Summary
इस प्रोटोकॉल एक संशोधित रेबीज वायरस फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त, और स्वतंत्र, निष्पक्ष क्लस्टर का विश्लेषण करती है कि अलग न्यूरोनल उपवर्गों के बीच रूपात्मक मैट्रिक्स की व्यापक लक्षण वर्णन सक्षम साथ प्रतिगामी संक्रमण के बाद चयनात्मक neuronal आबादी के बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण, लेबल का वर्णन है।
Abstract
इस प्रोटोकॉल स्वतंत्र और निष्पक्ष क्लस्टरिंग के उपयोग के साथ संयुक्त न्यूरॉन्स की बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण रूपात्मक एक चयनात्मक न्यूरोनल आबादी के बीच मनाया विशेषताओं का एक व्यापक सर्वेक्षण बनाने के लिए विश्लेषण की रूपरेखा। इन तकनीकों के संयोजन संग्रह और neuroanatomical डेटा के विश्लेषण के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण का गठन किया। साथ में, इन तकनीकों का बड़े पैमाने पर सक्षम है, और इसलिए अधिक व्यापक, चयनात्मक neuronal आबादी का नमूना और आबादी के भीतर आकृति विज्ञान अद्वितीय न्यूरोनल कक्षाओं वर्णन करने के लिए निष्पक्ष मात्रात्मक तरीकों की स्थापना।
प्रोटोकॉल संशोधित रेबीज वायरस का उपयोग चुनिंदा न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए रूपरेखा। जी-हटाए ब्याज का लक्ष्य मस्तिष्क संरचना में stereotaxic इंजेक्शन के बाद एक प्रतिगामी दरियाफ्त की तरह रेबीज वायरस काम करता है और न्यूरॉन्स में वितरण और EGFP की अभिव्यक्ति के लिए एक वाहन के रूप में कार्य करता है। न्यूरॉन्स के बड़ी संख्या में इस का उपयोग संक्रमित हैंतकनीक और उनके dendrites भर में व्यक्त GFP, "Golgi की तरह" व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की पूरी भरता का निर्माण किया। तदनुसार, वायरस की मध्यस्थता प्रतिगामी त्रुटि विधि पूरा intracellular भरता निर्माण करके पारंपरिक डाई आधारित प्रतिगामी ट्रेसिंग तकनीक पर सुधार।
व्यक्तिगत अच्छी तरह से पृथक अध्ययन के तहत मस्तिष्क क्षेत्र के सभी क्षेत्रों में फैले न्यूरॉन्स आदेश न्यूरॉन्स के एक प्रतिनिधि नमूने प्राप्त करने के लिए पुनर्निर्माण के लिए चुने गए हैं। प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं सेल निकायों के पुनर्निर्माण और कई ऊतक वर्गों में फैले लेबल न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान द्रुमायण पैटर्न को पूरा करने की रूपरेखा। मस्तिष्क की संरचना के भीतर प्रत्येक न्यूरॉन के पदों सहित रूपात्मक डेटा, आगे के विश्लेषण के लिए निकाले जाते हैं। मानक प्रोग्रामिंग कार्यों स्वतंत्र क्लस्टर विश्लेषण करती है और क्लस्टर रूपात्मक मैट्रिक्स के आधार पर मूल्यांकन प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया गया। इन विश्लेषण की उपयोगिता, एक क्लस्टर विश्लेषण perfo के सांख्यिकीय मूल्यांकन सत्यापित करने के लिए160 मकाक बंदर के चेतक (TRN) की thalamic जालीदार नाभिक में खंगाला न्यूरॉन्स पर rmed बनाया गया था। दोनों मूल क्लस्टर विश्लेषण और सांख्यिकीय यहां प्रदर्शन के मूल्यांकन से संकेत मिलता है कि टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स तीन उप-जनसंख्या, अद्वितीय रूपात्मक विशेषताओं के साथ प्रत्येक में अलग हो रहे हैं।
Introduction
Neuroanatomy "connectomics" में तंत्रिका विज्ञान के 1 और हाल ही में ब्याज की नींव में से एक neuronal आबादी की रूपात्मक विविधता और विशिष्ट न्यूरॉन्स 2 के बीच कनेक्शन को समझने के लिए उत्साह से नए सिरे से किया गया है। दृष्टिकोण 3, 4, 5 neuronal आबादी का अधिक व्यापक रूपात्मक सर्वेक्षणों को सक्षम करने लेबलिंग के लिए तरीके और पुनर्निर्माण न्यूरॉन्स बहुत आनुवंशिक और वायरस की मध्यस्थता सर्किट ट्रेसिंग सहित हाल ही में नवाचारों के साथ सुधार हुआ है। व्यक्तिगत न्यूरॉन्स लेबलिंग के क्षेत्र में सुधार के अलावा, मात्रात्मक डेटा विश्लेषण तकनीक भी है कि रूपात्मक डेटा 5, 6 के आधार पर अलग-अलग उप-जनसंख्या में न्यूरॉन्स की स्वतंत्र और निष्पक्ष वर्गीकरण सक्षम उभरा है। ये निष्पक्ष तकनीक अधिक traditiona पर एक सुधार कर रहे हैंएल गुणात्मक वर्गीकरण के तरीकों है कि एक सदी से भी अधिक क्षेत्र में मानक की गई है। इस अध्ययन का लक्ष्य, रूपरेखा कदम-दर-कदम पर है, एक चयनात्मक आबादी के भीतर न्यूरॉन्स के वायरस की मध्यस्थता लेबलिंग के संयोजन, इन न्यूरॉन्स की एक व्यापक नमूना है, और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण के बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण के साथ स्वतंत्र क्लस्टरिंग पर आधारित सांख्यिकीय मूल्यांकन। इन विधियों के संयोजन से, हम एक चयनात्मक न्यूरोनल आबादी के भीतर व्यापक नमूना और आकृति विज्ञान अद्वितीय neuronal प्रकार की निष्पक्ष वर्गीकरण की सुविधा के लिए संग्रह और neuroanatomical आंकड़ों के विश्लेषण की ओर एक उपन्यास दृष्टिकोण की रूपरेखा।
इन तरीकों में से एक उदाहरण के रूप में, हम मकाक बंदर की thalamic जालीदार नाभिक (TRN) के एक ही क्षेत्र के भीतर न्यूरॉन्स की एक बड़ी आबादी के हमारे विश्लेषण का वर्णन है। ये आंकड़े एक पूर्व अध्ययन 7 से हैं। चुनिंदा पृष्ठीय latera को पेश टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स लेबलिंग के लिए तरीकेचेतक (dLGN) संशोधित रेबीज वायरस EGFP 4, 8 एनकोडिंग की शल्य इंजेक्शन का उपयोग कर के एल geniculate नाभिक (विशिष्ट सामग्री / उपकरण, पंक्ति 2 की तालिका देखें) रेखांकित कर रहे हैं। इस संशोधित रेबीज वायरस जीन, एक आवश्यक कोट प्रोटीन एन्कोडिंग वायरस के पार synaptic आंदोलन को नष्ट करने का अभाव है। एक बार वायरस इंजेक्शन स्थल पर अक्षतंतु टर्मिनल में प्रवेश करती है, यह संक्रमित न्यूरॉन्स 5, 9, 10 से भरे वृक्ष के समान द्रुमायण भर EGFP अभिव्यक्ति ड्राइविंग के महत्वपूर्ण लाभ के साथ एक पारंपरिक प्रतिगामी दरियाफ्त की तरह कार्य करता है। तदनुसार, इस जी-हटाए रेबीज वायरस चुनिंदा संक्रमित हैं और इंजेक्शन और प्रतिगामी परिवहन के बाद किसी भी न्यूरोनल जनसंख्या लेबल करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।
आदेश में एक विशिष्ट neuronal आबादी का एक व्यापक विश्लेषण प्रदर्शन करने में, यह से नमूना करने के लिए महत्वपूर्ण हैआबादी के भीतर न्यूरॉन्स की एक व्यापक वितरण। क्योंकि वायरस की मध्यस्थता लेबलिंग तकनीक पूरा intracellular पैदा करता है, "Golgi की तरह" वायरस इंजेक्शन स्थल पर एक्सोन के साथ कई न्यूरॉन्स की भरता है, यह एक मस्तिष्क संरचना की पूर्ण सीमा के भीतर न्यूरॉन्स की एक बहुत बड़ी नमूना फिर से संगठित करने के लिए संभव है। इसके अतिरिक्त, क्योंकि संशोधित रेबीज वायरस से संक्रमण और न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या लेबलिंग में बहुत प्रभावी है, यह संभव प्रति पशु न्यूरॉन्स के सैकड़ों फिर से संगठित करने के लिए है। आदेश dLGN पेश टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स की एक व्यापक नमूना उत्पन्न करने में टूर्नामेंट्स 11 के दृश्य क्षेत्र भर में 160 न्यूरॉन्स नमूना लेने के लिए प्रक्रिया रेखांकित कर रहे हैं। व्यक्ति एक माइक्रोस्कोप, कैमरा, और पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर सहित एक न्यूरॉन पुनर्निर्माण प्रणाली का उपयोग कर न्यूरॉन्स के पुनर्निर्माण की प्रक्रिया में वर्णित है। इसके अलावा वर्णित (टूर्नामेंट्स के भीतर इस मामले में) एक मस्तिष्क संरचना के भीतर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की स्थिति निर्धारित करने के लिए और वायरस इंजेक्शन एसआईटी को सत्यापित करने के तरीके हैंई की मात्रा और एक संरचना (dLGN के भीतर इस मामले में) के भीतर स्थान बड़ा समोच्च पुनर्निर्माण का उपयोग कर। रूपात्मक डेटा निर्यात और स्वतंत्र क्लस्टर प्रदर्शन करने के लिए कदम पर प्रत्येक न्यूरॉन के लिए मापा रूपात्मक मेट्रिक्स रेखांकित कर रहे हैं आधारित विश्लेषण करती है। वहाँ क्लस्टरिंग तरीकों के लिए सीमाएं हैं और वहाँ भी उपलब्ध विभिन्न क्लस्टरिंग एल्गोरिदम की एक किस्म है। तदनुसार, इन विकल्पों और अधिक आमतौर पर इस्तेमाल किया एल्गोरिदम में से कुछ का लाभ वर्णित हैं। क्लस्टर विश्लेषण समूहों की विशिष्टता के सांख्यिकीय सत्यापन प्रदान नहीं करता है। इसलिए, अतिरिक्त कदम इष्टतम क्लस्टरिंग के साथ ही भीतर और समूहों भर में रूपात्मक डेटा के बीच रिश्तों को सत्यापित करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं। टूर्नामेंट्स डाटासेट के लिए समूहों का मूल्यांकन कि टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स की पुष्टि करने के लिए सांख्यिकीय तरीकों तीन अद्वितीय 10 स्वतंत्र रूपात्मक मेट्रिक्स वर्णित हैं पर आधारित समूहों में बांटा जाता है।
इस प्रकार, चुनिंदा लेबलिंग के लिए कदम रूपरेखा द्वारा, पुनर्निर्माण, और एक विशिष्ट neuronal आबादी से रूपात्मक डेटा का विश्लेषण, हम एक आबादी के भीतर न्यूरॉन्स के बीच मतभेद रूपात्मक बढ़ाता के लिए विधियों का वर्णन। मकाक बंदर टूर्नामेंट्स के दृश्य क्षेत्र के भीतर अलग neuronal प्रकार की पूर्व निष्कर्ष अलग सांख्यिकीय मूल्यांकन के तरीकों के साथ इस बात की पुष्टि कर रहे हैं। साथ में, हम आशा है कि इन तकनीकों को मोटे तौर पर neuroanatomical डेटासेट के लिए लागू हो सकता है और मस्तिष्क के माध्यम से neuronal आबादी की विविधता के मात्रात्मक वर्गीकरण स्थापित करने में मदद करेगा।
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Protocol
नोट: इस अध्ययन में जांच ऊतक एक अलग अध्ययन 5 का एक भाग के रूप में तैयार किया गया था। इसलिए, प्रायोगिक पशुओं के उपयोग से जुड़े तरीकों के सभी ब्रिग्स एट अल की प्रायोगिक तरीके खंड में विस्तार से वर्णन किया गया है। (2016)। पूर्व के अध्ययन के एक भाग के रूप में आयोजित किया जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया। 2 - dLGN में वायरस के इंजेक्शन और मस्तिष्क के ऊतकों के histological प्रसंस्करण के लिए कदम 1 वर्गों में नीचे संक्षेप में वर्णित हैं।
1. stereotaxic इंजेक्शन
- सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर एक बाँझ वातावरण में सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं का प्रदर्शन। स्टीम बाँझ सभी धातु शल्य चिकित्सा उपकरणों, आटोक्लेव में धुंध और कपड़ा सामग्री। सभी सामग्री है कि रासायनिक बंध्याकरण (जैसे एथिलीन ऑक्साइड) का उपयोग कर भाप से क्षतिग्रस्त हो सकता है जीवाणुरहित।
- प्रेरित और पशु और पी के अनुसार संज्ञाहरण बनाए रखने केrotocol-विशिष्ट आवश्यकताओं।
- बंदरों में वायरस इंजेक्शन के लिए, ketamine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ संज्ञाहरण प्रेरित और isoflurane के साथ पूर्ण शल्य चिकित्सा संज्ञाहरण के तहत पशुओं को बनाए रखने के लिए - निगरानी समाप्त हो गई है सीओ 2 (1 से 3% ऑक्सीजन में साँस), ईकेजी, श्वसन दर, और तापमान लगातार और समय समय पर जाँच जबड़े टोन के लिए उचित संवेदनाहारी गहराई सुनिश्चित करने के लिए।
- एक stereotaxic फ्रेम में पशु रखें सिर की स्थिति को स्थिर करने और stereotaxic निर्देशांक के उपयोग के हित के इंजेक्शन संरचना (जैसे dLGN) का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए। अगर दृश्य प्रतिक्रियाओं को मापने, जगह आई ड्रॉप (1% atropine आई ड्रॉप अगर छात्र फैलाव वांछित है, अन्यथा खारा आई ड्रॉप) और फिर दोनों आंखों में लेंस से संपर्क करें सूखापन को रोकने के लिए। दृश्य प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए नहीं हैं, तो आँखों में नेत्र मरहम जगह है।
- एक midline खोपड़ी चीरा और त्वचा और मांसपेशियों को वापस लेना।
- stereotaxic के अनुसार एक hemisph में ब्याज की संरचना (dLGN) के लिए निर्देशांकअरे, एक छोटे से craniotomy बनाते हैं।
- धीरे-धीरे एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (जैसे टंगस्टन या प्लैटिनम / इरीडियम इलेक्ट्रोड (विशिष्ट सामग्री / उपकरण, पंक्ति 3 की तालिका देखें) एक micromanipulator कि मैन्युअल तैनात है को clamped) मस्तिष्क में craniotomy के माध्यम से कम है। कम प्रतिबाधा (<1 MΩ) और थोड़ा मोटा (~ 250 माइक्रोन व्यास) इलेक्ट्रोड, ड्यूरा घुसना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है अगर वांछित।
- cortical सतह पर और इस मुद्दे पर जहां दृश्य प्रतिक्रियाओं को मापा जाता है पर जोड़तोड़ की स्थिति रिकॉर्ड। विजुअल प्रतिक्रियाएं सुनाई देती हैं, समय बंद प्रकाश में न्यूरोनल प्रतिक्रियाएं एक नेत्रदर्शक या छोटे एलईडी / टॉर्च के साथ आंखों में लगीं।
- शुरुआत, मध्य, और दृश्य प्रतिक्रियाओं के अंत में जोड़तोड़ पदों पर ध्यान देने योग्य बात है और इन मूल्यों से cortical सतह स्थिति को घटाकर स्थान और dLGN की मोटाई निर्धारित करते हैं। dLGN के भीतर प्रत्येक के लिए बनाया गया इंजेक्शन साइट के लिए गहराई रिकॉर्ड।
नोट: इसी procedures उचित संवेदी उत्तेजनाओं का उपयोग करके गैर दृश्य संरचनाओं लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, मिलकर रिकॉर्डिंग / इंजेक्शन सिस्टम भी छोटे मस्तिष्क संरचना को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - एक बार इष्टतम इंजेक्शन स्थानों का उल्लेख किया जाता है, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (कांच पिपेट या इंजेक्शन सिरिंज) एक ही stereotaxic स्थिति और कम कीमत पर उचित गहराई तक प्रत्येक इंजेक्शन के लिए हटाने और एक इंजेक्शन पिपेट जगह है, गहरी इंजेक्शन साइट के साथ शुरू करने और shallowest को आगे बढ़ने से, इलेक्ट्रोड की स्थिति बदलने से पहले इंजेक्शन लगाने के बाद कम से कम 1 मिनट इंतज़ार कर रहे। 50 माइक्रोन की ~ बाहरी व्यास के साथ कांच pipettes सिरिंज टिप्स (~ 200 माइक्रोन व्यास) की तुलना में वायरस की backflow कम कर सकते हैं।
- एक इंजेक्शन प्रणाली का उपयोग करना (विशिष्ट सामग्री की तालिका देखें / EQUIPMEN टी, पंक्ति 4), Picospritzer, या सिरिंज पंप, छोटी मात्रा इंजेक्षन (1 - 5 μL; इंजेक्शन प्रक्रियाओं के लिए निर्माता के निर्देशों को देखें) संशोधित रेबीज वायरस के कई (3 ओवर - 10) गहराईलक्ष्य संरचना (dLGN) के भीतर ~ 100 nl / मिनट की दर से। नोट: अलग-अलग इंजेक्शन पेनेट्रेशन बड़ा लक्ष्य ढांचे में बनाया जा सकता है (जैसे बंदर dLGN)। लक्ष्य संरचना आकार के अनुसार कुल इंजेक्शन की मात्रा समायोजित करें।
- इंजेक्शन पिपेट retracting से पहले कम से कम 5 मिनट रोकें। जब इंजेक्शन पिपेट हटा दिया जाता है, (जगह में गोंद हड्डी टुकड़ा हड्डी मोम या gelfoam लागू) सुरक्षात्मक सामग्री के साथ craniotomy भरने, तो मांसपेशियों और त्वचा सीवन वापस एक साथ।
- दर्दनाशक दवाओं प्रशासन (जैसे ketoprofen) और एंटीबायोटिक दवाओं सर्जरी के अंत से पहले और लगातार पशु की निगरानी जब तक पशु चल रहा है।
- कम से कम 3 दिनों के लिए और सर्जरी के बाद 10 दिनों के लिए, दैनिक जानवर की निगरानी सुनिश्चित करने के लिए टांके साफ, सूखे, और बरकरार हैं और जानवर दर्द या बेचैनी का कोई संकेत नहीं दिखाता है। दैनिक दर्दनाशक दवाओं और एंटीबायोटिक दवाओं के प्रशासन के रूप में की आवश्यकता है। शल्य चिकित्सा के बाद जानवर की सामाजिक आवास शुरू होने के बाद जानवर पूरी तरह से सर्जरी से बरामद किया है। </ राजभाषा>
- अनुमति दें 7 - 14 दिन वायरस की प्रतिगामी परिवहन के लिए है, तो पशु इच्छामृत्यु समाधान (जैसे Euthasol) की अधिक मात्रा से transcardially 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा, 4% paraformaldehyde, तो 10% sucrose के साथ 4% paraformaldehyde के साथ euthanize और पशु छिड़कना।
- 2 दिन - 1 के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 4% paraformaldehyde और शीतल के साथ 30% sucrose - मस्तिष्क (एक कृंतक मॉडल में अनुरूप चरणों के लिए 12 देखें) और 20 में जगह निकालें।
- मस्तिष्क कंटेनर के नीचे डूब गया है, इसे हटाने और प्रतिगमनपूर्वक लेबल न्यूरॉन्स के साथ मस्तिष्क क्षेत्र से युक्त ब्लॉकों में ऊतक (जैसे दृश्य कोर्टेक्स) और इंजेक्शन लक्ष्य संरचना (जैसे dLGN) काटा। कट गैर इंजेक्शन गोलार्द्ध से ऊतक के एक ही ब्लॉक - इन नियंत्रण वर्गों के रूप में काम करेगा। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, शुरू ऊतकीय प्रक्रियाओं immediatelहौसले से sectioned ऊतक पर वाई।
- एक ठंड microtome का उपयोग कर खंड के अनुसार 50 माइक्रोन की मोटाई पर धारा ऊतक coronally (विशिष्ट सामग्री / उपकरण, पंक्ति 5 की तालिका देखें)।
- Cortical परतों और subcortical संरचनाओं 13 कल्पना करने के लिए - साइटोक्रोम oxidase गतिविधि के लिए सभी वर्गों के दाग (8 विशिष्ट सामग्री / उपकरण, पंक्तियों 5 की तालिका देखें)। नोट: धारा साइटोक्रोम oxidase दाग निम्नलिखित अंतिम कुल्ला में एक रेफ्रिजरेटर में रात भर रखा जा सकता है।
- GFP के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सभी वर्गों के लेबल (1: 1,000 कमजोर पड़ने, ~ 12 घंटे ऊष्मायन, विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें, पंक्ति 9) प्राथमिक मेजबान मिलान एक माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया और बायोटिन 5 के साथ टैग (1: 500 कमजोर पड़ने 2 - 4 h ऊष्मायन, विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें, पंक्ति 10)। यह माध्यमिक एंटीबॉडी रात भर में वर्गों सेते की सिफारिश की है।
- एक avidin / बायोटिन परिसर के साथ लेबल वर्गों तो थपका और पेरोक्साइड के साथ प्रतिक्रिया स्थायी रूप से सभी लेबल न्यूरॉन्स 5 दाग।
- subbed गिलास स्लाइड पर वर्गों माउंट और सूखी रात भर करते हैं।
- शराब और xylene की एक श्रृंखला का उपयोग कर rinses तो Defat वर्गों पर्ची 14 को कवर किया।
- खुर्दबीन स्लाइड धारक में एक स्लाइड प्लेस और एक कम बढ़ाई उद्देश्य (जैसे 2X या 10X) का उपयोग कर ब्याज की एक एकल खंड पर ध्यान केंद्रित। सुनिश्चित करें कि कैमरा छवि ठीक स्थिति कैमरा शटर द्वारा सॉफ्टवेयर दृश्य में दिखाई दे रहा है बनाओ।
- ब्याज (जैसे TRN) कि काफी अलग कर रहे हैं के रूप में तो असंदिग्ध रूप से संभव के रूप में वृक्ष के समान द्रुमायण के रूप में ज्यादा के फिर से संगठित करने के मस्तिष्क की संरचना के भीतर लेबल न्यूरॉन्स चुनें। रियायत के न्यूरॉन्स चाहें तो सेल शरीर के क्रम में प्रत्येक कोशिका के शरीर का सबसे बड़ा हद तक कब्जा है और इसे सही अपने क्षेत्र और गोलाई अनुमान लगाने के लिए एक एकल खंड के भीतर पूरी तरह से है। सेल ख की पहचान करने के लिए 10X खुर्दबीन के उद्देश्य का उपयोग करेंघर धारा में ody।
- एक बार एक अच्छी तरह से सना हुआ, अच्छी तरह से अलग-थलग न्यूरॉन की पहचान की है, "नई धारा" बटन पर क्लिक करके धारा प्रबंधक सेल शरीर युक्त "घर" अनुभाग जोड़ें। शामिल करने के लिए वर्गों की संख्या दर्ज करें (- 3 वर्गों शुरू करने के लिए 2 सिफारिश)। 50 माइक्रोन मोटाई के एक वर्ग निरुपित जब प्रेरित (2.3 कदम देखें)।
- सेल शरीर युक्त घर धारा में प्रासंगिक मस्तिष्क संरचना की आकृति का पता लगा। समोच्च ट्रेसिंग के लिए 2x उद्देश्य / बढ़ाई प्रयोग करें।
- सबसे पहले, शीर्ष उपकरण पट्टी पर ड्रॉप-डाउन मेनू से "कंटूर" का चयन करें और फिर ड्रॉप-डाउन मेनू (उदाहरण के लिए "LGN" या "टूर्नामेंट्स") से समोच्च प्रकार का चयन करें।
- लक्ष्य संरचना (जैसे TRN) के साथ ही आसन्न संरचनाओं की आकृति का पता लगाने, अगर समोच्च एक ड्रॉ के उपकरण के रूप में माउस का उपयोग के साथ अंक पर क्लिक करके, वांछित।
- चयन माउस को राइट-क्लिक करें और इस विकल्प का चयन करके "बंद कंटूर"मेनू से पूरा करने और प्रत्येक पता लगाया समोच्च लगा देना।
- सही उपकरण पट्टी पर वांछित मार्कर प्रतीक पर क्लिक करें और फिर उस स्थान पर मार्कर जगह करने के पुनर्निर्माण में इच्छित स्थान पर क्लिक करके लक्ष्य संरचना के केंद्र में एक मार्कर रखें। सभी पुनर्निर्माण में लक्ष्य संरचना के केंद्र चिह्नित करने के लिए मार्कर का एक ही प्रकार का प्रयोग करें।
- 60X उद्देश्यों / बढ़ाई - एक बार की आकृति पूरी हो चुकी है, 40 का उपयोग करते हुए सेल शरीर की रूपरेखा का पता लगाने। ऐसा करने के लिए, पहली बार शीर्ष उपकरण पट्टी पर ड्रॉप-डाउन मेनू से "न्यूरॉन" का चयन करें और फिर पता लगाने के लिए इस मामले में "सेल शरीर" में, न्यूरॉन संरचना का चयन करें। अगली 3.4 में के रूप में सेल शरीर का पता लगा।
- सेल शरीर के केंद्र में एक अलग शैली मार्कर प्लेस, 3.5 में उल्लिखित चरणों का पालन।
- सेल शरीर में शुरुआत सभी डेन्ड्राइट ट्रेस।
- सबसे पहले, ड्रॉप-डाउन मेनू से "डेन्ड्राइट" का चयन करें। फिर प्रत्येक डेन्ड्राइट सेल बीओडी पर शुरू ट्रेसY और एक ड्रॉ के उपकरण के रूप में माउस का उपयोग। ट्रेसिंग भर Z गहराई से समायोजित करने के लिए सही कोण और डेन्ड्राइट की दिशा पर कब्जा करने के लिए सुनिश्चित करें।
- माउस को राइट-क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से "विभाजित नोड" या "Trifurcating नोड" का चयन करके डेन्ड्राइट साथ प्रत्येक शाखा बिंदु पर एक नोड रखें। सभी डेन्ड्राइट पुनर्निर्माण के लिए 60x उद्देश्य / बढ़ाई - 40 का प्रयोग करें।
- प्रत्येक डेन्ड्राइट के अंत में, माउस को राइट-क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से "समाप्त"।
- वृक्ष के समान अंत है कि आसन्न खंड में जारी है और माइक्रोस्कोप छवि में उचित Z गहराई पर ध्यान केंद्रित करने में इन लाने की संभावना है पहचानें। जैसे रक्त वाहिकाओं या आसानी से पहचानने डेन्ड्राइट पैटर्न या माइक्रोस्कोप छवि में बंडलों के रूप में पास प्रमुख स्थलों को शामिल करें।
- माइक्रोस्कोप पर 20X या 10X के लिए बढ़ाई कम (बढ़ाई है कि सबसे बड़ा मील का पत्थर दृश्य की अनुमति देता का चयन), और लेएक डिजिटल कैमरे का उपयोग माइक्रोस्कोप छवि का एक चित्र (जैसे सेल फोन, टैबलेट) कंप्यूटर स्क्रीन करने के लिए हाथ से आयोजित की।
- स्लाइड पर आसन्न अनुभाग में ले जाएँ और नई धारा में dLGN और टूर्नामेंट्स की सीमाओं के साथ पहले से पता लगाया खंड की आकृति अप लाइन।
- सेल शरीर (आकृति और प्रमुख स्थलों के आधार पर) के सामान्य क्षेत्र को देखने के क्षेत्र लौटें और बढ़ाई वापस 10 के लिए ला - 20X।
- नई धारा में dendrites की शुरुआत के साथ अंत संरेखित में सहायता करने के लिए पहले से पता लगाया अनुभाग से डेन्ड्राइट अंत की फोटो का प्रयोग करें।
- ट्रेसिंग और बारी बारी से यह कदम डेन्ड्राइट के लिए पंक्ति में, पुनर्निर्माण का चयन करने के लिए तीर उपकरण का उपयोग करने के लिए, राइट क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से "हटो" का चयन करें।
- वैकल्पिक रूप से, शुरुआत करने के लिए वृक्ष के समान अंत मैच के लिए "मैच" उपकरण का उपयोग करें। शीर्ष टूलबार से मैच उपकरण का चयन करें और जब संकेत दिया है, समाप्त होने पर क्लिक करेंपुनर्निर्माण और छवि में इसी निरंतरता बिंदु में। 3 या उससे अधिक के अंत के लिए दोहराएँ।
- एक बार जब पिछले अनुभाग से ट्रेसिंग नई धारा में डेन्ड्राइट के साथ लाइन में खड़ा है, यकीन है कि इसी नई धारा वर्तमान अनुभाग पर क्लिक करके अनुभाग प्रबंधक में चयनित है। या, के रूप में 3.3 में ऊपर वर्णित है, उसके अनुसार घर के अनुभाग के लिए प्रत्येक नई धारा रिश्तेदार Z गहराई और स्थिति का समायोजन और 50 मिमी (2.3 कदम देखें) करने के लिए प्रत्येक अनुभाग मोटाई की स्थापना, धारा प्रबंधक के लिए एक नया अनुभाग जोड़ें।
- 40 बढ़ाई बढ़ाएँ - 60X और पुनर्निर्माण से डेन्ड्राइट के अंत पर माउस को राइट-क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से चयन "समाप्त करने के लिए जोड़ें", तो डेन्ड्राइट एक के रूप में माउस का उपयोग कर अनुरेखण द्वारा डेन्ड्राइट निरंतरता का पता लगा उपकरण आकर्षित। यदि निरंतरता नई धारा में है निर्दिष्ट करने के लिए शीघ्र पालन करें।
- के प्रत्येक पक्ष पर कम से कम 3 आसन्न वर्गों के माध्यम से डेन्ड्राइट का पालन करें (एकघर अनुभाग) निम्नलिखित कदम 3.8 - 3.15। जब तक कम से कम 3 कुल वर्गों न्यूरॉन के लिए या जब तक डेन्ड्राइट नहीं रह पीछा किया या पाया जा सकता है पता लगाया जाता है पुनर्निर्माण में जोड़े। उपरोक्त चरणों का पालन, अगर वांछित पड़ोसी वर्गों में आकृति ट्रेस।
- एक ext का उपयोग करते हुए प्रत्येक व्यक्ति न्यूरोनल पुनर्निर्माण से रूपात्मक डेटा निकालेंraction न्यूरॉन पुनर्निर्माण प्रणाली के साथ जुड़े कार्यक्रम (- 12 विशिष्ट सामग्री / उपकरण, पंक्तियों 11 की तालिका देखें)।
- समोच्च जानकारी, मार्कर जानकारी, सेल शरीर और वृक्ष के समान द्रुमायण, आदि की रूपात्मक डेटा: सबसे पहले, सहित प्रत्येक पुनर्निर्माण के लिए वांछित रूपात्मक डेटा चुनें।
- शीर्ष उपकरण पट्टी में संपादित करें ड्रॉप-डाउन मेनू से, "सभी वस्तुओं का चयन करें" का चयन करें। फिर शीर्ष उपकरण पट्टी में विश्लेषण ड्रॉप-डाउन मेनू से "शाखित संरचना विश्लेषण" का चयन करें और प्रत्येक टैब पर क्लिक करें और प्रत्येक टैब में वांछित विश्लेषण विकल्प का चयन करें।
- विश्लेषण विंडो में "ठीक" बटन पर क्लिक करके सभी वांछित डेटा निकालने और उत्पादन खिड़कियां और 'एक्सेल में निर्यात "के चयन पर राइट क्लिक करके एक स्प्रेडशीट प्रारूप में बचाने के लिए।
- एक मास्टर स्प्रेडशीट संकलित (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें, 16 पंक्ति) जिसमें प्रत्येक रूपात्मक चर / मुझेtric न्यूरॉन प्रति एक संख्यात्मक अवलोकन का प्रतिनिधित्व करती है। इस मास्टर स्प्रेडशीट में, प्रत्येक न्यूरॉन के लिए पंक्ति पहचानकर्ता के रिकार्ड रखना।
- सत्यापित करें कि सभी चर क्लस्टर विश्लेषण में शामिल (जैसे रूपात्मक मैट्रिक्स) एक दूसरे से स्वतंत्र हैं। उदाहरण के लिए, नोड्स की संख्या एक वृक्ष के समान या axonal द्रुमायण में शाखाओं की संख्या के साथ संबंध स्थापित करेंगे। तदनुसार, इन दो चर का केवल एक एक क्लस्टर विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए।
- यानी हर न्यूरॉन (माप) सुनिश्चित करें कि प्रत्येक माप हर चर के लिए एक अवलोकन शामिल करना, एक डाटा-बिंदु (अवलोकन) प्रत्येक रूपात्मक मीट्रिक (चर) के लिए इसी होनी चाहिए। एक विशेष चर (उदाहरण के लिए, अक्षतंतु लंबाई) के लिए टिप्पणियों न्यूरॉन्स की एक सबसेट के लिए कमी कर रहे हैं, तो इस चर (अक्षतंतु लंबाई) क्लस्टर विश्लेषण में शामिल नहीं किया जा सकता।
- एक मैट्रिक्स जिसमें प्रत्येक पंक्ति एक न्यूरॉन और पूर्वी वायु कमान का प्रतिनिधित्व करता है में मास्टर स्प्रेडशीट पर डेटा को व्यवस्थित करेंज स्तंभ प्रत्येक रूपात्मक मीट्रिक (चित्रा 1) के लिए संख्यात्मक डेटा शामिल हैं। उदाहरण के लिए, 100 न्यूरॉन्स सहित एक डाटासेट जिसके लिए वहाँ 5 स्वतंत्र चर के लिए टिप्पणियों एक 100 x 5 (पंक्ति-से-स्तंभ) मैट्रिक्स द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाएगा रहे हैं। पंक्ति सूचकांक प्रत्येक न्यूरॉन के अद्वितीय पहचानकर्ता के रूप में काम करेगा - यह मैट्रिक्स के भीतर प्रत्येक न्यूरॉन के लिए किसी भी पहचान शामिल करने के लिए आवश्यक नहीं है। वहाँ भी कोई अंतराल या मैट्रिक्स में "नेन" s होना चाहिए। एक एकल चर के रूप में मैट्रिक्स सहेजें (जैसे data = [100 x 5 मैट्रिक्स]; देख पूरक संहिता नमूना कोड के लिए फ़ाइल)।
- एक एन आयामी अंतरिक्ष जहां n चर की संख्या से परिभाषित किया गया है में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व अंक के बीच दूरी की गणना करने के लिए एक एल्गोरिथ्म चुनें। 'Pdist' समारोह के बीच न्यूरॉन दूरी की गणना में लचीलापन सक्षम बनाता है। डिफ़ॉल्ट दूरी गणना इयूक्लिडियन दूरी है और neuronal morphologica के इसी तरह के विश्लेषण के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया हैएल डेटा 5, 6।
- साथ बीच-न्यूरॉन 'pdist' समारोह के उत्पादन में दूरियां समूहों के रूप में करने के लिए 'कड़ी' समारोह का उपयोग करें। फिर, कई क्लस्टरिंग विकल्प उपलब्ध हैं। वार्ड की विधि और केन्द्रक दूरी रूपात्मक डेटासेट 5, 6 के विश्लेषण में इसी तरह के परिणाम सामने आए हैं।
- अगर वांछित, 'pdist' और 'संबंध' कार्य करने के लिए एक विकल्प के रूप में क्लस्टरिंग दृष्टिकोण 'kmeans' समारोह का उपयोग करें। 'Kmeans' समूहों को आवंटित करने के केन्द्रक दूरी के बीच न्यूरॉन दूरी की गणना करने के लिए और फिर इयूक्लिडियन दूरी चुकता रोजगार।
- एक श्रेणीबद्ध क्लस्टर पेड़ कल्पना, 'संबंध' आपरेशन के उत्पादन पर 'dendrogram' समारोह का उपयोग करें। इस समारोह में एक डिफ़ॉल्ट सेटिंग है कि 30 माप के लिए दृश्य सीमा होती है, लेकिन यह माप की संख्या (<निर्दिष्ट द्वारा अधिरोहित जा सकता हैउन्हें> जैसे न्यूरॉन्स) का प्रदर्शन किया। dendrogram न्यूरॉन्स के प्रत्येक, एक्स-अक्ष पर उनकी पंक्ति सूचकांक द्वारा की पहचान के लिए y अक्ष पर कड़ी दूरियों को दिखाता है।
नोट: 'लिंकेज' और 'dendrogram' के आउटपुट समूहों की अधिकतम संख्या निर्धारित नहीं है। 'Kmeans' का उत्पादन करने के लिए समूहों माप आवंटित करता है, लेकिन यह परीक्षण नहीं पड़ता कि इन समूहों इष्टतम है। अलग सांख्यिकीय तुलना इष्टतम क्लस्टरिंग का सत्यापन किया जा सकता है (देखें नीचे)। - विधि 1: का मूल्यांकन क्लस्टरिंग:
- 'Evalclusters' समारोह जैसे 'kmeans' या 'संबंध' के रूप में समूहों, की गणना के लिए इस्तेमाल किया विधि निर्दिष्ट करने के लिए उपयोग करें। एक गाऊसी मिश्रण मॉडल उत्पादन भी मूल्यांकन किया जा सकता है (नीचे चरण 5.2 देखते हैं, वहाँ से पूरक संहिता नमूना कोड के लिए फ़ाइल)।
- (- "Evalclusters" के लिए खोज, कसौटी विकल्पों में से विवरण के लिए, मदद मेनू का उल्लेख करने जैसे 'CalinskiHarabasz') विकल्पों में से एक नंबर से मूल्यांकन कसौटी निर्दिष्ट करें।
- इष्टतम क्लस्टर नंबर की एक सीमा निर्दिष्ट परीक्षण करने के लिए (जैसे [1: 6] परीक्षण करने के लिए 1, 2, 3, 4, 5, 6 या समूहों इष्टतम रहे हैं कि क्या)।
नोट: 'evalclusters' के उत्पादन में क्लस्टरिंग एल्गोरिथ्म और कसौटी निर्दिष्ट दिया समूहों की एक इष्टतम संख्या है।
- विधि 2: गाऊसी मिश्रण मॉडल क्लस्टरिंग:
नोट: गाऊसी मिश्रण मॉडल क्लस्टरिंग algorithms (GMMs) मानते हैं कि प्रत्येक चर के लिए टिप्पणियों प्रत्येक ख्यात क्लस्टर, अपने स्वयं के मतलब और सहप्रसरण के साथ प्रत्येक को परिभाषित गाऊसी वितरण का एक मिश्रण से आते हैं। जीएमएम फिर, प्रत्येक माप के लिए पीछे संभावनाओं आवंटित करने के लिए एक विशेष क्लस्टर 16 से संबंधित की संभावना का संकेत है एक उम्मीद अधिकतम एल्गोरिथ्म का उपयोग करता है।- एक जीएमएम डेटा में नमूदार समूहों के ख्यात नंबर inputting द्वारा 'fitgmdist' समारोह का उपयोग कर लागू करें। वैकल्पिक रूप से, समूहों की संख्या की एक प्राथमिकताओं काम से बचने के लिए, विभिन्न इष्टतम क्लस्टर कदम यहाँ उल्लिखित का उपयोग कर नंबर की एक श्रृंखला के साथ प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग करें (देखें पूरक संहिता नमूना कोड के लिए फ़ाइल)।
- मूल डाटा मैट्रिक्स पर 'पीसीए' समारोह का उपयोग करें और एक उत्पाद के रूप प्रमुख घटक स्कोर बचाने के लिए।
- एक पाश 1 में शुरू करने और ख्यात इष्टतम समूहों के कुछ नंबर के माध्यम से जाने में, ध का उपयोग करेंप्रमुख घटक स्कोर पर ई 'fitgmdist' समारोह और ख्यात इष्टतम समूहों के प्रत्येक संख्या के लिए GMMs उत्पन्न करते हैं।
- नकारात्मक लॉग संभावना, Akaike जानकारी कसौटी, और Bayes जानकारी कसौटी का परीक्षण करके प्रत्येक जीएमएम का मूल्यांकन। सबसे कम मापदंड के साथ जीएमएम इष्टतम है।
- अगर वांछित, परीक्षण है कि प्रत्येक क्लस्टर के लिए मतलब मूल्यों काफी अलग हैं जब समूहों की संख्या इष्टतम है (प्रत्येक क्लस्टर के साधन के प्रत्येक जीएमएम की "म्यू" उत्पादन में जमा हो जाती है)।
- एक बार समूहों का इष्टतम संख्या श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग का उपयोग निर्धारित और मूल्यांकन किया है, मूल डेटा, समूहों में अलग न्यूरॉन्स के लिए लौटने के लिए, और कौन कौन से रूपात्मक मैट्रिक्स अद्वितीय वर्गों में न्यूरॉन्स की क्लस्टरिंग के लिए योगदान करते हैं।
- मूल रूपात्मक मीट्रिक डेटा ऐसी है कि न्यूरॉन्स क्लस्टर काम के हिसाब से बांटा जाता है के आधार पर क्रमबद्ध। न्यूरॉन्स के पार (सभी न्यूरॉन्स के लिए या समूहों में विभाजित न्यूरॉन्स के लिए) रूपात्मक डेटा के बीच संबंधों की जांच करने के लिए, प्रदर्शन रेखीय प्रतिगमन 2- करने के लिए और 3 तरह रूपात्मक मीट्रिक टिप्पणियों की तुलना फिट बैठता है। इन फिट बैठता है 'फिट' समारोह का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है और 'fitlm' समारोह में जो फिट आउटपुट की अच्छाई प्रतिगमन फिट बैठता आर 2 और पी मान शामिल का उपयोग कर मूल्यांकन।
- प्रत्येक क्लस्टर में न्यूरॉन्स के बीच सांख्यिकीय संबंधों की जांच करने के लिए, गैर पैरामीट्रिक दो नमूने (Wilcoxon रैंक राशि परीक्षण) या एकाधिक नमूना तुलना परीक्षण (एनोवा), समूहों की संख्या पर निर्भर करता है का उपयोग करें। महत्वपूर्ण बात है, कई नमूना ANOVAs का उपयोग सुनिश्चित करता है कि पी मूल्यों कई तुलना के लिए सही कर रहे हैं।
2. ऊतक कटाई, सेक्शनिंग, और धुंधला
3. Neuronal पुनर्निर्माण
नोट: मूल प्रयोगों के लिए सभी पुनर्निर्माण एक न्यूरॉन पुनर्निर्माण एक माइक्रोस्कोप से बना सिस्टम का उपयोग किया गया (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें, पंक्ति 14), संलग्न कैमरा (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें, पंक्ति 13), और पुनर्निर्माण सॉफ्टवेयर पैकेज (- 12 विशिष्ट सामग्री / उपकरण, पंक्तियों 11 की तालिका देखें)। सॉफ्टवेयर की मदद से न्यूरोनल पुनर्निर्माण neuronal प्रक्रियाओं के कंप्यूटर आधारित चित्र के साथ मढ़ा ऊतक स्लाइड्स के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है। महत्वपूर्ण बात है, सॉफ्टवेयर रूपात्मक reconstruc digitizesतीन आयामों में tion डेटा, स्थिति विशेष रूपात्मक जानकारी के सक्रिय करने के निष्कर्षण। संबंधित डेटा निष्कर्षण कार्यक्रम (विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका देखें, पंक्ति 12) प्रत्येक बचाया पुनर्निर्माण से रूपात्मक डेटा के एक अमीर सेट की निकासी के लिए सक्षम बनाता है।
4. स्वतंत्र क्लस्टरिंग
नोट: स्वतंत्र क्लस्टर, बड़े, बहु-आयामी डेटासेट कि अन्यथा कल्पना करने के लिए और महत्वपूर्ण बात के लिए मुश्किल हो सकता है की निष्पक्ष विश्लेषण सक्षम रूपात्मक विविधता का एक मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान विश्लेषण करती है। एक मैट्रिक्स आधारित प्रोग्रामिंग मंच बहु आयामी डेटासेट के विश्लेषण के लिए काफी उपयोगी है और परिष्कृत डेटा जोड़तोड़ और सांख्यिकीय विश्लेषण सक्षम बनाता है। चरण 4 में सूचीबद्ध कार्यों - 6 विशिष्ट सामग्री / उपकरण की तालिका में सूचीबद्ध प्रोग्रामिंग मंच में परिभाषित कर रहे हैं, पंक्ति 15।
5. क्लस्टरिंग का सत्यापन
नोट: जैसा कि ऊपर कहा गया है, क्लस्टर विश्लेषण ही सीधे चाहे समूहों क्लस्टर dendrogram में सचित्र अनूठा और नमूना के प्रतिनिधि हैं एक सांख्यिकीय मूल्यांकन प्रदान नहीं करता है। Dendrogram से समूहों की पुष्टि करने के लिए तरीके 15 प्रस्ताव किया गया है, लेकिन इन इष्टतम क्लस्टरिंग के सांख्यिकीय सत्यापन प्रदान नहीं करते। वहाँ बहु हैंइष्टतम क्लस्टरिंग पुष्टि करने के लिए मिसाल तरीकों।
6. संकुल डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण
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Representative Results
हम पहले से पता चला है एक चयनात्मक आबादी के भीतर न्यूरॉन्स की बड़े पैमाने पर पुनर्निर्माण dLGN 5 में संशोधित रेबीज वायरस के संभव निम्नलिखित इंजेक्शन है। हाल ही में, एक ही ऊतक टूर्नामेंट्स के दृश्य क्षेत्र में 160 न्यूरॉन्स को फिर से संगठित करने के लिए (समीक्षा में ब्रैग एट अल।, चित्रा 2A बी) का उपयोग किया था कि ऊपर वर्णित विस्तृत पद्धति चरणों का पालन। टूर्नामेंट्स अध्ययन में, टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स की तीन अद्वितीय समूहों 10 रूपात्मक मैट्रिक्स की स्वतंत्र क्लस्टर विश्लेषण के आधार पर पहचान की गई: सेल शरीर क्षेत्र, सेल शरीर गोलाई, टूर्नामेंट्स के भीतर टूर्नामेंट्स, पृष्ठीय उदर स्थिति के केंद्र के लिए औसत दर्जे का पार्श्व सापेक्ष स्थिति वृक्ष के समान पेड़, नोड्स के लिए औसत वृक्ष के समान दूरी, 3 की औसत लंबाई और उच्च आदेश डेन्ड्राइट, 1 सेंट आदेश dendrites की औसत कोण, कुल वृक्ष के समान द्रुमायण की औसत चरण कोण, और करने की कोणीय विचलन की संख्याताल वृक्ष के समान द्रुमायण। टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स यों इन तीन समूहों (चित्रा 2 सी) के पार वितरित किए गए। तीन समूहों में न्यूरॉन्स भर में सभी 10 रूपात्मक मैट्रिक्स के अलग सांख्यिकीय तुलना के लिए, लेकिन सभी मूल क्लस्टर विश्लेषण में शामिल रूपात्मक मैट्रिक्स के दो समूहों के पार सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मतभेद सामने आए। इस प्रकार, क्लस्टर विश्लेषण (चित्रा -2) और समूहों भर में रूपात्मक मैट्रिक्स की अलग सांख्यिकीय तुलना से उत्पन्न श्रेणीबद्ध पेड़ dendrogram पर आधारित है, टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स तीन अद्वितीय समूहों में वर्गीकृत किया जाता है।
इस अध्ययन में, हम विशेष रूप से सांख्यिकीय तरीकों के लिए अलग से एक क्लस्टर विश्लेषण के साथ निर्धारित समूहों का मूल्यांकन करने के लिए लागू करना चाहते थे। पूर्व अध्ययन से टूर्नामेंट्स डाटासेट लिए तय है कि तीन समूहों मनाया इष्टतम थे मूल्यांकन किया गया था। अलग अतिरिक्त क्लस्टर का विश्लेषण करती है, अर्थात् पीसीए और जीएमएम clusTERING, पूर्व क्लस्टरिंग तरीकों (चित्रा 1) सत्यापित करने के लिए प्रदर्शन किया गया। तीन प्रमुख परिणामों अलग से पहले क्लस्टर विश्लेषण की पुष्टि करें। सबसे पहले, जब मूल क्लस्टर विश्लेषण विधि समूहों उत्पन्न करने के लिए 'evalclusters' समारोह 'संबंध' समारोह को निर्दिष्ट का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था, समूहों का इष्टतम संख्या 3 था, श्रेणीबद्ध पेड़ dendrogram (चित्रा 2 सी) के आधार पर मूल निष्कर्ष मिलान। दूसरे, पीसीए रूपात्मक मैट्रिक्स के योगदान के आधार पर न्यूरॉन्स समूहीकरण का एक वैकल्पिक साधन के रूप में 160 टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स के लिए 10 रूपात्मक मेट्रिक्स का मूल डाटा मैट्रिक्स पर प्रदर्शन किया गया था। तीन GMMs उत्पन्न किया गया, यह सोचते हैं टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स 1, 2, या 3 अद्वितीय समूहों में बांटा गया था। नकारात्मक लॉग संभावना (NLL) और Akaike जानकारी कसौटी (एआईसी) सबसे कम सामने आए हैं, और इसलिए सबसे जानकारीपूर्ण, मूल्यों और जब जीएमएम 3 समूहों इस्तेमाल किया टूर्नामेंट्स रूपात्मक डेटा (वर्णन करने के लिए Figur दोनों मूल्यों इष्टतम थेई 3)। तीसरा, जीएमएम आधारित क्लस्टरिंग अलग से 'evalclusters' समारोह और समूहों का इष्टतम संख्या का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था 3. इस प्रकार श्रेणीबद्ध पेड़ dendrogram की टिप्पणियों, तीन समूहों, पीसीए और GMM- में विभाजित न्यूरॉन्स भर में रूपात्मक मैट्रिक्स की सांख्यिकीय तुलना आधारित क्लस्टरिंग, और प्रत्येक क्लस्टरिंग विधि (लिंकेज और जीएमएम) के अलग-अलग मूल्यांकन, सभी झुकेंगे ही परिणाम है कि टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स बेहतर 10 रूपात्मक उपयोग किया मैट्रिक्स के आधार पर 3 समूहों में विभाजित हैं।
चित्रा 1: डेटा स्वरूप। न्यूरॉन्स और एम = 5 कॉलम स्वतंत्र चर की कुल संख्या के लिए इसी क्लस्टर विश्लेषण में शामिल करने के लिए की संख्या के लिए इसी n पंक्तियों के साथ उदाहरण डेटा मैट्रिक्स (डाटा मैट्रिक्स में हेडर शामिल नहीं है)।
चित्रा 2: 160 टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स की स्वतंत्र क्लस्टरिंग। ए छोड़ दिया, एक जानवर की dLGN के माध्यम से एकल राज्याभिषेक अनुभाग के फोटोग्राफ, साइटोक्रोम oxidase गतिविधि के लिए दाग dLGN परतों कल्पना करने के लिए और GFP के खिलाफ वायरस इंजेक्शन कल्पना करने के लिए। तीर घने प्रतिगमनपूर्वक लेबल टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स के क्षेत्रों इंगित करता है। धारा उन्मुखीकरण नीचे पृष्ठीय उदर / औसत दर्जे का पार्श्व (डीवी / एमएल) कम्पास इस प्रकार है और बड़े पैमाने बार में सभी पैनलों के लिए 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। बाएं से दूसरा, समोच्च वायरस इंजेक्शन (काला आकृति) युक्त सभी वर्गों के लिए dLGN (लाल) और टूर्नामेंट्स (लाल रंग) की रूपरेखा। पीले रंग सितारों इंजेक्शन साइट केन्द्रों का संकेत मिलता है। अभिविन्यास और पैमाने पर एक के रूप में सलाखों के। छोड़ दिया, आकृति और इंजेक्शन स्थल, अभिविन्यास और बड़े पैमाने सलाखों के एक के रूप में की 3-डी renderings से तीसरा। ठीक है, जगहों के नक्शे खंगाला की टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स, कलर-कोडेड क्लस्टर असाइनमेंट (सी) के लिए एक एकल कुल टूर्नामेंट्स समोच्च (लाल रंग) के भीतर के अनुसार। अभिविन्यास और पैमाने पर एक के रूप में सलाखों के। बी। 5 खंगाला टूर्नामेंट्स टूर्नामेंट्स के भीतर उनकी औसत दर्जे का पार्श्व स्थिति के अनुसार शांत करने के लिए गर्म रंग का न्यूरॉन्स के साथ टूर्नामेंट्स (काला) और dLGN (ग्रे) की वाम, कुल आकृति। ए में डीवी / एमएल कम्पास के अनुसार अभिविन्यास, पैमाने बार 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। ठीक है, रंग मिलान पैमाने सलाखों के साथ ही 5 टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स की तस्वीरों 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व। सी। श्रेणीबद्ध पेड़ dendrogram क्लस्टर विश्लेषण 160 खंगाला टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स के बीच संबंध दूरी 10 स्वतंत्र रूपात्मक मैट्रिक्स के आधार पर illustrating के बाद। तीन समूहों में नीले, हरे, लाल और सचित्र। यह आंकड़ा के सभी हिस्सों में ब्रैग एट अल में शामिल आंकड़े से अनुकूलित कर रहे हैं। (समीक्षा में)।दुबला "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: क्लस्टर मूल्यांकन। दो अलग अलग कसौटी मूल्यों का प्लॉट, नकारात्मक लॉग संभावना (NLL, लाल) और Akaike जानकारी कसौटी (एआईसी, नीला) मानते हुए 1, 2, 3 या समूहों के तीन GMMs से उत्पन्न। 3 समूहों के साथ GMMs सबसे कम कसौटी मूल्यों प्रदान करते हैं।
पूरक संहिता फ़ाइल: उदाहरण कोड, एक मैटलैब-संगत भाषा में लिखा गया है, एक उदाहरण डेटा पीसीए और जीएमएम दृष्टिकोण का उपयोग क्लस्टर मूल्यांकन के द्वारा पीछा किया मैट्रिक्स पर क्लस्टर विश्लेषण करने के लिए। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
Neuroanatomical अध्ययनों से बनी है तंत्रिका विज्ञान और connectomics और संरचना समारोह संबंधों में हाल ही में ब्याज का एक स्तंभ चयनात्मक neuronal आबादी की विस्तृत रूपात्मक लक्षण वर्णन के लिए नए सिरे से उत्साह गया है। परंपरागत रूप से, neuroanatomical पढ़ाई के विशेषज्ञ neuroanatomists द्वारा परिभाषित न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान के अलग-अलग वर्गों में न्यूरॉन्स की गुणात्मक वर्गीकरण पर भरोसा किया है। न्यूरॉन्स के पुनर्निर्माण और रूपात्मक डेटा निकालने के लिए तकनीक के क्षेत्र में प्रगति के साथ, यह अब एक निष्पक्ष ढंग से आकृति विज्ञान के अलग-अलग वर्गों न्यूरोनल वर्गीकृत करने के लिए और अधिक परिष्कृत और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण के तरीकों का उपयोग करने के लिए संभव है। इस अध्ययन में, कदम-दर-कदम तरीकों 1 के लिए रेखांकित कर रहे हैं) अलग-अलग वायरस की मध्यस्थता प्रतिगामी लेबलिंग तरीकों का उपयोग कर न्यूरॉन्स के सैकड़ों चुनिंदा लेबलिंग; 2) व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की व्यवस्थित पुनर्निर्माण सैकड़ों एक के भीतर न्यूरॉन्स की एक व्यापक और इसलिए प्रतिनिधि नमूने के लिए फार्म चयनात्मक आबादी; और 3) स्वतंत्र क्लस्टरिंग एक चयनात्मक रूपात्मक मैट्रिक्स के आधार पर आबादी के भीतर न्यूरॉन्स की इष्टतम समूहों का निर्धारण करने के लिए सांख्यिकीय मूल्यांकन के साथ विश्लेषण करती है। ये विश्लेषण के तरीकों टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स के एक मौजूदा डाटासेट करने के लिए विभिन्न तरीकों को लागू करने क्लस्टरिंग द्वारा सत्यापित कर रहे हैं और हम तीन अलग-अलग मूल्यांकन के तरीकों कि टूर्नामेंट्स न्यूरॉन्स बेहतर तीन आकृति विज्ञान के अलग-अलग उप-जनसंख्या में clustered रहे हैं पर आधारित प्रदर्शित करता है।
प्रोटोकॉल इस अध्ययन में उल्लिखित का एक प्रमुख लाभ उनकी लचीलापन है। जी नष्ट कर रेबीज वायरस लक्ष्य संरचना में इंजेक्शन के बाद प्रतिगमनपूर्वक लेबल न्यूरॉन्स के सैकड़ों की संख्या में EGFP अभिव्यक्ति ड्राइविंग में प्रभावी किया गया है। एक ही रेबीज वायरस तनाव मकाक बंदरों 5, 9, ferrets (Hasse और ब्रिग्स, संशोधन में), और मूषक 7 सहित कई प्रजातियों में इसी तरह से प्रभावी है,"> 8। तदनुसार, संशोधित रेबीज वायरस चुनिंदा लक्ष्य संरचना में इंजेक्शन के बाद न्यूरॉन्स के किसी भी आबादी का पूरा वृक्ष के समान द्रुमायण पैटर्न लेबल करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। थपका / पेरोक्साइड प्रतिक्रिया के बाद GFP के खिलाफ एंटीबॉडी धुंधला की सिफारिश की है क्योंकि इस बात का स्थायी धुंधला का कारण बनता है लेबल न्यूरॉन्स और सक्षम बनाता है ऊतक वर्गों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की सहायता (जो अब जोखिम के साथ फ्लोरोसेंट लेबल bleaches) के बिना एक खुर्दबीन के नीचे देखे जा करने के लिए। हालांकि, विकल्प धुंधला तरीके उपलब्ध हैं और / या प्रतिदीप्ति सीधे मापने का अगर वांछित। एक लाभ यह कल्पना की जा सकती है कच्चे प्रतिदीप्ति कि अलग अलग फ्लोरोसेंट अणुओं की अभिव्यक्ति ड्राइविंग वायरस उदाहरण के लिए तय है कि न्यूरॉन्स एकाधिक लक्ष्य मस्तिष्क संरचना करने के लिए परियोजना के लिए, जोड़ा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ऊपर उल्लिखित चरणों (उदाहरण के axons और dendrites के लिए) सभी उपलब्ध रूपात्मक डेटा को लागू किया जा सकता है तेजी से मजबूत Morpho सक्षम करने के लिएन्यूरॉन्स की तार्किक वर्गीकरण। यह भी ध्यान दें कि रेबीज वायरस की छोटी मात्रा भी आदेश sparser प्रतिगामी लेबलिंग, जो डेन्ड्राइट के अलावा एक्सोन के पुनर्निर्माण के लिए फायदेमंद हो सकता है उत्पन्न करने में इंजेक्ट किया जा सकता महत्वपूर्ण है।
इस अध्ययन में उल्लिखित विश्लेषण के तरीकों का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि कई अलग अलग क्लस्टरिंग दृष्टिकोण का उपयोग किया और तुलना की जा सकती है। क्लस्टर विश्लेषण में हर कदम पर, विभिन्न विकल्पों के बीच न्यूरॉन पैरामीटर अंतरिक्ष में दूरियों के साथ ही विभिन्न एल्गोरिदम गणना करने के लिए समूहों उत्पन्न करने के लिए उपलब्ध हैं। इसके अतिरिक्त, कई मूल्यांकन के तरीकों में उपलब्ध हैं। बाद के रूप में प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उल्लिखित, के रूप में एक साधन इष्टतम क्लस्टरिंग सत्यापित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। निस्संदेह, समूहों पैदा करने के लिए और इष्टतम क्लस्टरिंग के मूल्यांकन के रूप में क्षेत्र में आगे बढ़ता रहता उपलब्ध हो जाएगा के लिए अतिरिक्त एल्गोरिदम। साथ में, इन विश्लेषण के तरीकों impro के लिए जारी रहेगाneuroanatomy के क्षेत्र में मात्रात्मक दृष्टिकोण ve और निष्कर्षों की मजबूती बढ़ाने के लिए।
वहाँ न्यूरोनल पुनर्निर्माण क्योंकि द्वारा हाथ अलग-अलग लेबल न्यूरॉन्स के पुनर्निर्माण समय लगता है, प्रशिक्षण और अनुभव की आवश्यकता होती है, और अभी भी कुछ हद तक व्यक्तिपरक हैं के स्वचालन में रुचि बढ़ रही है। क्योंकि कंप्यूटर आधारित स्वचालित न्यूरोनल पुनर्निर्माण अभी भी त्रुटि प्रवण हैं, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी आधारित neuroanatomical डेटा अभी भी लोगों द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं (उदाहरण के लिए 17 देखें)। हालांकि, यह है कि स्वचालित न्यूरोनल पुनर्निर्माण निकट भविष्य में उपलब्ध हो जाएगा संभावना है। स्वचालित न्यूरोनल पुनर्निर्माण डेटा विश्लेषण के छोर पर भी और अधिक जांच की आवश्यकता होगी, इस प्रकार क्लस्टरिंग विश्लेषण करती है और के रूप में मैदान तकनीकी रूप से अग्रिम जारी यहाँ रेखांकित मूल्यांकन के तरीकों और भी अधिक महत्वपूर्ण हो जाएगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम डीआरएस को धन्यवाद देना चाहेंगे। एड कालावे और हमें ऊतक एक पूर्व अध्ययन और लिब्बी Fairless और Shiyuan लियू न्यूरोनल पुनर्निर्माण के साथ मदद के लिए के एक भाग के रूप में तैयार उपयोग करने की अनुमति के लिए मार्टी Usrey। और व्हाइटहॉल फाउंडेशन: यह काम एनआईएच (EY018683 नै) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
- Cajal, S. R. y Histologie du systeme nerveaux de l'homme et des vertebres. , Maloine. (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
- Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
- Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
- Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
- Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
- Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
- Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
- Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
- Thorndike, R. L. Who belongs in the family? Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
- Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
