Storskaliga rekonstruktioner och oberoende, opartisk Kluster Baserat på morfologiska Metrics att klassificera nervceller i selektiva populationer

Summary

Detta protokoll beskriver storskaliga rekonstruktioner av selektiva neuronala populationer, märkta efter retrograd infektion med ett modifierat rabiesvirus som uttrycker fluorescerande markörer, och oberoende, opartisk kluster analyser som möjliggör omfattande karakterisering av morfologiska statistik bland distinkta neuronala klasser.

Abstract

Detta protokoll beskriver storskaliga rekonstruktioner av nervceller i kombination med användning av oberoende och opartisk klustring analyser för att skapa en omfattande undersökning av de morfologiska egenskaperna observerades bland en selektiv neuronal population. Kombination av dessa tekniker utgör en ny metod för insamling och analys av neuroanatomiska data. Tillsammans utgör dessa tekniker möjliggör storskalig och därmed mer omfattande provtagning av selektiva neuronala populationer och fastställa objektiva kvantitativa metoder för att beskriva morfologiskt unika neuronala klasser inom en population.

Protokollet beskriver användningen av modifierat rabiesvirus för att selektivt märka nervceller. G-utgår rabiesvirus fungerar som en bakåtsträvande spårämne efter stereotaktisk injektion i ett mål hjärnans struktur av intresse och fungerar som en vehikel för leverans och uttryck av EGFP i nervceller. Ett stort antal nervceller infekteras med hjälp av dennateknik och uttrycka GFP hela deras dendriter, som producerar "Golgi-liknande" kompletta fyllningar av enskilda nervceller. Följaktligen förbättrar virusmedierad retrograd spårning metod på traditionella färgämnesbaserade retrograd spårning tekniker genom att producera kompletta intracellulära fyllningar.

Individuella välisolerade nervceller som spänner över alla regioner i hjärnan området under studien ut för återuppbyggnad för att få ett representativt urval av nervceller. Protokollet beskriver förfaranden för att rekonstruera cellkroppar och slutföra dendritiska arborization mönster av märkta nervceller som spänner över flera vävnadssnitt. Morfologiska data, inklusive lägen för varje neuron i hjärnans struktur, extraheras för vidare analys. Standardprogrammeringsfunktioner användes för att utföra oberoende kluster analyser och kluster utvärderingar baserade på morfologiska statistik. För att verifiera användbarheten av dessa analyser, statistisk utvärdering av en klusteranalys performed på 160 neuroner rekonstruerade i thalamus retikulära kärnan i thalamus (TRN) av makakapa gjordes. Både den ursprungliga klusteranalys och statistiska utvärderingar här tyder på att TRN nervceller är uppdelade i tre underpopulationer, var och en med unika morfologiska egenskaper.

Introduction

Neuroanatomi är en av grundvalarna för neurovetenskap ¹ och nyligen intresse "connectomics" har förnyat entusiasm för att förstå morfologiska mångfalden av neuronala populationer och sambanden mellan specifika nervceller ^2. Metoder för märkning och återuppbygga nervceller har förbättrats avsevärt med nya innovationer, inklusive genetiska och virus-medierad krets spårning närmar ^{3, 4,} vilket möjliggör mer omfattande morfologiska undersökningar av neuronala populationer ^5. Förutom förbättringar i märkning enskilda nervceller har kvantitativa data analystekniker också framkommit att möjliggöra oberoende och opartisk klassificering av nervceller i distinkta subpopulationer baserade på morfologiska uppgifter ^{5, 6.} Dessa objektiva tekniker är en förbättring på mer traditional kvalitativa klassificeringsmetoder som har varit standard på området i över ett sekel. Målet med denna studie är att beskriva, steg-för-steg, kombinationen av virus-medierad märkning av nervceller i en selektiv population storskaliga rekonstruktioner av en omfattande urval av dessa neuroner, och kvantitativ analys av data baserad på oberoende klustring med statistisk utvärdering. Genom att kombinera dessa metoder vi skissera ett nytt tillvägagångssätt mot insamling och analys av neuroanatomiska data för att underlätta omfattande provtagning och opartisk klassificering av morfologiskt unika neuronala typer inom en selektiv neuronal population.

Som ett exempel på dessa metoder, beskriver vi vår analys av en stor population av nervceller inom en enda sektor av talamisk retikulära kärnan (TRN) hos makakapa. Dessa data är från en tidigare studie ^7. Metoder för att selektivt märka TRN neuroner skjuter till rygg Lateral geniculate kärnan i thalamus (dLGN) med hjälp av kirurgisk injektion av modifierat rabiesvirus som kodar för EGFP ^{4, 8} (se tabell av specifika material / utrustning, rad 2) beskrivs. Denna modifierade rabiesvirus saknar den gen som kodar ett väsentligt höljesprotein, vilket eliminerar trans-synaptisk rörelsen av viruset. När viruset kommer in i axonet terminaler vid injektionsstället, fungerar den som en traditionell bakåtsträvande spårämne med viktig fördel med att köra EGFP uttryck genom hela dendritiska arborization av infekterade nervceller ^{5, 9, 10.} Följaktligen kan denna G-deleted rabiesvirus användas för att selektivt infektera och märka någon neuronal population efter injektion och retrograd transport.

För att göra en analys av en specifik neuronal population, är det viktigt att ta prov frånen bred spridning av nervceller inom befolkningen. Eftersom viruset medierad märkningsteknik ger fullständig intracellulära "Golgi-liknande" fyller många neuroner med axoner på viruset injektionsstället, är det möjligt att rekonstruera en mycket stort urval av nervceller i den fulla omfattningen av en hjärnstruktur. Dessutom, eftersom den modifierade rabiesvirus är så effektiva på att infektera och märkning stort antal neuroner, är det möjligt att rekonstruera hundratals neuroner per djur. Förfaranden för provtagning 160 neuroner i hela den visuella delen av TRN ¹¹ i syfte att alstra en omfattande prov av dLGN-utskjutande TRN neuroner beskrivs. Processen för att rekonstruera enskilda nervceller med hjälp av en neuron rekonstruktionssystem innefattande ett mikroskop, kamera, och återuppbyggnad mjukvara beskrivs. Vidare beskrivs metoder för att bestämma positionerna för enskilda nervceller i en hjärnstruktur (i det här fallet inom TRN) och för att kontrollera virusinjektion site och lokalisering i en struktur (i detta fall inom dLGN) med hjälp av volymkontur rekonstruktioner. Åtgärder för att exportera morfologiska data och utföra oberoende kluster analyser baserade på morfologiska mått mätt för varje neuron beskrivs. Det finns begränsningar för klustring metoder och det finns också en mängd olika klusteralgoritmer tillgängliga. Följaktligen är dessa alternativ och fördelarna med några av de mer vanligen använda algoritmer beskrivna. Klusteranalysen ger inte statistisk kontroll av det unika i kluster. Därför är ytterligare steg beskrivs att kontrollera optimal kluster samt relationerna mellan morfologiska data inom och mellan kluster. Statistiska metoder för att utvärdera kluster för TRN dataset för att bekräfta att TRN nervceller är grupperade i tre unika kluster baserat på 10 oberoende morfologiska mått beskrivs.

Således, genom att redogöra steg för att selektivt märkning, Rekonstruera och analysera morfologiska data från en specifik neuronal population, vi beskriver metoder för att kvantifiera morfologiska skillnader mellan nervceller i en population. Tidigare resultaten av distinkta neuronala typer inom den visuella delen av makakapa TRN bekräftas med separata metoder statistisk utvärdering. Tillsammans hoppas vi dessa tekniker kommer att vara i stort sett tillämpas på neuroanatomiska dataset och bidra till att fastställa kvantitativ klassificering av mångfalden av neuronala populationer genom hjärnan.

Protocol

Obs: Den undersökta i denna studie vävnad framställdes som en del av en separat studie ^5. Därför är alla av de experimentella metoder som innefattar användning av djur har beskrivits i detalj i den experimentella metoder sektionen av Briggs et al. (2016). Alla som deltar i djurförsök genomförs som en del av den tidigare studien har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittéer. Stegen för injektion av virus i dLGN och histologiska behandling av hjärnvävnad beskrivs kortfattat nedan i avsnitt 1 - 2.

1. Stereotaxic Injektion

1. Utför alla kirurgiska ingrepp i en steril miljö med hjälp av aseptisk teknik. Ånga sterilisera alla metall kirurgiska instrument, gasbinda och dukmaterialet i autoklav. Sterilisera allt material som kan skadas av ånga med hjälp av kemisk sterilisering (t.ex. etylenoxid).
2. Inducera och bibehålla anestesi enligt djur- och protocol specifika krav.
   1. För virus injektion i apor, inducera anestesi med ketamin (10 mg / kg) och underhålla djur under verkliga kirurgisk anestesi med isofluran (1-3% inandas i syre) övervakning löpte _CO2, EKG, andningsfrekvens och temperatur kontinuerligt och regelbundet kontrollera för käken ton för att säkerställa korrekt anestesidjup.
3. Placera djuret i en stereotaxisk ram för att stabilisera huvudets position och att tillåta användning av stereotaktiska koordinater för att lokalisera injektions strukturen av intresse (t.ex. dLGN). Om mäta visuella svar droppar plats öga (1% atropin ögondroppar om pupillvidgning önskas, annars saltlösning ögondroppar) och sedan kontaktlinser i båda ögonen för att förhindra torrhet. Om inte mäta visuella svar placera oftalmologiska salva i ögonen.
4. Göra en mittlinje hårbotten snitt och dra in hud och muskler.
5. Enligt stereotaktiska koordinater för strukturen av intresse (dLGN) i en hemisphere, göra en liten kraniotomi.
6. Gradvis sänka en inspelning elektrod (t.ex. volfram eller platina / iridium elektrod (se tabell av specifika material / utrustning, rad 3) fäst vid en mikromanipulator som manuellt är placerad) genom kraniotomi in i hjärnan. Lägre impedans (<1 Mohm) och något tjockare (~ 250 | j, m diameter) elektroder kan utnyttjas för att penetrera dura, om så önskas.
7. Spela in manipulatorn position vid den kortikala ytan och vid den punkt där visuell respons mäts. Visuella svar är hörbar, tids låst neuronala svar på ljus blixtrade i ögonen med ett oftalmoskop eller små LED / ficklampa.
8. Fastställa belägenheten och tjockleken på dLGN genom att notera roboten positioner i början, mitten och slutet av visuella svaren och subtrahera den kortikala ytan position från dessa värden. Registrera djupet för varje utformat injektionsställe inom dLGN.
   OBS: Liknande procedures kan användas för att lokalisera icke-visuella strukturer med hjälp av lämpliga sensoriska stimuli. Dessutom kan kopplas inspelning / insprutningssystem även användas för att rikta små hjärnstrukturer.
9. När injektion optimala platser noteras, ta bort inspelningen elektroden och placera en injektion pipett (glaspipett eller injektionsspruta) på samma stereotaxic position och lägre till lämpligt djup för varje injektion, börjar med den djupaste injektionsstället och vidare till den grund, väntar minst 1 minut efter injektion innan du byter elektrodposition. Glaspipetter med ytterdiameter ~ 50 um kan minska återflöde av virus jämfört med sprut tips (~ 200 um diameter).
10. Med hjälp av ett insprutningssystem (se tabell av specifika material / Equipmen t, rad 4), Picospritzer eller sprutpump, injicera små volymer (1 - 5 mikroliter, se tillverkarens anvisningar för injektionsförfaranden) av modifierat rabiesvirus över flera (3 - 10) depthsmed en hastighet av ~ 100 nL / min inom målstrukturen (dLGN). Obs: Separata injektionsgenomföringar kan göras i större målstrukturer (t.ex. apa dLGN). Justera injektion total volym enligt målstruktur storlek.
11. Paus åtminstone 5 minuter innan dra tillbaka injektionen pipett. När injektionen pipetten tas bort, fyll kraniotomi med skyddande material (lim ben pusselbiten på plats, tillämpa ben vax eller Gelfoam), sedan sutur muskeln och huden tillbaka tillsammans.
12. Administrera smärtstillande medel (t.ex. ketoprofen) och antibiotika före slutet av operationen och övervaka djur kontinuerligt tills djuret är ambulatorisk.
13. För åtminstone 3 dagar och upp till 10 dagar efter operation, övervaka djur dagligen för att säkerställa suturer är rena, torra och intakta och djur visar inga tecken på smärta eller obehag. Administrera dagliga analgetika och antibiotika vid behov. Börja subventionerade bostäder av postoperativ djur efter djur har återhämtat sig helt från kirurgi.
</ Ol>

2. Tissue Skörd, sektionering och färgning

1. Tillåt 7 - 14 dagar för retrograd transport av virus, sedan avliva djuret genom överdos av dödshjälp lösning (t.ex. Euthasol) och BEGJUTA djuret transkardiellt med 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning, 4% paraformaldehyd, då 4% paraformaldehyd med 10% sackaros.
2. Ta bort hjärnan (se ¹² för analoga steg i en gnagare modell) och ske i 20 - 30% sackaros med 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert och kylskåp i 1 - 2 dagar.
3. När hjärnan har sjunkit till botten av behållaren, ta bort den och skär vävnaden i block som innehåller hjärnan region med retrograd märkta neuroner (t.ex. visuell cortex) och insprutnings målstrukturen (t.ex. dLGN). Skär samma block av vävnad från icke-injicerade hemisfären - dessa kommer att fungera som kontrollsektioner. För bästa resultat, börja histologiska förfaranden immediately på färsk sektionerad vävnad.
4. Vävnadssnitt koronalt med en tjocklek av 50 um per avsnitt med hjälp av en frys mikrotom (se tabell av specifika material / utrustning, rad 5).
5. Färgar alla sektioner för cytokromoxidas aktivitet (se tabell av specifika material / utrustning, rader 5 - 8) för att visualisera kortikala skikt och subkortikala strukturer ^13. Notera: Sektioner kan lagras över natten i ett kylskåp i den slutliga sköljningen efter den cytokromoxidas fläcken.
6. Märka alla sektioner med en primär antikropp mot GFP (1: 1000 utspädning, ~ 12 h inkubation; se tabell av specifika material / utrustning, rad 9) följt av en sekundär antikropp som matchar den primära värden och märkta med biotin ⁵ (1: 500 utspädning , 2-4 h inkubation, se tabell av specifika material / utrustning, rad 10). Det rekommenderas att inkubera avsnitt i den sekundära antikroppen över natten.
7. Etikett sektioner med en avidin / biotin-komplexet reagerar därefter med DAB och peroxid för att permanent färga alla märkta nervceller ^5.
8. Montera avsnitten om subbed glas och låt torka över natten.
9. Avfetta sektioner med hjälp av en serie av alkohol och xylen sköljningar sedan täcka slip ^14.

3. Neuronal återuppbyggnad

OBS: Alla rekonstruktioner för original experiment gjordes med hjälp av en neuron rekonstruktion system som består av ett mikroskop (se tabell av specifika material / utrustning, rad 14), fäst kameran (se tabell av specifika material / utrustning, rad 13), och återuppbyggnad programvara paket (se tabell av specifika material / utrustning, rader 11 - 12). Software-assisterad neuronal rekonstruktion möjliggör visualisering av vävnadsglas övertäckt med datorbaserade ritningar av neuronala processer. Viktigare, digitaliserar programvaran morfologiska återupptionsdata i tre dimensioner, vilket möjliggör utvinning av positionsspecifika morfologisk information. Den tillhörande datautvinning program (se tabell av specifika material / utrustning, rad 12) möjliggör extraktion av en rik uppsättning av morfologiska data från varje sparad rekonstruktion.

1. Placera en bild i objektglas hållaren och fokusera på ett enda avsnitt av intresse att använda en låg förstoring mål (t.ex. 2X eller 10X). Kontrollera kamerabilden är synlig i mjukvaran vy genom korrekt placering av kamerans slutare.
2. Välja märkta nervceller i hjärnan strukturen av intresse (t.ex. TRN) som är rimligt isolerade så att de entydigt rekonstruera så mycket av den dendritiska arborization som möjligt. Preferentiellt välja neuroner, om cellkroppen är helt inom ett enda avsnitt i syfte att fånga den största omfattningen av varje cellkroppen och exakt uppskatta dess area och rundhet. Använd 10X mikroskop mål att identifiera cellen bODY i hemmet avsnitt.
3. När en väl färgade, väl isolerad neuron identifieras, lägga till avsnittet "hem" som innehåller cellkroppen till sektionschef genom att klicka på "Nytt avsnitt" -knappen. Ange antal sektioner för att inkludera (rekommenderar 2 - 3 sektioner för att börja). Tilldela ett avsnitt tjocklek på 50 um när du uppmanas (se steg 2,3).
4. Rita konturerna av relevanta hjärnstrukturer i hemmet sektion som innehåller cellkroppen. Använd 2X mål / förstoring för kontur spårning.
   1. Först väljer "Contour" från rullgardinsmenyn på verktygsfältet och välj sedan konturtypen från rullgardinsmenyn (t.ex. "LGN" eller "TRN").
   2. Spåra konturerna av målstrukturen (t.ex. TRN) samt närliggande strukturer, om så önskas, genom att klicka på punkter längs konturen på mus som en dragverktyg.
   3. Välj "Close Contour" genom att högerklicka med musen och välja det här alternativetfrån menyn för att fylla i och bifoga varje spåras kontur.
5. Placera en markör i mitten av målstrukturen genom att klicka på den önskade markören symbolen på höger verktygsfält och sedan klicka på önskad plats i återuppbyggnaden att placera markören på den platsen. Använd samma typ av markör för att markera mitten av målstrukturen i alla rekonstruktioner.
6. När konturerna är klar, spåra konturerna av cellkroppen med hjälp av 40 - 60X mål / förstoring. För att göra det, välj först "Neuron" från rullgardinsmenyn på verktygsfältet och välj sedan neuron struktur för att spåra, i det här fallet "cellkroppen". Nästa spåra cellkroppen enligt 3.4.
7. Placera en annan stil markör i mitten av cellkroppen, att följa stegen i 3,5.
8. Spåra alla dendriter börjar på cellkroppen.
   1. Först väljer "Dendrite" från rullgardinsmenyn. Sedan spåra varje dendrit börjar vid cell body och använder musen som oavgjort verktyg. Var noga med att justera Z-djup genom spårning att exakt fånga vinkel och riktning dendrit.
   2. Placera en nod vid varje förgreningspunkt längs Dendrite genom att högerklicka med musen och välja "Bifurcating Node" eller "Trifurcating Node" från rullgardinsmenyn. Använd 40 - 60X mål / förstoring för alla Dendrite rekonstruktioner.
   3. Vid slutet av varje dendrit, högerklicka med musen och välj "Avsluta" från rullgardinsmenyn.
9. Identifiera dendritiska ändelser som sannolikt kommer att fortsätta in i den intilliggande sektionen och föra dessa i fokus på lämplig z-djup i mikroskopbild. Inkludera viktiga landmärken i närheten såsom blodkärl eller lätt igenkännbara Dendrite mönster eller buntar i mikroskopbild.
   1. Minska förstoringen till 20X eller 10X på mikroskopet (välj förstoringen som gör störst landmärke visualisering), och taen bild av mikroskopet bilden med en digitalkamera (t.ex. mobiltelefon, surfplatta) handhållna på datorskärmen.
10. Flytta till den intilliggande delen på bilden och rada upp konturerna av den tidigare spårade delen med gränserna för dLGN och TRN i det nya avsnittet.
11. Återgå synfältet till det allmänna området av cellkroppen (baserat på konturer och stora landmärken) och ta förstoringen upp till 10 - 20X.
12. Använd bild av Dendrite ändelser från tidigare spårade delen för att underlätta anpassningen ändelser med början av dendriter i det nya avsnittet.
    1. Att rotera spårning och flytta den till anpassa dendriter, använd pilen för att markera återuppbyggnaden, högerklicka och välj "Move" från rullgardinsmenyn.
    2. Alternativt kan du använda "Match" verktyg för att matcha dendritiska ändelser till början. Välj Match verktyget uppifrån verktygsfältet och när du uppmanas att klicka på sluteti återuppbyggnaden och den motsvarande fortsättning punkt i bilden. Upprepa för 3 eller fler ändelser.
13. När spårning från föregående avsnitt är uppradade med dendriterna i den nya delen, se till att motsvarande nytt avsnitt väljs i avsnittet genom att klicka på det aktuella avsnittet. Eller lägg till en ny sektion på Section Manager, som beskrivits ovan i 3.3, justera Z-djup och position för varje nytt avsnitt i förhållande till hemmasektionen detta och sätta varje avsnitt tjocklek till 50 mm (se steg 2,3).
14. Öka förstoringen till 40 - 60X och spåra Dendrite förlängningar genom att högerklicka med musen på slutet av dendrit från återuppbyggnad och välja "Lägg till Avsluta" från rullgardinsmenyn, sedan spåra dendrit med hjälp av musen som en ritverktyget. Följ uppmaning att ange om fortsättning är i det nya avsnittet.
15. Följ dendriter genom minst 3 intilliggande sektioner (en på vardera sidan avhemmasektionen) följande steg 3,8-3,15. Lägg till återuppbyggnaden förrän tidigast 3 Totalt antal sektioner spåras för neuron eller tills dendriter kan inte längre följas eller hittas. Spåra konturerna i grann sektioner efter stegen ovan, om så önskas.

4. Oberoende Clustering

Obs: Oberoende kluster analyser möjliggöra objektiva analyser av stora, flerdimensionella datamängder som annars kan vara svåra att visualisera och, framför allt, ge en kvantitativ bedömning av morfologisk mångfald. En matris-baserad programmering plattform är ganska användbart för analys av flerdimensionella datauppsättningar och möjliggör avancerade uppgifter manipulationer och statistiska analyser. De funktioner som anges i steg 4 - 6 definieras i programmering plattform som anges i Tabell över specifika material / utrustning, rad 15.

1. Utdrag morfologiska data från varje enskild neuronal rekonstruktion med en extdiffraktion programmet i samband med neuron rekonstruktionssystem (se tabell av specifika material / utrustning, rader 11 - 12).
   1. Först väljer de morfologiska data som önskas för varje rekonstruktion inklusive: konturinformation, märkinformation, morfologiska data för cellkroppen och dendritiska arborization, osv.
   2. Från Redigera rullgardinsmenyn i det övre verktygsfältet, välj "Välj alla objekt". Välj sedan "grenad struktur Analysis" från rullgardinsmenyn analys i det övre verktygsfältet och klicka på varje flik och välj önskade alternativ analys i varje flik.
   3. Extrahera alla önskade data genom att klicka på "OK" -knappen i analysfönstret och spara i en kalkylbladsformat genom att högerklicka på utgångsfönster och välja "Exportera till Excel".
2. Samman en Master kalkylblad (se tabell av specifika material / utrustning, rad 16) där varje morfologisk variabel / metric representeras av en enda numerisk observation per neuron. I denna Master kalkylblad, föra ett register över radidentifieraren för varje neuron.
3. Kontrollera att alla variabler som ingår i klusteranalys (t.ex. morfologiska mätvärden) är oberoende av varandra. Till exempel kommer antalet noder korrelerar med antalet filialer i en dendritiska eller axonal arborization. Följaktligen endast en av dessa två variabler bör ingå i en klusteranalys.
4. Se till att varje mätning innehåller en observation för varje variabel, dvs varje neuron (mätning), måste ha en datapunkt (observation) motsvarande varje morfologiska variabler (variabel). Om observationer för en viss variabel (t ex axon längd) saknas för en delmängd av nervceller, kan denna variabel (axon längd) inte ingå i klusteranalys.
5. Organisera data på Master kalkylblad till en matris där varje rad representerar en neuron och EACh kolumn innehåller numeriska data för varje morfologisk mätvärde (Figur 1). Till exempel, en datamängd innefattande 100 neuroner för vilka det finns observationer för 5 oberoende variabler skulle representeras av en 100 x 5 (rad-för-kolumn) matris. Det är inte nödvändigt att innefatta varje identifiering för varje neuron inom matrisen - radindex kommer att fungera som varje neuron unika identifierare. Det bör också finnas några luckor eller "NaN" s i matrisen. Spara matrisen som en enda variabel (t.ex. Data = [100 x 5 matris], se Kompletterande kodfil för exempelkod).
6. Välja en algoritm för att beräkna avstånd mellan punkter som representerar enskilda neuroner i ett n-dimensionellt utrymme, där n är definierad av antalet variabler. Den "pdist" funktion möjliggör flexibilitet i beräkning mellan-neuron avstånd. Beräkningen Standardavståndet är euklidiska avståndet och har använts tidigare för liknande analyser av neuronal morphological uppgifter ^{5, 6.}
7. Med mellan-neuron avstånd utgången på "pdist" funktion, använder "koppling" funktion för att bilda kluster. Återigen, flera klustring alternativ är tillgängliga. Ward metod och tyngd avstånd har gett liknande resultat i analyser av morfologiska dataset ^{5, 6.}
8. Om så önskas, använda "kmeans" fungerar som ett alternativ klustring strategi för "pdist" och "länk" funktioner. "kmeans" sysselsätter kvadrat euklidiska avståndet för att beräkna mellan-neuron avstånd och sedan centroid avstånd tilldela kluster.
9. Att visualisera en hierarkisk kluster träd, använder "dendrogram" funktion på utgången av "koppling" operation. Denna funktion har en grundinställning som begränsar visualisering till 30 mätningar, men det kan åsidosättas genom att ange antalet mätningar (<em> t.ex. neuroner) visas. Den dendrogram illustrerar länkavstånden på y-axeln för varje av neuronerna, identifieras genom deras radindex på x-axeln.
   OBS: Utgångarna av "koppling" och "dendrogram" definierar inte det optimala antalet kluster. Utsignalen från "kmeans" inte tilldela mätningar kluster, men det är inte testa om dessa kluster är optimala. kan utföras separata statistiska jämförelser och verifiering av optimal kluster (se nedan).

5. Kontroll av Clustering

Obs: Som nämnts ovan, inte klusteranalys själv inte direkt ge en statistisk bedömning av huruvida kluster visas i klustret dendrogram är unika och representativa för provet. Metoder för att kontrollera kluster från dendrogram har föreslagits ^15, men dessa inte ger statistisk kontroll av optimal klustring. Det finns fleraPLE metoder för att verifiera optimal klustring.

1. Metod 1: Utvärdera klustring:
   1. Använd "evalclusters" funktion som anger den metod som används för att beräkna kluster, såsom "kmeans" eller "koppling". Kan också utvärderas En Gauss blandning modellens resultat (se steg 5,2 nedan, se Kompletterande kodfil för exempelkod).
   2. Ange utvärderingskriterium från ett antal alternativ (t.ex. "CalinskiHarabasz" - för beskrivningar av kriterier alternativ finns i hjälpmenyn, söker efter "evalclusters").
   3. Ange ett intervall av optimala kluster nummer för att testa (t.ex. [1: 6] för att testa om en, två, 3, 4, 5 eller 6 kluster är optimala).
      Obs: Utsignalen från "evalclusters" är ett optimalt antal kluster med tanke på klustring algoritmen och kriterium anges.
2. Metod 2: Gauss blandning modell klustring:
   OBS: Gauss blandning modell klustring Algorithms (GMM) antar att observationer för varje variabel kommer från en blandning av gaussiska distributioner definierar varje förmodad kluster, var och en med sin egen medelvärdet och samvariation. GMM använder sedan en förväntan maxime algoritm för att tilldela bakre sannolikheter för varje mätning, vilket indikerar sannolikheten att tillhöra en viss kluster ^16.
   1. Genomföra en GMM med hjälp av "fitgmdist" funktion genom att mata in den förmodade antal kluster observerbara i data. Alternativt, för att undvika en priori tilldelning av antalet kluster, använder huvudkomponenter analys (PCA) med en rad olika optimala klusternummer med stegen här (se Kompletterande kodfil för exempelkod).
   2. Använd 'PCA' funktion på den ursprungliga datamatrisen och spara de viktigaste poängen komponent som en utgång.
   3. I en slinga som börjar vid ett och gå igenom ett visst antal förmodade optimala kluster använder the 'fitgmdist "funktion på de viktigaste poängen komponent- och generera GMM för varje antal förmodade optimala kluster.
   4. Utvärdera varje GMM genom att undersöka den negativa loggen sannolikhet Akaike informationskriterium, och Bayes informationskriterium. GMM med de lägsta kriterier är optimal.
   5. Om så önskas, testa om medelvärdena för varje kluster är signifikant olika när antalet kluster är optimal (medel för varje kluster lagras i "mu" utsignalen från varje GMM).

6. Statistiska analyser av kluster Data

1. När det optimala antalet kluster bestäms med hjälp av hierarkisk klustring och utvärderas, återgå till den ursprungliga uppgifter, separata nervceller i kluster, och bestämma vilka morfologiska mått bidrar till klustring av nervceller i unika klasser.
2. Sortera ursprungliga morfologiska metriska data så att neuroner är grupperade enligt klustertilldelning. För att undersöka relationer mellan morfologiska data över neuroner (för alla neuroner eller för nervceller separerade i kluster), utföra linjär regression passar till 2- och 3-vägs jämförelser av morfologiska metriska observationer. Dessa passar kan uppskattas med hjälp av "fit" funktion och utvärderas med hjälp av "fitlm" funktion där godhet lämpliga utgångar inkluderar R ² och p-värden för regressions passar.
3. För att undersöka de statistiska sambanden mellan neuroner i varje grupp, använda icke-parametrisk två-prov (Wilcoxon rangsummetest) eller flera prov jämförelser tester (ANOVA), beroende på antalet kluster. Viktigt är att användningen av fler prov ANOVA säkerställer att p-värden är korrigerade för multipla jämförelser.

Representative Results

Vi har visat tidigare att storskaliga rekonstruktioner av nervceller i ett selektivt befolkning är genomförbar efter injektion av modifierat rabiesvirus in i dLGN ^5. Nyligen var samma vävnad används för att rekonstruera 160 nervceller i den visuella delen av TRN (Bragg et al, i gransknings, Fig. 2A-B) genom att följa detaljerade metodologiska steg som beskrivs ovan. I TRN studien tre unika kluster av TRN nervceller identifieras utifrån den oberoende klusteranalys av 10 morfologiska statistik: cellkroppen område, cellkroppen rundhet, medial-lateral position i förhållande till mitten av TRN, dorsal-ventral position inom TRN , antalet dendritiska träd, i snitt dendritiska avståndet till noder, medellängd av ^{3: e} och högre ordningens dendriter, genomsnittlig vinkel av ^{1: a} ordningen dendriter, genomsnittlig fasvinkel av den totala dendritiska arborization, och vinkelavvikelse av atttal dendritisk arborization. TRN neuroner likvärdigt fördelade mellan dessa tre grupper (figur 2C). Separata statistiska jämförelser av alla 10 morfologiska statistik över nervceller i de tre klustren gav statistiskt signifikanta skillnader mellan kluster för alla utom två av de morfologiska statistik som ingår i den ursprungliga klusteranalys. Således, baserat på den hierarkiska träd dendrogram genereras från klusteranalysen (figur 2C) och de separata statistiska jämförelser av morfologiska mätvärden över kluster, är TRN nervceller klassificeras i tre unika grupper.

I denna studie ville vi särskilt att tillämpa statistiska metoder för att separat utvärdera kluster bestäms med en klusteranalys. TRN dataset från den tidigare studien utvärderades för att avgöra om de tre kluster observerades optimal. Separat extra kluster analyser, nämligen PCA och GMM clustrering, utfördes för att verifiera de tidigare kända metoderna klustring (Figur 1). Tre viktiga resultat separat kontrollera den tidigare klusteranalys. För det första, när den ursprungliga klusteranalys metod utvärderades med hjälp av "evalclusters" funktion som anger "koppling" funktion för att generera kluster, det optimala antalet kluster var 3, som matchar den ursprungliga slutsatsen grundad på den hierarkiska träd dendrogram (figur 2C). För det andra var PCA på den ursprungliga datamatrisen 10 morfologiska mått för 160 TRN neuroner som ett alternativt sätt att gruppera nervceller baserat på bidrag från morfologiska statistik. Tre GMM genererades, förutsatt TRN neuroner grupperades i 1, 2 eller 3 unika kluster. Den negativa log sannolikhet (NLL) och Akaike informationskriterium (AIC) gav lägst och därför mest informativa, värderingar och båda värdena var optimal när GMM används 3 kluster för att beskriva TRN morfologiska uppgifter (Figure 3). För det tredje, var GMM-baserad klustring separat utvärderade enligt "evalclusters funktion och det optimala antalet kluster var 3. Således observationer av trädet dendrogram, statistiska jämförelser av morfologiska statistik över nervceller separerade i tre grupper, PCA och GMM baserad klustring och separata utvärderingar av varje kluster metod (koppling och GMM), alla gav samma resultat som TRN nervceller är optimalt separeras i 3 grupper baserat på de 10 morfologiska mätvärden utnyttjas.

Figur 1: Dataformat. Exempel Data matris med n rader som motsvarar antalet neuroner och m = 5 kolumner som motsvarar det totala antalet oberoende variabler som ska ingå i klusteranalys (inte inkluderar rubriker i datamatris).

Figur 2: Oberoende Kluster av 160 TRN nervceller. A. Vänster, fotografi av en enda coronal snitt genom dLGN av ett djur, färgades för cytokromoxidas aktivitet att visualisera dLGN lager och mot GFP att visualisera virus injektion. Pilen visar regioner av täta retrograd märkta TRN nervceller. Avsnitt orientering följer dorsal-ventrala / medial-laterala (DV / ML) kompass nedan och skala stapel representerar 500 pm för alla paneler i A. För det andra från vänster, beskriver konturen av dLGN (röd) och TRN (rödbrun) för alla sektioner som innehåller virus injektion (svarta konturer). Gula stjärnor tyder på injektionsstället centra. Orientering och skal barer som i A. Tredje från vänster, 3-d återgivningar av konturer och injektionsstället, orientering och skal barer som i A. Höger, kartor över platser av rekonstruerade TRN nervceller, färgkodade enligt klustertilldelning (C) i en enda samlings TRN kontur (rödbrun). Orientering och skal barer som i A. B. Vänster, samlade konturer TRN (svart) och dLGN (grå) med 5 rekonstruerade TRN neuroner färgade varmt till kallt i enlighet med deras medial-lateral position inom TRN. Orientering enligt DV / ML kompass i A representerar skala bar 500 pm. Höger, fotografier av samma fem TRN nervceller med färgmatchade skala barer som representerar 100 nm. C. Hierarkiskt träd dendrogram efter klusteranalys som visar länk avstånd mellan 160 rekonstruerade TRN nervceller baserat på 10 oberoende morfologiska statistik. Tre kluster visas i blått, grönt och rött. Alla delar av denna siffra är anpassade från siffrorna i Bragg et al. (under granskning).stripigt "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Cluster utvärdering. Tomt på två olika kriterier värden, negativ log sannolikhet (NLL, röd) och Akaike informationskriterium (AIC, blå) som genereras från tre GMM antagande 1, 2 eller 3 grupper. GMM med 3 kluster erbjuda de lägsta kriterier värdena.

Kompletterande kodfil: Exempel kod, skriven i en Matlab-kompatibel språk, för att utföra klusteranalys på ett exempel datamatris följt av kluster utvärdering med PCA och GMM närmar. Klicka här för att ladda ner filen.

Discussion

Neuroanatomiska studier har förblivit en pelare av neurovetenskap och nyligen intresse connectomics och struktur-funktionssamband har förnyat entusiasm för detaljerad morfologisk karakterisering av selektiva neuronala populationer. Traditionellt har neuroanatomiska studier förlitat sig på kvalitativa klassificeringar av nervceller i morfologiskt distinkta klasser av nervceller som definieras av expert neuroanatomists. Med framsteg inom tekniker för att rekonstruera neuroner och extrahera morfologiska uppgifter, är det nu möjligt att använda mer sofistikerade och kvantitativa data analysmetoder för att klassificera morfologiskt distinkta neuronala klasser på ett opartiskt sätt. I denna studie är steg-för-steg metoder beskrivs för en) selektivt märknings hundratals enskilda nervceller med hjälp av virusmedierad bakåtsträvande märkningsmetoder; 2) systematiskt rekonstruera hundratals enskilda nervceller för att bilda en omfattande och därför representativt urval av nervceller i en selektiv population; och 3) oberoende klustring analyser med statistisk utvärdering för att bestämma optimala kluster av nervceller i ett selektivt befolkning baserad på morfologiska statistik. Dessa analysmetoder verifieras genom att tillämpa olika klustermetoder till en befintlig datamängd av TRN nervceller och vi visar bygger på tre separata utvärderingsmetoder som TRN nervceller är optimalt klustrade i tre morfologiskt distinkta subpopulationer.

En stor fördel med de protokoll som beskrivs i denna studie är deras flexibilitet. G-deleted rabiesvirus har varit effektiv i att driva EGFP uttryck i hundratals retrograd märkta nervceller efter injektion i en målstruktur. Samma rabiesvirusstammen är lika effektiva i flera arter, inklusive makak-apor ^{5, 9,} illrar (Hasse & Briggs, i översynen), och gnagare ^7,"> 8. Följaktligen modifierat rabiesvirus kan användas för att selektivt märka hela dendritiska arborization mönster någon population av nervceller efter injektion i en målstruktur. Antibody färgning mot GFP följt av DAB / peroxid reaktion rekommenderas eftersom detta orsakar permanent färgning av märkta nervceller och gör det möjligt för vävnadssnitt kan visualiseras under ett mikroskop utan hjälp av fluorescensmikroskopi (som bleker fluorescerande märkning med längre exponering). Men, alternativa färgningsmetoder finns tillgängliga och / eller fluorescens kan direkt visualiseras om så önskas. en fördel med att mäta rå fluorescens är att olika virus som driver uttryck av olika fluorescerande molekyler kan kombineras, till exempel för att avgöra huruvida neuroner skjuter till flera mål hjärnstrukturer. Dessutom kan stegen ovan tillämpas på alla tillgängliga morfologiska uppgifter (t ex axoner och dendriter) för att möjliggöra alltmer robust Morphologisk klassificering av nervceller. Det är också viktigt att notera att mindre mängder av rabiesvirus också kan injiceras för att generera glesare retrograd märkning, vilket skulle kunna vara fördelaktigt för rekonstruktioner av axoner utöver dendriter.

En ytterligare fördel med de analysmetoder som beskrivs i denna studie är att flera olika kluster metoder kan utnyttjas och jämföras. Vid varje steg i klusteranalys, olika alternativ finns tillgängliga för att beräkna mellan-neuron avstånd i parameterrymden samt olika algoritmer för att generera kluster. Dessutom flera utvärderingsmetoder finns tillgängliga. Det senare är särskilt användbar som ett sätt att kontrollera optimal klustring, som beskrivs i avsnittet Resultat representanten. Otvivelaktigt ytterligare algoritmer för att generera kluster och för att utvärdera optimal kluster kommer att bli tillgängliga som fältet rör sig framåt. Tillsammans kommer dessa analysmetoder fortsätta att improve kvantitativa metoder inom neuroanatomi och öka robustheten i resultaten.

Det finns ett växande intresse för automatisering av neuronala rekonstruktioner på grund av hand rekonstruktioner av enskilda märkta nervceller är tidskrävande, kräver utbildning och erfarenhet, och är fortfarande något subjektivt. Eftersom datorbaserade automatiska neuronala rekonstruktioner är fortfarande felbenägen, är elektronmikroskopi baserade neuroanatomiska data fortfarande analyseras av människor (se till exempel ^17). Det är dock troligt att automatiserad neuronal återuppbyggnaden kommer att finnas tillgänglig inom en snar framtid. Automatiserad neuronal återuppbyggnaden kommer att kräva ännu mer kontroll på dataanalys slut, alltså klustring analyserar och utvärderingsmetoder som beskrivs här kommer att bli ännu viktigare eftersom området fortsätter att avancera tekniskt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute		Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten	FHC	UEPSGGSE1N2M	Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204, 110V	Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome	Thermo Scientific
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
Catalase	Sigma-Aldich	C9322-5G
Rabbit anti-GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	#BA-1000	Secondary antibody
Neurolucida System	MicroBrightField		Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		Data export software
Microfire Camera	Optronics		2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope	Nikon Instruments Inc.		Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	Microsoft		Spreadsheet program