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Biochemistry

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148

Introduction

의학 연구에 많은 관심이 지질 상호 작용의 다양한 관련된 진성 또는 외부 중 막 단백질에 초점을 맞추고있다. 지질 상호 작용하는 단백질과 작업 중 하나가, 세제 등의 지질에 대체를 선택 1 amphipols, 또는 작은 단백질 2, 또는 수용성 활성 단백질을 유지하는 막 대용품을 찾는 포함되어 있습니다. 리포 막 대체는 리포좀과 nanodiscs (ND) 3, 4를 포함한다.

Nanodiscs 당연히 혈액에서 발생하는 고밀도 지단백질 (HDL)의 단백질의 일부 ​​ApoA-1 엔지니어링 개발 가까운 천연 막 플랫폼이다. ApoA-1은 짧은 양친 매성 α-나선의 243 잔류 긴 체인 및 지질없는 수용성 형태가 있습니다. 시험관 내에서의 지질의 존재 하에서, 단백질 ApoA-1 개의 카피 자발적 히드을 둘러싸 재정렬 때지질 이중층 패치 5 ophobic 아실 사슬 부분. ApoA-1의 엔지니어링 버전은 일반적으로 멤브레인 비계 단백질 (MSP)라고하고, 증가는 플라스미드이나 정제 단백질과 같은 시판되고있다. 6 길거나 짧은 7 막 비계 단백질 ApoA-1 결과에 반복 또는 α-나선의 삭제. 차례로 이로써 7 8 내지 17 6nm의 주위 디스크를 형성 할 수있다. nanodiscs 3, 9 응용 프로그램의 다른 유형이있다. 가장 일반적으로 사용되는 애플리케이션이 이전 3 검토 일체 세포막 단백질 (8)의 안정화를위한 니어 - 네이티브 막 환경을 제공하는 것이다. 덜 탐구 이용의 연구 나노 멤브레인 표면을 제공하는 것이다말초 막 단백질 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. 프로토콜의 제 1은 인지질 막 단백질 폴딩 이루어지는 nanodiscs의 제조 과정을 시각화한다.

샘플 준비는 대부분의 방법에서 병목 현상입니다. 방법 별 샘플은 특정 정보를 추가 할 수 있습니다,하지만 그들은 또한 결과의 비교를 어렵게 만든다. 샘플 복합있는 여러 가지 방법에 직접 사용할 수있는 경우에 따라서, 간단하다. nanodiscs의 사용과 장점은 리포좀 (예를 들어, 샘플을 직접 본 프로토콜에서와 같이, TEM 및 비 - 변성 겔 전기 영동에 모두 사용될 수 있음)에 비교하여 나노 디스크의 작은 크기이다.

18이다. 그러나, 리포좀 막에 포함 된 monotopic 막 단백질의 더 높은 해상도의 3D 구조는 우리가 아는까지로, 아직 게시되지 않았습니다. 금 나노 입자는 항체 또는 TEM (19)을 사용하여 리포솜 소낭 또는 결합 단백질을 가시화하기 위해 사용될 수있다. 이 프로브는 매우 특정한 비록 그들이 막 결합 부위를 베일로 덮기하거나 유연한 부분과 관심 영역을 마스킹함으로써 막 - 결합 단백질을 방해 할 수있다. 골드 표지 또는 항체 복합체 단백질은 아마 겔에서 분석 할 수 있지만,이 실험의 비용을 증가시킬 것이다.

리포좀이 뛰어난 플랫폼 비록, 하나는 팝업이 확신 할 수 없다위험률은 리포좀 당 단백질의 특정 비율, nanodiscs (20)를 사용하여 탐색 할 수있는 기능이 있습니다. 리포좀에서, 보조 인자 및 기판 수용성 내부에 트랩 될 수있다. 막 용해 물질은 막 모방 체의 두 가지 유형에 대해 동일한 운명을 공유합니다. 이중층 영역 nanodiscs 작다 그럼에도 불구하고, 약물의 적은 양의 나노 디스크 막을 포화 요구된다.

원자 구조의 결정을 통해 이해 단백질의 기능 연구의 많은 분야에 대해 필수였다. 단백질 구조 결정하는 방법은 X 선 (21)을 포함한다; 핵 자기 공명 (NMR) 22, 23; 및 투과형 전자 현미경 (TEM) 저온에서 24 cryoEM. cryoEM에서 해상도가 최근 크게 주로 직접적인 전자 드의 사용으로 개선 된26, 25 tectors. 거대 분자는 거의 원시 상태에서 얇은, 유리체 얼음 27 군데 있습니다. 200 kDa의 - 그러나, 생체 분자의 낮은 대비로 인해, 그들 (100)의 크기의 범위가 검출하기 어려운된다. 적절한 크기의 샘플은 데이터를 수집 할 수 있고, 하나의 입자의 재구성 방법은 구조물 (28)을 얻기 위해 적용될 수있다.

그러나, TEM에 의한 단백질 구조의 측정은 다단계 과정이다. 그것은 일반적으로 부정적인 얼룩 TEM (29) phosphotungsten (PT) 30 우라늄 (31)과 같은 중금속을 사용하여 샘플 단 분산의 평가로 시작합니다. 음으로 염색 고분자의 저해상도 모델의 재구성은 일반적으로 이루어지고, 분자 구조 (29)에 대한 중요한 정보를 산출 할 수있다. 병행하여,cryoEM 시작할 수 있습니다 사용하여 데이터 수집. 인위 형성 오해를 방지하기 위해 네거티브 얼룩 TEM 데이터를 평가할 때주의를 기울여야한다. 한 특정의 인공물은 인지질의 PT 얼룩의 효과와 측면 (33)에서 본 동전의 스택을 닮은 긴 막대의 형성의 결과로, 32 리포솜. 이러한 "ROULEAU"또는 "스택"(이하 "스택"으로 표시됨) nanodiscs 35 이상 또한 34 HDL 초기에 관찰 하였다.

막의 적재 및 재 형성은 여러 가지 이유로 발생할 수 있습니다. 예를 들면, 암모늄 몰 리브 데이트 얼룩 36 TEM 영상으로 나타낸 구리 등 공동 요인에 의해 유도 될 수있다. 리포좀의 막 지질의 일부분 따라서 구리 이온의 첨가 후 리포좀 스태킹 EDTA하여 금속 착물을 모방 이미 노디 아세트산 머리기를 포함 (37) (사용 된 스테인 언급되지 않음). PT에 의한 인지질의 스택 형성은 초기에 관찰되었다; 그러나, 나중에 작업을 제거하거나이 이슈 형성 (38) 폐지에 초점을 맞추고있다.

여기서는 TEM에 의해 막 결합 단백질의 연구 적재 NAPT 유도 나노 디스크를 이용할 수있는 방법을 제안한다. 즉, nanodiscs에 결합 단백질은 스택에서 nanodiscs을 방지 할 수 있습니다. 적층에 대한 이유는 명확하지 않지만, 그것은 서로 (도 1A)에 부착하기 위해 디스크를 일으키는 인지질 및 PT의 포스 포릴 그룹 사이의 정전 기적 상호 작용이 있다는 것을 제시 하였다 (39). 우리 프로토콜 뒤에 가설 단백질은 나노 디스크에 결합하면, 인지질 표면의 대부분 availa 없다는 것이다 때문에 단백질에 의한 입체 장애에 대한 PT와 상호 작용 BLE. 이 스택 형성 (그림 1B)를 방지 할 수 있습니다. 두 가지 결론을 그릴 수 있습니다. 우선, 적층 예방 관심있는 단백질은 막에 결합 된 것을 의미한다. 둘째, 단백질 ND 복합체는 복합체의 대략적인 형태를 얻기 위해 표준 단일 입자 처리 방법 (24) (40)로 처리 될 수있다. 또한, 비 - 변성 겔 전기 영동 또는 동적 광 산란과 같은 방법으로 분석을 수행 할 수있다.

이 가설을 입증하기 위해, 우리는 많은 염증성 질환 (41), (42)에 관여하는 막 결합 단백질 5 리폭 시게나 제 (5LO)을 사용했다. 이 78-kDa 단백질은 막 (43)에 결합하는 칼슘 이온을 필요로한다. 이 멤브레인 연관이 조사 된 경우에도 광범위 리포좀을 사용하여S = "외부 참조"> 44, 45, 46, 47의 막 분획, 이러한 TEM 분석과 구조 결정을 위해 사용될 수 없다.

nanodiscs의 제조는 세제 나트륨 콜레이트 재현 탁 MSP 지질과 혼합함으로써 시작한다. 얼음상에서 1 시간 동안 배양 한 후, 세제 서서히 흡착 수지를 이용하여 재구성 된 혼합물로부터 제거된다. 이러한 종류의 재료는 종종 작은 비드로 성형 폴리스티렌 이루어진다. 그들은 상대적으로 소수성 및 지질 (48)에 비해 세제를 바인딩에 대한 강한 선호를 가지고있다. 소수성 비드를 제거하고, 원심 분리를 이용하여 설명을 수행 한 후에는 nanodiscs은 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)에 의해 정제된다. 정제 nanodiscs은 (a 적정 또는 여러 비) 등몰 비율의 monotopic 막 단백질 (및 가능한 보조 인자)와 혼합하고, (R)에 남아어린애들입니다 사람들을 대피 (15 분). TEM 분석으로는 글로우 방전 탄소 코팅 된 그리드 상에 샘플 μL - 양을 적용하여 다음 NAPT 마이너스 염색을 수행함으로써 수행된다. 분취 액은 TEM 그리드에인가 된 경우에서 동일한 샘플은 별다른 변화 비 변성 또는 SDS의 PAGE 겔 전기 영동뿐만 아니라 의한 활성의 측정 각종 분석을 위해 사용될 수있다.

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Protocol

Nanodiscs 1. 준비

  1. 식 및 멤브레인 비계 단백질 (8)의 정화 (35)
    1. 대장균 BL21에서 그의-태그 MSP1E3D1 (DE3) 플라스크에 T1R pRARE2의 피로를 표현한다. 37 ° C에서 50 μg의 / mL의 카나마이신으로 보충 LB 배지 50 mL의 하룻밤 스타터 문화를 준비합니다. 50 μg의 / mL의 카나마이신으로 보충 훌륭한 국물 매체의이 L에서 하룻밤 스타터 문화를 희석.
    2. 약 3 18 ° C에서 3 시간 동안 0.5 mM의 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 단백질 발현을 유도 도달 600nm의 (OD 600)에서의 광학 밀도까지 37 ℃에서 세포를 성장한다.
    3. 용해 완충액 (100 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤 100 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)을 준비한다. 사용 직전에 1 mM의 TCEP를 추가합니다.
    4. 18 ° C에서 유도 3 시간 후, 4500 XG에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포를 수확4 ° C를. , 상층 액을 버린다 수확 된 세포를 무게, 그리고 세포의 g 당 2 mL의 용해의 버퍼의 비율로 용해 버퍼에서 그들을 다시는 일시 중지합니다.
    5. 를 Lyse 펄스 초음파 (반복 속도 : 4의 ON, 4의 OFF)에 의한 세포의 80 % 진폭에서 3 분.
    6. 49,000 XG, 4 ° C에서 20 분 동안 해물을 원심 분리기. 이 원심에서 펠렛을 폐기하십시오.
    7. 바람직하게는 4 ℃에서 보관하는 자동화 액체 크로마토 그래피 시스템에 연결된 5 ㎖의 니켈로 상등액 + 킬레이트 컬럼을 주입.
    8. 그분의-태그 MSP를 제외한 모든 단백질을 제거하기 위해 아래 - 3 용출 단계 (단계 1.1.9)하기 전에 버퍼 1 열을 씻는다. 정제 공정을 수행하기 위해 280 nm에서의 단백질 함량을 모니터; 280 nm에서 UV 기록은 각 세척 후 다시 기본에 가야한다.
      1. 40 mM의 트리스 -HCl, 300mM NaCl, 10 mM의 이미 다졸, 1 % 트리톤, pH가 8.0 : 1 세척 완충액으로 세척 하였다.
      2. 40 mM 트리스 - 염산, 300 MM : 세척 버퍼 (2)로 세척염화나트륨, 20 mM의 이미 다졸, 50 mM의 나트륨 콜레이트, pH가 8.0.
      3. 40 mM 트리스 - 염산, 300 mM의 염화나트륨, 50 mM의 이미 다졸, pH가 8.0 : 세척 버퍼 3 씻으십시오.
    9. 40 mM의 트리스 -HCl, 300mM NaCl, 및 500 mM의 이미 다졸, pH를 8.0으로 MSP를 용출.
    10. 겔 여과 (8), (35)에 의해 표준 버퍼 (0.5 mM의 EDTA, 100 mM의 NaCl을 20 mM 트리스 - 염산, pH를 7.5) MSP하기 위해 버퍼를 변경; 배치 당 수율은 약 7 mg을 L해야한다 -1.
  2. 인지질 원액의 제조
    1. 유리 비이커를 25 ㎎ / ㎖의 농도로 클로로포름에 용해 된 1- 팔미 토일 -2- oleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (POPC) 305 μL를 첨가하고 부드러운 질소 스트림으로 퍼징하여 클로로포름을 증발 . 진공 데시 케이 터에서 지질 밤새 건조. 주 :이 단계는 유리 비이커의 바닥에서 지질의 박막을 남긴다 지질로부터 용매를 제거한다.
    2. 용액이 투명해질 때까지 튜브를 볼 텍싱하여 100 mM의 나트륨 콜레이트를 함유 MSP 표준 완충액 200 μL의 지질 케이크를 재현 탁; 이것은 50 mm의 POPC 농도를 갖는 용액을 제공한다.
      주 : 2 (지질 : 세제) (8) 일반적으로,이 때 세제로 지질의 몰비는 1이어야한다. 이 지질 세제 혼합은 약 2 달 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
  3. 세제 제거를위한 소수성 구슬의 준비
    1. 50 ㎖의 튜브에 비즈 5g (건조 중량)을 놓습니다.
    2. 초순수 물 40 mL로 한 후 100 % 메탄올 30 ㎖로 세척하고 비드.
    3. 10 mL의 MSP의 표준 버퍼로 구슬을 씻으십시오. 마지막으로, 4 ° C에서 MSP 표준 버퍼의 15 mL로 구슬을 저장합니다.
  4. 나노 디스크의 재구성
    1. 의 microfuge 튜브에 MSP1E3D1 (0.124 mM)을 190 μL를 분배 및 인지질 원액 (50 mM의 P의 61.5 μL를 추가같은 튜브에 OPC). 1 시간 동안 젖은 얼음에 재구성 혼합물을 품어. 주 : 130 (MSP1E3D1 : POPC)이 (1)의 몰비가 동일하다.
    2. 자기 조립 공정을 시작하도록 재구성 혼합물을 1 ㎖ 당 비드 0.5 g의 농도로 소수성 비드를 추가한다. 4 ℃에서 16 시간 동안 회전 배양기에서 품어.
    3. 배양 후, 13,000 XG에 10 분, 4 ° C를위한 원심 분리기 침전물 및 집계를 제거합니다. 펠렛을 버리고 상층 액을 저장합니다.
    4. 280 nm에서의 흡광도가 안정 될 때까지 MSP 표준 완충액 (자동화 액체 크로마토 그래피 시스템에 장착) 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼을 평형화. 컬럼에 상층 액을 주입 피크 분수를 수집합니다.
    5. 280 nm에서의 피크 분획 nanodiscs의 농도를 측정한다. 나노 디스크 농도 계산 MSP1E3D1 (ε = 29,910cm -1 M-1)의 몰 흡광 계수를 사용한다. 참고 :나노 디스크 당 지질의 수는 방사성 표지 된 지질 및 인산 분석 (4)의 조합에 의해 또는 인산 형 분석에 의해 측정 할 수있다.

Monotopic 단백질 2. 5- 리폭 시게나 제 (35)

  1. 밤새 스타터 문화를 준비합니다. 100 μg의 / ㎖의 앰피 실린 LB 배지 50 ㎖를 보완. 5- 리폭 시게나 제 유전자 (ALOX5)의 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21 (DE3)를 배지에 접종. 42 mM의 나트륨 2 HPO 4, 24 mM의 KH 2 PO 4, 9 mM의 염화나트륨, 19 mM의 NH 4 CL, 1mM의 황산, 0.1 mM의 CaCl2를, 0.2 % D- 글루코오스, 0.1를 함유하는 발현 배지에서 밤새 스타터 배양 희석 %, 5 μM 다음날에 FeSO4, 100 μg의 / ㎖ 암피실린. 600 인 OD ~ 0.5에서 25 ° C까지 세포를 성장. 20 ° C에서 16 시간 35 0.2 mM의 IPTG로 단백질 발현을 유도한다.
  2. 7000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리하여 수확하고 상층 액을 버린다. 프로테아제 억제제 및 0.5을 포함하는 (1 mM의 TCEP 100 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤 100 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0)에 용해 완충액에서 수확 된 세포 및 재현 탁 수확 된 세포를 포함하는 상기 튜브의 하단에있는 펠릿 무게 ㎎ / ㎖ g 당 세포 용해 완충 용액 2의 비율로 35 리소자임.
  3. 80 % 진폭에서 5 × 15 초 동안 초음파로를 Lyse는 세포. 7000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 용액 (35)에 단백질을 침전 포화도 60 % - 30 황산 암모늄 침전 법을 수행한다. 16,000 XG에 15 분, 4 ° C에 대한 원심 분리기. 주 : 5LO 펠릿 급속 냉동 최대 6 개월 동안 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
  4. 40,000 XG에 15 분, 4 °의 C에 대한 용해 버퍼와 원심 분리기 20 mL를 펠렛을 재현 탁.
  5. 에 뜨는을 품어 30 분 동안 4 ° C에서 ATP 아가로 오스 열입니다. 0.5 M NaCl을 함유하는 용해 버퍼 중 하나 열 볼륨을 한 번 열을 씻으십시오. 10 μM 다음날에 FeSO4 및 20 μg의 / ㎖의 카탈라제를 함유하는 용해 완충액에 20 mM의 ATP로 5LO을 용출. ATP에 (35)을 제거하기 위해 겔 여과 크로마토 그래피를 수행한다.
    주 : 5LO이 불안정 및 정제 후 즉시 사용하여야한다. 그렇지 않으면, 황산 암모늄 침전시키는 단계 (단계 2.1.3 후 메모 참조)에서 중단하는 것이 좋습니다.

나노 디스크 - 단백질 복합체의 3 준비

  1. 복잡한 100 μL의 총 부피를 준비한다. MSP 표준 버퍼의 1 ㎜ 칼슘 2 + 현재와 0.8 μM ND 0.8 μM 5LO 믹스 (20 mM 트리스 - 염산, pH가 7.5, 100 mM의 NaCl을 0.5 mM의 EDTA, 1.5 mM의 염화칼슘 2)과는 10 분 동안 품어 얼음 에다가요. 참고 : 샘플 1 개월까지 C ~ 35 ° 4에 저장할 수 있습니다.
샘플의 ove_title "> 4. 분석

  1. 겔 전기 영동
    1. 비 변성 전기 영동
      1. 5 로딩 버퍼의 μL (50 mM의 BisTris, 6 N 염산, 50 mM의 NaCl을, 10 % (w / v)의 글리세롤, 0.001 % 폰소 s, 산도 7.2) 49 시료의 15 μL를 혼합하고 4로드 - 16 % 비스 - 트리스 젤 전기 영동을 수행 할 수 있습니다.
      2. 광 음극 버퍼 음극 탱크 채우기 (50 mM의 트리 신, 산도 6.8, 50 mM의 비스 트리스 및 0.002 % 쿠마 G-250) 및 버퍼 (50 mM의 비스 트리스 50 mM의 트리 신, 산도 6.8)를 실행하는 양극 탱크. 150 V.에 일정한 전압을 이용하여 분리를 시작
      3. 쿠마 프론트 겔의 끝에 도달 할 때 전기 영동 분리를 중지.
      4. 표준 쿠마 푸른 프로토콜 젤을 얼룩.
    2. 변성 전기 영동
      1. ((SDS를 함유 로딩 완충액 10 μL와 0.05 %의 시료 40 μL를 혼합 / V) 브로 모 페놀 블루 w 0.2 M 트리스 -HCl,pH가 6.8; 20 % (v / v)의 글리세롤; 10 % (W / V) SDS; 전기 영동을 수행하기 위해 20 % 트리스 글리신 젤 - 10 mM의 2- 머 캅토 에탄올)과는 4로드합니다.
      2. 버퍼를 실행하는 캐소드와 애노드 탱크를 채우기 (25 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 200 mM의 글리신 및 0.1 % (W / V) SDS). 150 V.에 일정한 전압을 이용하여 분리를 시작
      3. 로딩 염료 프론트 겔의 끝에 도달 할 때 전기 영동 분리를 중지.
      4. 표준 쿠마 푸른 프로토콜 젤을 얼룩.
  2. NAPT 용액의 제조
    1. (w / v)의 산성 용액을 2 %를주고, 실온에서 교반하여 물 50 mL에 phosphotungstate 나트륨 1 g을 녹인다.
    2. 1 M NaOH로 7.4로 pH를 조정합니다. 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 입자를 제거한다. 실온 또는 4 ℃에서 용액을 저장한다.
  3. TEM 분석을위한 시료의 준비
    1. 글로우 방전 탄소 코팅 된 구리 그리드 (430mA에서 20 초 00 메쉬) 시료의 흡착 전에 친수성 그리드 렌더링합니다. 그리드에서 샘플합니다 (nanodiscs에 대해 0.8 μM)의 3.5 μL를 놓고 30 초 동안 품어. 참고 : 적용된 볼륨이 시료 농도에 따라 2.5 내지 5 μL 다를 수 있습니다. 1 μM - nanodiscs에 적합한 농도 범위는 0.5입니다.
    2. 여과지를 사용하여 잉여의 용액을시킨다.
    3. 즉시 30 초 동안 2 %의 NAPT 방울 그리드 얼룩. 초과 솔루션을 가릴 공기 건조에 그리드를 둡니다.
    4. TEM에 의한 격자를 평가합니다. 120-200 keV의 가속 전압을 갖는 현미경 겹침의 정도를 추정하는 데 충분하다. 참고 : 본 프로토콜은, 교정 된 투과 전자 현미경을 사용 하였다 200 keV의 전계 방출 총 장비.
    5. TEM에 이미지를 기록합니다. 긴 스택을 보여주는 이미지의 경우, 추가로 처리하지 않는다; 이미지는 몇 가지를 포함 할 수 있습니다 외부 단백질 nanodiscs의 복잡한을 보여짧은 스택하지만, 대부분의 입자는 복잡한에 있습니다. 녹음 여러 이미지 공정 급 평균 및 저해상도의 복합체의 3 차원 모델을 획득하기 위해 표준 방법에 의해이.
      주 : 네가티브 염색 데이터의 수집을 위해, 격자는 적어도 세 개의 다른 날에 이루어졌다. 부정적인 얼룩이 적용되기 전에 매일 신선한 샘플 배양 (단계 3.1에서와 같이)가 만들어졌다.

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Representative Results

우리가 제안하는 방법은 결합 monotopic 막 단백질 막 표면을 제공 nanodiscs의 제조 방법에 의존한다. 나노 디스크 지질 이중층에 매립에는 막 관통 단백질이 없을 때, nanodiscs 여기에서 "빈 nanodiscs"(도 2A)로 표시된다. 이 두 MSP1E3D1 비계 단백질과 POPC (8)의 약 260 분자의 조성물 256 kDa의의 계산 된 분자량이있다. 이 단백질 사용 : 재구성을위한 지질 비율, 하나의 주요 피크 (그림 2A하는) 겔 여과 동안 용출 하였다. 9 ㎖ (그림 2A) 주변의 피크 분획을 하나의 밴드 (그림 2B, 레인 1)을 보여주는 파란색 기본 겔 전기 영동 (49)에 의해 조사 하였다. 밴드 256 kDa의 계산보다 다소 큰 크기에 대응되지만, TEM 영상에서 측정 된 나노 디스크 직경은에 대응0.5 nm의 ± 내지 13을 예상했다.

이전 35 (프로토콜 단계 2) 위에서 더 상세히 기술 된 바와 같이 monotopic 세포막 단백질 5- 리폭 시게나 제 (5LO)를 정제 하였다. 78 kDa의 5LO의 동질성은 SDS PAGE에서 전기 영동 (도 2C, 레인 1)로 분석 한 결과 35 (도시 생략) 전체 기능이었다.

이 프로토콜에서, 조건은 의도적으로 nanodiscs의 적층을 촉진이 만들어집니다. 그러나이 적층 특별히 다른 치료 및 부가가 이루어지고 난 후에 마지막 단계 네거티브 얼룩 나트륨 phosphotungstate 첨가함으로써 만 TEM 영상 (소위 검체)를 위해 만들어진 샘플에서 유도되는 것을 주목해야한다. 사실, NAPT 묻은 nanodiscs의 이미지는 HDL (34)에 대한 초기에 예상되는 적층 (그림 3A)를 보여줍니다 5, 50. 도 1a에 개략적으로 설명 된 장 등에 의해 제안 바와 같이 (도 3a)은 "측면에서 볼 동전 긴 스택"는 이중층 사이 인터 phosphotungstate로 집계 nanodiscs이다. 32, 39.

또한, 버퍼의 다양한 추가 영향 여부를 확인하지 않도록, 또는 적층을 유도하는 것이 중요하고, 이하 명백해질 바와 같이, 칼슘 이온의 영향의 조사가 필요했다. 도 3b에서, 적층은 여전히 칼슘 이온 NAPT 염색 전에 나노 디스크 용액에 첨가하고 시료에 존재한다.

프로토콜의 중요한 단계는 그림 4, 막 칸에 표시됩니다딩 단백질은 용액으로 존재한다. 5LO가 nanodiscs (도 4a)의 막 표면에 결합 될 때 적층은 NAPT 얼룩에 의해 유도 할 수 없었다. 개략적으로 (오른쪽, 하단도 1b)를도 1에 도시 된 바와 같이, 1 :이 표본 들어 nanodiscs에 5LO의 몰비는 1이었다. nanodiscs의 지질 이중층 양쪽에서 접근로 TEM 이미지를 더 적은 겹침 (도 4B) 표시하면서 또한 리포좀 대조적으로 제조 된 두 5LO 하나 나노 디스크의 비율 시편.

10, 11, 12 또는 10 포스파티딜 phosphoinositols 구속력 들어, 일부 외부 막 단백질은 세포막의 특정 지질의 존재 등을 의존 할 수있다. 5LO의 경우, 칼슘 이온의 존재이다 neces43 세리. 도 4aB에서 칼슘 이온은 nanodiscs 및 5LO와 솔루션에 참석했다. 즉, 단지 적층의 부족은 monotopic 단백질 결합 된 것을 도시하지만 결합은 칼슘 이온에 달려있다. 이를 표시하기 위해 nanodiscs 및 5LO하지만없이 칼슘을 함유하는 용액으로 염색 NAPT하고 TEM (도 4C)에 의해 촬상. 예상대로, 5LO 솔루션에서 무료로 5LO를 떠나, 칼슘없이 nanodiscs에 바인딩 할 수 없습니다, 그래서 nanodiscs 대신 (그림 4C) 스택.

그림 1
나노 디스크 스태킹 및 방법의 개요 그림 1. 원리. 나노 디스크의 스택의 A. 원리. nanodiscs (왼쪽)의 용액에 부정적인 얼룩 phosphotungstate 나트륨의 첨가는 토륨 리드 전자 인해 인지질 이중층과 PT 분자 (중간, 검은 점) 사이의 정전기력 (중간 화살표)에 nanodiscs (오른쪽)의 적층. 프로토콜의 B. 도식 표현. 네 개의 다른 각도 (아래 가운데)에서 묘사 된 복합체를 형성하기 위해 (회색)는 외부 막 단백질에 빈 nanodiscs (왼쪽) 바인드. monotopic 단백질의 존재 입체적 phosphotungstate 염으로 염색 할 때 스택에서 nanodiscs 방지 (우하) 어떠한 큰 개체 (오른쪽)의 부재에 의한 적층 대조적이다. 녹색과 오렌지색 링은 밝은 갈색에 표시되는 인지질 코어, 주위에 두 개의 MSP 포장을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2. Nanodiscs 및 5LO의 균질성 분석. 재구성 빈 nanodiscs의 A. 크기 배제 크로마토 그래피. (9) 용액의 nanodiscs 피크의 용출. B. (A)에 도시 된 SEC로부터 피크 분획의 겔 전기 영동 분석은 비 변성. 레인 M은 마커가 포함되어 있습니다. 싱글 밴드 (9) 용액의 피크 분획로드 레인 (1)에 존재한다. C. 정제 5LO의 젤 전기 영동 분석 변성. 레인 1에서 강렬한 밴드로 78 kDa의 5LO을 보여줍니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
TEM에 의해 분석되는 단백질의 부재에 Nanodiscs 그림 3. 스택 형성. A. 나노 디스크 스태킹은 승 유도암탉은 NAPT로 염색. 측면에서 볼 때 "동전의 스택은"nanodiscs의 스택입니다. 각각의 나노 디스크는 흰색 밴드로 나타납니다. NAPT 물들 때 B. 스태킹은 나노 디스크 용액 중의 칼슘 이온의 존재에 의해 방해되지 않았다. 스케일 바는 100 나노 미터이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
TEM에 의해 분석 보조 인자의 존재에 단백질의 바인딩에 의해 스택의 형성을 방지 그림 4. 1 (A) 또는 2 : 1 (B) 및 A. B. 칼슘 이온의 몰 비율로 1 5LO의 혼합물 및 nanodiscs에 존재 하였다. (B)에 도시 된 바와 같이 더 5LO는 nanodiscs 결합, 적은 nanodiscs는 스택에 사용할 수 있습니다. 보의 단일 입자 복합체제 (A) 및 (B)는 상기 처리 (35)에 적합하다. 칼슘 이온의 부재에서 C.는 5LO 바인드 없다. 이 샘플의 NAPT 염색 언 바운드 5LO을 떠나, nanodiscs의 전형적인 스택을 보여줍니다. 스케일 바는 100 나노 미터이다. 이미지는 69,500x의 배율에 4K X 4K CCD 카메라에 의해 획득 하였다. CCD 카메라의 픽셀 크기는 이미지의 EM 시험편 수준 2.16 Å의 대응하는 값을 제공 ~ 15㎛이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

빈 nanodiscs의 재구성, 나노 디스크 단백질 복합체의 제조, 및 이들 복합체의 TEM 용 네가티브 염색 :이 방법은 세 부분으로 분리 될 수있다. 각 부분은 기술, 중요한 단계, 유용한 수정의 한계에 대해 개별적으로 해결 될 것입니다.

빈 nanodiscs의 재구성. 생산과 nanodiscs의 사용에서 중요한 단계 및 제한.

nanodiscs 빈의 제조를위한, 상기 MSP 대 지방의 비율을 최적화하는 것이 필수적이다. 가장 일반적인 MSP 및 (세제로 콜레이트를 사용하여) 지질의 경우, 최적의 비율에 대한 제안이 문헌에서 찾을 수있다 (예를 들어, 125 - 본 프로토콜에 사용 MSP1E3D1 8, 51 당 130 POPC). 차이는 단백질 농도 결정, (L)의 효율을위한 방법에 의존 할 수있다 게시 비율 비교 얻어진IPID 세제에 매화, 용액에서 세제를 제거하는 방법.

우리는 가능한 대안 투석 또는 시클로 덱스트린 (52), (53)의 첨가 동안, 소수성 비드 (48) (단계 1.3)를 사용하여 세제 제거를 수행하도록 제안한다. 우선, 투석 HDL 5 (34)의 재구성을 위해 사용하였고, 여전히 54이 바람직하다. 상관없이 세제를 제거하기위한 방법의 속도가 필수적이다. 제거가 (소수성 비드의 양이 너무 많으면)가 너무 빠르다면, 지질과 MSP의 자발적인 재배치가 발생하는 시간이있다. 대신 리포좀과 단백질 응집체의 다량 형성 할 수있다. 크기 배제 크로마토 그래피의 결과, 보이드 부피 재구성 nanodiscs의 최적 피크 미사용의 큰 피크를 리포좀 대량 표시 할MSP 4, 6, 51. 소수성 구슬 너무 작은 볼륨의 경우, 세제 제거가 불완전 할 수 있으며, 형성 nanodiscs은 대부분의 예상보다 작은 크기의 변화를 표시 할 수 있습니다. 하나는 재구성의 속도를 느리게하는 대신 하나의 큰 첨가 소수성 구슬의 작은 볼륨이 추가을 테스트 할 수 있습니다.

지질의 선택은 신중하게 고려되어야한다 8 9 45 46 (55), 나노 디스크의 제조를위한 용도에 따라. 일반적으로, (도 2D 결정화 실험 같이 nanodiscs 또는 리포좀 재구성) 막의 형성을 목적으로하는 모든 방법을위한 지질은 "유체"상태 (56)에 있어야한다. 특정 온도 이하 번째전자 지질은 단단한이다. 소위 전이 온도 (TM)에있어서, 지질은 액체이다. 일부 일반적으로 사용되는 포화 지질가 실내 온도보다 잘 Tm은이 있습니다. 또한, 지질 혼합물, 지질의 뮤즈의 혼 화성은 57로 간주 될 수있다. 나노 디스크 형성의 최적 온도는 지질의 상전이 (TM)를 해결한다.

본 프로토콜의 세제 나트륨 콜레이트 8입니다. 다른 세정제가 사용되어야하는 경우, 콜레이트에 사용 된 것과 동일한 농도를 직접 사용할 수 없다. 특정 중성 세제 덜 효율적 지질을 용해하고, 더 높은 농도를 필요로 할 수있다. 클로로포름 (프로토콜 단계 1.2.2)의 증착 후의 지질 케이크 세제하여 투명한 용액에 용해되어야한다. 볼텍스,주기, 초음파 욕조 동결 융해, 초음파 처리가 용해를 촉진하는데 사용될 수있다.

combinat에 대한지질 이온 (-mixtures), MSP, 여기에 사용되는 큰 응집체 리포좀 또는 과량 MSP 최소화 적정 이외 세제 필요한 4, 6, 51, 58이다. MSP 및 인지질의 일부 조합의 경우, 다른 최적화는 4, 6, 51에 비해 더 어려울 수 있고, 그 피크 분획의 함량을 결정하는 것이 필수적이된다. 나노 디스크 조성물 및 크기 분석에 대한 가장 정확한 방법은 인산 분석 4 MSP 당 인지질의 수를 결정하고, 나노 디스크 분자량을 계산한다. 나노 디스크 크기는 잘 해결 비 변성 겔 전기 영동에 의해 추정 될 수있다; 동적 광산란 (DLS) 59; 또는 음의 얼룩 TEM, 이름 만 몇 가지 방법에 관한 것이다. NEGA에 관해서적인 얼룩 유발 적층 프로토콜은 TEM 이미지에 존재하는 스택의 폭의 측정은 nanodiscs의 직경을 산출 여기에 제시 하였다.

막 비계 단백질의 발현 및 정제에 관해서는, 가용성 단백질에 대한 모든 보통의주의와 관심을 기울여야 할주의해야한다. 다른 태그 및 프로테아제 절단 부위를 포함 할 수있다 사용할 수있는 플라스미드의 경우에서, 태그는 MSP 사용 전에 제거되어야한다.

5LO, 프로토콜에서 사용되는 monotopic 단백질,주의가 다른 곳에서 35 설명과 내부 참조에서 촬영 빠르게하지 않으면 비활성화합니다. 즉, 촉매 철은 쉽게 손실되고, 산화 조건은 5LO의 이량의 원인이 될 수 있습니다. 메모 (프로토콜 단계 2.1.3)에 명시된 바와 같이, 정화는 침전 단계 이상 사용할 때까지 저장 분취 한 후 정지 할 수있다. 분취 정제 한 후, 단백질은 몇 시간 (D) 내에서 사용되어야 급속한 불 활성화 35 UE.

단백질 나노 디스크 복합체의 제조에서 중요한 단계.

나노 디스크 영역 대 monotopic 단백질의 크기가 중요하다. MSP1E3D1 단백질 사슬의 길이는 10.5 nm의 내경 및 8900-Å이 이중층 영역 (8)에 대해 나노 디스크에 대응한다. 이것은 5LO (45)의 막 - 삽입 부분에 대해보고 된 영역에 잘 대응한다. 따라서, 우리의 예상 결합 비는 1 : 1, 또는 최대 2 : 나노 디스크 당 5LO. 적정 실험 (35)에보고 된이 올바른 것으로 판명. 다른 35 설명하지만, 나노 디스크 당이 5LO의 결합을 최대를 얻을 수 없습니다. 다소 큰 나노 디스크 가능성이 전체 허용 할 수 : 1이 바람직하다 실험에 결합하지만,이 경우, 1 : 1 비율이 주요 목표이다.

"ove_content>가 단백질 나노 디스크 복합체 형성을위한 최적의 지질의 선택은 이전의 지식에 의해 도움을받을 수있다. 이는 지질의 선택이 합성 POPC (35)이었다 본 프로토콜의 경우였다. 지질 헤드 그룹 (46)과 유사에서 모두 변화 아실 체인 (45)의 포화 특정 지질 요구를 알 수없는 경우. 5LO 활동 46 SN -2- 아실 쇄의 위치 45, 불포화 콜린 인지질을 함유하는 리포좀에 결합하여 증가 하였다. 리포좀 5LO 결합 연구에서 시험 받았으나 원래 멤브레인의 신원이 알려진 천연 지질 추출물 먼저 55을 테스트 할 수 있습니다.

보조 인자 의존성은 막 (43)을 결합하기위한 칼슘 이온에 따라 5LO, 알려져 있었다. 완전히 솔루션에서 칼슘을 제거하기 위해 도전. 여기서, 착화 제 EDTA 자유 칼슘 이온의 제어 된 양을 떠나야 조정 양 버퍼에 존재한다. 버퍼의 자유 결합 분자들의 계산은 착화 제 (35)의 하나 이상의 유형을 포함하는 버퍼에 대한 60 BAD 소프트웨어에 의해 만들어졌다. 막에 부분적으로 용해 보조 인자의 농도에 미치는 영향이 소프트웨어를 차지하지 않습니다.

nanodiscs의 부정적인 염색에서 중요한 단계는 스택 형성을 촉진합니다.

최대 적재가 요구되는 손의 프로토콜의 경우, 얼룩은 phosphotungsten의 나트륨 염이어야한다. 텅스텐의 다른 염을 사용할 수 있으며, 우리는 인 텅스텐 산 (도시 생략)에 적층 비효율적임을 관찰 하였다. 명확 이유로, PT 염색 중에 나트륨 다량 스태킹 촉진 보인다. 또한, 샘플 버퍼를 들어, 도시 된 나트륨 계속 하부 그천만에, 하부 유도 (32)를 적층의 양. 이것은 또한 적층 감소와 같은 이유로, 샘플 후의 EM 그리드에인가 된 염색 전에 수세가 실행되어서는 안된다. 한편, 일부 적층 항상 유도 된 절대 프로토콜의 최적의 성능을 위해 필요한 범위까지 않는다.

물론, 여기에 칼슘 이온과 같은 보조 인자는 부정적인 얼룩이나 nanodiscs 간섭을 검사해야합니다. 본 프로토콜의 경우, 칼슘 이온은 인산염 완충액을 석출했을하므로 트리스 완충액을 사용 하였다. nanodiscs는 NAPT 유도 스태킹 (그림 3B)을 방지 다른 부정적인 얼룩, 우라 닐 포름산 (35)를 사용하여 검사로, 칼슘 이온 자체에 의해 적층,도 칼슘을하지 않았다되었다.

작은 monotopic 단백질, 여분의 크기는 cryoEM의 검출을 렌더링 할 수있는 나노 디스크에 결합함으로써 추가했다. 에이단백질에 비해 매우 큰 나노 디스크는 스태킹 방지 할 수는 없습니다 큰 나노 디스크에 작은 단백질로, 최적이 아닐 수 있습니다. 그러나, 외부 단백질의 형상이 영향을 미칠 수있다. 더 정확한 비율은 현재로서는 제공되지 수 있지만, 단백질의 추정 결합 표면보다 약간 큰 나노 디스크 이중층 표면을 권장합니다. 이 제한, 바인딩 최대 단백질은 나노 디스크의 각 측면에 하나의 단백질이 될 것이다.

일반 제한 및 방법의 장점.

이 프로토콜은 모든 실험실에서 사용할 수없는 투과 전자 현미경 및 관련 장비의 가용성에 따라 달라집니다. 그러나, 기존의 CCD 카메라를 구비 한 120- 200-kV의 전자 현미경은 겹침의 검출에 매우 충분하다. NAPT 네가티브 염색을 실온에서 수행되고, 그리드는 나중에보기 위해이 온도에서 저장 될 수있다.

TEM의 IMAGING 신속 겹침 방지되었는지의 여부를 표시한다. 구조 정보를 획득하는 단백질 나노 디스크 착물 (예를 들어,도 4AB), 추가 처리를 나타내는 이미지에 대해 수행 될 수있다. 음 묻은 시료의 구조 세부 사항은 1 나노 미터 도달 할 수있는 유용한 구조 정보 (29)를 제공 수 있습니다. cryoEM에 의해 결정 구조 전용 실험실에서 시료의 부정적인 염색 표준 절차입니다. 우리의 프로토콜의 사용은 일정한 절차를 신속하고 간단하게 추가 할 것이다.

일부 monotopic 단백질은 필요한 nanodiscs (13)에 횡단 단백질의 혼입과 같은 절차에 의해 나노 디스크 - 단백질 복합체를 형성하는데있어 미리 스토 일화, 팔미 또는 단백질 표면에 소수성 패치에 의해 막에 고정된다. 여기서, 단백질 복합체의 서브 유닛 중 하나는 오전를 포함막 바인딩을위한 유연한 N 말단 꼬리에 yristoylation. 우라 닐 아세테이트 염색 TEM 이미지의 경우,이 단백질 복합체는 막에 수직하게 결합하고, 나노 디스크가 아닌 측에된다고 기술 하였다. 이것과 다른 결과, 막 부착 13 강성 구조를 확인 하였다. 이 바인딩의 경우, NAPT는 같은 균일하게 확산 단일 입자를 보여줄 것이다 제안 된 프로토콜에 따라 염색. 첨부 파일이 유연한 사슬을 통해 있었다면 그러나 우라 닐 아세테이트 염색 명확한 결과를 제공하지 않을 수 있습니다. 우리는 "동전의 스택"유연한 체인 막 부착 된 단백질 복합체를 들어, NAPT 염색은 전형적인를 보여주는, 스택 할 nanodiscs을 유도 할 수 있음을 추측하지만 지금은 측면에 부착 된 단백질에 의해 장식.

리포좀을 사용할 수있는 경우 왜 nanodiscs을 사용할 수 있습니까? 지질, 보조 인자, 또는 다른 파라미터의 최적화는 잘 당 결합위한 리포좀에서 시험 될 수있다ipheral 단백질 (CF. 5LO). 리포좀의 NAPT 유도 스태킹은 32 입증되었다, 그래서 monotopic 단백질을 리포좀 스태킹을 방지 할 수있다. 그러나, 비교 리포좀의 크기는 단백질을 monotopic하고 nanodiscs로도 활동하기 시작한다. 큰 외부 단백질이 78-kDa의 5LO 같은 작은 단백질 반면, 리포좀의 겹침을 방지 할 수 있습니다, 수도없는 리포좀 당 높은 숫자에 존재하지 않는. 작은 리포좀을 제조, 아직 멤브레인의 강한 소포 작은 곡률 할 수 있습니다. 나노 디스크 이중층은 평평하다. nanodiscs를 사용하여 다양한 매개 변수를 테스트하는 것은 적은 비용 효율적인 MSP로 인해 수 있습니다. 한편, 리포좀 부분적 리포좀의 내부로, 상기 막으로 분할하고 일정한 비싼 보조 인자 또는 기판에 대해 더 큰 양으로 요구 될 수있다. 결론적으로, 상기 나노 디스크 플랫폼은 정확한 N 결합에 대해 정의 된 영역을 선택할 수있는 가능성을 제공한다 단백질의 암갈색. 이중층 영역은 양측에서 액세스 할 수있는 평면이다.

상기 방법의 의미.

단백질이나 복잡한 거대 분자의 3 차원 구조를 결정하는 것은 세포의 내부 동작을 시각화. 이 혼잡 한 환경에서, 특정 단백질은 막 표면, 단독으로 또는 다른 단백질과 복잡하지만, 일반적으로 지질 이중층의 구성 요소와 물리적 상호 작용들이 기계적 기능의 일부가되도록 활성이다. 다른 사람이 막에 형태 나 방향을 변경 그럼에도 불구하고 막에 닿는하지만 반면 일부 단백질 용액의 형태로 인해 트리거의 일종으로, 막 삽입에 따라 변경됩니다. 소수성 기판 입력 경로는 열 수 있습니다, 또는 횡단 단백질에 결합 허용하는 형태가 발생할 수 있습니다. 구조를 얻거나 적어도 구조 정보에서 막에 결합 등 주변 단백질 도전합니다.

jove_content가 "> Nanodiscs가 막 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16에 대한 배향 기능 (17)에 관한 몇몇 연구에 사용 하였다. 해독 중앙 시토크롬 P450을, α 나선에 의해 막에 고정하고 포함한다 선형 색성 측정 (15)을 허용의 구형 부분 헴 그룹. 결과시켜 막 매립 시토크롬 P450의 시뮬레이션에서 도출 다른 결론을 강화했다 시뮬레이션과 근접 계약 막에 대하여 헴의 방향을 나타내었다. 작은 나노 디스크에있는 막에 정박는 GTPase를 들어, NMR 연구는 각 인터페이스 막과 단백질에 두 개의 서로 다른 영역을 식별 할 수 추가, 어떻게 nucleo 조류는 다른 17에 하나의 인터페이스에서 스위치를 유도 바인딩. 돌연변이와 이펙터 바인딩뿐만 아니라, GTP 결합은 라스 - 수퍼 패밀리 (16) 신호 종양 발생에 영향을 줄 멤브레인의 방향에 의존 활동에 대한 효과의 번호를 찾을 수있는 다른는 GTPase에서 공부했다. 5LO는 가용성 형태 (61)을 가지고 있으며, 핵 막 (43)에 결합 칼슘을 필요로한다. 거대한 단일 층 리포좀을 사용하여, 편광, 감쇠 전반사 적외 실험 46를 수행 하였다. 결과는 N 말단 β 배럴 정상 막으로부터 약 45도 기울어 β 배럴의 대칭축으로 막에 결합하는 것을 암시. 5LO C 말단 도메인은 거의 원통형 α 나선 다발이며, 이는 막 (45)에 장축에 평행으로 결합하는 것이 제안되었고,= "외부 참조"> 46. nanodiscs에 포함 된 5LO에 우리의 이전 연구에서, 이중층의 면적은 상기 제안 방향 35 쪽 당 하나의 5LO 수 있도록 선택되었다. TEM 이미지는 낮은 해상도 (35)에 불구하고,이 방향을 확인했다. 예를 들어, 단지 N 말단 β 배럴 바인드되었지만, 아니라면 C 말단 도메인, 나노 디스크 당 5LO 높은 숫자는 수득 한 것이다. 또한, 다른 단백질은 활성화 제, 5- 리폭 시게나 제 활성화 단백질 막 횡단 단백질, FLAP로 5LO의 결합 막과 방향을 변경할 수있다. FLAP은 nanodiscs로 재구성되었으며, 우리는 5LO와 FLAP 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 TEM 등의 방법을 사용합니다. 내인성 아라키돈 산의 상호 작용 결과는 많은 염증성 질환에 관여 41 강력한 화학 유인 물질의 합성 첫 단계 A4, 42 류코트리엔 변환되고 62.

5LO - 나노 디스크 착체 cryoEM 의해 구조적 조사 약 200 kDa의 한계 근처 334 kDa의 분자량을 가지고 산출된다. 5LO의 원자 구조 (61)로서 사용할 그럼에도 불구하고, 중간 해상도로 도킹은 3 차원의 전자 밀도지도는 나노 디스크 막과의 상호 작용에 대한 정보를 얻을 것이다.

cryoEM 기술의 혁신은 원자 수준 (63)에 해상도를 밀어뿐만 아니라 작은 단백질 크기 제한을 추진하지 않습니다. 목적은 지금 200 kDa의 접근하고 크기 범위를 증가시키는 것처럼 NMR (22)의 구조 결정을위한 상황은 반대이다. 최근, 소형는 GTPase 단백질 결합 멤브레인 NMR (16), (17)에 의해 조사 하였다. 만 약 20 kDa의 이러한 단백질, 우리약 130 kDa의 복합체를 형성, 7.6 nm의 내부 직경의 작은 nanodiscs에 닿는 재. 미래에, 비슷한 크기의 복합체가 결합 단백질의 막 다른 측면을 규명하기 위해 NMR 및 cryoEM 모두 조사 할 수있다.

프로토콜의 확장은 나노 디스크 이중층의 막 횡단 단백질 (TMP)를 포함 nanodiscs를 조사 할 수 있습니다. TMP-nanodiscs의 NAPT 유발 적층 동일한 지질 조성물을 함유 빈 nanodiscs 비교 될 수있다. 짧은 루프 (64)를 적층 방지 할 수는 없습니다 동안 큰 extramembranous 루프, 스택을 방지 할 수 있습니다. 프로토콜은 특히 막 관통 단백질에 결합하는 단백질을 연구하는데 사용될 수 있기 때문에 이것은, 이점으로 전환 될 수있다.

이 방법의 이점은 멤브레인 상호 즉시 보여 질 수 있다는 것이다. 빈 nanodiscs 대량 제조의 상대적 단순성 하나가 연장 될 수 있음을 의미이 방법은 산도, 온도, 버퍼 및 바인딩 monotopic 단백질의 보조 인자 의존성과 같은 다른 조건을 선별합니다. 나노 디스크 플랫폼 9 막 관통 단백질의 안정화를 위해 개발되었고, 점점 이러한 목적을 위해 사용되는 반면, 사실, 다소간 외인성 단백질을 일시적으로 결합의 다수의 연구를위한 잠재력은 본 내부 세포 명확히 유지되어야 마음입니다.

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Acknowledgments

저자는 그들의 지원을 위해 스웨덴 연구위원회, 스톡홀름 카운티위원회, 및 KI 기금 감사합니다. MSP의 발현 및 정제는 카롤린스카 연구소 / SciLifeLab 단백질 과학 핵심 시설에 (http://PSF.ki.se)을 수행 하였다. 저자는 또한 기술 전문 지식을 공유하고 자신의 적시 지원을 위해 박사 파시 Purhonen 박사 마틸다 베르그에게 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

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B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

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