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Immunology and Infection

लीजोनेला pneumophila बाहरी झिल्ली Vesicles: अलगाव और मैक्रोफेज पर उनके समर्थक भड़काऊ संभावित का विश्लेषण

Published: February 22, 2017 doi: 10.3791/55146
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3
1Institute for Lung Research, Universities of Giessen and Marburg Lung Center, Philipps-University Marburg, 2German Center for Lung Research, 3Department of Medicine, Pulmonary and Critical Care Medicine, University Medical Center Giessen and Marburg

Summary

यहाँ, हम लीजोनेला pneumophila (एल pneumophila) तरल संस्कृतियों से बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (OMVs) की शुद्धि का वर्णन है। ये शुद्ध पुटिकाओं तो मैक्रोफेज के इलाज के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं उनके समर्थक भड़काऊ संभावित विश्लेषण करने के लिए।

Introduction

जीवाणु अलग तंत्र के माध्यम से 1 विषैलापन कारकों छिपाना कर सकते हैं। जाने-माने स्रावी सिस्टम इसके अलावा, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के बारे में जानकारी का आदान-प्रदान और बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (OMVs), जो छोटे हैं, अंडाकार आकृति पुटिकाओं व्यास में 10-300 एनएम और एक bilayered झिल्ली संरचना के साथ के माध्यम से डाह कारकों वितरित कर सकते हैं। वे विकास के वातावरण (तरल संस्कृति, ठोस संस्कृति, और biofilms) की एक किस्म में और सभी विकास के चरण 2, 3 में स्रावित होते हैं। OMVs परिवहन का एक महत्वपूर्ण साधन हैं (जैसे, के लिए प्रोटीन, adhesins, जहर, और एंजाइमों, साथ ही साथ के लिए LPS, OMV सतह पर पाया जाता है) 4। Intraluminal माल प्रोटिओलिटिक गिरावट से सुरक्षित है, तो यह लंबी दूरी पर कार्य करने के लिए सक्षम है, और पुटिकाओं शरीर के तरल पदार्थ और दूर के अंगों 5, 6 में पाया जा सकता है,"xref"> 7, 8। वे केवल मान्यता प्राप्त नहीं किया जा सकता है और कोशिकाओं 9, 10 से ऊपर ले लिया है, लेकिन इसके अलावा, वे मेजबान कोशिकाओं 4 में बैक्टीरिया और उनके आक्रमण के बंधन की सुविधा के लिए सक्षम हैं। लीजोनेला pneumophila (एल pneumophila) एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु कि OMVs जारी कर सकते है। मानव फेफड़ों में, यह मुख्य रूप से वायुकोशीय मैक्रोफेज को संक्रमित करता है, भले ही अपनी प्राकृतिक मेजबान मीठे पानी अमीबा 11 हैं। एक एल pneumophila संक्रमण Legionnaires रोग, निमोनिया 12 की एक गंभीर रूप हो सकता है। यह ब्लॉक फेगोसोम-lysosome मेजबान कोशिका में संलयन। यह भी मेजबान अंगों जिससे एक प्रतिकृति आला, लीजोनेला युक्त रिक्तिका (एलसीवी), 13, 14 का गठन किया है रंगरूटों। लाइसोसोमल गिरावट न केवल प्रेरक प्रोटीन टीआरए से हिचकतेप्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली के माध्यम से, लेकिन यह भी OMVs 15 की रिहाई के द्वारा nslocation।

बैक्टीरियल संस्कृतियों से OMVs की शुद्धि प्राप्तकर्ता कोशिकाओं पर उनके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है। इससे पहले एल pneumophila OMVs में प्रोटीन की मात्रा पर और वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं 16 है, लेकिन मानव फेफड़े के ऊतकों प्रत्यारोपण के साथ बाद में पढ़ाई पर पुटिकाओं के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित अध्ययन दिखा कि एल pneumophila OMVs वायुकोशीय मैक्रोफेज 17 द्वारा लिया जाता है।

OMVs वर्तमान रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) और अन्य जीवाणु एंटीजन के रूप में, वे कोशिकाओं के संक्रमण पर प्रभाव पड़ता है और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 18 मिलाना हो सकता है। एल pneumophila OMVs तेजी से मेजबान कोशिका झिल्ली के साथ फ्यूज और, इसके अलावा, वे झिल्लीदार TLR2 19 को सक्रिय करें। ऐसा नहीं है कि एल pneumoph के रूप में जाना जाता हैइला OMVs एक समर्थक भड़काऊ तरीके से 16, 17 में मैक्रोफेज और उपकला कोशिकाओं को उत्तेजित, हम मानव और murine मैक्रोफेज में संक्रमण की प्रक्रिया पर OMVs के प्रभाव का विश्लेषण किया।

यहाँ, हम अंतर ultracentrifugation द्वारा secreted OMVs अलग-थलग करने और यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं पर पुटिकाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए, या तो सीधे या एक संक्रमण के बाद तरल संस्कृति में एल pneumophila की खेती के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Protocol

1. मध्यम और अगर प्लेटें तैयार

  1. शोरबा मध्यम (YEB) के 1 एल तैयार करें। इक्के की 10 ग्राम और आसुत जल के 900 एमएल में खमीर निकालने की 10 ग्राम भंग। KOH (5 एन) के साथ 6.9 पीएच को समायोजित करें। एल सिस्टीन और फे की 10 एमएल (आसुत जल के 10 एमएल में 0.4 ग्राम) के 10 एमएल जोड़ें (सं 3) 3 x9H 2 ओ (आसुत जल के 10 एमएल में 0.25 छ)। आसुत जल के साथ 1 एल को भरने और समाधान (ताकना आकार: 0.22 माइक्रोन) बाँझ फिल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  2. बफर लकड़ी का कोयला खमीर निकालने (BCYE) प्लेटों अगर तैयार करें। इक्के की 10 ग्राम और आसुत जल के 900 एमएल में खमीर निकालने की 10 ग्राम भंग। KOH (5 एन) के साथ 6.9 पीएच को समायोजित करें। अगर की 15 ग्राम और सक्रिय लकड़ी का कोयला का 2.5 ग्राम जोड़ें। आसुत जल और आटोक्लेव के साथ 1 एल को भरें।
    1. एल सिस्टीन के 10 एमएल जोड़ें और (आसुत जल के 10 एमएल में 0.4 ग्राम) फे की 10 एमएल (सं 3) 3 x9H 2 ओ (आसुत जल के 10 एमएल में 0.25 जी, दोनों निस्पंदन द्वारा निष्फल 0.22 माइक्रोन के माध्यम सेpores) ठंडा BCYE (लगभग 50 डिग्री सेल्सियस)। 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें और दुकान डालो।

2. एल pneumophila खेती

  1. BCYE अगर प्लेटों पर बिखरा एल pneumophila तनाव Corby (जंगली प्रकार, डब्ल्यूटी) और 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं। एक आयुध डिपो preculture थाली से एल pneumophila के साथ 0.3 के 600 में YEB के 10 एमएल टीका लगाना; 6 घंटे के लिए एक घूर्णन प्रकार के बरतन (150 आरपीएम) पर 37 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया सेते हैं।
  2. एक रक्त अगर प्लेट पर निलंबन के 100 μL के प्रसार के द्वारा तरल संस्कृति की शुद्धता की जाँच करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
  3. ताजा YEB माध्यम के 90 एमएल के लिए शेष तरल संस्कृति जोड़ें और एक घूर्णन प्रकार के बरतन (37 डिग्री सेल्सियस और 150 आरपीएम) पर सेते एक आयुध डिपो के 600 3.0-3.5, जो लगभग 16-20 घंटे तक पहुँचने के लिए ले जाता है।

3. तैयार है और यों एल pneumophila OMVs

नोट: निम्न centrifugation कदम के सभी बाहर लेबाँझ शर्तों के तहत और 4 डिग्री सेल्सियस पर है।

  1. 20 मिनट के लिए 4000 XG पर तरल संस्कृति अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया गोली। ताजा अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला बैक्टीरिया गोली त्यागें, और centrifugation (20 मिनट के लिए 4000 XG) दोहराएँ। यह कदम एक बार दोहराएँ।
  2. बाँझ फिल्टर शेष सतह पर तैरनेवाला दो बार (ताकना आकार: 0.22 माइक्रोन)। 3 घंटे के लिए 100,000 XG पर ultracentrifuge ट्यूब और ultracentrifuge को बैक्टीरिया मुक्त सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  3. सतह पर तैरनेवाला छानना और यह त्यागें। बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और ultracentrifuge (100,000 3 घंटे के लिए XG) में OMV गोली Resuspend contaminating प्रोटीन और LPS हटा दें।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बाँझ पीबीएस के 500 μL में OMV गोली resuspend। स्ट्रीक 20 μL एक रक्त अगर प्लेट पर और एक BCYE अगर प्लेट पर तैयार पुटिकाओं के जीवाणु संक्रमण बाहर करने के लिए। 37 में रक्त अगर प्लेट रातोंरात और 3 दिन (दोनों के लिए BCYE अगर प्लेट सेते6; सी)।
  5. प्रोटीन राशि निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक bicinchoninic एसिड परख का उपयोग OMV तैयारी से प्राप्त यों।
    नोट: 100 एल एमएल pneumophila संस्कृति की एकाग्रता आमतौर पर 1 माइक्रोग्राम / μL है। -20 डिग्री सेल्सियस पर तैयार की और मात्रा निर्धारित OMVs स्टोर।

4. पूर्व इलाज मैक्रोफेज

  1. THP-1 कोशिकाओं को तैयार।
    नोट: THP-1 एक monocytic सेल एक ल्यूकेमिया मरीज से निकाली गई रेखा है।
    1. 24 कुओं प्रति 2x10 5 THP-1 कोशिकाओं जोड़ें और मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह में 20 एनएम phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) जोड़कर उन्हें अलग। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. ताजा माध्यम के 500 μL के साथ मध्यम बदलें और एक और 24 घंटे के लिए सेते; THP-1 कोशिकाओं के लिए इष्टतम मध्यम RPMI 1640 उच्च ग्लूकोज 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक से बना है।
  2. , Murine अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (mBMDM) को अलग संदर्भ लें के रूप में वर्णितखिलाडि़यों 20।
  3. समझो THP-1 व्युत्पन्न मैक्रोफेज या OMVs साथ mBMDM।
    1. चरण 3 में तैयार OMVs गला लें और उन्हें अपने प्रोटीन राशि (0.1, 1, और 10 माइक्रोग्राम / एमएल) मानव या murine मैक्रोफेज के अनुसार जोड़ें। कम से कम 20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर OMVs साथ मैक्रोफेज सेते हैं। एलिसा के लिए सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करें या चरण 5 के साथ आगे बढ़ना।

5. मैक्रोफेज संक्रमित और एक कॉलोनी के गठन इकाई (CFU) परख के साथ बैक्टीरियल प्रतिकृति का आकलन

  1. 2.1 कदम से एल pneumophila का प्रयोग करें, पूर्व इलाज THP-1 कोशिकाओं या mBMDM 4.3 चरण से, और नियंत्रण (2x10 5/24 कुओं) के रूप में नहीं पूर्व में इलाज मैक्रोफेज। मध्यम का आदान-प्रदान नहीं करते।
  2. एल pneumophila Corby की एक flagellin-कमी उत्परिवर्ती साथ एल pneumophila Corby WT और mBMDM साथ THP-1 कोशिकाओं को संक्रमित ((0.5 की MOI) संक्रमण की बहुलता के साथ दोनों, 1x10 5 एल pneumophila / 24 कुओं) और 24 के लिए सेते और 48 घंटे, क्रमशः। बो तैयारवें एल pneumophila Corby (डब्ल्यूटी या flagellin-कमी उत्परिवर्ती) 2.1 चरण में वर्णित है।
  3. Lyse सैपोनिन के अलावा द्वारा उनके माध्यम में कोशिकाओं (अंतिम एकाग्रता: 0.1%) और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. pipetting द्वारा बैक्टीरिया Resuspend और एक प्रतिक्रिया पोत को निलंबन हस्तांतरण। एल pneumophila बाँझ पीबीएस में मीडिया युक्त के धारावाहिक dilutions तैयार करें।
  5. स्ट्रीक BCYE अगर प्लेटों पर आवश्यक dilutions के 50 μL और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए सेते हैं।
  6. नेत्रहीन गठन कालोनियों गिनती। CFU गणना 1 समीकरण नहीं पूर्व इलाज लेकिन संक्रमित मैक्रोफेज, जो 100% करने के लिए सेट कर रहे हैं CFU गिनती परिणाम मानक के अनुसार।

Representative Results

प्रयोगात्मक सेटअप एल pneumophila OMVs तैयार करने के लिए और निम्नलिखित संक्रमण चित्र 1 में दिखाया गया है मैक्रोफेज के समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया पर अपने प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए। तैयार OMVs के समर्थक भड़काऊ संभावित पीएमए विभेदित THP-1 कोशिकाओं है, जो चित्रा 2 में दिखाया गया है पर विश्लेषण किया जा सकता है। THP-1 कोशिकाओं आईएल -8 और आईएल -6 स्राव का एक समय और खुराक पर निर्भर वृद्धि के साथ जवाब। इसके अतिरिक्त, एल pneumophila OMV मान्यता पर अलग TLRs के प्रभाव, विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि से mBMDM का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता के रूप में चित्रा 3 में CXCL1 एलिसा द्वारा प्रस्तुत किया। OMV उत्तेजना के बाद CXCL1 स्रावित गुम्मट चूहों से mBMDM, जबकि mBMDM TLR2 / 4 - / - काफी कम स्रावित। THP-1 मैक्रोफेज में बैक्टीरियल प्रतिकृति पर एल pneumophila OMVs के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं OMVs साथ पूर्व incubated रहे थे और फिर इसके अतिरिक्त संक्रमितएल pneumophila साथ (चित्रा 4 ए)। THP-1 व्युत्पन्न मैक्रोफेज के पूर्व उत्तेजना पहले संक्रमण के 24 घंटे के बाद बैक्टीरियल प्रतिकृति को कम कर देता है, लेकिन यह CFU में एक दोहरीकरण की ओर जाता है बाद में समय बिंदु (48 घंटे पीआई) में गिनते हैं। टोल की तरह रिसेप्टर (TLR) मैक्रोफेज के संक्रमण के बाद OMV मान्यता पर संकेत के प्रभाव, mBMDM द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है के रूप में चित्रा 4 बी में प्रस्तुत किया। जीवाणु प्रतिकृति OMV पूर्व ऊष्मायन के बाद गुम्मट जानवरों से mBMDM में दस गुना से बढ़ जाती है, जबकि TLR2 - / - और Trif / MyD88 - / - कोशिकाओं एल pneumophila प्रतिकृति में इस वृद्धि नहीं दिखाते।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रायोगिक प्रक्रिया। (ए) एल pneumophila Corby गुम्मट 10 सेमी BCYE अगर प्लेटें एक छोटा सा तरल संस्कृति (10 एमएल) है, जो ताजा YEB के 90 एमएल में स्थानांतरित कर रहा है टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं से6 घंटे के बाद मध्यम। एक छोटी मात्रा भी शुद्धता के लिए जाँच करने के लिए एक रक्त अगर प्लेट पर चढ़ाया जाता है। जीवाणु जल्दी स्थिर चरण (600 आयुध डिपो = 3.0-3.5) जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated हैं। (बी) के तरल संस्कृति centrifuged है और बैक्टीरिया को दूर करने के लिए बाँझ फ़िल्टर। लीजोनेला मुक्त सतह पर तैरनेवाला तो एक OMV गोली है, जो पीबीएस में फिर से resuspended और ultracentrifuged है प्राप्त करने के लिए ultracentrifuged है। पृथक पुटिकाओं resuspended हैं, पवित्रता के लिए जाँच की है, और प्रोटीन की मात्रा निर्धारित राशि के लिए। पैमाने पर पट्टी 2.5 सेमी का प्रतिनिधित्व करता है। (सी) मानव या murine मैक्रोफेज मात्रा निर्धारित OMVs के साथ प्रेरित कर रहे हैं। सेल संस्कृति सतह पर तैरनेवाला एलिसा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या मैक्रोफेज 10 सेमी BCYE अगर प्लेटों पर CFU परख द्वारा बैक्टीरियल प्रतिकृति निर्धारित करने के लिए एल pneumophila से संक्रमित हो सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एल pneumophila OMVs द्वारा THP-1 कोशिकाओं के समर्थक भड़काऊ सक्रियण। (ए) यहाँ, monocytic THP-1 सेल लाइन वायुकोशीय मैक्रोफेज के लिए एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है। पीएमए विभेदित THP-1 कोशिकाओं में क्रमश: 24 और 48 घंटे के लिए एल pneumophila OMVs (0.01-25 माइक्रोग्राम / एमएल) की खुराक में वृद्धि, के साथ इलाज किया गया। सेल मुक्त सतह पर तैरनेवाला आईएल -8 एलिसा के लिए इस्तेमाल किया गया था। ± SEM के तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मूल्यों का मतलब दिखाए जाते हैं। THP-1 कोशिकाओं महत्वपूर्ण आईएल -8 स्राव, जो समय और खुराक पर निर्भर था के साथ के रूप में छोटे रूप में 0.01 माइक्रोग्राम / एमएल एल pneumophila OMVs को जवाब दिया। (बी) एल pneumophila OMVs (0.1-10 माइक्रोग्राम / एमएल) पीएमए विभेदित THP-1 कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। सतह पर तैरनेवाला ऊष्मायन के 24 और 48 घंटे के बाद एकत्र किया गया था, और जारी आईएल -6 एलिसा के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला में मापा गया था। ± SEM के तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मूल्यों का मतलब दिखाए जाते हैं। THP-1 कोशिकाओं भी OMVs की सबसे कम खुराक (0.1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ आईएल -6 के महत्वपूर्ण मात्रा में स्रावित। आईएल -6 का स्राव OMV खुराक में वृद्धि के साथ और लंबे समय तक ऊष्मायन समय के साथ वृद्धि हुई है। सांख्यिकी: मान व्हिटनी परीक्षण; * पी <0.05 और ** पी <0.01 इसी 0 माइक्रोग्राम / एमएल OMV की तुलना में। संदर्भ 20. से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: मैक्रोफेज के समर्थक भड़काऊ सक्रियण TLR2 / 4 पर निर्भर करता है। गुम्मट से mBMDM और TLR2 / 4 - / - चूहों एल pneumophila OMVs (0.1 या 1 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ incubated रहे थे। CXCL1 स्राव 24 और 48 घंटे के बाद एलिसा द्वारा विश्लेषण किया गया था, क्रमशः।तीन स्वतंत्र प्रयोगों के SEM ± मतलब मूल्यों को दिखाया जाता है। WT चूहों से mBMDM एल pneumophila OMV ऊष्मायन के बाद एक खुराक पर निर्भर CXCL1 स्राव के साथ जवाब दिया। TLR2 / 4 - / - mBMDM गुम्मट mBMDM की तुलना में काफी कम CXCL1 स्रावित, और इस स्राव में वृद्धि नहीं था खुराक dependently। सांख्यिकी: मान व्हिटनी परीक्षण; * पी <0.05 इसी 0 माइक्रोग्राम / एमएल OMV की तुलना में; #P 0.05 <एक समान रूप से व्यवहार किया गुम्मट नमूना की तुलना में। संदर्भ 20. से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: मैक्रोफेज में एल pneumophila OMV पूर्व ऊष्मायन बढ़ जाती है बैक्टीरियल प्रतिकृति। (ए) विभेदित THP-1 कोशिकाओं OMVs (0.1, 1 के साथ पूर्व incubated रहे थे, या 10 μछ / एमएल) या एलपी / IFN-γ (200 एनजी / एमएल प्रत्येक) या नियंत्रण के लिए इलाज छोड़ दिया गया था। पूर्व ऊष्मायन (20 ज) के बाद, THP-1 कोशिकाओं एल pneumophila Corby डब्ल्यूटी (MOI 0.5) के साथ 2, 24, और 48 घंटे के लिए क्रमश: संक्रमित थे। THP-1 कोशिकाओं सैपोनिन के अलावा द्वारा lysed रहे थे, और बैक्टीरिया BCYE अगर प्लेटों पर चढ़ाया गया। CFUs हर समय बिंदु के बाद 0 माइक्रोग्राम / एमएल OMV के सापेक्ष गणना की गई। सलाखों के तीन स्वतंत्र प्रयोगों, तकनीकी डुप्लिकेट में प्रदर्शन प्रत्येक के SEM ± मतलब मूल्यों प्रतिनिधित्व करते हैं। वहाँ नहीं पूर्व इलाज कोशिकाओं की तुलना में बैक्टीरियल तेज (2 घंटे के बाद संक्रमण (पीआई)) में कोई मतभेद नहीं थे। बैक्टीरियल प्रतिकृति में बदलाव, 24 और 48 घंटे के बाद निर्धारित किया गया है क्रमशः। LPS / IFN-γ पूर्व इलाज THP-1 कोशिकाओं बैक्टीरियल लोड 24 घंटे गड़बड़ी में कमी यह भी एल pneumophila OMV पूर्व इलाज कोशिकाओं के लिए खुराक dependently मनाया गया दिखाया। बाद में समय बिंदु (48 घंटे पीआई) में OMV पूर्व इलाज THP-1 कोशिकाओं एल pneumophila पुनः में एक दोहरीकरण से पता चलातह, एलपीएस जबकि / IFN-γ पूर्व इलाज मैक्रोफेज जीवाणु लोड की और कमी देखी गई। सांख्यिकी: मान व्हिटनी परीक्षण; * पी <0.05 और ** पी <0.01 इसी 0 माइक्रोग्राम / एमएल OMV की तुलना में। 0.1 माइक्रोग्राम / एमएल एल pneumophila OMVs के साथ पूर्व incubated रहे थे 20 घंटे के लिए और फिर एक flagellin- से संक्रमित थे विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ चूहों (गुम्मट, TLR2 - / -, और Trif / MyD88 - - /) से (बी) mBMDM 48 घंटे के लिए एल pneumophila Corby (MOI 0.5) की कमी उत्परिवर्ती। mBMDM सैपोनिन के अलावा द्वारा lysed रहे थे, और लीजोनेला BCYE अगर प्लेटों पर चढ़ाया गया। CFU 0 माइक्रोग्राम / एमएल OMV के सापेक्ष गणना की गई है, ठोस लाइन द्वारा संकेत दिया। सलाखों मतलब मूल्यों ±± तीन स्वतंत्र प्रयोगों, डुप्लिकेट में प्रदर्शन प्रत्येक के SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। WT चूहों से mBMDM OMV पूर्व उपचार के बाद एल pneumophila प्रतिकृति में वृद्धि देखी गई। TLR2 - / - मैक्रोफेज काफी कम दिखाया - / - mBMDM। सांख्यिकी: मान व्हिटनी परीक्षण; पी <0.05 गुम्मट नमूना की तुलना में। संदर्भ 20. से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

बैक्टीरियल रोगज़नक़ों और उनके लक्ष्य कोशिकाओं पर इन झिल्ली पुटिकाओं के प्रभाव का OMVs वर्तमान में अधिकता का अध्ययन किया जा रहा है। उदाहरण के लिए, क्लोस्ट्रीडियम perfringens व्युत्पन्न OMVs मैक्रोफेज में साइटोकाइन स्राव को प्रेरित, बी लिम्फोसाइट Borrelia burgdorferi से OMVs से सक्रिय किया जा सकता है, और हेलिकोबेक्टर -released झिल्ली पुटिकाओं गैस्ट्रिक उपकला कोशिकाओं 21, 22, 23 पर कार्रवाई कर सकते हैं। एल pneumophila, एक intracellular रोगज़नक़ कि असामान्य निमोनिया की एक गंभीर रूप पैदा कर सकते हैं, यह भी OMVs कि फेफड़ों उपकला कोशिकाओं और मैक्रोफेज 16, 19 को सक्रिय करने में सक्षम हैं विज्ञप्ति। यहाँ, हम तरल संस्कृति से एल pneumophila OMVs के छोटे पैमाने पर अलगाव निमोनिया में OMVs की संभावित भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। यह बाँझ Condit के तहत काम करने के लिए महत्वपूर्ण हैआयनों और आदेश में एक शुद्ध एल pneumophila प्राप्त करने के लिए अन्य बैक्टीरिया से संक्रमण से बाहर शासन करने के लिए OMV तैयारी व्युत्पन्न। OMVs के अलगाव के क्रम में, एल pneumophila के साथ प्राप्त OMV गोली के प्रदूषण को रोकने के लिए भले ही यह OMV उपज कम कर देता है, के बाद से सबसे बड़ा OMVs इस निस्पंदन कदम से खो रहे हैं में 0.22 माइक्रोन छिद्रों के माध्यम से एक निस्पंदन कदम भी शामिल है।

इसके अलावा, हम और अधिक बारीकी से लीजोनेला निमोनिया, जहां OMVs कोशिकी बैक्टीरिया 15 से एलसीवी के अंदर जारी कर रहे हैं में स्थिति लगभग करने के लिए उन पृथक पुटिकाओं और एल pneumophila से संक्रमित कोशिकाओं को मानव और murine मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया का परीक्षण किया। नियोजित OMV खुराक ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद मानव मैक्रोफेज की इन विट्रो संक्रमण में मुफ्त OMV राशि के अनुसार अनुमान लगाया गया है (संदर्भ 20 में वर्णित)। अन्य प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए या विवो प्रयोगों में,अन्य OMV खुराक आवश्यक हो सकता है और स्थापित किया जाना चाहिए। एल pneumophila OMVs के प्रभाव का विश्लेषण प्रोटोकॉल Jager और Steinert 24 द्वारा वर्णित करने के लिए एक प्रगति का प्रतिनिधित्व करता।

इधर, पीएमए विभेदित THP-1 कोशिकाओं प्राथमिक मानव सामग्री की सीमित उपलब्धता के कारण वायुकोशीय मैक्रोफेज के लिए एक मॉडल के रूप में सेवा करते हैं। पीएमए के अलावा मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह 25 में monocytic THP-1 कोशिकाओं differentiates। इसके अलावा, वे एल pneumophila के लिए एक प्रसिद्ध मॉडल सेल लाइन अध्ययन 26 कर रहे हैं। इस मानव monocytic सेल लाइन इसके अलावा, mBMDM कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाता है। mBMDM व्यापक रूप से एल pneumophila 27, 28, 29 के प्रभाव के अध्ययन के लिए स्वीकार कर रहे हैं। अलग TLRs या अन्य प्रोटीन के लिए आनुवंशिक नॉकआउट उपयोग करने की संभावना उन्हें OMV प्रभाव के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाते हैं। ORD मेंप्रयोग के प्रति चूहों की राशि को कम करने के लिए एर, mBMDM मैक्रोफेज की सीमाओं के कारण वायुकोशीय मैक्रोफेज के बजाय प्रयोग किया जाता है। कुंजी प्रयोगों सत्यापन के लिए वायुकोशीय मैक्रोफेज की आवश्यकता हो सकती है।

Ultracentrifugation के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल OMVs शुद्ध करने के लिए इसके अलावा, यह एक घनत्व ढाल centrifugation, जो Chutkan एट अल द्वारा प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है प्रदर्शन करने के लिए संभव है। 30। यह प्राप्त OMV तैयारी की शुद्धता में सुधार और सह शुद्ध प्रोटीन समुच्चय, flagellin, और LPS की मात्रा को कम कर सकता है। प्राप्त OMV तैयारी की पवित्रता संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा या गुणवत्ता नियंत्रण में एक अनुपूरक कदम के रूप में nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। इस प्रोटीन माप प्रक्रिया यहाँ प्रस्तुत परे, गुणात्मक रूप से एक अतिरिक्त साधन प्रदान कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, एलपीएस एकाग्रता एक Limulus amebocyte lysate परीक्षण से विश्लेषण किया जा सकता है। OMV उपज कम है, तो एककेन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से अतिरिक्त एकाग्रता कदम प्रदर्शन किया जा सकता है, जो यहाँ नहीं किया गया था। तो उपज की उम्मीद से कम रहा, OMVs खारिज कर दिया गया था।

OMVs पीछे जैविक तंत्र और कार्यों को स्पष्ट करने के लिए चल रहे प्रयास के तहत, OMV उत्पादन पर अलग तनाव की स्थिति के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है। पोषक तत्वों के अभाव, हानिकारक एजेंटों के लिए ऊष्मायन के तापमान, या जोखिम में परिवर्तन OMV स्राव 31 पर एक प्रभाव हो सकता है। संभावित तनाव की स्थिति Klimentova और Stulik 32 से प्रोटोकॉल में चर्चा कर रहे हैं। इसके अलावा, अति या hypovesiculating एल pneumophila म्यूटेंट उत्पन्न किया जा सकता है। अलग OMV की तैयारी तो मैक्रोफेज, मानव फेफड़े के ऊतकों explants (संदर्भ 17 में वर्णित), या यहां तक कि इन विवो मॉडल में संक्रमण के साथ प्रयोगों में विश्लेषण किया जा सकता है। सहज प्रतिरक्षा संकेतन में OMVs की भूमिका, बैक्टीरियल संचार में उनके प्रभाव के अलावाप्रयोगात्मक संबोधित किया जा सकता। इसके अलावा, विभिन्न सहज प्रतिरक्षा cascades संकेत के प्रभाव murine पीटकर कोशिकाओं के उपयोग या मानव कोशिका लाइनों में CRISPR / Cas9 नॉकआउट की पीढ़ी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। OMVs में यह बुनियादी अनुसंधान नया टीका रणनीति है, जो पहले से ही नेइसेरिया meningitides 33 के माध्यम से प्रेषित मेनिनजाइटिस बी के लिए मौजूद हैं के विकास में मदद करेंगे।

OMV अलगाव और लक्षण पर प्रोटोकॉल से शुरू, एक अन्य ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और अन्य मेजबान कोशिकाओं को यह आवेदन कर सकते हैं; यह केवल तरल संस्कृति में बैक्टीरिया की वृद्धि को समायोजित करने की जरूरत है। प्रोटोकॉल Chutkan एट अल द्वारा प्रकाशित किया। कोलाई और Pseudomonas aeruginosa 30 से OMVs की पीढ़ी के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है। संस्कृति के आदेश और lysed बैक्टीरिया में बढ़ जाती है contaminating प्रोटीन और मेम से बचने के लिए देर से स्थिर चरण तक पहुंचने नहीं करना चाहिएbranes। इसके अतिरिक्त, मेजबान कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया OMV खुराक, विवो में संक्रमण के दौरान OMVs वर्तमान की राशि के अनुसार निर्धारित किया जाना है, जबकि अभी भी cytotoxicity की कम दर सुनिश्चित करने की जरूरत है। इस तरह, OMVs के रोग भूमिका, अंतर-प्रजाति संचार, और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पर उनके प्रभाव की जांच की जा सकती है।

आगे निमोनिया में एल pneumophila OMVs की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, पर्याप्त पैदावार और तुलनीय संक्रमण प्रयोगों के साथ मानकीकृत OMV की तैयारी की जरूरत है। इस प्रोटोकॉल अलगाव प्रक्रियाओं का मानकीकरण करने और अन्य ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और अन्य मेजबान कोशिकाओं को OMV अध्ययन का विस्तार करने में मदद मिलेगी। इसके अलावा, अनुसंधान विट्रो ज्ञान है, जो इन विवो सेटिंग्स करने के लिए प्रयोगों का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में विस्तृत से लाभ होगा। भविष्य में, इस तरह के प्रोटोकॉल सीरम या ब्रोन्कोएल्वियोलर लव के रूप में प्राथमिक जैविक सामग्री से OMVs, के अलगाव के लिए बढ़ाया जा सकता हैउम्र तरल पदार्थ, OMVs की संरचना शारीरिक शर्तों के तहत जारी किया गया में जानकारी हासिल करने के लिए। इस OMV रचना के प्रमुख मानकों का निर्धारण करने के लिए और इन विट्रो -generated OMVs के गुणों को समझने में मदद मिलेगी।

Acknowledgments

हम TLR2 के साथ हमें प्रदान करने के लिए प्रो डॉ मार्कस Schnare धन्यवाद - / - और TLR2 / 4 - / - चूहों और Trif / MyD88 के लिए प्रो डॉ कार्स्टन किरशनिंग - / - चूहों। इस काम के कुछ हिस्सों Bundesministerium फर Bildung und Forschung द्वारा वित्त पोषित किया गया (ई: जैव miRSys - FKZ 0316175B, ई: मेड CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), और Hessisches Ministerium फर Wissenschaft und Kunst (LOEWE मेडिकल RNomics - FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), सभी बी एस।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 82.1473
70 Ti rotor Beckman Coulter Incorporation (California, USA) 337922
ACES Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9138.2
activated charcoal Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) X865.2
agar-agar, Kobe I Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5210.2
Columbia agar with 5% sheep blood Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) 254005
cuvettes Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 67.742
ELISA (human) BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murine) DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2O Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 5632.1
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 10270-106
Heracell 240i CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 40830469
Heraeus Multifuge X3R Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 75004515
Inoculation loop  Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) 86.1567.010
KOH Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 6751.1
L. pneumophila Corby --- --- kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)
L. pneumophila Corby ΔflaA --- --- kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)
L-cystein Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)
mBMDM --- --- kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)
PBS Biochrom GmbH (Berlin, Germany) L 1825
phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) P8139-1MG
rotating shaker (MaxQ 6000) Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) SHKE6000
RPMI 1640 high glucose Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) 11875-093
saponin Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 9622.1
Ultrospec 10 Biochrom Ltd (Cambridge, England) 80-2116-30
sterile filter (pore size: 0.22 µm) Corning Incorporated (new York, USA) 431096
THP-1 Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) 88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)
yeast extract Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) 2363.2
Pierce BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) 23225

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References

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संक्रमण अंक 120, बाहरी झिल्ली पुटिकाओं मैक्रोफेज शुद्धि अंतर ultracentrifugation समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया बैक्टीरियल प्रतिकृति
<em>लीजोनेला pneumophila</em> बाहरी झिल्ली Vesicles: अलगाव और मैक्रोफेज पर उनके समर्थक भड़काऊ संभावित का विश्लेषण
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Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. … More

Jung, A. L., Hoffmann, K., Herkt, C. E., Schulz, C., Bertrams, W., Schmeck, B. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (120), e55146, doi:10.3791/55146 (2017).

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