,000 mL | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström's macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
