Масштабные реконструкций и независимой, беспристрастной кластеризация на основе морфологических показателей для Классифицировать Нейроны в селекционных популяциях

Summary

Этот протокол описывает крупномасштабные реконструкций селективных популяций нейронов, меченных следующие ретроградной инфекции с модифицированным вирусом бешенства выражения флуоресцентные маркеры, и независимый, беспристрастный кластерный анализ, которые позволяют всестороннюю характеристику морфологических показателей среди различных нейрональных подклассов.

Abstract

Этот протокол описывает крупномасштабные реконструкции нейронов в сочетании с использованием независимого и объективного анализа кластеризации для создания комплексного обследования морфологических характеристик наблюдаемых среди селективного нейронного населения. Сочетание этих методов представляет собой новый подход для сбора и анализа данных нейроанатомической. Вместе эти методы позволяют крупномасштабные, и, следовательно, более всеобъемлющий, отбор проб селективных популяций нейронов и установить объективные количественные методы для описания морфологически уникальных нейронные классов внутри популяции.

В протоколе описано использование модифицированного вируса бешенства, чтобы селективно маркировать нейроны. G-удален вирус бешенства действует как ретроградный трассирующими следующие стереотаксической инъекции в целевой структуре мозга интерес и служит в качестве транспортного средства для доставки и экспрессии EGFP в нейронах. Большое количество нейронов заражены с помощью этоготехника и выразить GFP на протяжении всей их дендритов, производя "Гольджи типа" Complete заливку отдельных нейронов. Соответственно, метод ретроградного трассировка вирус-опосредованной улучшает традиционных методов ретроградной трассировки на основе красителя, производя полные внутриклеточные заливок.

Отдельные хорошо изолированные нейроны, охватывающие все регионы области мозга при исследовании выбраны для реконструкции для того, чтобы получить репрезентативную выборку нейронов. Протокол изложены процедуры по восстановлению клеток тела и завершить дендритные паттерны разветвление меченых нейронов, разделенного на несколько срезов ткани. Морфологические данные, в том числе позиции каждого нейрона в структуре головного мозга, извлекаются для дальнейшего анализа. Стандартные функции программирования были использованы для выполнения независимого кластерного анализа и оценки кластеров на основе морфологических показателей. Чтобы проверить полезность этих анализов, статистическую оценку кластерного анализа Performed на 160 нейронов реконструированных в таламуса ретикулярного ядра таламуса (TRN) от макаки была сделана. Как оригинальный кластерный анализ и статистические оценки, проведенные здесь, показывают, что нейроны TRN разделены на три субпопуляции, каждая с уникальными морфологическими характеристиками.

Introduction

Нейроанатомии является одной из основ нейробиологии ¹ и недавний интерес к "connectomics" возобновила энтузиазм для понимания морфологическое разнообразие популяций нейронов и связей между конкретными нейронами ^2. Методы маркировки и восстановление нейронов значительно улучшились с последними инновациями, включая трассировку генетического и вируса-опосредованного схемы подходов ^{3, 4,} что позволяет более полные морфологические обследования популяций нейронов ^5. В дополнение к улучшению маркировки отдельных нейронов, методы анализа количественных данных также выяснилось , что для проведения независимой и объективной классификации нейронов в различных субпопуляций на основе морфологических данных ^{5, 6.} Эти объективные методы являются усовершенствованием дополнительной traditionaл качественные методы классификации, которые были стандартом в области более ста лет. Цель данного исследования заключается в определении, шаг за шагом, сочетание вирус-опосредованной маркировки нейронов в выборочной совокупности, крупномасштабные реконструкции комплексной выборки этих нейронов и количественного анализа данных на основе независимой кластеризации статистическая оценка. Комбинируя эти методы, мы опишем новый подход к сбору и анализу данных нейроанатомической для облегчения всеобъемлющего отбора проб и объективную классификацию морфологически уникальных типов нейронов в пределах избирательного нейрональной популяции.

В качестве примера этих методов, мы опишем наш анализ большого числа нейронов в пределах одного сектора таламуса ретикулярного ядра (TRN) от макаки. Эти данные взяты из предыдущего исследования ^7. Методы селективного маркировки TRN нейронов, к спинной Lateraл коленчатое ядро таламуса (dLGN) с помощью хирургического инъекции модифицированного вируса бешенства , кодирующей EGFP ^{4, 8} (см Таблицу конкретных материалов / оборудования, строка 2) очерчены. Этот модифицированный вирус бешенства отсутствует ген, кодирующий существенную белковую оболочку, избавляя транс-синаптический движения вируса. После того , как вирус попадает аксонов в месте инъекции, он действует как традиционный ретроградной трассера с важным преимуществом вождения выражение EGFP на протяжении полного ветвления дендритов зараженных нейронов ^{5, 9, 10.} Соответственно, этот G-удален вирус бешенства может быть использован для селективного инфицировать и маркировать любую нейронную популяцию после инъекции и ретроградного транспорта.

Для проведения комплексного анализа конкретной нейрональной популяции, важно, чтобы образец изширокое распределение нейронов в популяции. Поскольку вирус-опосредованный метод маркировки производит полный внутриклеточный "Гольджи типа" заполняет многих нейронов с аксонов в месте инъекции вируса, можно реконструировать очень большой выборки нейронов в полном объеме структуры мозга. Кроме того, так как модифицированный вирус бешенства настолько эффективен при заражении и мечения большого количества нейронов, можно реконструировать сотни нейронов на животное. Процедуры отбора проб 160 нейронов по всему визуальному секторе TRN ¹¹ для того , чтобы создать полную выборку dLGN-выступающими нейронов TRN очерчены. Процесс восстановления отдельных нейронов с помощью системы восстановления нейронов, включая микроскоп, камера, и программное обеспечение восстановления описано. Также описаны методы определения позиции отдельных нейронов в пределах структуры мозга (в данном случае в пределах TRN) и для проверки на вирусы инъекции сидячуюОбъем е и местоположение в пределах структуры (в данном случае в пределах dLGN) с использованием объемного контура реконструкций. Шаги для экспорта морфологических данных и выполнить независимую кластерный анализ на основе морфологических показателей, измеренные для каждого нейрона очерчены. Существуют определенные ограничения на методы кластеризации и есть также множество различных алгоритмов кластеризации доступны. Соответственно, эти варианты и преимущества некоторых из наиболее часто используемых алгоритмов описаны. Кластерный анализ не обеспечивает статистическую проверку уникальности кластеров. Таким образом, дополнительные шаги описаны для проверки оптимальной кластеризацию, а также соотношения между морфологическими данными внутри и между кластерами. Статистические методы оценки кластеров для TRN набора данных, чтобы подтвердить, что TRN нейроны сгруппированы в три уникальных кластеров на основе 10 независимых морфологических показателей описаны.

Таким образом, рассмотрены основные шаги для селективного маркировки, Реконструкции и анализа морфологических данных от определенного нейронного населения, мы опишем методы количественной оценки морфологических различий между нейронами в пределах популяции. Предварительные выводы различных типов нейронов в пределах визуального сектора макаки TRN подтверждены отдельные методы статистической оценки. Вместе мы надеемся, что эти методы будут широко применяться для нейроанатомической наборов данных и помочь установить количественную классификацию разнообразия популяций нейронов через мозг.

Protocol

Примечание: Ткань рассмотрены в данном исследовании , была подготовлена в качестве части отдельного исследования ^5. Поэтому все экспериментальные методы , связанных с использованием животных, были подробно описаны в разделе Экспериментальные методы Бриггс и соавт. (2016 г.). Все процедуры, связанные с животными, проводимых в рамках предварительного исследования были одобрены уходу и использованию животных Институциональные комитеты. Шаги для инъекции вируса в dLGN и гистологической обработки тканей мозга кратко описаны ниже в разделах 1 - 2.

1. Стереотаксическая инъекция

1. Выполнение всех хирургических процедур, в стерильной среде с использованием асептических методов. Пар-стерилизовать все металлические хирургические инструменты, марля и драпировку материал в автоклаве. Стерилизовать все материалы , которые могут быть повреждены паром с использованием химической стерилизации (например , окиси этилена).
2. Индуцируют и поддержания анестезии в соответствии с animal- и рТребования к rotocol конкретным.
   1. Для инъекции вируса у обезьян, вызывают анестезию кетамином (10 мг / кг) и поддерживать животных при полной хирургической анестезии с изофлуран (1 - 3% вдыхают в кислороде) мониторинга истекли CO _2, ЭКГ, частота дыхания и температуры непрерывно и периодически проверять для челюсти тон, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезирующего средства.
3. Поместите животное в стереотаксической рамы , чтобы стабилизировать положение головы и позволить использование стереотаксической координат , чтобы найти структуру инжекции интерес (например , dLGN). При измерении визуальные ответы, место глазные капли (1% атропина глаза капли, если расширение зрачков желательно, иначе глазные капли физиологического раствора), а затем контактные линзы в оба глаза, чтобы предотвратить сухость кожи. Если измерение не проводится визуальных ответов, место глазной мази в глаза.
4. Сделайте срединный разрез кожи головы и убрать кожу и мышцы.
5. В соответствии с стереотаксической координаты интересующей структуры (dLGN) в одном hemisphERE, сделать небольшой краниотомии.
6. Постепенно опустить регистрирующего электрода (например , вольфрам или платина / иридий электрод (см Таблицу конкретных материалов / Оборудование, строка 3) , прикрепляемых к микроманипулятор , который устанавливается вручную) через Краниотомия в мозг. Нижний импеданс (<1 МОм) и немного толще (диаметром ~ 250 мкм), электроды могут быть использованы, чтобы проникнуть через твердую мозговую оболочку, при желании.
7. Запишите положение манипулятора на поверхности коры и в точке, где измеряются визуальные ответы. Визуальные ответы слышны, время автоподстройки нейронные реакции на свет блеснул в глазах с офтальмоскопа или небольшой светодиодный фонарик /.
8. Определить расположение и толщину dLGN, отметив манипуляторов позиции в начале, середине и конце визуальных ответов и вычитая корковой положение поверхности от этих значений. Запись глубины для каждого планируемого места инъекции в пределах dLGN.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Похожие процедуры, применяемыеРез может быть использован для определения местоположения без визуальных структур с помощью соответствующих сенсорных стимулов. Кроме того, системы в сочетании записи / инъекций также может быть использована для целевых небольших структур мозга.
9. После того, как оптимальные места впрыска отмечены, снимите электрод записи и поместить инъекционный пипетку (стеклянную пипетку или шприцем) в то же стереотаксической позиции и нижней на соответствующую глубину для каждой инъекции, начиная с самого глубокого места инъекции и приступить к неглубокая, ожидая, по крайней мере 1 мин после инъекции перед изменением положения электродов. Стеклянные пипетки с наружным диаметром ~ 50 мкм, может уменьшить обратный поток вируса по сравнению с кончиков шприца (~ диаметр 200 мкм).
10. Используя систему впрыска (см Таблицу конкретных материалов / безалког т, строка 4), picospritzer или шприцевой насос, вводят небольшие объемы (1 - 5 мкл; обратитесь к инструкции производителя для процедур инъекций) модифицированного вируса бешенства в течение нескольких (3 - 10) глубинысо скоростью ~ 100 нл / мин в пределах целевой структуры (dLGN). Примечание: Отдельные проникновений инъекций могут быть сделаны в более крупных структур - мишеней (например , обезьяны dLGN). Полного объема впрыска в зависимости от размера целевой структуры.
11. Пауза по крайней мере, за 5 мин до втягивания инъекционную пипетку. При инъекции пипетка удаляется, заполняют краниотомия с защитным материалом (клей кости кусок в месте, применяют костный воск или Gelfoam), а затем сшивать мышцы и кожу вместе.
12. Администрирование анальгетики (например , кетопрофен) и антибиотики до окончания операции и контролировать животное непрерывно , пока животное не амбулаторное.
13. По крайней мере, 3-х дней и до 10 дней после операции, контролировать животных ежедневно, чтобы обеспечить швы чистыми, сухими и неповрежденными и животное не проявляет никаких признаков боли или дискомфорта. Администрирование ежедневные анальгетики и антибиотики в соответствии с требованиями. Начинают социальное жилье послеоперационной животное после того, как животное полностью восстановился после операции.
</ Ол>

2. Ткань Заготовка, секционирования и Окрашивание

1. Разрешить 7 - 14 дней для ретроградного переноса вируса, затем эвтаназии животных путем передозировки раствора эвтаназии (например Euthasol) и заливать животное транскардиальную с 0,1 М фосфатным буферным раствором, 4% параформальдегида, затем 4% параформальдегидом с 10% сахарозы.
2. Удалить мозг (см ¹² для аналогичных шагов в модели с грызунами) и место в 20 - 30% сахарозы с 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера и хранить в холодильнике в течение 1 - 2 дней.
3. Когда мозг канул на дно контейнера, удалите его и разрезать ткань на блоки , содержащие область мозга с ретроградно меченых нейронов (например , зрительной коры) и целевую структуру инъекции (например , dLGN). Вырежьте те же блоки ткани от не впрыскивается полушария - это будет служить в качестве контрольных участках. Для достижения наилучших результатов, начинают гистологические процедуры immediatelу на свеже секционного ткани.
4. Раздел ткани коронковой при толщине 50 мкм на участке с использованием микротома замораживания (см Таблицу конкретных материалов / оборудования, строка 5).
5. Пятно все разделы для цитохромоксидазы активности (см Таблицу конкретных материалов / оборудования, строки 5 - 8) для визуализации корковых слоев и подкорковых структур ^13. Примечание: Секции могут храниться на ночь в холодильнике в последнем полоскании после цитохромоксидазы пятно.
6. Добавьте все разделы с первичным антителом против GFP (1: 1000 разбавления, ~ 12 ч инкубации, см таблицу конкретных материалов / оборудования, строка 9) с последующим вторичным антителом , совпадающим с первичного хозяина и помечены с биотином ⁵ (1: 500 разведение , 2 - 4 ч инкубации; см таблицу конкретных материалов / оборудования, строка 10). Рекомендуется инкубировать секций во вторичной ночи антител.
7. Разделы Этикетка с авидин / биотин комплекса затем реагируют с ДАБ и перекисью постоянно окрашивает все маркированные нейроны ^5.
8. Установите секции на подкровать стеклах и просушить в течение ночи.
9. Defat секции с использованием ряда спирта и ксилола затем покрывают полоскания скольжения ^14.

3. Нейрональная Реконструкция

ПРИМЕЧАНИЕ: Все реконструкций для оригинальных экспериментов были сделаны с использованием системы реконструкции нейрон , составленную из микроскопа (см Таблицу конкретных материалов / оборудования, строка 14), прикрепленную камеру (смотрите таблицу конкретных материалов / оборудования, строка 13) и программное обеспечение реконструкции пакет (см таблицу конкретных материалов / оборудования, строки 11 - 12). нейронная реконструкция программного обеспечения при содействии позволяет визуализировать горками ткани, наложенных с компьютером на основе чертежей нейрональных процессов. Важно отметить, что программное обеспечение оцифровывает морфологическое Восстановленныйданные Тион в трех измерениях, что позволяет извлечение позиции конкретной морфологической информации. Соответствующая программа извлечения данных (см Таблицу конкретных материалов / оборудования, строка 12) обеспечивает извлечение богатого набора морфологических данных от каждой сохраненной реконструкции.

1. Поместите слайд в держатель слайдов микроскопа и сосредоточиться на одной секции интересов с использованием цели низкого увеличения (например , 2X или 10X). Убедитесь, что изображение с камеры отображается в окне программного обеспечения путем надлежащего позиционирования затвора камеры.
2. Выберите меченных нейронов в пределах структуры мозга интереса (например , РНН), которые достаточно изолированы таким образом , чтобы однозначно реконструировать , как большая часть ветвления дендритов , насколько это возможно. Предпочтительно выбирать нейроны, если тело клетки полностью в пределах одной секции, чтобы захватить самую большую протяженность каждой клетки тела и точно оценить его площадь и округлости. Используйте цель 10X микроскоп для идентификации клеток боды в домашней секции.
3. После того, как хорошо окрашенные, хорошо изолированные нейрон идентифицируется, добавьте раздел "домашний", содержащий тела клетки к секции диспетчера, нажав на кнопку "Новый раздел". Введите число секций для включения (рекомендуется 2 - 3 секции, чтобы начать). Назначьте раздел толщиной 50 мкм при появлении соответствующего запроса (шаг 2.3).
4. Очертить контуры соответствующих структур головного мозга в секции дома, содержащей тело клетки. Используйте 2X задачу / увеличения для отслеживания контура.
   1. Во- первых, выберите "Контур" из выпадающего меню на верхней панели , а затем выберите тип контура из выпадающего меню (например , "LGN" или "РНН").
   2. Трассировка контуры целевой структуры (например , TRN), а также соседние структуры, если это необходимо, нажав на точки вдоль контура с помощью мыши в качестве инструмента дро.
   3. Выберите "Замкнуть контур", щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав эту опциюиз меню, чтобы заполнить и приложить каждый прослежена контур.
5. Поместите маркер в центре целевой структуры, нажав на требуемый символ маркера на правой панели, а затем нажав на нужное место в реконструкции, чтобы поместить маркер в этом месте. Используйте один и тот же тип маркера, чтобы отметить центр целевой структуры во всех реконструкций.
6. После того, как контуры будут завершены, проследить контур тела клетки с использованием 40 - 60X цели / увеличение. Для этого сначала выберите "Neuron" из выпадающего меню на верхней панели, а затем выбрать структуру нейрон, чтобы проследить, в данном случае "Cell Body". Далее след тела клетки, как и в 3.4.
7. Поместите другой маркер стиля в центре тела клетки, следуя инструкциям, изложенным в 3.5.
8. Трассировка всех дендриты, начинающаяся в теле клетки.
   1. Во-первых, выберите "Dendrite" из выпадающего меню. Затем отслеживать каждую дендриты, начиная с клеточного боду и с помощью мыши в качестве инструмента дро. Обязательно для регулировки Z-глубину по всей трассировку, чтобы точно фиксировать угол и направление дендрита.
   2. Поместите узел в каждой точке ветвления вдоль дендритов, щелкнув правой кнопкой мыши мыши и выбрав пункт "бифурцирующих узел" или "Trifurcating Node" из выпадающего меню. Используйте 40 - 60X цель / увеличение для всех дендритных реконструкций.
   3. В конце каждого дендрита, правой кнопкой мыши и выберите пункт "Завершение" из выпадающего меню.
9. Определение дендритных окончаний, которые, вероятно, продолжится и в соседней секции и привести их в фокус в соответствующем г глубины в микрофотографии. Включают в себя основные достопримечательности поблизости, такие как кровеносные сосуды или легко узнаваемых дендритных узоров или пучков в микрофотографии.
   1. Уменьшите увеличение до 20х или 10х на микроскоп (выбрать увеличение, которое позволяет максимально визуализировать знаковый), а также принятьизображение микроскопа изображения с помощью цифровой камеры (например , сотовый телефон, планшет) ручной на экран компьютера.
10. Переход к соседней секции на слайде и выстраиваются контуры ранее прослежена секции с границами dLGN и TRN в новом разделе.
11. Возвращает поле зрения к общей площади тела клетки (на основе контуров и основных ориентиров) и довести увеличение обратно до 10 - 20Х.
12. Используйте фотографию дендритных окончаний из ранее прослежена секции, чтобы помочь в согласовании окончаний с начала дендритов в новом разделе.
    1. Чтобы повернуть трассировку и переместить его, чтобы выровнять дендриты, используйте инструмент со стрелкой, чтобы выбрать реконструкцию, щелкните правой кнопкой мыши и выберите "Переместить" из выпадающего меню.
    2. В качестве альтернативы, используйте "Match" инструмент, чтобы соответствовать дендритных окончаний к началам. Выберите инструмент Матч из верхней панели и при появлении запроса нажмите на окончаниев реконструкции и соответствующей точкой продолжения в изображении. Повторите эти действия для 3-х или более окончаний.
13. После того, как трассировка из предыдущего раздела выстроились с дендритов в новом разделе, убедитесь, что соответствующий новый раздел выбран в менеджере раздела, нажав на текущем разделе. Или добавить новый раздел в разделе Управление, как описано выше в разделе 3.3, регулируя Z-глубину и положение каждого нового раздела относительно секции дома соответственно и установки каждой секции толщину до 50 мм (см Шаг 2.3).
14. Увеличение увеличение до 40 - 60X и проследить дендритных продолжений, щелкнув правой кнопкой мыши на конце дендрита от реконструкции и выбрав пункт "Добавить в Ending" из выпадающего меню, а затем прослеживая дендриты с помощью мыши, как рисовать инструмент. Выполните запрос, чтобы указать, если продолжение в новом разделе.
15. Последующие дендритов через по крайней мере, 3-х соседних секций (по одному с каждой сторонысекция дом) следующие шаги 3.8 - 3.15. Добавить в реконструкцию, пока по крайней мере 3 Всего разделов прослеживаются на нейрон или пока дендриты не может больше следовать или найдены. Трассировка контуры в соседних секциях следующие действия, описанные выше, если это необходимо.

4. Независимый кластеризация

Примечание: Независимый кластерный анализ позволяют объективные анализы больших, многомерных массивов данных, которые могли бы быть трудно визуализировать и, что очень важно, дать количественную оценку морфологического разнообразия. Матрица на основе программной платформы является весьма полезным для анализа многомерных наборов данных и позволяет сложные манипуляции с данными и статистический анализ. Функции , перечисленные в пунктах 4 - 6 определены в программной платформы , перечисленных в таблице конкретных материалов / оборудования, строка 15.

1. Извлечение морфологические данные из каждого отдельного нейронного реконструкции с использованием добraction программа , связанная с системой восстановления нейрон (см Таблицу конкретных материалов / оборудования, строки 11 - 12).
   1. Во- первых, выбрать морфологические данные нужные для каждой реконструкции , включая: информацию контура, информации маркера, морфологических данных клеток тела и ветвления дендритов и др.
   2. Из выпадающего меню Edit в верхней панели инструментов, выберите пункт "Выделить все объекты". Затем выберите "разветвленная структура Анализ" из выпадающего меню Analysis в верхней панели и нажмите на каждой вкладке и выбрать нужные параметры анализа в каждой вкладке.
   3. Извлеките все необходимые данные, нажав на кнопку "OK" в окне анализа и сохранить в формате электронной таблицы, щелкнув правой кнопкой мыши на выходные окна и выбрав пункт "Экспорт в Excel".
2. Составьте таблицу Master (смотрите таблицу конкретных материалов / оборудования, строка 16) , в котором каждая переменная морфологическое / менятрический представлена ​​одним численным наблюдения за нейроном. В этом мастер-таблицы, вести запись идентификатора строки для каждого нейрона.
3. Убедитесь , что все переменные , включенные в кластерном анализе (например , морфологический метрики) являются независимыми друг от друга. Например, количество узлов будет коррелировать с числом ветвей в дендритной или аксонального разветвление. Соответственно, только один из этих двух переменных должны быть включены в кластерном анализе.
4. Убедитесь , что каждое измерение содержит наблюдение за каждой переменной, т.е. каждый нейрон (измерение), должны иметь точку данных (наблюдение) , соответствующую каждой морфологической метрики (переменной). Если наблюдения для конкретной переменной (например, длина аксонов) отсутствуют для подмножества нейронов, эта переменная (длина аксонов) не могут быть включены в кластерном анализе.
5. Организация данных на мастер электронной таблицы в одну матрицу, в которой каждая строка представляет собой нейрон и EACч столбец содержит числовые данные для каждого морфологического метрики (рисунок 1). Например, набор данных, в том числе 100 нейронов, для которых имеются наблюдения за 5 независимых переменных были бы представлены матрицей 100 х 5 (строка за колонки). Нет необходимости включать любую идентификацию для каждого нейрона в матрице - индекс строки будет служить уникальным идентификатором каждого нейрона. Там также не должно быть никаких пробелов или "NaN" s в матрице. Сохраните матрицу в виде одной переменной (например , Data = [100 х 5 матрица], см Дополнительный файл кода для образца кода).
6. Выберите алгоритм вычисления расстояний между точками, представляющими отдельные нейроны в п-мерном пространстве, где п определяется числом переменных. Функция 'pdist' позволяет гибкость при расчете между нейроном-расстояния. Расчет расстояния по умолчанию является евклидово расстояние и использовалась ранее для подобных анализов нейронного morphologicaл данные ^{5, 6.}
7. С между нейроном-дистанцируется вывод функции 'pdist', используйте функцию '' сцепления для формирования кластеров. Опять же, несколько вариантов кластеризации доступны. Метод Уорда и центроид расстояние дали аналогичные результаты при анализе морфологических наборов данных ^{5, 6.}
8. При желании использовать функцию 'kmeans' в качестве альтернативного подхода к кластерной функции 'подъёмник' 'pdist' и. 'kmeans' квадрат евклидовой нанимает расстояние для расчета между нейроном-расстояния, а затем центроид расстояние для назначения кластеров.
9. Для визуализации иерархическую кластера дерева, используйте функцию 'дендрограммы' на выходе операции «рычажной». Эта функция имеет значение по умолчанию, которая ограничивает визуализацию до 30 измерений, но оно может быть изменено путем указания количества измерений (<EM> например , нейроны) отображается. Дендрограмму иллюстрирует связь расстояния на оси у для каждого из нейронов, которые были определены их индексом строки на оси х.
   Примечание: Выходы "связи" и "дендрограммы" не определяют оптимальное количество кластеров. Выход 'kmeans' делает назначать измерения для кластеров, но не испытывает ли эти кластеры являются оптимальными. Отдельные статистические сравнения и проверка оптимальной кластеризации может быть выполнено (см ниже).

5. Проверка кластеризации

Примечание: Как указано выше, сам кластерный анализ непосредственно не предоставляет статистическую оценку того, насколько кластеры, представленные в кластере дендрограммой являются уникальными и представитель образца. Методы проверки кластеров из дендрограммы были предложены ^15, однако они не обеспечивают статистическую проверку оптимальной кластеризации. Есть несколькоPLE методы проверки оптимальной кластеризации.

1. Метод 1: Оценка кластеризации:
   1. Используйте функцию 'evalclusters', указывающий метод, используемый для расчета кластеров, таких как «kmeans» или «связи». Гауссово выход модели смесь также можно оценить (шаг 5.2 ниже, см Дополнительный файл кода для образца кода).
   2. Укажите критерий оценки из нескольких вариантов (например , 'CalinskiHarabasz' - для описания вариантов критерия, обратитесь к меню Справка, поиск "evalclusters").
   3. Укажите диапазон оптимальных номеров кластеров для тестирования (например , [1: 6] , чтобы проверить , является ли 1, 2, 3, 4, 5, или 6 кластеров являются оптимальными).
      Примечание: Выход 'evalclusters' представляет собой оптимальное число кластеров данных алгоритм кластеризации и критерий, указанный.
2. Способ 2: гауссова модель смеси кластеризация:
   Примечание: Gaussian смесь модель кластеризация Algorithms (ГММ) предполагают, что наблюдения для каждой переменной приходят из смеси гауссовых распределений, определяющих каждую предполагаемую кластер, каждый со своим средним значением и ковариации. GMM затем использует алгоритм максимизации ожидания для назначения апостериорные вероятности для каждого измерения, что указывает на вероятность принадлежности к определенной группе ^16.
   1. Реализация GMM с помощью '' fitgmdist функцию путем ввода предполагаемого количества кластеров, наблюдаемых в данных. В качестве альтернативы, чтобы избежать априорное распределение числа кластеров, использовать анализ главных компонентов (PCA) с серией различных оптимальных номеров кластеров , используя шаги , описанные здесь (см Дополнительный файл кода для образца кода).
   2. Используйте функцию 'PCA' на исходной матрицы данных и сохранить основные оценки компонентов в качестве выходного сигнала.
   3. В цикле, начиная с 1 и проходящей через некоторое число предполагаемых оптимальных кластеров, использовать й'Fitgmdist' функция е на основные оценки компонентов и генерировать ГИМ для каждого числа предполагаемых оптимальных кластеров.
   4. Оцените каждый GMM, исследуя отрицательную логарифмическое правдоподобие, информационный критерий Akaike и информационный критерий Байеса. ГММ с самыми низкими критериями является оптимальным.
   5. При желании, проверить, является ли средние значения для каждого кластера существенно различаются, когда количество кластеров является оптимальным (средства каждого кластера сохраняются в "му" выходе каждого GMM).

6. Статистический анализ Кластерный данных

1. После того, как оптимальное количество кластеров определяется с использованием иерархической кластеризации и оценены, вернуться к исходным данным, отдельных нейронов в кластеры, и определить, какие морфологические показатели способствуют агрегацию нейронов в уникальных классов.
2. Сортировать исходные морфологические метрические данные таким образом, что нейроны группируются в соответствии с назначением кластера. Для изучения взаимосвязи между морфологическими данными между нейронами (для всех нейронов или для нейронов, разделенных на кластеры), выполняют линейной регрессии подходит к 2- и 3-ходовые сравнения морфологических метрических наблюдений. Эти припадки могут быть оценены с помощью "годных" функцию и оценивали , используя функцию 'fitlm' , в которой СОГЛАСИИ выходы включают значения R ² и р для регрессии припадков.
3. Для изучения статистических связей между нейронами в каждом кластере, используют непараметрические двухвыборочная (Уилкоксона тест суммы рангов) или множественного сравнения образцов тестов (ANOVA), в зависимости от количества кластеров. Важно отметить, что использование нескольких образцов ANOVAs гарантирует, что значения р корректируются для множественных сравнений.

Representative Results

Ранее мы показали , что крупномасштабные реконструкции нейронов в пределах выборочной совокупности возможна после инъекции модифицированного вируса бешенства в dLGN ^5. В последнее время в той же ткани была использована для восстановления 160 нейронов в зрительной секторе TRN (Брэгга и др, в обзоре;. Рисунок 2А-В) в соответствии с подробными методологических этапов , описанных выше. В исследовании TRN, три уникальных скоплений TRN нейронов были определены на основании независимого кластерного анализа 10 морфологических метрик: области тела клетки, округлость тела клетки, медиально-боковое положение по отношению к центру РНН, спинным-вентральной позиции в пределах TRN , количество дендритных деревьев, среднее дендритов расстояние до узлов, средней длины 3 - ^го и более высоких порядков дендритов, средний угол 1 - ^го порядка дендритов, средний угол сдвига фаз от общего ветвления дендритов, и угловое отклонение длятал дендритных разветвление. TRN нейроны были распределены по эквивалентно этих трех кластеров (рис 2С). Отдельные статистические сравнения всех 10 морфологических показателей через нейронов в трех кластерах дали статистически значимые различия между кластерами для всех, кроме двух морфологических показателей, включенных в оригинальной кластерного анализа. Таким образом, на основе иерархического дерева дендрограммой генерируемой из кластерного анализа (фиг.2с) и отдельных статистических сравнений морфологических показателей , по кластерам, РНН нейроны подразделяются на три уникальных групп.

В данном исследовании мы особенно хотели применить статистические методы для оценки отдельно кластеров определяли с помощью кластерного анализа. TRN набор данных из предыдущего исследования оценивали, чтобы определить, были ли оптимальным три кластера наблюдается. Отдельный дополнительный кластерный анализ, а именно PCA и GMM CLUSсеяние, были выполнены , чтобы проверить предыдущие методы кластеризации (Рисунок 1). Три ключевых результатов отдельно проверки предварительного кластерного анализа. Во - первых, когда оригинальный метод кластерного анализа оценивали с помощью функцию "evalclusters" задание функции "навески" для создания кластеров, оптимальное количество кластеров было 3, соответствие первоначальный вывод , основанный на иерархическом дереве дендрограммы (рис 2С). Во-вторых, РСА была выполнена на оригинальной матрицы данных 10 морфологических показателей для 160 TRN нейронов в качестве альтернативного средства группировки нейронов на основе вкладов морфологических показателей. Три ГММ генерировались, предполагая TRN нейроны были сгруппированы в 1, 2, или 3 уникальных кластеров. Отрицательный логарифм правдоподобия (СДЛ) и информационный критерий Akaike (АИК) дает самый низкий, и , следовательно , наиболее информативными, значения и оба значения были оптимальными , когда GMM использовали 3 кластеров для описания TRN морфологические данные (Figurе 3). В-третьих, на основе GMM кластеризация была отдельно оценивали с использованием функции 'evalclusters' и оптимальное количество кластеров было 3. Таким образом, наблюдения иерархического дерева дендрограммы, статистические сравнения морфологических показателей через нейроны разделены на три основные группы, PCA и GMM- на основе кластеризации, так и отдельные оценки каждого метода кластеризации (рычажного и GMM), все дали тот же результат, что TRN нейроны оптимально разделены на 3 кластеров на основе 10 морфологических показателей, используемых.

Рисунок 1: Формат данных. Матрица Пример данных с п строк, соответствующих количеству нейронов и т = 5 столбцов, соответствующих общему числу независимых переменных, чтобы включить в кластерном анализе (не включают в себя заголовки в матрице данных).

Рисунок 2: Независимый Кластеризация 160 TRN нейронами. A. Левая, фотография одной секции корональной через dLGN одного животного, окрашивали для цитохромоксидазы активности для визуализации dLGN слоев и против GFP для визуализации инъекции вируса. Стрелка указывает на области плотных ретроградно меченых нейронов TRN. Ориентация Раздел следует спинной-вентральной / медиально-латеральный (DV / ML) компас ниже и масштаб столбик представляет 500 мкм для всех панелей в. Во-вторых слева, контур очертания dLGN (красный) и TRN (темно-бордовый) для всех разделов, содержащих инъекции вируса (черные контуры). Желтые звезды указывают на центры в месте инъекции. Ориентация и масштаб баров , как в. Третий слева, 3-D визуализации контуров и укола, ориентации и масштаба баров , как в. Право, карты расположения реконструированных TRN нейроны, цветовым кодом в соответствии с назначением кластера (C) в пределах одного агрегатного TRN контура (темно - бордовый). Ориентация и масштаб баров , как в. B. Слева, совокупные контуры TRN (черный) и dLGN (серый) с 5 реконструированных нейронов TRN цветные тепло для охлаждения в соответствии с их медиально-латеральной позиции в TRN. Ориентация по компасу DV / ML в A, Шкалы представляет 500 мкм. Право, фотографии одних и тех же 5 TRN нейронов с цветовыми соответствием шкалы баров составляет 100 мкм. C. Иерархического дерева дендрограммы следующие кластерного анализа, иллюстрирующего сцепления расстояний между 160 реконструированных нейронов TRN на основе 10 независимых морфологических показателей. Три кластера показано в синий, зеленый и красный. Все части этой фигуры выполнены из фигур , включенных в Брэгг и др. (в обзоре).тощий "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Оценка кластера. Участок двух различных значений критерия, отрицательный логарифм правдоподобия (НБЛ, красный) и информационный критерий Акайке (АИК, синий), полученные от трех ГММ предполагающих 1, 2, или 3 кластеров. ГММ с 3 кластерами обеспечивают самые низкие значения критерия.

Справочная Файл код: Пример кода, написанный в Matlab-совместимого языка, для выполнения кластерного анализа на примере матрицы данных с последующей оценкой кластера с помощью РСА и GMM подходов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Нейроанатомической исследования оставались опорой нейробиологии и в последнее время интерес к connectomics и структурно-функциональных отношений возобновился энтузиазм по поводу детального морфологического характеристик селективных популяций нейронов. Традиционно нейроанатомические исследования опирались на качественные классификации нейронов в морфологически различных классов нейронов, определенных экспертных нейроанатомами. С развитием методов для восстановления нейронов и извлечения морфологических данных, теперь можно использовать более сложные и количественные методы анализа данных для классификации морфологически различные нейронные классы беспристрастно. В этом исследовании, шаг за шагом методы описаны для 1) избирательно маркировочная сотни отдельных нейронов с использованием вируса-опосредованного ретроградные методы маркировки; 2) систематически реконструируя сотни отдельных нейронов, чтобы сформировать комплексную и поэтому репрезентативную выборку нейронов в пределах избирательное население; и 3) независимый кластеризация анализ статистической оценки для определения оптимальных кластеров нейронов в выборочной совокупности на основе морфологических показателей. Эти методы анализа проверяются путем применения различных методов кластеризации к существующему набору данных ТРН нейронов и мы демонстрируем на основе трех отдельных методов оценки, которые TRN нейроны оптимально подразделить на три морфологически различных подгруппах.

Одним из основных преимуществ протоколов, описанных в данном исследовании, является их гибкость. G-удалил вирус бешенства был эффективным в вождении выражение EGFP в сотни ретроградно меченых нейронов после инъекции в целевую структуру. В тот же штамм вируса бешенства является так же эффективен в нескольких видов , включая макак ^{5, 9,} хорьков (Хассе и Бриггс, в пересмотре), и грызунов ^7,"> 8. Соответственно, модифицированный вирус бешенства может быть использован для селективного мечения полные древовидные образцы разветвление любой популяции нейронов после инъекции в целевую структуру. Антитело окрашивание против GFP с последующим ЦАВ реакции / пероксид рекомендуется , так как это вызывает постоянное окрашивание меченных нейронов и позволяет срезы ткани должны быть визуализированы под микроскопом без помощи флуоресцентной микроскопии (которая отбеливает флуоресцентную метку с более длительным воздействием). Тем не менее, альтернативные методы окраски доступны и / или флуоресценции можно непосредственно визуализировать, если это необходимо. преимуществом для измерения сырой флуоресценция является то, что различные вирусы стимулировать экспрессию различных флуоресцентных молекул могут быть объединены, например, чтобы определить, является ли проецировать нейроны нескольких структур мишени головного мозга. Кроме того, шаги, описанные выше, могут быть применены ко всем имеющимся морфологическими данными (например аксонов и дендритов) для того, чтобы все более надежные морфологическая классификация нейронов. Важно также отметить, что меньшее количество вируса бешенства также может быть введен для того, чтобы генерировать ретроградной маркировки редкой, что может быть выгодным для реконструкций аксонов в дополнение к дендритов.

Дополнительное преимущество методов анализа, описанных в данном исследовании, является то, что несколько различных подходов кластеризации могут быть использованы и в сравнении. На каждом этапе кластерного анализа, различные варианты доступны для расчета между нейроном-расстояния в пространстве параметров, а также различные алгоритмы для генерации кластеров. Кроме того, несколько методов оценки доступны. Последнее особенно полезно в качестве средства для проверки оптимальной кластеризации, как указано в разделе Результаты представительства. Несомненно, что дополнительные алгоритмы для генерации кластеров и для оценки оптимальной кластеризации станут доступны как поле движется вперед. В совокупности эти методы анализа будут продолжать Improве количественных подходов в области нейроанатомии и повысить надежность результатов.

Существует растущий интерес к автоматизации нейрональных перестроек, потому что по-стороны реконструкций отдельных меченых нейронов занимает много времени, требует подготовки и опыта, и по-прежнему несколько субъективный характер. Так как компьютерные автоматические нейрональные реконструкций по - прежнему подвержены ошибкам, электронная микроскопия на основе нейроанатомические данных по - прежнему анализируются людьми (смотри, например , ^17). Тем не менее, вполне вероятно, что автоматизированная нейронная реконструкция будет доступна в ближайшее время. Автоматизированная нейронная реконструкция потребует еще более пристального внимания к концу анализа данных, таким образом, кластеризация анализ и методы оценки, описанные здесь, станут еще более важно, так как поле продолжает продвигаться вперед в технологическом плане.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute		Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten	FHC	UEPSGGSE1N2M	Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204, 110V	Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome	Thermo Scientific
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
Catalase	Sigma-Aldich	C9322-5G
Rabbit anti-GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	#BA-1000	Secondary antibody
Neurolucida System	MicroBrightField		Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		Data export software
Microfire Camera	Optronics		2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope	Nikon Instruments Inc.		Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	Microsoft		Spreadsheet program