Abstract
Skeletmuskler er sammensat af myofibre, de største celler i det mammale legeme og et af de få syncytia. Hvordan de komplekse og evolutionært bevarede strukturer, som udgør det samles stadig under efterforskning. Deres størrelse og fysiologiske funktioner ofte begrænser manipulation og billedbehandlingsprogrammer. Den kultur af immortaliserede cellelinjer er meget udbredt, men det kan kun replikere de tidlige trin af differentiering.
Her beskriver vi en protokol, der gør det nemt genetisk manipulation af myofibre oprindelse fra primære mus myoblaster. Efter en uges differentiering, de myofibre vise kontraktilitet, justeret sarkomerer og triader, samt perifere kerner. Hele differentiering proces kan efterfølges af direkte billedvisning eller immunofluorescens. Dette system kombinerer fordelene ved de eksisterende ex vivo og in vitro-protokoller. Muligheden for nem og effektiv transfektion samtden lette adgang til alle differentieringstrin udvider anvendelsesmulighederne. Myofibre efterfølgende kan anvendes ikke alene at tilgodese relevante udviklingsmæssige og cellebiologiske spørgsmål, men også at gengive muskel sygdomsfænotyper til kliniske anvendelser.
Introduction
Skeletmuskel komponerer op til 40% af den menneskelige kropsvægt 1. Muskel-associerede sygdomme udgør en enorm sundhedsmæssige og økonomiske byrder 2. Hvordan dette meget komplekse og organiseret væv dannes, vedligeholdes, og regenereres udgør en omfattende og veletableret forskningsfelt. Afhængigt af den specifikke videnskabelig interesse, kan den mest velegnede metode spænder fra simple myotube kulturer til komplekse in vivo modeller 3 - 6.
Målet med denne protokol er at give et in vitro system, der giver mulighed for overvågning af myogenese via live billedbehandling og immunofluorescens. Sammenlignet med traditionelle fremgangsmåder, har en sådan meget komplet og dynamisk indsigt i musen myogene proces. Celler kan følges fra myoblast fase til den modne, flerkernede myofiber udviser tværgående triader og perifere kerner 7. Denne modning niveau kanopnås ved anvendelse af regelmæssig cellekultur udstyr, uden behov for komplekse stimulatoriske eller mekaniske apparater. Selv om nogle vellykkede in vitro-systemer er blevet rapporteret 8,9, så vidt vi ved, er dette den eneste protokol generere modne muse myofibre med T-tubuli tværs parret med reticulum (SR). Dette kan således in vitro system anvendes til at studere de molekylære mekanismer i triade formation, som stadig dårligt forståede 10.
En yderligere fordel ved at anvende dette system er tilgængeligheden af validerede muse-målrettede midler, såsom antistoffer, lægemidler og RNAi værktøjer. Den relativt simpel protokol kræver ikke besværlige trin, højtuddannede manipulation eller dyrt og dedikeret udstyr. Modnet myofibre blive vist efter 5 d kultur differentiering 7, viser kontraktilitet kombineret med calcium gnister (upublicerede data). På en uge, den anden udviklingal stadier af en af de mest komplekse celler i det mammale legeme kan studeres i kombination med en række forskellige in vitro assays.
Protocol
BEMÆRK: en mus udbytter tilstrækkelige myoblaster for cirka to 35 mm skåle eller to levende imaging retter, så planen maatter, dissektion og belægning (trin 2.6) i overensstemmelse hermed. Da myoblaster isoleres gennem sekventielle centrifugeringer og preplating bør protokollen ske i partier af 5 - 10 dyr.
Alle procedurer, der involverer dyr forsøgspersoner blev godkendt af Det Dyreetiske udvalget på Instituto de Medicina Molekylær og University Pierre et Marie Curie
1. Dissektion af Neonatal Mus Hind-lemmer Muskler
- Forbered alle løsninger på forhånd (Materialer Table) og der steriliseres ved filtrering (0,22 um filter). Kontroller, at alle medier er ved 37 ° C før tilsætning til cellerne, bortset fra formuleringer indeholdende basalmembran matrix (f.eks Matrigel).
- Steriliser dissektion materiale (en af hver af: krum saks, lige saks, regelmæssige pincet,og fin spids pincet) og det arbejde bænk ved at tørre dem med 70% ethanol.
- Forbered en 100 mm petriskål med 5 ml Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS) for muskel indsamling og holde den på is, indtil hakningen trin.
- Halshugge P6 - P8 mus med lige saks og sterilisere huden med 70% ethanol.
- Lav et snit i ryggen hud og træk det forsigtigt mod bagbenene indtil den fjernes helt udsætte hind-lemmer muskulatur.
- Brug pincet til at fjerne fedtvæv uden at beskadige musklerne.
- For at fjerne de dorsale hind-lemmer muskler, holde benet strakt og bøj pote at eksponere hæl sener. Brug krum saks til separat muskel fra knogler, startende fra sener, ved forsigtigt at skyde og skære opad. Punktafgifter musklerne og placere dem i ice DPBS.
- Isoler quadriceps ved at klemme musklen med fine-tip pincet og skæring rundt om det uden at beskadige femur eller knæleddet.
- Efter dissekere alle dyr, gå videre til en steril laminar flow cellekultur hætte, hvor der bør foretages alle de følgende trin.
2. myoblast Isolering
- Fjern det overskydende DPBS. Hakke vævet med steriliserede krum saks for at opnå en ensartet masse.
- Indsamle det hakkede væv i et 50 ml konisk centrifugerør under anvendelse af 5 ml fordøjelse blandes og inkuberes den med omrøring ved 37 ° C i 90 minutter.
- Stop fordøjelse ved tilsætning af 6 ml dissektion medium og centrifugeres suspensionen i 5 minutter ved 75 x g for at pelletere det resterende væv.
- indsamle omhyggeligt supernatanten. Sørg for ikke at indsamle væv vragrester. Centrifuger det ved 350 xg i 5 min; resuspendere den i 5 ml dissektion medium.
- Filtrer cellesuspensionen gennem en 40 um cellefilter. Tilsæt 25 ml dissektionsmedium og præplade den i en 150 mm skål i 4 timer i en cellekultur inkubator (37 ° C og 5% CO 2 </ Sub>), så fibroblaster til at overholde.
- Mens preplating, coat retter med 500 pi basalmembranmatrix fortyndet 1: 100 i koldt IMDM i 1 time ved stuetemperatur. Vask en gang med DPBS og plade cellerne straks (trin 2.8) eller forlade med vækstmedium indtil plating.
- Efter preplating, indsamle supernatanten og centrifugere det ved 350 xg i 10 min.
- Resuspender det i vækstmedium og tælle cellerne på et hæmocytometer. Juster lydstyrken, således at mellem 150.000 og 250.000 celler forgyldt pr basalmembran matrix-belagt fad. Holde cellerne i en cellekultur inkubator.
3. Myofiber Differentiering
BEMÆRK: Efter 3 d, skal cellerne begynde at fuse og danne myorør på omkring 70% sammenflydning (figur 1B).
- På dette tidspunkt, transficere cellerne, om ønsket med en siRNA eller DNA af interesse. Hvis cellerne ikke at transficeres, ændre direkte til differentiering medium og skip til trin 3.4.
- Transficere med transfektionsreagenser efter producentens anvisninger. Inkubér cellerne i 5 timer med siRNA-lipid komplekser (20 nm + 1 pi reagens) eller DNA-lipid komplekser (1 ug + 1 pi reagens). Optimer siRNA og DNA-koncentrationer om nødvendigt.
- Vask dem én gang med differentiering medium og derefter skifte til ny differentiering medium.
- Den følgende dag, fortyndes basalmembranmatrix 1: 2 i iskold differentiering medium. Fjern den eksisterende medium og tilsættes 200 pi iskold matrix til hver skål.
- Inkuber i 30 minutter i en cellekultur inkubator.
- Supplement differentieringen medium med agrin (100 ng / ml) og forsigtigt tilsættes 2 ml til cellerne.
- ændre omhyggeligt halvdelen af mediet hver 2 d, altid at supplere med agrin til en endelig koncentration på 100 ng / pl.
- Overvåg celledifferentiering og levedygtighed. Afhængigt af en række faktorer (såsom FBS og cHicken embryo ekstrakt oprindelse), kan cellerne tage mellem 5 - 10 differentiering d at nå fuld modning (figur 2).
4. Immunfarvning i glasbund Dishes
- For immunfarvning, til enhver tid-punkt af interesse, vaske cellerne en gang med DPBS og løse dem med 4% PFA ved stuetemperatur i 10 min.
- Vask dem to gange med DPBS. På dette tidspunkt kan cellerne opbevares ved 4 ° C.
- Permeabilisere dem med 0,5% Triton X-100 i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vaske dem to gange med PBS og blokere med blokerende opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Inkubere dem med primært antistof fortyndet i blokeringsopløsning O / N ved 4 ° C.
- Vask 3 x med DPBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Inkubere dem med det sekundære antistof og 0,2 ug / ml DAPI i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask 3 x med DPBS i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilføj 200 pi montering medium og fortsæt til billeddannelse.
Representative Results
Omfanget af myofiber udvikling er for det meste bestemt af renhed og levedygtigheden af de isolerede myoblaster. Adhæsionen, proliferation og fusion kapacitet kan anvendes til empirisk adgang til disse parametre (Figur 1 A, B). Ved proliferation D2, bør myoblaster have klæbet og bør vise den typiske tenformet form. Proliferation forventes at ske udførligt i denne fase, hvilket fører til spontan myotube dannelse den følgende dag (figur 1 B).
Cell sammenflydning måske brug mindre justeringer. Det bør øges, hvis myoblaster tage mere end 3 d til at formere sig og sikring. Det bør blive nedsat, hvis myofibre ikke får lov til at vokse og langstrakte forholdsvis lige på grund af deres tæthed. Sammenflydning falder typisk fra centrum til periferien af skålen, så de bedste myofibre skal findes mod de ydre regioner.
Myorør vil hurtigt langstrakt og vise flere centralt aligned kerner (figur 1C). Af D5, nogle celler begynder at erhverve riller og flytte deres kerner til periferien. Antallet af myofibre med modne egenskaber vil stige med tiden og med celle tykkelse (figur 1D).
Graden af differentiering kan yderligere observeres ved immunofluorescens. Myofibre fastsat til differentiering D8 nuværende tværgående triader. Dette kan bekræftes ved billeddannende komponenter af T-tubuli (DPHR) og SR (triadin), som forventes at colocalize på triader (figur 2).
Funktionaliteten af myofibre kan løses ved direkte billedvisning. Fra differentiering D3 fremefter, de celler udviser spontan trækninger. Ved transfektion af en calcium sensor (f.eks., GCaMP6f 11), er det muligt at observere, at veerne er koblet med calcium toppe (figur 3).
Ved hjælp af dette system, var vi i stand til at identificere en ny molekylær gangsti, der afbrydes i centronuclear myopatier og myotoniske dystrofier, som derfor kan være en roman mål for innovative molekylære terapier 7. Vi har også tilpasset denne metode til at undersøge udviklingen af den neuromuskulære forbindelse (NMJ) 12. Gennem cokultur med rotte rygmarv eksplantater har vi beskrevet en rolle for dynein i NMJ formationen 13.
Figur 1: udviklingsstadier af myoblast Culture. A) Ved spredning D2, har myoblaster levet og startet prolifererende. B) Ved spredningsrelateredebejde D3, en sammenflydning på 60 - med 80% er nået, og myoblaster begynder fusing spontant. C) Ved differentiering D3, myorør indeholder centralt beliggende kerner er fremherskende. D) Fra differentiering D5 fremefter (fx dag 8), myofibre begynde udstiller Rillerne og perifere kerner og begynder at blive tykkere. Scale bar: 50 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentant konfokal Billede af en D8 Myofiber immunofarvningsprocedure. A) Immunfarvning for dihydropyridin-receptor (DHPR, øverste panel) og triadin (TRDN, midterste panel). En overlejring af DHPR, TRDN, og DAPI-kanaler viser en lokalisering af de triade komponenter. B) En intensitet profil af den gule linje trukket i A. C) En 3D-billede af volumenet gengivelse af myofibre farvet for α-actinin (grøn) og DAPI (blå). Scale bar og gitter bredde: 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Levende Imaging af calcium i -myofibre med Spontan Krampetrækning. A) High-speed time-lapse (20 ms frames) mikroskopi af en calcium gnist i en trækninger myofiber. Calcium blev opdaget gennem ekspression af GCaMP6f (Addgene plasmid # 40.755). B) Kvantificering af fluorescensintensiteten over tid for calcium sensor i panel A._blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Brugen af denne protokol til dyrkning af primære myoblaster giver anledning til en særlig niche, der i høj grad nærer udviklingen af myofibre. Dette skyldes delvis andre celletyper, der også er til stede i meget mindre mængder. skal opnås en balance mellem myoblast koncentration og kultur renhed. En god cellekultur afhænger også af kvaliteten af de produkter, der anvendes til mediet formulering. Alle produkter af animalske kilder bør gennemtestet. Det er vores erfaring, bør også overvåges fordøjelsen betingelser.
Som sædvanlig for primære kulturer, kan eksperimentel variabilitet være højere end i studier med isolerede fibre eller udødeliggjort myoblaster. Denne variabilitet kan mindskes ved standardisering af mellemstore og fordøjelse komponenter, mus alder og størrelse samt de tidspunkter for kultur manipulation og resultater kollektion. Alligevel den fordel gennemgangen i realtid de indviklede mekanismernødvendige for myofiber udvikling i høj grad overgår variabiliteten ulempe.
Denne protokol giver fordelene ved in vitro-metoder uden at kompromittere celledifferentiering. Myofibre modnes indtil triader dannes og sammentrækninger er koblet til calcium gnister. Disse funktionelle udgange kan tilgås på forskellige eksperimentelle betingelser. Desuden kan der være mange tekniske aendringer i protokollen. Myoblaster kan høstes fra neonatale mus med mutationer af interesse vedrørende muskel udvikling. Celler kan lyseres til biokemisk analyse på forskellige differentiering tidspunkter. Calcium indikatorer kan tilsættes til kulturen til at følge dens dynamik. Optogenetic konstruktioner kan anvendes til at håndhæve visse signalveje eller at inducere specifikke lokale reaktioner. Endelig kan myofibre blive dyrket sammen med andre celletyper til at studere deres samspil.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
| IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
| Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5 |
| Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
| Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
| Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Eurobio | CVFSVF0001 | |
| Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
| Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200 ng/µL |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and Media | |||
| Digestion Mix | in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
| Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered |
||
| Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
- Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases. Front Physiol. 5, 37 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J Vis Exp. (73), (2013).
- Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J Vis Exp. (106), (2015).
- Falcone, S., Roman, W., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2. J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).
- Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression. Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).
- Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skelet Muscle. 1, 26 (2011).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. , (2016).
- Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS. Sci Rep. 6, 27804 (2016).
