Abstract
Muskler består av myofibers, de största cellerna i däggdjurskroppen och en av de få syncytia. Hur komplexa och evolutionärt konserverade strukturer som utgör den monteras fortfarande under utredning. Deras storlek och fysiologiska funktioner begränsar ofta manipulation och bildprogram. Den kultur av odödliggjorda cellinjer är allmänt används, men den kan bara replikera de tidiga stegen av differentiering.
Här beskriver vi ett protokoll som möjliggör enkel genetisk manipulation av myofibers härrör från primära mus myoblaster. Efter en vecka av differentiering, de myofibers visa kontraktilitet, inriktade sarkomerer och triader, samt perifera kärnor. Hela differentieringsprocess kan följas av levande avbildning eller immunofluorescens. Detta system kombinerar fördelarna med den existerande ex vivo och in vitro-protokollen. Möjligheten till enkel och effektiv transfektion samtlättillgänglighet till alla differentieringssteg breddar potentiella tillämpningar. Myofibers kan därefter användas inte bara för att ta itu med relevanta utvecklings- och cellbiologiska frågor, men också för att reproducera muskelsjukdom fenotyper för kliniska tillämpningar.
Introduction
Skelettmuskel komponerar upp till 40% av den mänskliga kroppen vikt 1. Muskelrelaterade besvär utgör en enorm hälsa och ekonomisk börda 2. Hur detta mycket komplexa och organiserad vävnad bildas, underhållas och regener utgör ett omfattande och väletablerat forskningsområde. Beroende på den specifika vetenskapligt intresse, kan den mest lämpade tillvägagångssättet varierar från enkla myotube kulturer till komplexa in vivo-modeller 3 - 6.
Målet med detta protokoll är att tillhandahålla ett in vitro-system som gör det möjligt att övervaka myogenes genom levande avbildning och immunofluorescens. Jämfört med traditionella metoder, erbjuder detta system en mycket komplett och dynamisk insikt i musen myogenic processen. Celler kan följas från myoblast stadiet till den mogna, flerkärniga myofiber visar tvär triader och perifera kärnor 7. Denna mognad nivå kanuppnås med användning av vanlig cellodlingsutrustning, utan behov av komplexa stimulatoriska eller mekaniska anordningar. Även om en del framgångsrika in vitro-system har rapporterats 8,9, så vitt vi vet, är detta det enda protokollet att generera mogna mus myofibers med T-tubuli tvären parade med sarkoplasmatiska retiklet (SR). Således kan detta in vitro-system användas för att studera de molekylära mekanismerna för triad bildning, som fortfarande är dåligt förstådda 10.
En ytterligare fördel med att använda detta system är att det finns validerade mus riktade resurser, såsom antikroppar, läkemedel och RNAi verktyg. Den relativt enkelt protokoll kräver inte mödosamma steg, högutbildade manipulation, eller dyrt och dedikerad utrustning. Förfallna myofibers börjar visas efter 5 d kultur differentiering 7, visar kontraktilitet i kombination med kalcium gnistor (opublicerade data). I en vecka, de olika utvecklingal stadier av en av de mest komplexa celler i däggdjurskroppen kan studeras i kombination med en mängd olika in vitro-analyser.
Protocol
OBS: en mus avkastningar tillräckliga myoblaster för cirka två 35 mm-skålar eller två levande avbildnings rätter, så planera mattväv, dissektion och beläggning (steg 2,6) i enlighet därmed. Eftersom myoblaster isoleras genom sekventiella centrifuge och preplating bör protokollet ske i omgångar av 5 - 10 djur.
Alla förfaranden som rör djurindivider godkändes av Animal etikkommittén vid Instituto de Medicina Molecular and University Pierre et Marie Curie
1. Dissekering av neonatala möss Hind-lem Muskler
- Förbered alla lösningar i förväg (Material tabell) och sterilisera genom filtrering (0,22 um filter). Se till att alla medier är vid 37 ° C före tillsats till cellerna, utom formuleringarna innehållande basalmembranmatris (t.ex. Matrigel).
- Sterilisera dissektion material (ett vardera av: böjd sax, rak sax, regelbundna pincett,och fin spets pincett) och arbetsbänken genom att torka dem med 70% etanol.
- Bered en 100 mm petriskål med 5 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) för muskel insamling och hålla den på is tills malningen steget.
- Decapitate P6 - P8-möss med rak sax och sterilisera huden med 70% etanol.
- Gör ett snitt i ryggen huden och dra det försiktigt mot bakbenen tills den tas bort helt utsätta hind-lem muskulatur.
- Använd pincett för att avlägsna fettvävnad utan att skada musklerna.
- För att ta bort rygg hind-lem muskler, hålla lem sträckt och böja tassen att exponera häl senor. Använd böjd sax till separata muskler från benet, från senor, genom att försiktigt dra och skära uppåt. Skära muskler och placera dem i iskallt DPBS.
- Isolera quadriceps genom att klämma muskeln med fin-spets pincett och skära runt det utan att skada lårbenet eller knäleden.
- Efter dissekera alla djur, gå vidare till en steril laminärt flöde cellkultur huva, där skall utföras alla de följande stegen.
2. myoblast Isolering
- Avlägsna överskott av DPBS. Mala vävnaden med steriliserade böjd sax för att erhålla en likformig massa.
- Samla upp den malda vävnaden i ett 50 ml koniskt centrifugrör med användning av 5 ml uppslutningsblandning och inkubera den med omrörning vid 37 ° C under 90 min.
- Stoppa digerering genom att tillsätta 6 ml av dissektion medium och centrifugera suspensionen under 5 min vid 75 xg för att pelletera återstående vävnaden.
- Samla supernatanten. Se till att inte samla vävnadsrester. Centrifugera det vid 350 xg under 5 min; resuspendera det i 5 ml dissektion medium.
- Filtrera cellsuspensionen genom en 40 | im cellfilter. Lägga 25 ml dissektion medium och preplate den i en 150 mm skål under 4 h i en cellkultur inkubator (37 ° C och 5% CO 2 </ Sub>) för att tillåta fibroblasterna att vidhäfta.
- Medan preplating, päls rätter med 500 mikroliter av basalmembranmatrisen utspätt 1: 100 i kall IMDM under 1 h vid RT. Tvätta en gång med DPBS och platta cellerna omedelbart (steg 2,8) eller lämna med tillväxtmedium tills plätering.
- Efter preplating, samla supernatanten och centrifugera det vid 350 xg under 10 minuter.
- Återsuspendera det i tillväxtmedium och räkna cellerna på en hemocytometer. Justera volymen så att mellan 150.000 och 250.000 celler stryks per basalmembranmatrisen belagda skålen. Hålla cellerna i en cellkultur inkubator.
3. Myofiber Differentiering
OBS: Efter tre d, bör cellerna börja säkring och bilda myotuber på cirka 70% konfluens (Figur 1B).
- Vid denna punkt, transfektera cellerna, om så önskas, med en siRNA eller DNA av intresse. Om cellerna inte skall transfekteras, ändra direkt till differentieringsmedium och skidorp till steg 3,4.
- Transfektera med transfektionsreagens efter tillverkarens instruktioner. Inkubera cellerna i 5 timmar med siRNA-lipid-komplex (20 nm + 1 mikroliter av reagens) eller DNA-lipid-komplex (1 ug + 1 mikroliter av reagens). Optimera siRNA och DNA-koncentrationer vid behov.
- Tvätta dem en gång med differentieringsmedium och sedan byta till ny differentieringsmedium.
- Följande dag, späd basalmembranet matrisen 1: 2 i iskallt differentieringsmedium. Ta bort den befintliga mediet och tillsätt 200 | il iskall matris till varje skål.
- Inkubera i 30 min i en cellodlingsinkubator.
- Komplettera den differentieringsmedium med agrin (100 ng / ml) och tillsätt försiktigt 2 ml till cellerna.
- ändra noggrant halv av mediet varje två d, alltid komplettera med agrin till en slutlig koncentration av 100 ng / | il.
- Övervakning av celldifferentiering och livskraft. Beroende på en mängd olika faktorer (såsom FBS och chicken embryo extrakt ursprung), kan cellerna ta mellan 5-10 differentiering d att nå full mognad (Figur 2).
4. Immunfärgning i glasbottnade rätter
- För immunfärgning, när som helst, plats av intresse, tvätta cellerna en gång med DPBS och fixera dem med 4% PFA vid RT under 10 minuter.
- Tvätta dem två gånger med DPBS. Vid denna punkt, kan cellerna lagras vid 4 ° C.
- Permeabilisera dem med 0,5% Triton X-100 under 5 minuter vid RT.
- Tvätta dem två gånger med PBS och blockera med blockeringslösning under 30 min vid RT.
- Inkubera dem med primär antikropp utspädd i blockeringslösning O / N vid 4 ° C.
- Tvätta 3x med DPBS under 5 min vid RT.
- Inkubera dem med den sekundära antikroppen och 0,2 | ig / ml DAPI under 1 h vid RT.
- Tvätta 3x med DPBS under 5 min vid RT.
- Tillsätt 200 mikroliter av monteringsmedium och vidare till avbildning.
Representative Results
Omfattningen av myofiber utvecklingen till stor del bestäms av renhet och livskraft isolerade myoblaster. Vidhäftningen, spridningen och fusionskapacitet kan användas för att empiriskt komma åt dessa parametrar (Figur 1 A, B). Vid spridning D2 bör myoblaster har följt och ska visa den typiska spolformade form. Proliferation förväntas ske i stor utsträckning på det här stadiet, vilket leder till spontan myotube bildning följande dag (Figur 1B).
Cell konfluens kanske behöver smärre justeringar. Det bör ökas om myoblaster ta mer än 3 d att föröka sig och säkring. Det bör minskas om myofibers inte tillåts växa och långsträckt relativt rakt på grund av deras densitet. Konfluens minskar typiskt från centrum till periferin av skålen, så de bästa myofibers bör finnas i riktning mot de yttre områdena.
Myotuber kommer snabbt långsträckt och visa flera centralt inriktade kärnor (Figur 1C). Genom D5, vissa celler börjar förvärva strimmor och flytta sina kärnor till periferin. Antalet myofibers med mogna egenskaper kommer att öka med tiden samt med celltjockleken (figur 1D).
Graden av differentiering kan observeras ytterligare genom immunofluorescens. Myofibers fast vid differentiering D8 närvarande tvär triader. Detta kan bekräftas genom avbildnings komponenter i T-tubuli (DPHR) och SR (triadin), som förväntas colocalize på triaderna (Figur 2).
Funktionaliteten av myofibers kan lösas genom levande avbildning. Från differentiering D3 och framåt, cellerna uppvisar spontan ryckningar. Genom att transfektera en kalciumsensor (t.ex.., GCaMP6f 11), är det möjligt att observera att de sammandragningar är kopplade med kalcium toppar (Figur 3).
Med detta system, kunde vi identifiera en ny molekylär väg som störs i centronuclear myopatier och myotona dystrofi, som därför kan vara ett nytt mål för innovativa molekylära behandlingar 7. Vi har också anpassat denna metod för att studera utvecklingen av den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) 12. Genom samodling med råttryggmärgs explants, har vi beskrivit en roll för dynein i NMJ bildningen 13.
Figur 1: utvecklingsstadier av myoblast kultur. A) Vid spridning D2 har myoblaster anslutit sig och började frodas. B) Vid prolifbete D3, en konfluens av 60-80% uppnåtts, och myoblaster börjar fusing spontant. C) Vid differentiering D3, myotuber innehåller centralt belägna kärnor dominerar. D) Från differentiering D5 och framåt (t.ex. dag 8), myofibers börja uppvisar strimmor och perifera kärnor och börjar tjockna. Skala bar: 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant Confocal Bild på en D8 Myofiber Immunostain. A) Immunfärgning för dihydropyridin-receptorn (DHPR, övre panelen) och triadin (TRDN, mellersta panel). En överlagring av de DHPR, TRDN och DAPI kanaler visar samlokalisering av triad komponenter. B) En intensitetsprofilen hos den gula linjen dras i A. C) En 3D-bild av volymrendering av myofibers färgade för α-actinin (grön) och DAPI (blå). Skala bar och galler bredd: 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Live avbildning av kalciumnivåer i Myofibers med Spontan Twitching. A) Höghastighets time-lapse (20 ms ramar) mikroskopi av en kalcium gnista i en ryckningar myofiber. Kalcium detekterades genom uttrycket av GCaMP6f (Addgene plasmid # 40755). B) Kvantifiering av fluorescensintensiteten över tiden för kalciumsensorn i panel A._blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Användningen av detta protokoll för odling av primära myoblaster ger upphov till en speciell nisch som kraftigt vårdar utvecklingen av myofibers. Detta beror delvis på andra celltyper som också är närvarande i mycket litet antal. En balans mellan myoblast koncentration och odlingsrenhet måste uppnås. En bra cellodling beror också på kvaliteten på de produkter som används för mediumformulering. Alla produkter som härrör från animaliska källor bör noggrant testade. I vår erfarenhet, bör matsmältningen villkor också övervakas.
Som vanligt för primära kulturer kan experimentell variabilitet vara högre än i studier med isolerade fibrer eller immortaliserade myoblaster. Denna variation kan minskas genom standardisering av medelstora och matsmältning komponenter, möss ålder och storlek, och tidpunkter för kultur manipulation och resultat samling. Icke desto mindre, den fördelen att granska i realtid de invecklade mekanismernödvändig för myofiber utveckling kraftigt överträffar variabiliteten nackdel.
Detta protokoll ger fördelarna med in vitro-metoder utan att kompromissa med celldifferentiering. Myofibers mogna tills triader bildas och sammandragningar är kopplade till kalcium gnistor. Dessa funktionella utgångar kan nås i olika experimentella förhållanden. Dessutom kan det finnas många tekniska variationer som gjorts i protokollet. Myoblaster kan skördas från neonatala möss med mutationer av intresse i samband med muskelutveckling. Celler kan lyseras för biokemisk analys vid olika differentierings tidpunkter. Kalciumindikatorer kan tillsättas till odlingen för att följa dess dynamik. Optogenetic konstruktioner kan användas för att genomdriva vissa signalvägar eller att inducera specifika lokala reaktioner. Slutligen kan de myofibers vara samodlades med andra celltyper för att studera deras interaktioner.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
| IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
| Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5 |
| Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
| Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
| Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Eurobio | CVFSVF0001 | |
| Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
| Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200 ng/µL |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and Media | |||
| Digestion Mix | in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
| Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered |
||
| Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
- Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases. Front Physiol. 5, 37 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J Vis Exp. (73), (2013).
- Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J Vis Exp. (106), (2015).
- Falcone, S., Roman, W., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2. J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).
- Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression. Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).
- Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skelet Muscle. 1, 26 (2011).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. , (2016).
- Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS. Sci Rep. 6, 27804 (2016).
