Reconstructions à grande échelle et indépendante, impartiale Clustering Basé sur Metrics morphologiques à Classifier Neurones dans les Populations sélectives

Summary

Ce protocole décrit les reconstructions à grande échelle des populations neuronales sélectives, marquées après l'infection rétrograde avec un virus de la rage modifiée exprimant des marqueurs fluorescents, et des analyses indépendantes, impartiales grappe qui permettent la caractérisation complète des paramètres morphologiques parmi les sous-classes neuronales distinctes.

Abstract

Ce protocole décrit les reconstructions à grande échelle de neurones associés à l'utilisation de regroupement indépendant et impartial des analyses pour créer une enquête exhaustive sur les caractéristiques morphologiques observées chez une population neuronale sélective. La combinaison de ces techniques constitue une nouvelle approche pour la collecte et l'analyse des données neuroanatomiques. Ensemble, ces techniques permettent à grande échelle, et donc plus complète, l'échantillonnage des populations neuronales sélectives et d'établir des méthodes quantitatives impartiales pour décrire les classes de neurones morphologiquement uniques au sein d'une population.

Le protocole décrit l'utilisation du virus de la rage modifié pour marquer sélectivement les neurones. G supprimé les actes du virus de la rage, comme un traceur rétrograde après l'injection stéréotaxique dans une structure cible du cerveau d'intérêt et sert de véhicule pour la délivrance et l'expression de l'EGFP dans les neurones. Un grand nombre de neurones sont infectés en utilisant cestechnique et d'exprimer la GFP à travers leurs dendrites, produisant "Golgi-like" remplissages complets de neurones individuels. En conséquence, le procédé de traçage rétrograde à médiation virale améliore les techniques de traçage rétrograde à base de colorants traditionnels par la production intracellulaire remplissages complets.

Individuels neurones bien isolées couvrant toutes les régions de la zone du cerveau à l'étude sont sélectionnés pour la reconstruction afin d'obtenir un échantillon représentatif des neurones. Le protocole décrit les procédures de reconstruction des corps cellulaires et de compléter les modèles arborisation dendritique des neurones marqués couvrant des sections de tissus multiples. Les données morphologiques, y compris les positions de chaque neurone dans la structure du cerveau, sont extraites pour analyse ultérieure. fonctions de programmation standard ont été utilisées pour effectuer des analyses et des grappes indépendantes évaluations groupées basées sur des mesures morphologiques. Pour vérifier l'utilité de ces analyses, l'évaluation statistique d'un perfo d'analyse de clusterrmée sur 160 neurones reconstruits dans le noyau réticulaire thalamique du thalamus (TRN) du singe macaque a été faite. Tant l'analyse de cluster d'origine et les évaluations statistiques réalisées ici indiquent que les neurones TRN sont séparés en trois sous-populations, chacune avec ses caractéristiques morphologiques uniques.

Introduction

Neuroanatomy est l' un des fondements de la neuroscience ¹ et de l' intérêt récent "connectomique" a renouvelé l' enthousiasme pour la compréhension de la diversité morphologique des populations neuronales et les connexions entre les neurones spécifiques ^2. Des procédés de marquage et les neurones reconstruisant ont grandement amélioré avec des innovations récentes, y compris circuit traçage génétique et virus médiée par des approches ^{3, 4,} ce qui permet des enquêtes morphologiques plus complètes des populations neuronales ^5. En plus des améliorations dans l' étiquetage des neurones individuels, les techniques d'analyse de données quantitatives sont également apparues qui permettent la classification indépendante et impartiale des neurones en sous - populations distinctes fondées sur des données morphologiques ^{5, 6.} Ces techniques impartiales sont une amélioration sur plus traditional méthodes de classification qualitatives qui ont été la norme dans le domaine depuis plus d'un siècle. Le but de cette étude est de décrire, étape par étape, la combinaison de l'étiquetage des virus médiée par des neurones au sein d'une population sélective, reconstructions à grande échelle d'un échantillon global de ces neurones, et l'analyse quantitative de données basée sur le regroupement indépendant avec évaluation statistique. En combinant ces méthodes, nous présentons une nouvelle approche vers la collecte et l'analyse des données neuroanatomiques pour faciliter l'échantillonnage complet et classification objective des types de neurones morphologiquement uniques au sein d'une population neuronale sélective.

A titre d'exemple de ces méthodes, nous décrivons l'analyse d'une large population de neurones dans un seul secteur du noyau thalamique réticulaire (TRN) du macaque. Ces données proviennent d'une étude préalable ^7. Méthodes d'étiquetage sélectivement les neurones TRN en saillie à l'latera dorsalel genouillée noyau du thalamus (dLGN) par injection chirurgicale du virus de la rage modifié codant EGFP ^{4, 8} (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 2) sont décrites. Ce virus de la rage modifié est dépourvu du gène codant pour une protéine d'enveloppe essentielle, ce qui élimine le mouvement trans-synaptique du virus. Une fois que le virus pénètre dans les terminaisons axonales au site d'injection, il agit comme un traceur rétrograde traditionnel avec l'avantage important de conduire l' expression EGFP dans toute la arborisation dendritique complète des neurones infectés ^{5, 9, 10.} En conséquence, ce virus de la rage G deletion peut être utilisée pour infecter et marquer une population neuronale après l'injection et le transport rétrograde de manière sélective.

Afin d'effectuer une analyse complète d'une population neuronale spécifique, il est important d'échantillonnerune large distribution des neurones au sein de la population. Étant donné que la technique de marquage à médiation virale produit intracellulaire complet, remplit de nombreux neurones avec des axones au niveau du site d'injection de virus "Golgi-like», il est possible de reconstruire un grand échantillon de neurones au sein de l'étendue de la structure du cerveau. En outre, parce que le virus de la rage est modifiée de manière efficace à infecter et à étiqueter un grand nombre de neurones, il est possible de reconstruire des centaines de neurones par animal. Les procédures d'échantillonnage de 160 neurones dans tout le secteur visuel de la TRN ¹¹ afin de générer un échantillon complet de neurones se projetant dLGN-TRN sont décrits. Le processus de reconstruction des neurones individuels à l'aide d'un système de reconstruction de neurones comprenant un microscope, une caméra, et un logiciel de reconstruction est décrit. On décrit également des méthodes pour déterminer les positions des neurones individuels au sein d'une structure du cerveau (dans ce cas au sein de la TRN) et de vérifier le virus sit d'injectionle volume de courrier et un emplacement à l'intérieur d'une structure (dans ce cas dans le dLGN) en utilisant des reconstructions de contour volumétrique. Étapes à suivre pour exporter des données morphologiques et effectuer grappe indépendante analyses fondées sur des paramètres morphologiques mesurés pour chaque neurone sont décrites. Il y a des limites aux méthodes de classification et il y a aussi une variété de différents algorithmes de clustering disponibles. En conséquence, ces options et les avantages de certains des algorithmes les plus couramment utilisés sont décrits. L'analyse de cluster ne fournit pas la vérification statistique de l'unicité de clusters. Par conséquent, des étapes supplémentaires sont décrites afin de vérifier le regroupement optimal, ainsi que les relations entre les données morphologiques au sein et entre les clusters. Méthodes statistiques pour évaluer les clusters pour l'ensemble de données TRN pour confirmer que les neurones TRN sont regroupés en trois groupes uniques basé sur 10 paramètres morphologiques indépendants sont décrits.

Ainsi, en décrivant les étapes pour l'étiquetage sélective, La reconstruction et l'analyse des données morphologiques d'une population neuronale spécifique, nous décrivons des procédés permettant de quantifier des différences morphologiques entre les neurones au sein d'une population. les résultats antérieurs des types neuronaux distincts au sein du secteur visuel du singe macaque TRN sont confirmées avec des méthodes d'évaluation statistiques distinctes. Ensemble, nous espérons que ces techniques seront largement applicables aux ensembles de données neuroanatomiques et aider à établir la classification quantitative de la diversité des populations neuronales dans le cerveau.

Protocol

Remarque: Le tissu examiné dans cette étude a été préparée dans le cadre d'une étude distincte ^5. Par conséquent, toutes les méthodes expérimentales impliquant l'utilisation d'animaux ont été décrits en détail dans la section Méthodes expérimentales de Briggs et al. (2016). Toutes les procédures impliquant des animaux menées dans le cadre de l'étude préalable a été approuvé par les comités de protection et d'utilisation des animaux institutionnels. Les étapes d'injection du virus dans le dLGN et le traitement histologique des tissus cérébraux sont décrits brièvement ci-dessous dans les paragraphes 1 - 2.

1. Injection stéréotaxique

1. Effectuer toutes les interventions chirurgicales dans un environnement stérile en utilisant des techniques aseptiques. Steam-stériliser tous les instruments chirurgicaux en métal, de la gaze et de tissu de champ en autoclave. Stériliser tous les matériaux qui pourraient être endommagés par la vapeur en utilisant la stérilisation chimique (par exemple de l' oxyde d'éthylène).
2. Provoquer et maintenir une anesthésie selon l'animal- et pexigences spécifiques ROTOCOLE.
   1. Pour l' injection de virus chez les singes, induire l' anesthésie avec de la kétamine (10 mg / kg) et de maintenir les animaux sous anesthésie chirurgicale complète avec isoflurane (1 - 3% inhalée en oxygène) surveillance expiré CO _2, ECG, fréquence respiratoire et la température en continu et périodiquement vérifier pour la mâchoire ton pour assurer la profondeur de l'anesthésie appropriée.
3. Placez l' animal dans un cadre stéréotaxique pour stabiliser la position de tête et pour permettre l' utilisation des coordonnées stéréotaxiques pour localiser la structure d'injection d'intérêt (par exemple dLGN). Si la mesure de réponses visuelles, le lieu des gouttes oculaires (1% oeil de gouttes d'atropine si la dilatation des pupilles est souhaitée, sinon les yeux gouttes salines) et des lentilles de contact dans les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Sinon la mesure des réponses visuelles, placer pommade ophtalmique dans les yeux.
4. Faire une incision médiane du cuir chevelu et retirer la peau et les muscles.
5. Selon stéréotaxique coordonnées pour la structure d'intérêt (dLGN) dans une Hémisphavant, faire une petite craniotomie.
6. Peu à peu , abaisser une électrode d'enregistrement (par exemple , de tungstène ou de l' électrode de platine / iridium (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 3) serrée à un micromanipulateur qui est positionnée manuellement) à travers la craniotomie dans le cerveau. Basse impédance (<1 MQ) et légèrement plus épais (~ 250 um de diamètre), les électrodes peuvent être utilisées pour pénétrer dans la dure-mère, si on le souhaite.
7. Notez la position du manipulateur à la surface corticale et au point où des réponses visuelles sont mesurées. réponses visuelles sont audibles, le temps de verrouillage des réponses neuronales à la lumière brilla dans les yeux avec un ophtalmoscope ou une petite LED / lampe de poche.
8. Déterminer l'emplacement et l'épaisseur de la dLGN en notant les positions du manipulateur, au début, au milieu et à la fin des réponses visuelles et en soustrayant la position de la surface corticale de ces valeurs. Notez les profondeurs pour chaque site d'injection conçu dans le dLGN.
   NOTE: procedu similairesres peuvent être utilisées pour localiser des structures non visuelles en utilisant des stimuli sensoriels appropriés. En outre, les systèmes d'enregistrement / d'injection couplés peuvent également être utilisés pour cibler des petites structures cérébrales.
9. Une fois que les emplacements d'injection optimales sont notés, retirer l'électrode d'enregistrement et de placer une pipette d'injection (pipette en verre ou une seringue d'injection) à la même position stéréotaxique et inférieure à la profondeur appropriée pour chaque injection, à partir du point d'injection le plus profond et en procédant à la plus faible, attendre au moins 1 minute après l'injection avant de changer la position de l'électrode. Pipettes en verre avec un diamètre externe de ~ 50 um peuvent réduire le reflux du virus par rapport aux embouts de seringue (~ diamètre de 200 um).
10. L' utilisation d' un système d'injection (voir le tableau des matériaux spécifiques / Equipmen t, ligne 4), Picospritzer ou pompe seringue, injecter de petits volumes (1 - 5 pi; se référer aux instructions du fabricant pour les procédures d'injection) de virus de la rage modifiée plus multiple (3 - 10) des profondeursà une vitesse d'environ 100 Nl / min dans la structure cible (dLGN). Remarque: Les pénétrations d'injection distinctes peuvent être réalisées dans les grandes structures cibles (par exemple , le singe dLGN). Ajuster le volume total d'injection selon la taille de la structure cible.
11. Une pause d'au moins 5 minutes avant de se rétracter de la pipette d'injection. Lorsque la pipette d'injection est enlevée, remplissez le craniotomie avec du matériel de protection (colle morceau d'os en place, appliquer de la cire d'os ou Gelfoam), puis suturer le muscle et la peau de retour ensemble.
12. Administrer des analgésiques (par exemple , le kétoprofène) et des antibiotiques avant la fin de la chirurgie et de surveiller l' animal en continu jusqu'à ce que l' animal est ambulatoire.
13. Pour au moins 3 jours et jusqu'à 10 jours après la chirurgie, le suivi des animaux par jour pour assurer les sutures sont propres, sèches et intactes et des animaux ne montre aucun signe de douleur ou d'inconfort. Administrer des analgésiques et des antibiotiques quotidiens selon les besoins. Commencez logement social de l'animal post-chirurgicale après animal a complètement récupéré de la chirurgie.
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2. La récolte de tissus, Sectionnement et Coloration

1. Permettent 7 - 14 jours pour le transport rétrograde de virus, puis euthanize l'animal par une surdose d' une solution d'euthanasie (par exemple Euthasol) et perfusent l'animal par voie transcardiaque avec 0,1 M de tampon phosphate salin, 4% de paraformaldehyde, puis 4% de paraformaldehyde à 10% de saccharose.
2. Retirez le cerveau (voir ¹² pour des étapes analogues dans un modèle de rongeur) et dans 20 - 30% de saccharose avec 4% de paraformaldehyde dans un tampon phosphate 0,1 M et réfrigérer pendant 1 - 2 jours.
3. Lorsque le cerveau a coulé au fond du récipient, l' enlever et couper le tissu en blocs contenant la région du cerveau avec des neurones marqués de manière rétrograde (par exemple le cortex visuel) et la structure cible d'injection (par exemple dLGN). Couper les mêmes blocs de tissu de l'hémisphère non injecté - ceux-ci serviront de sections de commande. Pour de meilleurs résultats, commencer les procédures histologiques immediately sur les tissus fraîchement sectionné.
4. Section tissu coronaire à une épaisseur de 50 pm par section à l' aide d' un microtome de congélation (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 5).
5. Colorer toutes les sections pour l' activité du cytochrome oxydase (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, lignes 5 - 8) pour visualiser les couches corticales et structures sous - corticales ^13. Note: Les articles peuvent être stockés pendant une nuit dans un réfrigérateur dans le rinçage final après la tache cytochrome oxydase.
6. Marquez toutes les sections avec un anticorps primaire contre la GFP (1: 1000 dilution, ~ 12 heures d' incubation; voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 9) suivi d'un anticorps secondaire correspondant à l'hôte principal et marqué avec de la biotine ⁵ (dilution 1: 500 , 2 - 4 h d' incubation; voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 10). Il est recommandé de faire incuber les sections dans l'anticorps secondaire pendant une nuit.
7. Sections d'étiquettes avec un complexe avidine / biotine réagissent ensuite avec DAB et de peroxyde pour colorer de façon permanente tous les neurones marqués ^5.
8. Monter sections sur des lames de verre substrate et laisser sécher pendant la nuit.
9. Sections Defat en utilisant une série d'alcool et de xylène rinçages puis lamelle ^14.

3. Reconstruction Neuronal

NOTE: Toutes les reconstructions pour des expériences originales ont été faites en utilisant un système de reconstruction de neurone composé d'un microscope (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 14), appareil photo ci - joint (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 13), et un logiciel de reconstruction package (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, lignes 11 - 12). assistée par logiciel de reconstruction neuronal permet de visualiser des lames de tissu superposées avec des dessins de processus neuronaux informatiques. Fait important, le logiciel numérise recons morphologiquedon- nées de en trois dimensions, permettant l'extraction de l'information morphologique position spécifique. Le programme d'extraction de données associées (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 12) permet l' extraction d'un riche ensemble de données morphologiques de chaque reconstruction enregistrée.

1. Placez une lame dans le porte-lame de microscope et se concentrer sur une seule section d'intérêt en utilisant un objectif à faible grossissement (par exemple 2X ou 10X). Assurez-vous que l'image de la caméra est visible dans la vue du logiciel en positionnant correctement l'obturateur de la caméra.
2. Choisissez neurones marqués au sein de la structure du cerveau d'intérêt (par exemple , TRN) qui sont raisonnablement isolé de manière à reconstruire sans ambiguïté , comme une grande partie de l'arborisation dendritique que possible. choisir Préférentiellement neurones si le corps cellulaire est entièrement dans une seule section afin de capturer la plus grande étendue de chaque corps cellulaire et précisément estimer sa superficie et sa rondeur. Utilisez objectif de microscope 10X pour identifier la cellule body dans la section maison.
3. Une fois bien coloré, neurone bien isolé est identifié, ajoutez la section «maison» contenant le corps de la cellule au gestionnaire de la section en cliquant sur le bouton "Nouvelle section". Entrez le nombre de sections à inclure (recommander 2 - 3 sections pour commencer). Attribuer une épaisseur de section de 50 pm lorsque vous êtes invité (voir l'étape 2.3).
4. Tracer les contours des structures cérébrales pertinentes dans la section d'accueil contenant le corps de la cellule. Utilisez le 2X objectif / agrandissement pour contour tracé.
   1. Tout d' abord, sélectionnez "Contour" dans le menu déroulant de la barre d' outils, puis sélectionnez le type dans le menu déroulant (par exemple "LGN" ou "TRN") contour.
   2. Tracer les contours de la structure cible (TRN), ainsi que des structures adjacentes, si on le souhaite, en cliquant sur les points le long du contour en utilisant la souris comme outil de traction.
   3. Sélectionnez "Close Contour" par un clic droit sur la souris et en sélectionnant cette optiondans le menu pour compléter et encadrer chaque contour tracé.
5. Placer un marqueur au centre de la structure cible en cliquant sur le symbole de marqueur souhaité sur la barre d'outils à droite, puis en cliquant sur l'emplacement souhaité dans la reconstruction de placer le marqueur à cet endroit. Utilisez le même type de marqueur pour marquer le centre de la structure cible dans toutes les reconstructions.
6. Une fois que les contours sont complets, tracer le contour du corps cellulaire en utilisant 40 - 60X objectifs / agrandissement. Pour ce faire, sélectionnez d'abord "Neuron" dans le menu déroulant de la barre d'outils, puis sélectionnez la structure des neurones à tracer, dans ce cas, "Cell Body". Suivant tracer le corps cellulaire en 3.4.
7. Placer un marqueur de style différent au centre du corps de la cellule, en suivant les étapes décrites dans 3.5.
8. Trace tous les dendrites commençant au niveau du corps cellulaire.
   1. Tout d'abord, sélectionnez "Dendrite" dans le menu déroulant. Puis tracer chaque dendrite à partir de la bod cellulairey, et en utilisant la souris comme outil de traction. Assurez-vous de régler la profondeur z dans l'ensemble du tracé de saisir avec précision l'angle et la direction de la dendrite.
   2. Placez un noeud à chaque point de ramification le long de la dendrite par un clic droit sur la souris et en sélectionnant "Node bifurquant" ou "Node Trifurcating" dans le menu déroulant. Utilisez 40 - 60X objectif / agrandissement pour toutes les reconstructions dendrites.
   3. A la fin de chaque dendrite, clic droit de la souris et sélectionnez "Terminer" dans le menu déroulant.
9. Identifier les terminaisons dendritiques qui sont susceptibles de continuer dans la section adjacente et amener ceux-ci dans le foyer à la z-profondeur appropriée dans l'image de microscope. Inclure les principaux monuments à proximité tels que les vaisseaux sanguins ou facilement modèles dendrites reconnaissables ou des faisceaux dans l'image de microscope.
   1. Réduire le grossissement 20X ou 10X sur le microscope (choisir le grossissement qui permet la visualisation plus grand point de repère), et de prendreune image de l'image de microscope en utilisant un appareil photo numérique (par exemple , téléphone portable, tablette) tenu à la main à l'écran d'ordinateur.
10. Déplacer vers la section adjacente sur la lame et aligner les contours de la section précédemment tracée avec les limites de la dLGN et TRN dans la nouvelle section.
11. Retour le champ de vision de la zone générale du corps cellulaire (basé sur les contours et les principaux points de repère) et amener le grossissement de retour jusqu'à 10 - 20X.
12. Utilisez la photo des terminaisons dendritiques de la section précédemment tracée pour aider à aligner les terminaisons avec les débuts des dendrites dans la nouvelle section.
    1. Pour faire pivoter le traçage et le déplacer pour aligner dendrites, utilisez l'outil de défilement pour sélectionner la reconstruction, cliquez-droit et sélectionnez "Déplacer" dans le menu déroulant.
    2. Vous pouvez également utiliser l'outil "Match" pour correspondre à terminaisons dendritiques à des débuts. Sélectionnez l'outil d'alignement de la barre d'outils supérieure et lorsque vous êtes invité, cliquez sur la findans la reconstruction et le point de continuation correspondant dans l'image. Répétez l'opération pour 3 ou plus fins.
13. Une fois que le tracé de la section précédente est alignée avec les dendrites dans la nouvelle section, assurez-vous que la nouvelle section correspondante est sélectionnée dans le gestionnaire de section en cliquant sur la section en cours. Ou, ajouter une nouvelle section au gestionnaire de la section, comme décrit ci-dessus en 3.3, le réglage de la z-profondeur et la position de chaque nouvelle section par rapport à la section de la maison en conséquence et le réglage de chaque épaisseur de coupe à 50 mm (voir l'étape 2.3).
14. Augmenter le grossissement de 40 - 60X et tracer les continuations dendrites par un clic droit de la souris sur la fin de la dendrite de la reconstruction et en sélectionnant «Ajouter à Ending" dans le menu déroulant, puis tracer le dendrite en utilisant la souris comme dessiner outil. Suivez l'invite à préciser si la poursuite est dans la nouvelle section.
15. Suivre les dendrites au travers d'au moins 3 sections adjacentes (une de chaque côté dela section d'accueil) suivant les étapes 03.08 à 03.15. Ajouter à la reconstruction jusqu'à au moins 3 sections totales sont tracées pour le neurone ou jusqu'à ce que les dendrites ne peuvent plus être suivie ou trouvée. Tracer les contours dans les sections voisines en suivant les étapes ci-dessus, si on le souhaite.

4. Independent Clustering

Remarque: analyse indépendante grappe permettent des analyses impartiales de grands ensembles de données multidimensionnelles qui pourraient autrement être difficiles à visualiser et, surtout, de fournir une évaluation quantitative de la diversité morphologique. Une plate-forme de programmation matricielle est très utile pour l'analyse des ensembles de données multidimensionnels et permet des manipulations de données complexes et des analyses statistiques. Les fonctions énumérées dans les étapes 4 - 6 sont définis dans la plate - forme de programmation figurant dans le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 15.

1. Extraire les données morphologiques de chaque reconstruction neuronale individuelle à l'aide d'un posteprogramme de raction associé au système de reconstruction des neurones (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, lignes 11 - 12).
   1. Tout d' abord, choisir les données morphologiques souhaités pour chaque reconstruction , y compris: des informations de contour, des informations de marqueur, les données morphologiques du corps cellulaire et arborisation dendritique, etc.
   2. Dans le menu déroulant Modifier dans la barre d'outils, sélectionnez "Sélectionner tous les objets". Ensuite, sélectionnez "Ramifiée Analyse Structure" dans le menu déroulant Analyse dans la barre d'outils supérieure, puis cliquez sur chaque onglet et sélectionner les options d'analyse souhaitées dans chaque onglet.
   3. Extraire toutes les données souhaitées en cliquant sur le bouton "OK" dans la fenêtre d'analyse et enregistrer dans un format de feuille de calcul en cliquant-droit sur les fenêtres de sortie et sélectionner "Exporter vers Excel".
2. Compiler une feuille de calcul principale (voir le tableau des matériaux spécifiques / équipement, ligne 16) dans laquelle chaque variable morphologique / metric est représenté par une observation numérique unique par neurone. Dans cette feuille de calcul principale, conserver un enregistrement de l'identifiant de ligne pour chaque neurone.
3. Vérifiez que toutes les variables incluses dans l'analyse de cluster (par exemple les métriques morphologiques) sont indépendants les uns des autres. Par exemple, le nombre de nœuds sera en corrélation avec le nombre de branches dans une arborisation dendritique ou axonal. Par conséquent, seule une de ces deux variables doivent être incluses dans une analyse de cluster.
4. Assurez - vous que chaque mesure contient une observation pour chaque variable, à savoir chaque neurone (mesure), doit avoir un point de données (d'observation) correspondant à chaque mesure morphologique (variable). Si les observations d'une variable particulière (par exemple, la longueur de l'axone) font défaut pour un sous-ensemble de neurones, cette variable (longueur de l'axone) ne peut pas être inclus dans l'analyse de cluster.
5. Organiser les données sur la feuille de calcul Master en une seule matrice dans laquelle chaque ligne représente un neurone et each colonne contient des données numériques pour chaque mesure morphologique (Figure 1). Par exemple, un ensemble de données comprenant 100 neurones pour lesquels il existe des observations pour 5 variables indépendantes seraient représentés par une matrice de 100 x 5 (ligne par colonne). Il est nécessaire d'inclure toute identification pour chaque neurone dans la matrice - l'indice de ligne servira comme identifiant unique de chaque neurone. Il devrait également être pas de lacunes ou s "NaN" dans la matrice. Enregistrer la matrice comme une variable unique (par exemple des données = [100 x 5 matrice]; voir le code supplémentaire Fichier pour le code de l' échantillon).
6. Choisir un algorithme pour calculer les distances entre les points représentant les neurones individuels dans un espace à n dimensions, où n est défini par le nombre de variables. La fonction 'pdist' permet la flexibilité dans le calcul entre-neurone distances. Le calcul de la distance par défaut est la distance euclidienne et a été utilisé précédemment pour des analyses similaires de morphologica neuronall données ^{5, 6.}
7. Avec l'entre-neurone éloigne sortie de la fonction 'pdist', utilisez la fonction 'de liaison »pour former des amas. Encore une fois, plusieurs options de clustering sont disponibles. La méthode de Ward et de la distance barycentre ont donné des résultats similaires dans les analyses des ensembles de données morphologiques ^{5, 6.}
8. Si vous le souhaitez, utilisez la fonction 'kmeans' comme une approche de clustering alternative à 'pdist' et les fonctions «de liaison». 'kmeans' emploie carré distance euclidienne pour calculer entre-neurone distances et la distance barycentre pour attribuer des clusters.
9. Pour visualiser un arbre de classification hiérarchique, utilisez la fonction 'dendrogramme' sur la sortie de l'opération «de liaison». Cette fonction a un réglage par défaut qui limite la visualisation 30 mesures, mais elle peut être remplacée en spécifiant le nombre de mesures (<em> par exemple , les neurones) affichés. Le dendrogramme illustre les distances de liaison sur l'axe des ordonnées pour chacun des neurones, identifiés par leur indice de ligne sur l'axe x.
   NOTE: Les sorties de «liaison» et «dendrogramme» ne définissent pas le nombre optimal de clusters. La sortie de 'kmeans' n'attribue des mesures à des clusters, mais il ne teste pas si ces groupes sont optimales. comparaisons statistiques séparées et la vérification de regroupement optimal peuvent être effectuées (voir ci-dessous).

5. Vérification de Clustering

Remarque: Comme indiqué plus haut, l'analyse de grappe elle-même ne fournit pas directement une évaluation statistique si les grappes représentées dans le dendrogramme des grappes sont uniques et représentatives de l'échantillon. Les méthodes de vérification des grappes du dendrogramme ont été proposées ^15, mais elles ne fournissent pas de vérification statistique de regroupement optimal. Il existe plusieursméthodes ples pour vérifier le regroupement optimal.

1. Méthode 1: regroupement Évaluation:
   1. Utilisez la fonction «evalclusters» spécifiant la méthode utilisée pour le calcul des clusters, comme «kmeans» ou «liaison». Une sortie du modèle de mélange gaussien peut aussi être évaluée (voir l' étape 5.2 ci - dessous; voir le code supplémentaire Fichier pour le code de l' échantillon).
   2. Spécifiez le critère d'évaluation à partir d' un certain nombre d'options (par exemple 'CalinskiHarabasz' - pour les descriptions des options de critère, reportez - vous au menu d'aide, la recherche de "evalclusters").
   3. Spécifiez une plage de nombre optimal de clusters pour tester (par exemple [1: 6] pour vérifier si 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 grappes sont optimales).
      Remarque: La sortie de 'evalclusters' est un nombre optimal de clusters étant donné l'algorithme de classification et le critère spécifié.
2. Méthode 2: le clustering gaussien de modèle de mélange:
   NOTE: mélange clustering gaussien modèle algorithms (MGM) supposent que les observations pour chaque variable proviennent d'un mélange de distributions gaussiennes définissant chaque groupe putatif, chacun avec leur propre moyen et covariance. Le GMM utilise ensuite un algorithme de maximisation de l' attente d'attribuer des probabilités a posteriori à chaque mesure, indiquant la probabilité d'appartenance à un groupe spécifique ^16.
   1. Mettre en œuvre un GMM en utilisant la fonction 'fitgmdist' en saisissant le numéro putative de clusters observables dans les données. Sinon, pour éviter une affectation a priori du nombre de clusters, utilisez analyse en composantes principales (ACP) avec une série de nombres différents de cluster optimale en utilisant les étapes décrites ici (voir code supplémentaire Fichier pour le code de l' échantillon).
   2. Utilisez la fonction 'pca' sur la matrice de données d'origine et enregistrer les scores des composantes principales en tant que sortie.
   3. Dans une boucle à partir de 1 et en passant par un certain nombre de grappes optimales putatifs, utilisez efonction e 'fitgmdist' sur les scores des composantes principales et générer MGM pour chaque nombre de grappes optimales putatifs.
   4. Évaluer chaque GMM en examinant la probabilité négative journal, critère d'information Akaike et critère d'information de Bayes. Le GMM avec les critères les plus bas est optimal.
   5. Si l'on désire tester si les valeurs moyennes de chaque groupe sont sensiblement différentes lorsque le nombre de grappes est optimal (moyennes de chaque groupe sont stockés dans le "mu" sortie de chaque GMM).

6. Les analyses statistiques des données en cluster

1. Une fois que le nombre optimal de clusters est déterminée en utilisant la classification hiérarchique et évalué, revenir aux données originales, les neurones séparés en groupes, et déterminer quels paramètres morphologiques contribuent à la classification des neurones dans des classes uniques.
2. Trier les données métriques morphologiques originales telles que les neurones sont regroupés en fonction de l'affectation de cluster. Pour examiner les relations entre les données morphologiques entre les neurones (pour tous les neurones ou pour les neurones séparés en groupes), effectuer une régression linéaire correspond à 2 et 3 voies comparaisons des observations morphologiques métriques. Ces ajustements peuvent être estimées en utilisant la fonction «fit» et évalués en utilisant la fonction «fitlm» dans lequel la bonté des sorties d' ajustement comprennent R ² et p valeurs pour des crises de régression.
3. Pour examiner les relations statistiques entre les neurones dans chaque grappe, utilisez non-paramétrique de deux échantillons (test de Wilcoxon rank-sum) ou plusieurs échantillons tests de comparaisons (ANOVA), en fonction du nombre de grappes. Surtout, l'utilisation de multiples échantillons ANOVA assure que les valeurs de p sont corrigées pour les comparaisons multiples.

Representative Results

Nous avons montré précédemment que les reconstructions à grande échelle des neurones au sein d' une population sélective est réalisable par injection subséquente de virus de la rage modifié dans le dLGN ^5. Récemment, le même tissu a été utilisé pour reconstruire 160 neurones dans le secteur visuel de la TRN (Bragg et al dans la revue;. La Figure 2A-B) suivant les étapes méthodologiques détaillées décrites ci - dessus. Dans l'étude de TRN, trois groupes uniques de neurones TRN ont été identifiés sur la base d'une analyse indépendante de la grappe de 10 métriques morphologiques: cell surface du corps, le corps cellulaire circularité, médio-latérale position par rapport au centre de la TRN, la position dorsale-ventrale à l'intérieur de la TRN , nombre d'arbres dendritiques, la distance moyenne dendritique à des nœuds, la longueur moyenne de 3 ^ème et supérieur dendrites d'ordre, angle moyen de 1 ^er ordre dendrites, angle de phase moyenne de l'arborisation dendritique totale, et la déviation angulaire du autal arborisation dendritique. TRN neurones ont été répartis de manière équivalente dans les trois groupes (figure 2C). comparaisons statistiques distinctes de l'ensemble des 10 paramètres morphologiques à travers les neurones dans les trois groupes ont donné des différences statistiquement significatives entre les groupes pour tous, mais deux des paramètres morphologiques inclus dans l'analyse initiale du cluster. Ainsi, sur la base du dendrogramme hiérarchique arborescente généré à partir de l'analyse de cluster (figure 2C) et les comparaisons statistiques distinctes de paramètres morphologiques à travers les clusters, les neurones TRN sont classés en trois groupes distincts.

Dans cette étude, nous voulions précisément d'appliquer des méthodes statistiques pour évaluer séparément les grappes déterminées par une analyse de cluster. L'ensemble de données TRN de l'étude préalable a été évaluée afin de déterminer si les trois groupes observés étaient optimales. analyse cluster supplémentaire séparée, à savoir l'APC et GMM clusTering, ont été réalisés pour vérifier les méthodes de classification précédents (figure 1). Trois principaux résultats vérifient séparément l'analyse de cluster avant. Tout d' abord, lorsque la méthode d'analyse de cluster d' origine a été évaluée en utilisant la fonction 'evalclusters de spécifier la fonction «de liaison» pour générer des clusters, le nombre optimal de grappes était de 3, correspondant à la conclusion originale basée sur l'arbre dendrogramme hiérarchique (figure 2C). Deuxièmement, l'APC a été réalisée sur la matrice de données d'origine de 10 paramètres morphologiques pour 160 neurones TRN comme un autre moyen de regroupement neurones basé sur les contributions des paramètres morphologiques. Trois MGM ont été générés, en supposant que les neurones TRN ont été groupés en 1, 2 ou 3 groupes uniques. Le log négatif vraisemblance (NLL) et le critère d'information d' Akaike (AIC) ont donné le plus bas, et donc la plus informative, les valeurs et les deux valeurs sont optimales lorsque le GMM utilisé 3 clusters pour décrire TRN données morphologiques (Figure 3). En troisième lieu, le regroupement basé GMM a été évaluée séparément à l'aide de la fonction 'evalclusters' et le nombre optimal de groupes était 3. Ainsi observations du dendrogramme hiérarchique arborescente, des comparaisons statistiques de paramètres morphologiques à travers les neurones séparés en trois groupes, PCA et GMM- regroupement sur la base, et des évaluations séparées de chaque méthode de classification (de liaison et GMM), tous ont donné le même résultat que les neurones TRN sont parfaitement séparés en 3 groupes sur les 10 paramètres morphologiques utilisés.

Figure 1: Format des données. matrice Exemple de données à n lignes correspondant au nombre de neurones et m = 5 colonnes correspondant au nombre total de variables indépendantes à inclure dans l'analyse de cluster (ne pas inclure les en-têtes dans la matrice de données).

Figure 2: Clustering indépendante de 160 TRN Neurones. A. gauche, photo de la section coronale unique à travers l'dLGN d'un animal, colorées pour l' activité du cytochrome oxydase pour visualiser les couches dLGN et contre GFP pour visualiser l' injection de virus. La flèche indique les régions de neurones TRN rétrogressivement marqués denses. Section orientation suit la boussole dorsale-ventrale / médio-latérale (DV / ML) ci - dessous et barre d'échelle représente 500 um pour tous les panneaux en A. Deuxième de gauche, contour décrit des dLGN (rouge) et TRN (marron) pour toutes les sections contenant injection de virus (contours noirs). Les étoiles jaunes indiquent les centres d'injection. Orientation et échelle des barres comme dans A. Troisième de gauche, des rendus 3D des contours et site d'injection, l' orientation et les barres d'échelle comme dans A. Droit, cartes de lieux de reconstruire Neurones TRN, un code couleur en fonction de l' affectation de la grappe (C) dans un seul contour TRN global (marron). Orientation et échelle des barres comme dans A. B. Gauche, contours globaux de TRN (noir) et dLGN (gris) avec 5 neurones TRN reconstruits couleur chaude pour refroidir selon leur position médio-latérale au sein de la TRN. Orientation en fonction de la boussole DV / ML en A, barre d'échelle représente 500 um. Droit, des photographies des mêmes neurones 5 TRN avec couleur assortie barres d'échelle représentant 100 um. C. dendrogramme arbre hiérarchique après analyse de cluster illustrant les distances de liaison entre 160 neurones TRN reconstruits sur la base de 10 paramètres morphologiques indépendants. Trois groupes illustrés en bleu, vert et rouge. Toutes les parties de ce chiffre sont adaptés à partir des chiffres inclus dans Bragg et al. (en revue).décharné "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Evaluation Cluster. Terrain de deux valeurs de critère différent, log négatif vraisemblance (NLL, rouge) et de l'information Akaike critère (AIC, bleu) généré à partir de trois MGM supposant 1, 2, ou 3 clusters. MGM avec 3 groupes fournissent les valeurs des critères les plus bas.

Fichier supplémentaire de code: Exemple de code, écrit dans un langage Matlab-compatible, d'effectuer une analyse de cluster sur un exemple de matrice de données suivie par l' évaluation du cluster à l' aide de l' APC et GMM approches. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les études neuroanatomiques sont restés un pilier des neurosciences et de l'intérêt récent pour connectomique et relations structure-fonction a renouvelé l'enthousiasme pour la caractérisation morphologique des populations neuronales sélectives. Traditionnellement, les études neuroanatomiques se sont appuyés sur les classifications qualitatives des neurones dans des classes morphologiquement distinctes de neurones définis par neuroanatomistes experts. Avec les progrès dans les techniques de reconstruction des neurones et l'extraction des données morphologiques, il est maintenant possible d'utiliser des méthodes d'analyse des données plus sophistiquées et quantitatives pour classer les classes de neurones morphologiquement distincts d'une manière impartiale. Dans cette étude, les méthodes étape par étape sont décrits pour 1) l'étiquetage sélective des centaines de neurones individuels en utilisant des méthodes d'étiquetage rétrogrades virus médiée; 2) reconstituant systématiquement des centaines de neurones individuels pour former un échantillon complet et donc représentatif de neurones dans un population sélective; et 3) le regroupement indépendant des analyses avec une évaluation statistique pour déterminer les grappes optimales de neurones au sein d'une population sélective en fonction de paramètres morphologiques. Ces méthodes d'analyse sont vérifiés par l'application de différentes méthodes de classification à un ensemble de données existant de neurones TRN et nous démontrons basés sur trois méthodes d'évaluation distinctes que les neurones TRN sont parfaitement regroupés en trois sous-populations morphologiquement distinctes.

Un avantage majeur des protocoles décrits dans la présente étude est leur flexibilité. Le virus de la rage G deletion a été efficace pour diriger l'expression d'EGFP dans des centaines de neurones marqués de manière rétrograde après l'injection dans une structure cible. La même souche de virus de la rage est aussi efficace chez plusieurs espèces , y compris des singes macaques ^{5, 9,} furets (Hasse & Briggs, en révision) et les rongeurs ^7,"> 8. Par conséquent, le virus de la rage modifié peut être utilisé pour marquer sélectivement les motifs de arborisation dendritique complet de chaque population de neurones suite à une injection dans une structure cible. Coloration des anticorps contre la GFP suivie par DAB / réaction de peroxyde est recommandée , car cela provoque une coloration permanente de marqué neurones et permet les coupes de tissu à visualiser au microscope sans l'aide de la microscopie à fluorescence (qui blanchit marqueur fluorescent avec une exposition plus longue). Cependant, les méthodes de coloration de substitution sont disponibles et / ou de fluorescence peuvent être directement visualisées si on le souhaite. un avantage de la mesure fluorescence brute est que les différents virus expression de différentes molécules fluorescentes de conduite peuvent être combinés, par exemple pour déterminer si les neurones projettent à plusieurs structures cibles du cerveau. en outre, les étapes décrites ci-dessus peuvent être appliquées à toutes les données morphologiques disponibles (par exemple axones et dendrites) pour permettre morpho plus en plus robusteclassification logique des neurones. Il est également important de noter que de petites quantités de virus de la rage peuvent également être injectés par voie afin de générer un étiquetage clairsemés rétrograde, ce qui pourrait être avantageux pour des reconstructions d'axones en plus des dendrites.

Un autre avantage des méthodes d'analyse décrites dans la présente étude est que plusieurs approches différentes de classification peuvent être utilisés et comparés. A chaque étape de l'analyse de cluster, différentes options sont disponibles pour calculer entre-neurone distances dans l'espace des paramètres, ainsi que des algorithmes différents pour générer des clusters. En outre, les méthodes d'évaluation multiples sont disponibles. Ce dernier est particulièrement utile en tant que moyen de vérifier le regroupement optimal, tel que décrit dans la section des résultats représentatifs. Sans aucun doute, des algorithmes supplémentaires pour générer des clusters et pour évaluer le regroupement optimal sera disponible que le champ se déplace vers l'avant. Ensemble, ces méthodes d'analyse continueront à IMPROve approches quantitatives dans le domaine de la neuroanatomie et d'améliorer la robustesse des résultats.

Il y a un intérêt croissant pour l'automatisation des reconstructions neuronales parce que les reconstructions par la main de neurones marqués individuels prennent du temps, ont besoin de formation et d'expérience, et sont encore quelque peu subjective. Parce que les reconstructions neuronales automatiques informatiques sont toujours source d' erreurs, les données neuroanatomiques à base de microscopie électronique sont encore analysés par des personnes (voir par exemple ^17). Toutefois, il est probable que la reconstruction neuronale automatisée sera disponible dans un avenir proche. reconstruction neuronale automatique, il faudra encore plus le contrôle sur la fin de l'analyse des données, ainsi analyse le regroupement et les méthodes d'évaluation décrites ici sera encore plus important que le domaine continue de progresser technologiquement.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute		Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten	FHC	UEPSGGSE1N2M	Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204, 110V	Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome	Thermo Scientific
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
Catalase	Sigma-Aldich	C9322-5G
Rabbit anti-GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	#BA-1000	Secondary antibody
Neurolucida System	MicroBrightField		Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		Data export software
Microfire Camera	Optronics		2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope	Nikon Instruments Inc.		Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	Microsoft		Spreadsheet program