Abstract
कंकाल की मांसपेशियों myofibers, स्तनधारी शरीर में सबसे बड़ी कोशिकाओं और कुछ syncytia में से एक से बना रहे हैं। कैसे जटिल और evolutionarily संरक्षित संरचनाओं कि यह रचना इकट्ठा कर रहे हैं जांच के तहत बनी हुई है। उनके आकार और शारीरिक सुविधाओं अक्सर हेरफेर और इमेजिंग अनुप्रयोगों को विवश। अमर सेल लाइनों की संस्कृति को व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन यह केवल भेदभाव के प्रारंभिक चरणों नकल कर सकते हैं।
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि प्राथमिक माउस myoblasts से होने वाले myofibers की आसान आनुवंशिक हेरफेर के लिए सक्षम बनाता का वर्णन है। भेदभाव के एक सप्ताह के बाद, myofibers सिकुड़ना, गठबंधन sarcomeres और तीनों के साथ-साथ परिधीय नाभिक प्रदर्शित करते हैं। पूरे भेदभाव प्रक्रिया रहते इमेजिंग या immunofluorescence द्वारा पीछा किया जा सकता है। इस प्रणाली के मौजूदा पूर्व vivo की और इन विट्रो प्रोटोकॉल में लाभों को जोड़ती है। आसान और कुशल अभिकर्मक की संभावना के रूप में अच्छी तरह सेसभी भेदभाव चरणों के लिए उपयोग में आसानी के संभावित अनुप्रयोगों के broadens। Myofibers बाद में न केवल प्रासंगिक विकास और कोशिका जीव विज्ञान सवालों को संबोधित करने के लिए, लेकिन यह भी नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए मांसपेशियों की बीमारी phenotypes पुन: पेश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी मानव शरीर के वजन 1 से 40% तक composes। स्नायु जुड़े विकारों एक विशाल स्वास्थ्य और आर्थिक बोझ 2 प्रतिनिधित्व करते हैं। कैसे इस बेहद जटिल और संगठित ऊतक, का गठन किया है बनाए रखा है, और पुनर्जीवित एक व्यापक और अच्छी तरह से स्थापित अनुसंधान के क्षेत्र का गठन किया। 6 - विशिष्ट वैज्ञानिक ब्याज पर निर्भर करता है, सबसे अनुकूल दृष्टिकोण विवो मॉडल 3 में जटिल करने के लिए सरल myotube संस्कृतियों से लेकर कर सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इन विट्रो प्रणाली है कि लाइव इमेजिंग और immunofluorescence के माध्यम से myogenesis की निगरानी के लिए अनुमति देता है प्रदान करना है। पारंपरिक तरीकों की तुलना में, इस प्रणाली माउस myogenic प्रक्रिया में एक बहुत ही पूर्ण और गतिशील अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। प्रकोष्ठों परिपक्व, multinucleated myofiber आड़ा तीनों और परिधीय नाभिक 7 प्रदर्शित करने के लिए myoblast मंच से पीछा किया जा सकता। यह परिपक्वता के स्तर सकते हैंजटिल उत्तेजक या यांत्रिक apparatuses के लिए आवश्यकता के बिना नियमित रूप से सेल संस्कृति उपकरण का उपयोग कर प्राप्त किया जा। हालांकि इन विट्रो प्रणालियों में कुछ सफल 8,9 सूचित किया गया है, हमारे ज्ञान के लिए, यह केवल प्रोटोकॉल टी-नलिकाओं transversally sarcoplasmic जालिका (एसआर) के साथ रखा के साथ परिपक्व माउस myofibers पैदा कर रहा है। इस प्रकार, इस लिए इन विट्रो प्रणाली है जो अभी भी खराब समझ रहे हैं 10 त्रय गठन की आणविक तंत्र, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस प्रणाली का उपयोग करने का एक और लाभ यह ऐसी एंटीबॉडी, दवाओं, और आरएनएआई उपकरण के रूप में मान्य माउस-लक्षित संसाधनों की उपलब्धता है। अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल श्रमसाध्य कदम, अत्यधिक कुशल हेरफेर, या महंगा और समर्पित उपकरण की आवश्यकता नहीं है। परिपक्व myofibers के बाद संस्कृति भेदभाव 7 के 5 डी प्रदर्शित होने शुरू, कैल्शियम Sparks (अप्रकाशित डेटा) के साथ मिलकर सिकुड़ना प्रदर्शित। एक सप्ताह में, अलग-अलग विकासस्तनधारी शरीर में सबसे जटिल कोशिकाओं में से एक के अल चरणों में इन विट्रो assays की एक किस्म के साथ संयोजन में अध्ययन किया जा सकता है।
Protocol
नोट: एक माउस की पैदावार लगभग दो 35 मिमी व्यंजन या दो रहते इमेजिंग व्यंजन, इसलिए योजना mattings, विच्छेदन, और कोटिंग (2.6 चरण) तदनुसार के लिए पर्याप्त myoblasts। 10 पशु - चूंकि myoblasts अनुक्रमिक centrifugations और Preplating के माध्यम से अलग कर रहे हैं, 5 प्रोटोकॉल के बैच में किया जाना चाहिए।
पशु विषयों को शामिल सभी प्रक्रियाओं Instituto डी Medicina आण्विक और विश्वविद्यालय पियरे एट मैरी क्यूरी पर पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया
1. नवजात चूहों हिन्द-अंग की मांसपेशियों के विच्छेदन
- अग्रिम (सामग्री तालिका) में सभी समाधान तैयार है और निस्पंदन (0.22 माइक्रोन फिल्टर) द्वारा बाँझ। सुनिश्चित करें कि सभी मीडिया तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (जैसे, Matrigel) युक्त योगों को छोड़कर, कोशिकाओं के अलावा पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कर रहे हैं।
- विच्छेदन सामग्री (एक से प्रत्येक जीवाणुरहित: घुमावदार कैंची, सीधे कैंची, नियमित रूप से संदंश,और ठीक टिप संदंश) और उन्हें 70% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा काम बेंच।
- पेशी के संग्रह के लिए Dulbecco फास्फेट खारा बफर (DPBS) के 5 एमएल के साथ एक 100 मिमी पेट्री डिश तैयार है और नख़रेबाज़ चरण तक बर्फ पर रहते हैं।
- सीधे कैंची से P8 चूहों और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा बाँझ - पी 6 सिर काटना।
- वापस त्वचा में एक चीरा और यह धीरे खींच हिंद अंग के प्रति जब तक यह पूरी तरह से हटा दिया जाता है हिंद अंग मांसलता उजागर।
- मांसपेशियों को नुकसान पहुँचाए बिना वसा ऊतकों को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
- पृष्ठीय हिंद अंग की मांसपेशियों को दूर करने के लिए, अंग बढ़ाकर रखने के लिए और पंजा मोड़ एड़ी tendons बेनकाब करने के लिए। हड्डी से अलग पेशी के लिए घुमावदार कैंची का प्रयोग करें, नाड़ी से शुरू, धीरे से फिसलने और ऊपर की तरफ काटने से। मांसपेशियों को आबकारी एवं उन्हें ठंडी DPBS में जगह है।
- ठीक टिप संदंश के साथ मांसपेशियों बन्द रखो और फीमर या संयुक्त घुटने को नुकसान पहुँचाए बिना यह चारों ओर काटने से quadriceps अलग।
- सभी जानवरों विदारक के बाद, एक बाँझ लामिना का प्रवाह सेल संस्कृति हुड, जहां सभी निम्न चरणों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए करने के लिए आगे बढ़ें।
2. Myoblast अलगाव
- DPBS के अतिरिक्त निकालें। आदेश में एक समान बड़े पैमाने प्राप्त करने में निष्फल घुमावदार कैंची के साथ ऊतक कीमा।
- 50 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज पाचन मिश्रण के 5 एमएल का उपयोग कर ट्यूब में कीमा बनाया हुआ ऊतक लीजिए और 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ यह सेते हैं।
- शेष ऊतक गोली 75 XG पर विच्छेदन मध्यम और सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए निलंबन के 6 एमएल जोड़कर पाचन बंद करो।
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। ऊतक मलबे जमा नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें। 5 मिनट के लिए 350 XG पर यह अपकेंद्रित्र; विच्छेदन माध्यम के 5 मिलीलीटर में यह resuspend।
- एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर। 25 विच्छेदन के माध्यम से एमएल जोड़ें और एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 <के लिए एक 150 मिमी पकवान में यह preplate/ उप>) fibroblasts पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए।
- आरटी पर 1 घंटे के लिए ठंड IMDM में 100: Preplating जबकि, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 500 μL के साथ कोट व्यंजन 1 पतला। DPBS के साथ एक बार धोएं और तुरंत कोशिकाओं प्लेट (2.8 कदम) या चढ़ाना जब तक मध्यम विकास के साथ छोड़ दें।
- Preplating के बाद, सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने और 10 मिनट के लिए 350 XG पर यह अपकेंद्रित्र।
- मध्यम विकास में यह Resuspend और एक hemocytometer पर कोशिकाओं की गिनती। इतना है कि 150,000 और 250,000 के बीच कोशिकाओं प्रति तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित पकवान चढ़ाया जाता मात्रा समायोजित करें। एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं रखें।
3. Myofiber भेदभाव
नोट: के बाद 3 डी, कोशिकाओं के चारों ओर 70% confluency (चित्रा 1 बी) पर फ्यूज और फार्म myotubes शुरू कर देना चाहिए।
- इस बिंदु पर, एक siRNA या ब्याज के डीएनए के साथ, कोशिकाओं transfect अगर वांछित। कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट करने के लिए नहीं कर रहे हैं, तो हो सकता है, भेदभाव मध्यम और स्की करने के लिए सीधे बदलपी 3.4 कदम।
- निर्माता के निर्देशों का पालन अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ transfect। siRNA लिपिड परिसरों के साथ 5 घंटे के लिए कोशिकाओं (20 एनएम अभिकर्मक के + 1 μL) या डीएनए लिपिड परिसरों (1 माइक्रोग्राम अभिकर्मक के + 1 μL) सेते हैं। siRNA और डीएनए सांद्रता का अनुकूलन यदि आवश्यक है।
- उन्हें भेदभाव माध्यम के साथ एक बार धोएं और फिर नई भेदभाव माध्यम के लिए स्विच।
- ठंडा भेदभाव माध्यम में 2: अगले दिन, पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स 1। मौजूदा मध्यम निकालें और प्रत्येक पकवान ठंडा मैट्रिक्स के 200 μL जोड़ें।
- एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेते हैं।
- Agrin साथ भेदभाव मध्यम (100 एनजी / एमएल) के पूरक और ध्यान से कोशिकाओं के लिए 2 मिलीलीटर जोड़ें।
- ध्यान से मध्यम के आधे हर 2 डी बदलने के लिए, हमेशा 100 एनजी / μL के अंतिम एकाग्रता के लिए Agrin के साथ सप्लीमेंट।
- सेल भेदभाव और व्यवहार्यता की निगरानी। कारकों (जैसे FBS और सी के रूप में की एक किस्म पर निर्भर करता है10 भेदभाव डी पूर्ण परिपक्वता (चित्रा 2) तक पहुँचने के लिए - hicken भ्रूण निकालने मूल), कोशिकाओं 5 के बीच ले सकता है।
4. गिलास नीचे बर्तन में Immunostaining
- immunostaining के लिए, ब्याज की किसी भी समय बिंदु पर, कोशिकाओं को एक बार DPBS के साथ 4% पीएफए के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए धोने और उन्हें ठीक।
- उन्हें DPBS के साथ दो बार धोएं। इस बिंदु पर, कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन X-100 के साथ उन्हें Permeabilize।
- उन्हें पीबीएस के साथ दो बार धोएं और आरटी पर 30 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान के साथ ब्लॉक।
- उन्हें अवरुद्ध समाधान हे / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए DPBS के साथ धो 3x।
- उन्हें माध्यमिक एंटीबॉडी और 0.2 माइक्रोग्राम / आरटी पर 1 घंटे के लिए DAPI की एमएल के साथ सेते हैं।
- आरटी पर 5 मिनट के लिए DPBS के साथ धो 3x।
- बढ़ते मध्यम के 200 μL जोड़ें और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ें।
Representative Results
myofiber विकास की हद तक ज्यादातर पवित्रता और पृथक myoblasts की व्यवहार्यता से निर्धारित होता है। आसंजन, प्रसार, और फ्यूजन क्षमता अनुभव से उन मानकों (चित्रा 1 ए, बी) का उपयोग किया जा सकता है। प्रसार डी 2 में myoblasts पालन किया जाना चाहिए और ठेठ तकली जैसा आकार प्रदर्शित करना चाहिए। परमाणु अप्रसार इस स्तर पर बड़े पैमाने पर ऐसा करने के लिए, सहज myotube गठन के अगले दिन (चित्रा 1 बी) के लिए अग्रणी उम्मीद है।
सेल confluency मामूली समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। यदि myoblasts अधिक से अधिक 3 डी लेने के लिए पैदा करना और फ्यूज करने के लिए यह वृद्धि की जानी चाहिए। myofibers उनके घनत्व के कारण बढ़ती है और अपेक्षाकृत सीधे बढ़ाना करने की अनुमति नहीं है, तो यह कम किया जाना चाहिए। Confluency आम तौर पर, पकवान की परिधि के लिए केंद्र से कम हो जाती है तो सबसे अच्छा myofibers बाहरी क्षेत्रों की ओर पाया जाना चाहिए।
Myotubes जल्दी बढ़ाना और प्रदर्शन कई केन्द्र गठबंधन नाभिक (चित्रा 1 सी) होगा। द्वारा D5, कुछ कोशिकाओं स्त्रिअतिओन्स प्राप्त करने और परिधि के लिए उनके नाभिक चलना शुरू। परिपक्व विशेषताओं के साथ myofibers की संख्या सेल मोटाई (चित्रा -1) के साथ समय के साथ के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि होगी।
भेदभाव की डिग्री आगे immunofluorescence द्वारा मनाया जा सकता है। भेदभाव D8 वर्तमान आड़ा तीनों पर तय Myofibers। यह टी-नलिकाओं (DPHR) और एसआर (triadin) है, जो तीनों (चित्रा 2) पर colocalize करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं की इमेजिंग घटकों द्वारा की पुष्टि की जा सकती है।
myofibers की कार्यक्षमता को लाइव इमेजिंग द्वारा संबोधित किया जा सकता है। भेदभाव डी 3 के बाद से, कोशिकाओं सहज हिल प्रदर्शित करते हैं। एक कैल्शियम सेंसर परासंक्रमित (जैसे।, GCaMP6f 11), यह संभव है कि निरीक्षण करने के संकुचन कैल्शियम चोटियों (चित्रा 3) के साथ मिलकर कर रहे हैं है।
इस प्रणाली का उपयोग करना, हम एक उपन्यास आणविक मार्ग है कि centronuclear myopathies और मायोटोनिक अपविकास में बाधित है, जो इसलिए अभिनव आणविक उपचारों 7 के लिए एक उपन्यास लक्ष्य हो सकता है की पहचान करने में सक्षम थे। हम यह भी neuromuscular जंक्शन (NMJ) 12 के विकास का अध्ययन करने के लिए इस विधि ढाल लिया है। चूहे रीढ़ की हड्डी explants के साथ coculture माध्यम से, हम NMJ गठन के 13 में dynein के लिए एक भूमिका का वर्णन किया है।
चित्रा 1: Myoblast संस्कृति के विकास के चरणों। ए) प्रसार डी 2 में myoblasts पालन और प्रसार शुरू कर दिया है। बी) prolif परeration डी 3, 60 के एक confluency - 80% तक पहुँच जाता है, और myoblasts अनायास fusing शुरू करते हैं। सी) भेदभाव डी 3 में, केन्द्र स्थित नाभिक युक्त myotubes प्रमुख हैं। डी) भेदभाव D5 के बाद से (जैसे, 8 दिन), myofibers स्त्रिअतिओन्स और परिधीय नाभिक का प्रदर्शन शुरू करते हैं और अधिक मोटा होना शुरू करते हैं। स्केल पट्टी: 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक D8 Myofiber immunostain के प्रतिनिधि confocal छवि। ए) dihydropyridine रिसेप्टर (DHPR, शीर्ष पैनल) के लिए immunostaining और triadin (TRDN, मध्यम पैनल)। DHPR, TRDN, और DAPI चैनलों की एक ओवरले त्रय घटकों की colocalization पता चलता है। बी) पीले रंग की लाइन ए सी में तैयार) α-actinin (हरा) और DAPI (नीला) के लिए दाग myofibers की मात्रा प्रतिपादन के एक 3 डी छवि के एक तीव्रता प्रोफ़ाइल। स्केल पट्टी और ग्रिड चौड़ाई: 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: सहज हिल के साथ Myofibers में कैल्शियम के स्तर के रहते इमेजिंग। ए) उच्च गति समय चूक (20 एमएस फ्रेम) एक हिल myofiber में एक कैल्शियम चिंगारी के माइक्रोस्कोपी। कैल्शियम GCaMP6f की अभिव्यक्ति (Addgene प्लाज्मिड # 40755) के माध्यम से पता चला था। बी) के पैनल ए में कैल्शियम सेंसर के लिए समय पर प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा_blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
प्राथमिक myoblasts की खेती के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए एक विशेष जगह है कि बहुत myofibers के विकास के पाले को जन्म देता है। यह आंशिक रूप से अन्य प्रकार की कोशिकाओं को भी बहुत कम संख्या में मौजूद हैं के कारण है। myoblast एकाग्रता और संस्कृति पवित्रता के बीच एक संतुलन हासिल किया जाना चाहिए। एक अच्छा सेल संस्कृति भी मध्यम तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया उत्पादों की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। पशु स्रोतों से प्राप्त सभी उत्पादों को अच्छी तरह से परीक्षण किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, पाचन की स्थिति भी निगरानी की जानी चाहिए।
प्राथमिक संस्कृतियों के लिए हमेशा की तरह, प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता अलग फाइबर या अमर myoblasts के साथ पढ़ाई की तुलना में अधिक हो सकता है। इस परिवर्तनशीलता मध्यम और पाचन घटकों, चूहों की उम्र और आकार, और संस्कृति में गड़बड़ी और परिणाम संग्रह के लिए समय अंक के मानकीकरण के द्वारा कम किया जा सकता है। फिर भी, जटिल तंत्र वास्तविक समय में छानबीन का लाभmyofiber विकास के लिए आवश्यक बहुत परिवर्तनशीलता दोष से बढ़कर है।
इस प्रोटोकॉल सेल भेदभाव समझौता किए बिना इन विट्रो दृष्टिकोण में करने के फायदे प्रदान करता है। Myofibers परिपक्व होने तक तीनों का गठन कर रहे हैं और संकुचन कैल्शियम स्पार्क्स के लिए मिलकर कर रहे हैं। इन कार्यात्मक outputs के विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों में पहुँचा जा सकता है। इसके अलावा, वहाँ कई तकनीकी प्रोटोकॉल के लिए किए गए बदलाव हो सकते हैं। Myoblasts मांसपेशियों के विकास से संबंधित हित के परिवर्तन के साथ नवजात चूहों से काटा जा सकता है। कोशिकाओं को अलग भेदभाव समय बिंदुओं पर जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए lysed जा सकता है। कैल्शियम संकेतकों अपनी गतिशीलता का पालन करने की संस्कृति से जोड़ा जा सकता है। Optogenetic निर्माणों कुछ संकेत दे रास्ते को लागू करने के लिए या विशिष्ट स्थानीय प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, myofibers उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए अन्य कोशिकाओं प्रकार के साथ cocultured जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
| IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
| Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5 |
| Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
| Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
| Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Eurobio | CVFSVF0001 | |
| Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
| Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200 ng/µL |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and Media | |||
| Digestion Mix | in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
| Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered |
||
| Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
- Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases. Front Physiol. 5, 37 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J Vis Exp. (73), (2013).
- Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J Vis Exp. (106), (2015).
- Falcone, S., Roman, W., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2. J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).
- Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression. Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).
- Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skelet Muscle. 1, 26 (2011).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. , (2016).
- Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS. Sci Rep. 6, 27804 (2016).
