Summary
이 프로토콜은 수정 된 광견병 바이러스가 형광 마커를 표현, 독립, 편견 클러스터가 서로 다른 신경 세포의 서브 클래스 간의 형태 학적 통계의 종합적인 특성을 사용하는 것이 분석과 역 행성 감염 다음 레이블이 선택적 신경 인구의 대규모 복원에 대해 설명합니다.
Abstract
이 프로토콜은 독립적 바이어스 클러스터링의 사용과 결합 된 신경 세포의 대규모 복원이 선택적 신경 세포 집단 중에서 관찰 학적 특성의 광범위한 조사를 만들 분석 요약. 이러한 기술들의 조합은 신경 해부학 정보의 수집 및 분석을위한 새로운 방법을 구성한다. 함께, 이러한 기술은 대규모을 활성화하고 선택적 신경 인구 때문에보다 포괄적 인 샘플링 및 인구 내에서 형태 학적으로 독특한 신경 클래스를 설명하는 편견 양적 방법을 설정합니다.
이 프로토콜은 선택적으로 신경 세포에 라벨을 수정 광견병 바이러스의 사용을 설명합니다. 관심의 대상 뇌 구조로 정위 주입 다음 역행 추적 등의 광견병 바이러스의 역할을 G는-삭제 및 신경 세포에서 EGFP의 전달과 표현을위한 수단으로 역할을합니다. 뉴런의 많은 수는이를 사용하여 감염기술과 개별 뉴런의 "골지 같은"전체 채우기를 생산, 자신의 수상 돌기에 걸쳐 GFP를 표현한다. 따라서, 바이러스 매개 역행 추적 방법은 완전한 세포 칠을 생성함으로써 기존의 염료 계 역행 추적 기술을 개선시킨다.
연구중인 뇌 영역의 모든 영역에 걸쳐 개별 잘 격리 뉴런은 신경 세포의 대표적인 샘플을 획득하기 위해 재 선정된다. 이 프로토콜은 세포 기관을 재구성하고 여러 조직 섹션에 걸쳐 표시 신경 세포의 수지상 arborization 패턴을 완료하는 절차를 설명합니다. 뇌 구조 내의 각 뉴런의 위치를 포함하여 형태 학적 데이터, 추가 분석을 위해 추출된다. 표준 프로그래밍 함수는 독립 클러스터 분석 학적 지표에 기초하여 클러스터 평가를 수행하는 데에 이용 하였다. 클러스터 분석 PERFO의 이러한 분석의 유틸리티, 통계적 평가를 확인하려면원숭이 원숭이의 시상 (TRN)의 시상 망상 핵에 재건 (160) 뉴런에 rmed가되었다. 원래 클러스터 분석하고 여기에 수행 통계적 평가는 모두 TRN 뉴런 세 소집단, 독특한 형태 학적 특성을 각각으로 분리되어 있음을 나타냅니다.
Introduction
신경 해부학은 "connectomics"에서 신경 과학 (1) 최근 관심의 기초 중 하나가 신경 인구의 형태 학적 다양성과 특정 뉴런 (2) 사이의 연결을 이해하기위한 열정을 갱신했다입니다. 라벨링 방법 및 재구성 신경 세포는 크게 유전 및 바이러스 매개 회로 추적 등을 포함하여 혁신과 개선의 연결 인구 5의보다 포괄적 인 형태 설문 조사를 수 있도록, 3, 4에 접근한다. 개별 뉴런 라벨의 개선 이외에, 정량 데이터 분석 기술들은 그 데이터 형태 5, 6에 기초하여 별개의 개체군으로 뉴런의 독립적 인 편향 구분 가능 나왔다. 이러한 편견 기술은 더 traditiona의시 개선된다한 세기 넘게 분야에서 표준이되어왔다 L 질적 분류 방법. 이 연구의 목표는, 개요 단계별하는 것입니다, 선택적 인구 내에서 신경 세포의 바이러스 매개 라벨의 조합이하는 이러한 신경 세포의 포괄적 인 샘플 및 정량 데이터 분석의 대규모 복원은 독립적 인 클러스터링을 기반으로 통계 평가. 이러한 방법을 결합함으로써, 우리는 선택적 신경 인구 내에서 포괄적 인 샘플링과 형태 학적으로 독특한 신경 종류의 편견 분류를 용이하게하기 위해 수집 및 신경 해부학 데이터의 분석을 향한 새로운 접근 방식을 설명합니다.
이러한 방법의 예를 들어, 우리는 짧은 꼬리 원숭이의 시상 망상 핵 (TRN)의 단일 섹터 내에서 뉴런의 대규모 인구의 분석에 대해 설명합니다. 이 자료는 이전 연구 7에서 있습니다. 선택적 지느러미 latera에 돌출 TRN 뉴런을 라벨에 대한 방법EGFP 4, 8 인코딩 수정 광견병 바이러스의 수술 주입을 사용하여 시상 (dLGN)의 리터의 geniculate 핵이 설명되어 있습니다 (특정 자재 / 장비, 행 2의 표 참조). 이 변형 광견병 바이러스는 유전자 필수적인 코트 단백질을 코딩하는 바이러스 트랜스 - 시냅스 움직임을 제거 없다. 바이러스 주사 부위 엑손 단자 입사되면, 감염된 신경 5, 9, 10의 전체에 걸쳐 수상 arborization EGFP 발현을 구동하는 중요한 이점 전통적인 역행 트레이서처럼 작용한다. 따라서,이 G-삭제 광견병 바이러스는 선택적으로 감염 및 사출과 역행 전송 다음 모든 신경 인구 라벨을 사용할 수있다.
특정 신경 세포 집단의 포괄적 분석을 수행하기 위해, 샘플은 중요인구 내에서 뉴런의 광범위한 분포. 바이러스 - 매개 표지 기술은 완전한 세포를 생성하기 때문에, "골지체 형상은"바이러스 주사 부위 축삭 많은 뉴런 채우고, 그 뇌 구조의 전체 범위 내에서 신경 세포의 매우 큰 샘플을 재구성 할 수있다. 개질 광견병 바이러스 감염과 뉴런의 다수의 라벨에 있으므로 효과적이기 때문에 또한, 동물 당 수백 뉴런을 재구성 할 수있다. dLGN 투 TRN 뉴런의 광범위한 샘플을 생성하기 위해 TRN (11)의 영상 분야에 걸쳐 160 뉴런 샘플링 절차가 설명된다. 현미경, 카메라, 및 재구성 소프트웨어를 포함하는 신경 복원 시스템을 이용하여 각각의 신경 세포를 복원하는 과정을 설명한다. 또한 설명합니다 (TRN 내의이 경우) 뇌 구조 내의 개별 뉴런의 위치를 결정하는 바이러스 주입 윗몸을 확인하는 방법이다체적 형상 복원을 사용합니다 (dLGN 내의 이러한 경우) 구조 내에서 전자 볼륨 및 위치. 각 신경 세포를 측정 형태 측정이 설명되어 있습니다에 형태 학적 데이터를 내보낼 독립적 인 클러스터를 수행하는 단계는 기반 분석. 클러스터링 방법에 제한이 있습니다 가능한 다른 클러스터링 알고리즘의 다양한도 있습니다. 따라서, 이러한 옵션과 더 일반적으로 사용되는 알고리즘의 몇 가지의 장점이 설명되어 있습니다. 클러스터 분석 클러스터의 고유성의 통계적 검증을 제공하지 않습니다. 따라서, 추가 단계가 최적의 클러스터뿐만 아니라 내부 및 클러스터에 걸쳐 형태 데이터 사이의 관계를 확인하기 위해 설명된다. 그 TRN 뉴런을 확인하기 위해 TRN 데이터 세트에 대한 클러스터를 평가하기위한 통계 방법이 설명되어 있습니다 (10) 독립적 인 형태 학적 지표에 따라 세 가지 고유 한 클러스터로 그룹화됩니다.
따라서, 선택적으로 표시하는 단계를 요약하여, 재구성, 특정 신경 세포 집단에서 형태 학적 자료를 분석, 우리는 인구 내에서 신경 세포 사이의 형태 학적 차이를 정량화하는 방법을 설명합니다. 짧은 꼬리 원숭이 원숭이 TRN의 시각적 부문 내에서 서로 다른 신경 세포 유형의 선행 연구 결과는 별도의 통계적인 평가 방법으로 확인된다. 함께, 우리는 이러한 기술은 신경 해부학 데이터 세트에 광범위하게 적용 할 수 뇌를 통해 신경 인구의 다양성의 정량적 분류를 확립 도움이되기를 바랍니다.
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Protocol
참고 : 본 연구에서 조사 된 조직이 별도의 학습 (5)의 일부로서 제조 하였다. 따라서, 동물의 사용을 수반하는 실험 방법은 모두 브릭스 동부 등의 실험 방법 섹션에서 상세하게 설명되었다. (2016). 이전 연구의 일환으로 수행 동물과 관련된 모든 절차는 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 2 - dLGN 내로 바이러스의 주입 및 뇌 조직 학적 처리 단계는 섹션 1에 간략하게 설명한다.
1. 정위 주입
- 무균 기술을 사용하여 무균 환경에서 모든 수술 절차를 수행합니다. 오토 클레이브의 모든 금속 수술기구, 거즈 및 드레이프 물질을 증기 소독. 화학적 멸균 (예 : 에틸렌 옥사이드)를 사용하는 증기에 의해 손상 될 수있는 모든 물질을 살균.
- 유도와이나 동물 페이지에 따라 마취를 유지rotocol 별 요구 사항.
- 원숭이 바이러스 주입, 케타민 (10 ㎎ / ㎏)으로 마취를 유도하고 이소 플루 란 전체 수술 마취하에 동물 유지 - CO 2 만료 모니터링 (1 내지 3 %의 산소를 흡입), 심전도, 호흡 속도 및 온도를 연속적으로 주기적 검사 턱 톤을 적절한 마취 깊이를 확인합니다.
- 헤드 위치를 안정화시키고 정위 좌표를 이용 관심의 주입 구조체 (예 dLGN)를 찾을 수 있도록 고정대에 동물을 놓는다. 시각적 반응을 측정하는 경우, 장소 눈 (그렇지 않으면 식염수 안약, 동공 팽창이 필요한 경우 1 % 아트로핀 안약) 삭제 한 다음 양쪽 눈에서 콘택트 렌즈 건조를 방지 할 수 있습니다. 시각적 반응을 측정하지 않으면, 눈 안과 연고를 배치합니다.
- 중간 선 두피 절개를하고 피부와 근육을 수축.
- 정위에 따르면 하나 hemisph에 대한 관심의 구조 (dLGN) 좌표감수, 작은 개두술을합니다.
- 점차적으로 기록 전극 (예를 들어, 텅스텐 또는 백금 / 이리듐 전극 (특정 자재 / 장비, 행 3 표 참조) 수동으로 위치하는 미세 조작기에 고정) 뇌에 개두술을 통해 내립니다. 원한다면 낮은 임피던스 (<1 MΩ) 약간 두꺼운 (~ 250 μm의 직경) 전극은 경질 침투하는 데에 이용 될 수있다.
- 대뇌 피질의 표면에서 시각적 응답이 측정 지점에서 조작 위치를 기록합니다. 비주얼 응답 시간이 잠겨 빛에 신경 응답은 검안경 또는 작은 LED / 손전등 눈에 번쩍,들을 수 있습니다.
- 시각적 반응의 시작, 중간, 끝 부분에 조작 위치를 지적하고이 값에서 대뇌 피질의 표면 위치를 빼서 dLGN의 위치와 두께를 결정합니다. dLGN 내의 각 설계 주사 부위의 깊이를 기록합니다.
참고 : 유사 procedu입술 적절한 감각 자극을 사용하여 비 시각 구조를 찾기 위해 사용될 수있다. 또한, 결합 된 기록 / 주사 시스템은 소 뇌 구조물을 대상으로 사용될 수있다. - 최적 주입 위치가 기록되면, 상기 깊은 주입 부위에서 시작하여 가장 얕은 진행 각 분사에 적절한 깊이로 동일한 정위 위치와 하부에서 (유리 피펫 또는 분사 주사기) 기록 전극을 제거하고, 사출 피펫 배치 전극 위치를 변경하기 전에 주입 후 최소 1 분 대기. 50 μm의 ~의 외경과 유리 피펫은 주사기 팁 (~ 200 μm의 직경)에 비해 바이러스의 역류를 감소시킬 수있다.
- 여러 (3 이상의 수정 광견병 바이러스 - (주입 절차에 대한 제조 업체의 지침을 참조하십시오 5 μL 1) - 주입 시스템을 사용하여, picospritzer, 또는 주사기 펌프 (/ 기술 장비의 t, 4 행을 특정 재료의 표 참조) 작은 볼륨을 주입 10) 오쿠타겟 구조 (dLGN) 내의 100 ~ 거리 nL / min의 속도. 참고 : 별도의 주입 침투가 더 큰 목표 구조에서 (예를 들어 원숭이 dLGN를) 할 수있다. 대상 구조의 크기에 따라 총 주입 볼륨을 조정합니다.
- 주입 피펫을 철회하기 전에 최소 5 분을 일시 중지합니다. 주사 피펫을 제거하면 다시 함께 근육과 피부를 봉합 (장소 접착제 골편 골 왁스 gelfoam을 적용) 보호 물질로 개두술을 채운다.
- 진통제를 관리 (예 : 케토 프로 펜) 및 수술의 끝 이전에 항생제와 동물이 외래 될 때까지 지속적으로 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 최소 3 일 동안 수술에 따라 최대 10 일까지, 봉합은 깨끗하고, 건조하고, 그대로 동물이 통증이나 불편의 흔적을 보여줍니다 보장하기 위해 매일 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 필요에 따라 매일 진통제와 항생제를 관리 할 수 있습니다. 동물이 완전히 수술에서 회복 된 후 수술 동물의 사회 주택을 시작합니다. </ OL>
- 십사일 바이러스 역행 운송 후 0.1 M 인산염 완충 식염수, 4 % 파라 포름 알데히드, 10 % 수크로오스로 다음 4 % 파라 포름 알데하이드로 transcardially 동물을 안락사 용액 (예 Euthasol)의 과다에 의해 동물을 안락사 및 관류 - 7 허용.
- 이일 - 1 4 %, 0.1 M 인산 버퍼에 파라 포름 알데히드 냉장으로 30 % 자당 - (20)의 뇌 (설치류 모델에서 유사한 단계 12 참조)과 장소를 제거합니다.
- 뇌가 용기의 바닥에 가라 때, 제거 및 역행 표지 신경과 뇌 영역을 포함하는 블록으로, 조직 (예를 들면 시각 피질)과 주입 대상의 구조 (예 dLGN)을 잘랐다. 비 분사 반구에서 조직의 동일한 블록 컷 - 이러한 제어부로서 기능한다. 최상의 결과를 조직 학적 절차 immediatel 시작갓 단면 조직에 y를.
- 냉동 마이크로톰을 사용하여 섹션 당 50 ㎛의 두께 coronally 섹션 조직 (특정 자재 / 장비, 행 5의 표 참조).
- 대뇌 피질의 층과 피질 하 구조 (13)를 시각화 - 시토크롬 산화 효소 활동에 대한 모든 부분을 얼룩 (8 특정 자재 / 장비, 행 5의 표 참조). 주 : 섹션 시토크롬 옥시 다제 염색 다음 최종 헹굼에서 밤새 냉장고에서 저장 될 수있다.
- GFP에 대한 일차 항체로 모든 섹션 레이블 (1 : 1,000 희석 ~ 12 시간 배양, 특정 자재 / 장비의 표를 참조, 행 9) 차 호스트와 일치하는 이차 항체 다음과 비오틴 5 태그 (1 : 500 희석 - 2 4 시간 배양는) 10 행, 특정 자재 / 장비의 표를 참조하십시오. 2 차 항체 밤새 섹션을 배양하는 것이 좋습니다.
- 아비딘 / 비오틴 복합체와 라벨 부분은 영구적으로 모든 레이블 뉴런 5 얼룩 DAB 및 과산화수소와 반응.
- 자막도 유리 슬라이드에 섹션을 탑재하고 건조 하룻밤을 할 수 있습니다.
- 다음 알코올과 자일 렌의 일련의 린스 사용하여 탈지 섹션 슬립 (14)를 커버한다.
- 현미경 슬라이드 홀더에 슬라이드를 놓고 낮은 배율 목적 (예를 들어 2 배 또는 10 배)를 사용하여 관심의 한 부분에 초점을 맞 춥니 다. 카메라 영상이 제대로 카메라 셔터를 배치하여 소프트웨어 뷰에 표시되어 있는지 확인하십시오.
- 명확하게 가능한 한 수지상 arborization의 정도를 재구성 할 수 있도록 합리적으로 분리되어 관심 (예 : TRN)의 뇌 구조 내에서 레이블 뉴런을 선택합니다. 세포체 각 전지 본체의 가장 큰 정도를 정확하게 포착 영역과 진원도를 추정하기 위해 하나의 섹션 내에 완전히 경우 우선적으로 신경 세포를 선택한다. 셀 B를 식별 10X 현미경 대물 렌즈를 사용하여홈 섹션에서 ODY.
- 잘 염색, 잘 격리 된 신경 세포가 확인되면, "새 절"버튼을 클릭하여 과장에 세포체를 포함하는 "홈"섹션을 추가합니다. 포함하는 섹션의 번호를 입력 (- 시작 3 2 항을 추천합니다). 메시지가 표시되면 50 ㎛의 단면 두께를 지정 (단계 2.3 참조).
- 전지 본체를 포함하는 홈 부분에 관련된 뇌의 구조의 윤곽을 추적. 윤곽 추적을위한 2X 목적 / 배율을 사용합니다.
- 첫째, 상단 도구 모음의 드롭 다운 메뉴에서 "형상"을 선택하고 드롭 다운 메뉴 (예 : "LGN"또는 "TRN")에서 윤곽 유형을 선택합니다.
- 연신 수단으로 마우스를 사용하여 윤곽을 따라 점을 클릭함으로써, 원하는 경우, 타겟 구조 (예 TRN)뿐만 아니라 인접 구조 윤곽 추적.
- 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고이 옵션을 선택하여 "닫기 컨투어"를 선택메뉴에서 완료하고 각 추적 윤곽을 묶어야합니다.
- 해당 위치에 마커를 배치 재건에 원하는 위치를 클릭 한 후 오른쪽 도구 모음에서 원하는 마커 기호를 클릭하여 대상 구조의 중심에 마커를 배치합니다. 모든 복원의 대상 구조물의 중심을 표시하는 마커의 동일한 유형을 사용한다.
- 60X 목표 / 배율 - 윤곽이 완료되면, (40)를 사용하여 전지 본체의 윤곽을 추적. 이렇게하려면, 먼저 상단 도구 모음의 드롭 다운 메뉴에서 "신경"을 선택하고이 경우 "셀 바디"에, 추적 신경 구조를 선택합니다. 3.4 다음과 세포체 추적.
- 3.5에 설명 된 단계에 따라, 세포체의 중심에 서로 다른 스타일의 마커를 배치합니다.
- 세포체에서 시작하는 모든 수상 돌기를 추적합니다.
- 첫째, 드롭 다운 메뉴에서 "덴 드라이트"를 선택합니다. 이어서 세포 BOD부터 각 수지상 추적Y와 무승부 도구로 마우스를 사용. 정확하게 수상 돌기의 각도와 방향을 캡처 추적에 걸쳐 Z-깊이를 조정해야합니다.
- 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 "용 분기 노드"또는 "Trifurcating 노드"를 선택하여 수지상 따라 각 분기점에서 노드를 배치합니다. 모든 수상 돌기 복원을 위해 60X 목적 / 확대 - 40을 사용합니다.
- 각 수상 돌기의 끝에서 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 "종료"를 선택합니다.
- 인접 부에 계속 현미경 이미지에서 적절한 Z-깊이에 초점이를 가져올 가능성이 수지상 엔딩을 확인합니다. 이러한 현미경 영상에서 혈관 또는 쉽게 인식 수상 돌기 패턴이나 번들 인근의 주요 랜드 마크를 포함합니다.
- (최고의 랜드 마크 시각화 할 수 있습니다 배율을 선택) 현미경에 20 배 또는 10 배 배율을 줄이고, 소요디지털 카메라를 이용하여 이미지의 현미경 사진 (예를 들어 휴대 전화, 태블릿) 컴퓨터 화면 휴대용.
- 슬라이드에 인접한 섹션으로 이동하고 새로운 섹션의 dLGN과 TRN의 경계로 이전 추적 부분의 윤곽을 줄.
- (윤곽 주요 최적 기준) 전지 본체의 일반 영역에 시야를 돌아 백업 (10)의 배율을 가지고 - 20X.
- 새로운 섹션의 수상 돌기의 시작과 결말을 정렬에 도움이 이전에 추적 섹션에서 수상 돌기 엔딩의 사진을 사용합니다.
- 추적을 회전 재건을 선택하려면 화살표 도구를 사용하여, 수상 돌기를 정렬을 이동하려면 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 "이동"을 선택합니다.
- 또한, 처음에 수지상 결말을 맞게 "일치"도구를 사용합니다. 상단 도구 모음에서 일치 도구를 선택하고 메시지가 표시되면, 결말 클릭재구성 화상에 대응하는 연속 점이다. 3 개 이상의 엔딩에 대해 반복합니다.
- 이전 섹션에서 추적이 새로운 섹션의 수상 돌기에 줄 지어되면, 대응하는 새로운 섹션은 현재 섹션을 클릭하여 과장이 선택되어 있는지 확인합니다. 이에 따라 홈 부분에 각각의 새로운 섹션 상대의 z 깊이와 위치를 조정하고 50mm (단계 2.3 참조) 각 섹션의 두께를 3.3에서 상술 한 바와 같이 또는, 섹션 관리자에 새 섹션을 추가합니다.
- 40 배율을 증가 - 60X 다음으로 마우스를 사용하여 수지상 추적, 재건의 수상 돌기의 끝 부분에 마우스를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 "종료에 추가"를 선택하여 수지상 연속 요청을 추적 도구를 그립니다. 계속 새로운 섹션에있는 경우 지정하는 프롬프트를 따르십시오.
- 양쪽에 (적어도 3 인접한 섹션을 통해 하나를 수상 돌기를 따라홈 섹션) 단계 3.8 다음 - 3.15. 최소 3 전체 섹션이 신경 세포 또는 수상 돌기가 더 이상 다음되거나 발견 될 때까지 추적 될 때까지 재건에 추가합니다. 원하는 경우, 위의 단계를 다음과 주변 부분의 윤곽을 추적합니다.
- 내선을 사용하여 각 개별 신경 세포의 재구성에서 형태 학적 데이터를 추출신경 세포 복원 시스템과 관련된 raction 프로그램은 (- 12 특정 자재 / 장비, 행 (11)의 표 참조).
- 윤곽 정보, 마커 정보, 세포체와 수상 돌기 arborization 등의 형태 학적 데이터 : 첫째, 포함하여 각 재건 원하는 형태 학적 데이터를 선택합니다.
- 상단 도구 모음에서 편집 드롭 다운 메뉴에서 "모든 개체를 선택합니다"를 선택합니다. 그런 다음 상단 도구 모음에서 분석 드롭 다운 메뉴에서 "측쇄 구조 분석"을 선택하고 각 탭을 클릭하고 각 탭에서 원하는 분석 옵션을 선택합니다.
- 분석 창에서 "OK"버튼을 클릭하여 원하는 모든 데이터를 추출하고 출력 창문과 "Excel로 내보내기"를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 스프레드 시트 형식으로 저장합니다.
- (특정 자재 / 장비의 표를 참조하십시오 16 행) 마스터 스프레드 시트를 컴파일하는 각각의 형태 학적 변수 / 나⚻에 정해진는 신경 당 단일 관측 수치로 표현된다. 이 마스터 스프레드 각 뉴런의 행 식별자의 레코드를 유지한다.
- 클러스터 분석에 포함 된 모든 변수 (예 : 형태 학적 측정)이 서로 독립적인지 확인합니다. 예를 들어, 노드의 수는 수지상 또는 축삭 arborization의 분기의 수와 연관된다. 따라서, 이들 두 변수 중 하나만이 클러스터 분석을 포함한다.
- 각 형태 메트릭 (변수)에 해당하는 데이터 점 (관찰)가 있어야합니다, 각 신경 세포 (측정) 즉, 확인 각 측정은 모든 변수에 대한 관찰을 포함합니다. (예를 들어, 엑손의 길이)은 특정 변수에 대해 관찰 뉴런의 서브셋 부족한 경우,이 변수 (엑손 길이)은 클러스터 분석에 포함시킬 수 없다.
- 각 행은 뉴런 및 EAC를 나타내는 단일 행렬로 마스터 스프레드 시트 데이터를 구성시간 열은 각 형태 메트릭 (그림 1)에 대한 수치 데이터가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 100 뉴런을 포함하는 데이터 집합하는 100 × 5 (행별로 열) 행렬로 표현 될 것이다 5 독립 변수에 대한 관측이있다. 행 인덱스는 각각의 신경 세포의 고유 식별자로서 기능한다 - 매트릭스 내의 각각의 신경 세포에 대한 식별 정보를 포함 할 필요가 없다. 또한 행렬의 틈 또는 "NaN이"의이 없어야합니다. 하나의 변수로 매트릭스 저장 (예를 들어 데이터 = 100 × 5 행렬을] 기업 코드 샘플 코드 파일 참조).
- N이 변수의 수에 의해 정의 된 N 차원 공간에서 개별 뉴런을 나타내는 점들 사이의 거리를 계산하는 알고리즘을 선택한다. 'pdist'기능은 간 신경 세포의 거리를 계산하는 유연성을 가능하게한다. 기본 거리 계산은 유클리드 거리이며 신경 morphologica 유사한 분석을 위해 이전에 사용 된L 개의 데이터 (5, 6).
- (가) 사이-신경 'pdist'기능의 출력을 거리를 함께 클러스터를 형성하기 위해 '연결'기능을 사용합니다. 또, 여러 클러스터링 옵션을 사용할 수 있습니다. 구청의 방법 및 중심 거리가 형태 학적 데이터 세트 5, 6의 분석에서 비슷한 결과를 산출했다.
- 원하는 경우, 'pdist'와 '연결'기능에 대한 대안 클러스터링 방식으로 'kmeans'기능을 사용합니다. 'kmeans는'다음 클러스터를 할당하는 중심 거리를 간 신경 세포의 거리를 계산하는 유클리드 거리 제곱 사용한다.
- 계층 적 클러스터 트리를 시각화하기 위해, '연결'작업의 출력의 'dendrogram은'기능을 사용합니다. 이 기능 (30)의 측정에 시각화 제한 디폴트 설정이 있지만 측정 횟수 (<지정에 의해 무시 될 수있다EM> 예 뉴런)이 표시. dendrogram은 X 축에 자신의 로우 인덱스에 의해 식별되는 각각의 뉴런에 대한 y 축상의 링크의 거리를 나타낸다.
참고 : '연결'과 'dendrogram은'의 출력은 클러스터의 최적의 수를 정의하지 않습니다. 'kmeans'의 출력은 클러스터 측정 할당 않지만, 이러한 클러스터가 최적인지 테스트하지 않는다. 별도의 통계 비교 및 최적의 클러스터링의 검증 (아래 참조)을 수행 할 수 있습니다. - 방법 1 : 평가 클러스터링 :
- 이러한 'kmeans'또는 '링크'로 클러스터를 계산하기 위해 사용되는 방법을 지정하는 'evalclusters'기능을 사용합니다. 가우시안 혼합 모델의 출력도 평가 될 수있다 (아래 단계 5.2를 참조, 기업 코드 샘플 코드 파일 참조).
- (- "evalclusters"를 검색, 도움말 메뉴를 참조 기준 옵션에 대한 설명은 예를 들어 'CalinskiHarabasz') 옵션의 숫자에서 평가 기준을 지정합니다.
- 테스트 최적 클러스터 번호의 범위를 지정 (예를 들어 [1 : 6] 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개의 클러스터가 최적인지 테스트)이다.
참고 : 'evalclusters'의 출력은 지정된 클러스터링 알고리즘 및 기준을 주어진 클러스터의 최적의 수입니다.
- 방법 2 : 가우시안 혼합 모델 클러스터링 :
참고 : 가우시안 혼합 모델 클러스터링 ALGORithms (GMM에)는 각 변수에 대한 관측 각 추정 클러스터, 자신의 평균과 공분산 각을 정의 가우스 분포의 혼합물에서 온 것으로 가정합니다. GMM은 특정 클러스터에 속하는 16의 확률을 나타내는, 각 측정 사후 확률들을 할당하는 기댓값 최대화 알고리즘을 사용한다.- 데이터에서 관찰 클러스터의 추정 수를 입력하여 'fitgmdist'기능을 사용하여 구현 GMM. 대안 적으로, 클러스터의 개수의 사전 할당을 피하기 위해 여기에 설명 된 단계를 사용하여 서로 다른 최적의 클러스터 번호 일련 주성분 분석 (PCA)을 사용 (기업 코드 샘플 코드 파일을 참조).
- 원래 데이터 매트릭스의 'PCA'기능을 사용하여 출력으로 주성분 점수를 저장합니다.
- 루프 1에서 시작하여 추정 최적의 클러스터의 일부 번호를 겪고에서, 제 사용주성분 점수에 전자 'fitgmdist'기능은 추정 최적의 클러스터의 각 번호에 대한 GMM에를 생성합니다.
- 음의 로그 우도, 아카 이케 정보 기준 및 베이 즈 정보 기준을 검사하여 각 GMM를 평가합니다. 가장 낮은 기준을 가진 GMM 최적입니다.
- 원하는 경우, 클러스터의 개수가 (각 클러스터의 각 수단은 GMM의 "무"출력에 저장되는) 최적 인 경우, 각 클러스터에 대한 평균 값이 크게 차이가 있는지 여부를 테스트.
- 클러스터의 최적의 수는 계층 적 클러스터링을 사용하여 결정하고 평가되면, 클러스터로 원래의 데이터, 별도의 뉴런으로 돌아가과 형태 학적 측정은 독특한 클래스로 신경 세포의 클러스터링에 기여 결정합니다.
- 뉴런 클러스터 할당에 따라 그룹화되도록 원래 형태 메트릭 데이터를 정렬한다. 신경 세포에서 (모든 신경 세포 또는 클러스터로 분리 된 뉴런에 대한) 형태 학적 데이터 간의 관계를 조사하기 위해 수행하는 선형 회귀는 형태 학적 측정 관찰 2 및 3 방향 비교를 맞는다. 이러한 적합은 '적합'함수를 이용하여 추정하고 맞는 출력의 장점 회귀 적합위한 R 2 및 P 값을 포함하는 'fitlm'기능을 사용하여 평가 될 수있다.
- 각각의 클러스터에서 뉴런들 사이의 통계적 관계를 조사하기 위해, 클러스터의 개수에 따라 비모수 개의 샘플 (윌 콕슨 순위 - 합 테스트) 또는 복수의 샘플의 비교 시험 (ANOVA)를 사용한다. 중요한 것은, 다중 샘플 ANOVAs의 사용은 P 값이 다중 비교 보정되도록.
2. 조직 수확, 단면 및 염색
3. 신경 재건
참고 : 원래 실험에 대한 모든 복원 현미경들로 구성된 신경 세포 복원 시스템을 사용하여 만들어졌다가 부착 된 카메라 (13 행, 특정 자재 / 장비의 표 참조) 및 복원 소프트웨어 (14 행, 특정 자재 / 장비의 표 참조) 패키지는 (- 12 특정 자재 / 장비, 행 (11)의 표 참조). 소프트웨어를 이용한 신경 재건의 연결 과정의 컴퓨터 기반의 도면을 중첩 조직 슬라이드 시각화 할 수 있습니다. 중요한 것은, 소프트웨어 형태 reconstruc 디지털화입체적 기 데이터, 위치 특정 형태의 정보를 추출 가능. 연관된 데이터 추출 프로그램 (12 행, 특정 자재 / 장비의 표 참조)은 각 저장 재건의 형태 학적 데이터의 풍부한 추출 할 수 있습니다.
4. 독립 클러스터링
참고 : 독립 클러스터, 그렇지 않으면 중요한 시각화하기 어려울 수 있습니다 대형, 다차원 데이터 세트의 편견 분석을 가능하게 형태 학적 다양성의 정량적 평가를 제공 분석한다. 매트릭스 기반의 프로그래밍 플랫폼은 다차원 데이터 세트의 분석에 매우 유용하고 정교한 데이터 조작과 통계 분석을 할 수 있습니다. 단계 4에 나열된 기능 - 6 특정 자재 / 장비의 표에 나와있는 프로그래밍 플랫폼에 정의 된 15 행.
클러스터링 5. 확인
주의 : 전술 한 바와 같이, 클러스터 분석 자체가 직접 클러스터 dendrogram은 도시 클러스터가 고유 샘플 대표인지의 통계적 평가를 제공하지 않는다. dendrogram은 클러스터에서 확인하는 방법은 그러나 이러한 최적 클러스터링 통계적 인증을 제공하지 않는다 (15)이 제안되어있다. 다있다최적의 클러스터링을 검증하기위한 PLE 방법.
클러스터 데이터 6. 통계 분석
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Representative Results
우리는 선택적 모집단 내의 뉴런의 대규모 복원이 dLGN (5)에 변형 광견병 바이러스의 가능한 다음 주입 이전임을 보여 주었다. 최근, 동일 조직은 TRN 시각적 섹터 (160)의 뉴런을 재구성하기 위해 이용 하였다 (브래그 등, 리뷰].도 2A-B) 상술 한 상세한 방법 론적 단계에 따라. TRN 연구에서 TRN 뉴런의 세 가지 고유의 클러스터는 독립적 10 형태 메트릭 클러스터 분석에 기초하여 확인되었다 : 세포체 구역, 세포체 진원도의 TRN 내의 TRN 등쪽 - 복부 위치의 중심 내측 측방 상대적인 위치 , 수지상 나무, 노드에 평균 수지상 거리, 제 3의 평균 길이 및 고차 수상 돌기, 1 일 주문 수상 돌기의 평균 각도, 총 수지상 arborization의 평균 위상 각과에의 각도 편차의 수탈 수지상 arborization. TRN 뉴런은 등가 적으로 이러한 세 클러스터 (도 2c)에 분산시켰다. 세 개의 클러스터의 신경 세포에 걸쳐 10 개의 형태 학적 측정의 별도의 통계 비교는 원래 클러스터 분석에 포함 된 형태 측정의 모든하지만 두 클러스터에서 통계적으로 유의 한 차이를 얻었다. 따라서, 클러스터 분석 (도 2C) 및 클러스터에 걸쳐 통계 학적 별도의 통계 비교로부터 생성 된 계층 적 트리 dendrogram은에 기초 TRN 뉴런 독특한 세 그룹으로 분류된다.
본 연구에서는 특별히 별도 클러스터 분석을 결정 클러스터를 평가하는 통계적 방법을 적용하고 싶었다. 이전 연구에서 TRN 데이터 세트 관찰 세 개의 클러스터가 최적이었다 여부를 결정하기 위해 평가 하였다. 별도의 추가 클러스터, 즉 PCA와 GMM CLUS 분석에 들어가기는 종래 클러스터링 방법 (도 1)를 검증하기 위해 수행되었다. 세 가지 주요 성과는 별도로 전에 클러스터 분석을 확인합니다. 원래 클러스터 분석 방법은 클러스터를 생성하기 위해 '링크'기능을 지정하는 "evalclusters '기능을 이용하여 평가했을 때 먼저 클러스터의 최적 개수는 계층 적 트리 dendrogram은 (도 2c)에 기초하여 원래의 결론과 일치하는 3이었다. 둘째, PCA는 통계 학적 기여도에 기초 뉴런 그룹핑의 다른 수단으로서 160 TRN 뉴런 10 형태 메트릭 원래의 데이터 행렬에 행 하였다. 세는 GMM에 TRN 뉴런이 1, 2 또는 3 개의 고유 한 클러스터로 그룹화 가정하에 생성되었다. 음의 로그 우도 (NLL)과 아카 이케 정보 기준 (AIC)는 가장 낮은 나왔고, 따라서 대부분의 정보, 값 및 GMM은 (Figur을 TRN 형태의 데이터를 설명하기 위해 3 클러스터를 사용하는 경우 두 값은 최적이었다예 3). 셋째, GMM 기반 클러스터링 별도로 계층 트리 dendrogram은 3. 따라서 관측 세 클러스터 PCA 및 GMM-로 분리 뉴런 걸쳐 형태 메트릭 통계적 비교는 'evalclusters'기능 클러스터의 최적의 수를 사용 하였다 평가 기반 클러스터링하고 각 클러스터 법 (결합 및 GMM)의 별도의 평가는 모두 TRN 뉴런 최적 활용 10 형태 메트릭에 기초하여 3 클러스터로 분리하는 것과 같은 결과를 얻었다.
그림 1 : 데이터 형식. 클러스터 분석을 포함하는 독립 변수의 수에 대응하는 뉴런 m = 5 열의 수에 대응하는 n 개의 행의 예는 데이터 매트릭스 (데이터 매트릭스에 헤더를 포함하지 않는다).
그림 2 : 160 TRN 뉴런의 독립 클러스터링. 시토크롬 산화 효소 활동 스테인드 A. 왼쪽, 하나 동물의 dLGN을 통해 하나의 코로나 부분의 사진, dLGN 층을 시각화하고 GFP에 대해 바이러스 주사를 시각화 할 수 있습니다. 화살표는 고밀도 역행 표시 TRN 뉴런의 영역을 나타냅니다. 제 방향은 아래의 지느러미 - 복부 중간 - 측면 / (DV / ML) 나침반을 다음과 스케일 바는 A의 모든 패널 500 μm의를 나타냅니다. 왼쪽에서 두 번째, 윤곽은 바이러스 주입 (검정 윤곽선)를 포함하는 모든 부분에 대한 dLGN (적색)과 TRN (적갈색)의 설명합니다. 노란색 별은 주사 부위 센터를 나타냅니다. A의 같은 방향 및 규모 바. A의 같은 윤곽과 주사 부위, 방향 및 스케일 바의 왼쪽 3 차원 렌더링에서 세 번째. 오른쪽, 위치지도 재구성의 TRN 신경 세포, 색으로 구분 하나의 집계 TRN 윤곽 (적갈색) 내에서 클러스터 할당 (C)에 따라. A의 같은 방향 및 규모 바. B. TRN 내에서 내측 - 외측 위치에 따라 냉각하는 따뜻한 색깔의 5 재구성 TRN 신경 세포와 TRN (검정) 및 (회색) dLGN의 왼쪽, 총 윤곽. A의 DV / ML 나침반에 따라 방향은, 스케일 바는 500 μm의를 나타냅니다. 오른쪽, 색상 일치 스케일 바의 같은 5 TRN 뉴런의 사진은 100 μm의를 나타내는. C. 10 독립적 인 형태 측정을 기반으로 160 재구성 TRN 뉴런 사이의 연결 거리를 보여주는 클러스터 분석 다음 계층 트리 dendrogram은. 세 개의 클러스터, 녹색, 파란색과 빨간색으로 보여줍니다. 이 그림의 모든 부분은 브래그 등에 포함 된 그림에서 적응하고 있습니다. (리뷰).여윈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 클러스터 평가. 두 개의 다른 기준 값을 플롯 마이너스 로그 우도 (적색 NLL) 및 아카 이케 정보 기준 1, 2 또는 3 개의 클러스터를 가정 GMM에 세에서 생성 (AIC, 블루). (3) 클러스터와 GMM에 최저 기준 값을 제공한다.
기업 코드 파일 : 예제 코드, matlab에 호환 언어로 작성된은, PCA와 GMM이 접근 방식을 사용하여 클러스터 평가 다음에 예를 들어 데이터 행렬에 클러스터 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
신경 해부학 연구는 신경 과학 및 connectomics 및 구조 - 기능 관계에서 최근 관심의 기둥이 선택적 신경 인구의 상세한 형태 학적 특성에 대한 열정을 갱신했다 남아있다. 전통적으로, 신경 해부학 적 연구는 전문가 neuroanatomists에 의해 정의 된 신경 세포의 형태 학적으로 별개의 클래스로 신경 질적 분류에 의존하고있다. 신경 세포를 복원 및 형태 학적 데이터를 추출하는 기술의 진보에 의해,이 공평하게 뚜렷한 형태 학적 신경 클래스 분류 정교한 정량적 데이터 분석 방법을 활용하는 것이 가능하다. 본 연구에서는 단계별 방법 1에 설명되어있다) 바이러스 - 매개 역행 레이블링 방법을 이용하여 각각의 신경 세포를 선택적으로 라벨링 수백; 2) 개별 뉴런의 체계적 재구성 수백은 내 신경 세포의 포괄적 따라서 대표 샘플을 형성한다 선택적 인구; 3) 독립 클러스터링 형태 메트릭에 기초하여 선택 뉴런 집단 내에 최적의 클러스터를 결정하기 위해 통계적으로 분석 평가. 이러한 분석 방법은 TRN 뉴런 기존 데이터 세트에 다른 클러스터링의 방법을 적용하여 검증 우리는 TRN 뉴런 최적 세 형태 학적으로 구별 개체군 클러스터 된 세 개의 분리 된 평가 방법에 기초하여 보여준다.
이 연구에서 설명 된 프로토콜의 가장 큰 장점은 유연성이다. G-삭제 광견병 바이러스는 대상 구조로 주입 다음 역행 레이블 뉴런의 수백 EGFP 발현을 유도하는 효과가있다. 같은 광견병 바이러스 균주는, 짧은 꼬리 원숭이 (개정에서 하세 & 브릭스) 원숭이 5, 9, 흰 족제비, 및 설치류 (7)를 포함한 여러 종의 유사 효과"> 8. 따라서, 변형 된 광견병 바이러스는 선택적으로 표적 구조물에 주입 다음 뉴런의 어느 모집단의 완전한 수지상 arborization 패턴 라벨을 이용할 수있다. DAB / 과산화 반응시켰다 GFP에 대한 항체 염색이 영구적으로 염색이 발생하기 때문에 권장 뉴런을 표시합니다. 그러나, 다른 염색 방법을 사용할 수 있습니다 및 / 또는 형광을 직접 측정하는 원하는 경우. 장점을 시각화 할 수있는 조직 섹션 (이상 노출 형광 표지를 표백) 형광 현미경의 도움없이 현미경으로 시각화 할 수 있습니다 원시 형광 다른 형광 분자의 발현을 구동 다른 바이러스 뉴런 여러 대상 뇌 구조 돌출 여부를 결정하기 위해, 예를 들어 결합 될 수 있다는 것이다. 또한, 상기 설명 된 단계 (예 축삭 및 수상 돌기위한) 모든 이용 가능한 형태의 데이터에 적용될 수있다 점점 더 강력한 모토를 활성화뉴런의 논리적 분류. 또한 광견병 바이러스 소량 또한 돌기에 더하여 축삭 복원 유리할 수 성긴 역행 라벨을 생성하기 위해 주입 될 수 있음을 주목하는 것이 중요하다.
본 연구에 제시된 분석 방법의 또 다른 장점은 상이한 클러스터링 접근법들이 이용되고 비교 될 수 있다는 것이다. 클러스터 분석의 각 단계에서 다른 옵션은 클러스터를 생성하기 위해 간 신경 세포 매개 변수 공간에서 거리뿐만 아니라 다른 알고리즘을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 여러 평가 방법을 사용할 수 있습니다. 수단 최적의 클러스터링을 확인으로 대표 결과 섹션에 설명 된대로 후자는 특히 유용합니다. 의심 할 여지없이, 클러스터를 생성하고 필드 앞으로 이동하면서 사용할 수있게됩니다 최적의 클러스터링을 평가하기위한 추가 알고리즘. 함께, 이러한 분석 방법은 impro 계속신경 해부학 분야의 정량 방법을 발견했습니다과의 견고성을 향상시킨다.
개별 레이블 뉴런의 때문에별로 손 복원은 시간이 소요된다 훈련과 경험을 필요로하며, 여전히 다소 주관적 신경 복원의 자동화에 관심이 증가하고있다. 컴퓨터 기반의 자동 연결을 복원 여전히 오류가 발생하기 쉬운 때문에, 전자 현미경 기반의 신경 해부학 적 데이터는 여전히 (예 17 참조) 사람들에 의해 분석된다. 그러나, 자동화 된 신경 재구성 가까운 미래에 제공 될 가능성이 높다. 자동 신경 재구성 따라서 클러스터링 분석하고 필드는 기술적 발전을 계속하는 여기에 설명 된 평가 방법은 더 중요해질 것이며, 데이터 분석 끝에 더 조사를 필요로한다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 박사에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 이전 연구와 리비 Fairless 및 Shiyuan 리우의 연결 복원에 대한 도움말의 일환으로 준비 조직을 사용할 수 있도록하기위한 에드 캘러웨이와 마티 Usrey. 그리고 화이트 홀 재단 :이 작품은 NIH (EY018683 NEI)에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
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