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Biochemistry

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

doi: 10.3791/55148 Published: March 5, 2017

Introduction

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En la investigación médica, mucha atención se centra en proteínas de membrana, ya sea intrínsecos o extrínsecos, que participan en una variedad de interacciones de lípidos. Trabajando con proteínas lípidos interactuar incluye o bien la selección de un sustituto a los lípidos, tales como detergentes, amphipols 1, o proteínas pequeñas 2, o la búsqueda de un sustituto de la membrana que mantiene la proteína soluble y activa. Sustitutos de membrana lipoico incluyen liposomas y nanodiscos (ND) 3, 4.

Nanodiscos son plataformas de membrana cerca de nativos desarrollados por la ingeniería de la parte proteica, ApoA-1, de la lipoproteína de alta densidad (HDL) de origen natural en la sangre. ApoA-1 es una cadena de 243 residuos de longitud de cortos alfa-hélices anfipáticas y tiene una conformación soluble en lípidos libres. In vitro cuando en la presencia de lípidos, dos copias de la proteína ApoA-1 reordenan espontáneamente para rodear la hidrporción de la cadena de acilo ophobic de un parche bicapa lipídica 5. versiones de ingeniería de ApoA-1 generalmente se llaman proteínas de andamiaje de membrana (MSP), y un número creciente están disponibles comercialmente como plásmidos o como proteínas purificadas. Repeticiones o deleciones de los alfa-hélices de la ApoA-1 resultado en andamios proteínas de membrana 7 6 más largos o más cortos. Esto a su vez hace que sea posible formar discos de alrededor de 6 nm 7-17 nm 8 de diámetro. Hay diferentes tipos de aplicaciones para el nanodiscos 3, 9. La aplicación más utilizada es el de proporcionar un entorno de membrana casi nativo para la estabilización de una proteína de membrana 8, previamente revisados 3, 9. Un uso menos explorada-es proporcionar una superficie de membrana nanoescala para el estudio demembrana periférica proteínas 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Sección 1 del protocolo a continuación visualiza el procedimiento para hacer nanodiscos compuestas de fosfolípidos y proteínas de andamiaje membrana.

Preparación de la muestra es un cuello de botella en la mayoría de los métodos. muestras específicas del método pueden añadir información en particular, pero también hacer comparaciones de los resultados difícil. Por lo tanto, es más simple cuando las muestras son multimodal y se pueden utilizar directamente en varios métodos diferentes. Una de las ventajas con el uso de nanodiscos es el pequeño tamaño de la nanodisc en comparación con liposomas (por ejemplo, las muestras se pueden utilizar directamente para ambos TEM y electroforesis en gel no desnaturalizante, como en el presente Protocolo).

18. Sin embargo, ninguna estructura 3D de alta resolución de una proteína de membrana monotópico incrustado en una membrana del liposoma se ha publicado todavía, en lo que sabemos. Nanopartículas o anticuerpos oro puede ser utilizado para visualizar las proteínas de unión a liposomas o vesículas utilizando TEM 19. A pesar de que estas sondas son muy específicos, que podrían interferir con las proteínas de unión a la membrana por el velo del sitio de unión de membrana o por áreas de interés con las partes flexibles de enmascaramiento. Marcado con oro o proteínas de anticuerpo complejado probablemente podría ser analizado en un gel, pero esto aumentaría el costo del experimento.

Aunque los liposomas son una excelente plataforma, no se puede estar seguro de que el populación tiene una relación particular de proteína por liposoma, una característica que puede ser explorado por el uso de nanodiscos 20. En un liposoma, cofactores y sustratos pueden ser atrapados en el interior soluble. Las sustancias que son solubles en la membrana compartirán el mismo destino para ambos tipos de miméticos de membrana. Sin embargo, como la zona de dos capas es más pequeño en nanodiscos, se requiere una menor cantidad de sustancia para saturar las membranas nanodisc.

función de las proteínas comprensión a través de la determinación de la estructura atómica ha sido esencial para muchos campos de investigación. Los métodos para la determinación de la estructura de proteínas incluyen rayos-X 21; resonancia magnética nuclear (NMR) 22, 23; y microscopía electrónica de transmisión (TEM) 24 a temperaturas criogénicas, cryoEM. La resolución por cryoEM últimamente se ha mejorado en gran medida, debido principalmente a la utilización de electrones de directadetectores 25, 26. Las macromoléculas son imágenes en, hielo vítreo delgada 27 en un estado casi nativo. Sin embargo, debido al bajo contraste de las moléculas biológicas, se convierten en difíciles de detectar en el rango de tamaño de 100 a 200 kDa. Para muestras de tamaño adecuado, la recogida de datos se puede realizar y el método de reconstrucción de partícula única se puede aplicar para obtener una estructura 28.

Sin embargo, la determinación de la estructura de la proteína por TEM es un proceso de múltiples pasos. Por lo general comienza con la evaluación de monodispersividad muestra mediante tinción negativa TEM 29 utilizando sales de metales pesados como el phosphotungsten (PT) 30 31 o uranio. La reconstrucción de un modelo de baja resolución de la macromolécula con tinción negativa se hace generalmente y puede proporcionar información importante sobre la estructura molecular 29. En paralelo,Recopilación de datos mediante cryoEM puede comenzar. Se debe tener cuidado al evaluar los datos de TEM de tinción negativa para evitar la mala interpretación de formación de artefactos. Un artefacto en particular es el efecto de la mancha PT en fosfolípidos y liposomas 32, lo que resulta en la formación de varillas largas se asemejan a las pilas de monedas, vista desde el lado 33. Tal "cartucho de dinero" o "pilas" (de aquí en adelante designado como "pilas") se observaron desde el principio para el HDL de 34 años, y más tarde también para nanodiscos 35.

El apilamiento y la reorganización de las membranas pueden ocurrir por muchas razones. Por ejemplo, puede ser inducida por co-factores como el cobre, que se muestran por imágenes TEM en una mancha de molibdato de amonio 36. Una fracción de los lípidos de membrana en liposomas contenía un grupo de cabeza de ácido iminodiacético imitando la formación de complejos de metal por EDTA, apilando de este modo los liposomas después de la adición de iones de cobre 37. Se observó temprano en la formación de pila de fosfolípidos por PT; Sin embargo, el trabajo posterior se ha centrado en la eliminación o supresión de esta formación artefacto 38.

En este caso, se propone un método para tomar ventaja de la nanodisc inducida por NAPT apilamiento para el estudio de las proteínas de unión a la membrana por TEM. En resumen, la unión de las proteínas nanodiscos impediría que los nanodiscos de apilamiento. Aunque las razones para el apilamiento no son claros, se propuso 39 que hay una interacción electrostática entre los fosfolípidos y el grupo fosforilo de PT, haciendo que los discos a pegarse entre sí (Figura 1A). La hipótesis detrás de nuestro protocolo es que cuando una proteína se une a una nanodisc, la mayor parte de la superficie de fosfolípido no es availa ble para la interacción con el PT debido a impedimento estérico por la proteína. Esto evitaría la formación de la pila (Figura 1B). Dos conclusiones pueden extraerse. En primer lugar, la prevención de apilamiento significa que la proteína de interés se ha unido a la membrana. En segundo lugar, el complejo proteína-ND se puede tratar con los métodos de procesamiento de una sola partícula estándar 24, 40 para obtener una morfología rugosa del complejo. Por otra parte, los análisis mediante métodos como la electroforesis en gel no desnaturalizante o dispersión de luz dinámica se puede realizar.

Para demostrar esta hipótesis, se utilizó la proteína de unión a membrana de 5-lipoxigenasa (5LO), que está implicado en muchas enfermedades inflamatorias 41, 42. Esta proteína de 78 kDa requiere iones de calcio para unirse a su membrana 43. Aunque esta asociación a la membrana se ha estudiado ampliamente el uso de liposomass = "xref"> 44, 45, 46 y las fracciones de membrana 47, éstas no se pueden utilizar para el análisis de TEM y determinación de la estructura.

La preparación de nanodiscos comienza mezclando MSP con lípidos se resuspendieron en el colato de sodio detergente. Después de la incubación en hielo durante 1 h, el detergente se retira lentamente de la mezcla de la reconstitución utilizando una resina adsorbente. Este tipo de material se hizo con frecuencia de forma en pequeñas perlas de poliestireno. Son relativamente hidrófobo y tienen una fuerte preferencia por la unión de detergente en comparación con los lípidos 48. Después de retirar las perlas hidrófobas y la realización de la clarificación mediante centrifugación, las nanodiscos se purifican por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Los nanodiscos purificados se mezclaron con una proteína de membrana monotópico (y posibles cofactores) en una relación equimolar (o varias relaciones de valoración) y se dejan a react (15 min). El análisis por TEM se lleva a cabo mediante la aplicación de mu L-cantidades de muestra sobre, rejillas revestidas de carbono resplandor descargada y luego mediante la realización de tinción negativa con NAPT. La misma muestra de cuando las alícuotas se aplicaron a las rejillas TEM se puede utilizar para el análisis por no desnaturalizante o PAGE SDS-electroforesis en gel, así como por varios tipos de mediciones de la actividad, sin cambios importantes.

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Protocol

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1. Preparación de nanodiscos

  1. Expresión y purificación de la proteína de andamiaje de la membrana 8, 35
    1. Expresar el MSP1E3D1 marcada con His en el E. coli BL21 (DE3) cepa T1R pRARE2 en frascos. Preparar un cultivo iniciador durante la noche de 50 ml con medio LB suplementado con 50 g / ml de kanamicina a 37 ° C. Diluir el cultivo iniciador durante la noche en 2 L de medio de caldo excelente suplementado con 50 g / ml de kanamicina.
    2. Cultivar las células a 37 ° C hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD 600) alcanza aproximadamente 3. inducen la expresión de la proteína con 0,5 mM isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 3 horas a 18 ° C.
    3. Preparar el tampón de lisis (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 100 mM; y 10% de glicerol). Añadir TCEP 1 mM inmediatamente antes del uso.
    4. Después de 3 h de inducción a 18 ° C, recoger las células por centrifugación durante 10 min a 4.500 xgy 4 ° C. Descartar el sobrenadante, pesar las células recogidas, y les re-suspender en tampón de lisis a una razón de 2 ml de tampón de lisis por gramo de células.
    5. Lisar las células por sonicación de impulsos (frecuencia de repetición: 4 s ON, 4 s OFF) durante 3 min a 80% de la amplitud.
    6. Centrifugar los lisados ​​durante 20 minutos a 49.000 x g y 4 ° C. Se desecha el precipitado de esta centrifugación.
    7. Inyectar el sobrenadante en un 5 ml Ni + columna quelante conectado a un sistema de cromatografía de líquidos automatizado preferentemente se mantiene a 4 ° C.
    8. Antes de la etapa de elución (etapa 1.1.9), se lava la columna con tampones de 1 - 3 a continuación para eliminar todas las proteínas excepto la His-MSP. Monitorear el contenido de proteína a 280 nm para seguir el proceso de purificación; la grabación UV a 280 nm debería volver a la línea de base después de cada lavado.
      1. Lavar con tampón de lavado 1: 40 mM Tris-HCl, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, y 1% de Triton, pH 8,0.
      2. Se lava con tampón de lavado 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, imidazol 20 mM, y colato de sodio 50 mM, pH 8,0.
      3. Lavar con tampón de lavado 3: 40 mM Tris-HCl, NaCl 300 mM, e imidazol 50 mM, pH 8,0.
    9. Eluir la MSP con Tris-HCl 40 mM, NaCl 300 mM, e imidazol 500 mM, pH 8,0.
    10. Cambiar el tampón a MSP tampón estándar (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; y EDTA 0,5 mM) por filtración en gel 8, 35; el rendimiento por lotes debe estar alrededor de 7 mg L-1.
  2. Preparación de la solución madre de fosfolípidos
    1. Añadir 305 l de 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfocolina (POPC) disuelto en cloroformo a una concentración de 25 mg / ml a un vaso de precipitados de vidrio y se evapora el cloroformo mediante purga con una corriente suave de nitrógeno . Se seca la noche a la mañana de lípidos en un desecador de vacío. NOTA: Este paso se realiza para eliminar el disolvente de la lípidos, lo que deja una película delgada de lípido en la parte inferior del vaso de precipitados de vidrio.
    2. Resuspender el pastel de lípidos en 200 l de tampón estándar de MSP que contiene colato de sodio 100 mM por agitación del tubo hasta que la solución se vuelve transparente; esto proporcionará una solución con una concentración de 50 mM POPC.
      NOTA: En general, la relación molar de lípido a detergente en este punto debe ser de 1: 2 (lípido: detergente) 8. Esta mezcla de lípido-detergente puede ser almacenado a -80 ° C durante casi 2 meses.
  3. Preparación de perlas hidrófobas para la eliminación del detergente
    1. Colocar 5 g de perlas (peso seco) en un tubo de 50 ml.
    2. Lavar las perlas con 30 ml de metanol al 100% y después con 40 ml de agua ultrapura.
    3. Lavar las perlas con 10 ml de tampón estándar MSP. Por último, almacenar los granos con 15 ml de tampón estándar MSP a 4 ° C.
  4. reconstitución Nanodisc
    1. Prescindir de 190 l de MSP1E3D1 (0,124 mM) en un tubo de microcentrífuga y añadir 61,5 l de solución madre de fosfolípidos (50 mM POPC) al mismo tubo. Incubar la mezcla de la reconstitución en hielo durante 1 h. NOTA: Este es igual a una relación molar de 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. Añadir perlas hidrofóbicas a una concentración de 0,5 g de perlas por ml de mezcla de la reconstitución para iniciar el proceso de autoensamblaje. Incubar en una incubadora rotativa durante 16 horas a 4 ° C.
    3. Después de la incubación, se centrifuga durante 10 min a 13.000 xg y 4 ° C para eliminar los precipitados y agregados. Se desecha el precipitado y guardar el sobrenadante.
    4. Equilibrar la columna de cromatografía de exclusión por tamaño (montado en un sistema de cromatografía de líquidos automatizado) con tampón estándar MSP hasta que la absorbancia a 280 nm es estable. Inyectar el sobrenadante en la columna y recoger las fracciones pico.
    5. Medir las concentraciones de nanodiscos en las fracciones de los picos a 280 nm. Utilice el coeficiente de extinción molar de MSP1E3D1 (varepsilon = 29,910 cm -1 M -1) para el cálculo de la concentración nanodisc. Nota lanúmero de lípidos por nanodisc se puede medir mediante una combinación de lípidos radiomarcados y análisis de fosfato de 4 o por análisis de fosfato solo.

2. Preparación de la proteína monotópico 5-lipoxigenasa 35

  1. Preparar un cultivo iniciador durante la noche. Suplemento 50 ml de medio LB con 100 mg / ml de ampicilina. Inocular el medio con E. coli BL21 (DE3) que contiene el plásmido del gen de la 5-lipoxigenasa (ALOX5). Diluir el cultivo iniciador durante la noche en medio de expresión que contiene 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, NaCl 9 mM, 19 mM NH 4 Cl, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, 0,2% de D-glucosa, 0,1 %, 5 M FeSO 4, y 100 g / ml ampicilina. Cultivar las células hasta que la DO 600 es ~ 0,5 a 25 ° C. Inducir la expresión de proteína con IPTG 0,2 mM durante 16 h a 20 ° C 35.
  2. Cosecha por centrifugación durante 10 min a 7.000 xg y 4 ° C y descartar el sobrenadante. Pesar la pastilla que se encuentra en la parte inferior del tubo que contiene las células recogidas y resuspender las células recogidas en tampón de lisis (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 100 mM; 10% de glicerol, y TCEP 1 mM) que contenía inhibidor de proteasa y 0,5 mg / ml de lisozima 35 en una proporción de 2 ml de tampón de lisis por gramo de células.
  3. Lisar las células por tratamiento con ultrasonidos durante 5 x 15 s en 80% de la amplitud. Eliminar los restos celulares por centrifugación durante 10 min a 7.000 xg y 4 ° C. Realizar la precipitación con sulfato de amonio al 30 - 60% de saturación para precipitar las proteínas en la solución 35. Centrifugar durante 15 minutos a 16.000 x g y 4 ° C. NOTA: El sedimento 5LO puede ser congelado y almacenado a -80 ° C durante un máximo de 6 meses con rapidez.
  4. Resuspender el precipitado con 20 ml de tampón de lisis y se centrifuga durante 15 min a 40.000 xg y 4 ° C.
  5. Incubar el sobrenadante en una columna de agarosa ATP a 4 ° C durante 30 min. Lavar la columna una vez con una columna-volumen de tampón de lisis que contiene 0,5 M NaCl. Eluir la 5LO con ATP 20 mM en tampón de lisis que contiene 10 mM FeSO 4 y 20 mg / ml de catalasa. Se realiza una cromatografía de filtración en gel para eliminar el ATP 35.
    NOTA: El 5LO es inestable y debe usarse inmediatamente después de la purificación. De lo contrario, se recomienda para detener en la etapa de precipitación con sulfato de amonio (véase la nota después de la etapa 2.1.3).

3. Preparación del complejo Nanodisc-proteína

  1. Preparar un volumen total de 100 l de complejo. Mezclar 0,8 M ND y 0,8 M 5LO con el mM Ca 2 + 1 presente en el tampón estándar MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; EDTA 0,5 mM; y 1,5 mM CaCl 2) y se incuba durante 10 min sobre hielo. NOTA: La muestra se puede almacenar durante un máximo de un mes a 4 ° C 35.
ove_title "> 4. El análisis de las muestras

  1. Electroforesis en gel
    1. Electroforesis no desnaturalizante
      1. Mezclar 15 l de la muestra con 5 l de tampón de carga (mM BisTris 50, HCl 6 N, NaCl 50 mM, 10% (w v) de glicerol /, y 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 y cargarlo en un 4 - 16% Bis-Tris gel para llevar a cabo la electroforesis.
      2. Llenar el depósito de cátodo con tampón de luz cátodo (Bis 50 mM Tris; mM tricina 50, pH 6,8, y 0,002% de Coomassie G-250) y el depósito de ánodo con tampón (50 mM Bis Tris y Tricina 50 mM, pH 6,8) que se ejecuta. Iniciar la separación mediante el uso de un voltaje constante a 150 V.
      3. Detener la separación electroforética cuando el frente de Coomassie alcanza el final del gel.
      4. Tinción del gel con un protocolo estándar de azul de Coomassie.
    2. electroforesis desnaturalizante
      1. Mezclar 40 l de la muestra con 10 l de tampón de carga que contiene SDS (0,05% (w / v) azul de bromofenol; M Tris-HCl 0,2,pH 6,8; 20% (v / v) de glicerol; 10% (w / v) SDS; y 10 mM 2-mercaptoetanol) y se carga en un 4 - gel glicina Tris 20% para llevar a cabo la electroforesis.
      2. Llenar los depósitos de cátodo y ánodo con tampón de desarrollo (mM Tris-HCl, pH 6,8 25; glicina 200 mM; y 0,1% (w / v) SDS). Iniciar la separación mediante el uso de un voltaje constante a 150 V.
      3. Detener la separación electroforética cuando el frente de la carga de colorante alcanza el final del gel.
      4. Tinción del gel con un protocolo estándar de azul de Coomassie.
  2. Preparación de la solución de NAPT
    1. Disolver 1 g de sal de fosfotungstato de sodio en 50 ml de agua por agitación a temperatura ambiente para dar un 2% (w / v) de solución ácida.
    2. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 1 M. Eliminar las partículas utilizando un filtro de jeringa de 0,22 micras. Almacenar la solución a temperatura ambiente oa 4 ° C.
  3. Preparación de la muestra para el análisis TEM
    1. De descarga luminosa rejillas de cobre recubiertas de carbono (400 de malla) durante 20 s a 30 mA para rendir las rejillas hidrófilos antes de la adsorción de la muestra. Colocar 3,5 l de la muestra (0,8 M con respecto a los nanodiscos) en la parrilla y se incuba durante 30 s. NOTA: El volumen aplicado puede variar entre 2,5 y 5 l, dependiendo de la concentración de la muestra. Un intervalo de concentración adecuada para nanodiscos es de 0,5 - 1 mM.
    2. Seque solución sobrante con papel de filtro.
    3. Inmediatamente manchar la red con una gota de 2% NAPT durante 30 s. Seque el exceso de solución y dejar la red secar al aire.
    4. Evaluar las rejillas de TEM. Un microscopio con 120-200 keV voltaje de aceleración es suficiente para estimar el grado de apilamiento. NOTA: Para el presente protocolo, se utilizó un microscopio electrónico de transmisión calibrada, equipado con un cañón de emisión de campo de 200 keV.
    5. Grabar las imágenes de TEM. Para las imágenes que muestran pilas largas, no procesan aún más; imágenes muestran el complejo de nanodiscos, con la proteína extrínseca, que puede contener unos pocosshort stacks, pero la mayoría de las partículas están en el complejo. Memorizar varias imágenes y estos procesos de acuerdo con los métodos estándar para la obtención de clase medias y de baja resolución, 3 modelo dimensional del complejo.
      NOTA: Para la recogida de datos de tinción negativa, rejillas se hicieron por lo menos en tres días diferentes. Para cada día, se realizaron incubaciones de muestras frescas (como en el paso 3.1) antes de que se aplicó la tinción negativa.

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Representative Results

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El método que proponemos depende de la preparación de nanodiscos para proporcionar la superficie de la membrana para la unión monotópico membrana-proteína. Como no existe una proteína transmembrana incrustado en la bicapa lipídica nanodisc, los nanodiscos están aquí denotan como "nanodiscos vacías" (Figura 2A). Estos tienen un peso molecular calculado de 256 kDa para una composición de dos proteínas MSP1E3D1 andamios y alrededor de 260 moléculas de POPC 8. El uso de esta proteína: lípido para la reconstitución, un pico principal (Figura 2A) se eluyó durante la filtración en gel. Las fracciones del pico alrededor de 9 ml (Figura 2A) se examinaron por electroforesis en gel nativo azul 49, que muestra una banda (Figura 2B, carril 1). Aunque la banda corresponde a un tamaño algo mayor que el calculado 256 kDa, el diámetro nanodisc medido en las imágenes de TEM se corresponde con elesperado 13 nm ± 0,5 nm.

La proteína de membrana monotópico 5-lipoxigenasa (5LO) se purificó como se describe anteriormente (paso Protocolo 2) y en más detalle anteriormente 35. La homogeneidad de la 78-kDa 5LO se analizó por electroforesis SDS PAGE (Figura 2C, carril 1) y era completamente funcional 35 (no se muestra).

En este protocolo, se crean las condiciones que promueven intencionalmente el apilamiento de los nanodiscos. Sin embargo, hay que señalar que este apilamiento se induce sólo en las muestras hechas para obtener imágenes de TEM (denominados especímenes), específicamente por la adición de la fosfotungstato mancha de sodio negativo como el último paso después de que se han hecho todos los otros tratamientos y adiciones. De hecho, las imágenes de nanodiscos teñidos con NAPT muestran el apilamiento esperado (Figura 3A) muy temprano para HDL 34 5, 50. Las "largas pilas de monedas, vista desde el lado" (Figura 3A) son los nanodiscos agregados con fosfotungstato intercaladas entre las bicapas, tal como se describe esquemáticamente en la Figura 1A y propuesto por Zhang et al. 32, 39.

Es importante comprobar si varias adiciones en las memorias intermedias afectan, prevenir, o incluso inducir apilamiento, y como se hará evidente a continuación, los efectos de los iones de calcio requiere investigación. En la figura 3B, el apilamiento está todavía presente en una muestra que se añadieron iones de calcio a la solución nanodisc antes de la tinción con NAPT.

El paso esencial en el protocolo se muestra en la Figura 4, donde la membrana-binproteína ding está presente en las soluciones. El apilamiento no podía ser inducida por la mancha NAPT cuando 5LO se une a la superficie de la membrana de los nanodiscos (Figura 4A). Para esta muestra, la relación molar de 5LO a nanodiscos era 1: 1, como se muestra esquemáticamente en la Figura 1 (Figura 1B, parte inferior derecha). Además, como la bicapa lipídica de las nanodiscos es accesible desde ambos lados, en contraste con los liposomas, las muestras con la proporción de dos a uno 5LO nanodisc se prepararon, mientras que las imágenes de TEM muestran incluso menos de apilamiento (Figura 4B).

Para la unión, algunas proteínas de la membrana extrínsecos podrían depender de la presencia de un lípido específico en la membrana, tales como phosphoinositols 10, 11, 12 o 10 fosfatidilserina. En el caso de 5LO, la presencia de Ca2 + es neceSary 43. En la Figura 4A y B, los iones de calcio están presentes en las soluciones con nanodiscos y 5LO. En otras palabras, la falta de apilamiento no sólo muestra que la proteína se ha unido monotópico sino también que la unión depende de iones Ca2 +. Con el fin de mostrar esto, una solución que contiene nanodiscos y 5LO pero sin calcio se tiñó con NAPT y fotografiada por TEM (Figura 4C). Como era de esperar, 5LO no se puede unir a los nanodiscos sin Ca2 +, dejando el 5LO libre en la solución, por lo que los nanodiscos apilar lugar (Figura 4C).

Figura 1
Figura 1. Principio de Nanodisc apilamiento y visión general del método. A. Principio de apilamiento nanodisc. La adición de la mancha fosfotungstato de sodio negativo a una solución de nanodiscos (izquierda) conduce a th e apilamiento de los nanodiscos (derecha) debido a las fuerzas electrostáticas (por medio, flechas) entre la bicapa de fosfolípidos y las moléculas del TT (medias, puntos negros). B. Representación esquemática del protocolo. nanodiscos vacías (izquierda) se unen a una proteína de membrana extrínseca (gris) para formar un complejo, representado desde cuatro ángulos diferentes (media baja). La presencia de la proteína monotópico impide estéricamente los nanodiscos de apilamiento cuando se tiñen con la sal fosfotungstato (inferior derecha), en contraste con el apilamiento inducida en ausencia de cualquier objeto grande (superior derecha). Los anillos de efecto invernadero y de color naranja representan los dos envoltura MSP alrededor del núcleo de fosfolípidos, que está representado en marrón claro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. Análisis de Homogeneidad de nanodiscos y 5LO. Cromatografía de exclusión de tamaño A. nanodiscos vacíos reconstituidos. La elución de los picos nanodiscos a los 9 mL. B. no desnaturalizante en gel de análisis electroforético de la fracción del pico de la SEC se muestra en (A). Carril M contiene el marcador. Una sola banda está presente en el carril 1, donde se cargó la fracción pico a 9 mL. C. La desnaturalización gel de análisis electroforético de 5LO purificada. El 78 kDa 5LO muestra como una banda intensa en el carril 1. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Formación Pila de nanodiscos en ausencia de proteína analizados por TEM. A. Nanodisc apilamiento se indujo wgallina manchada con NAPT. Las "pilas de monedas" son las pilas de nanodiscos cuando se ve desde el lado. Cada nanodisc aparece como una banda blanca. B. Apilado no fue perturbada por la presencia de iones de calcio en la solución nanodisc cuando se tiñen con NAPT. Las barras de escala son 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. La prevención de Formación de pila por la unión de la proteína en la presencia de un cofactor Analizado por TEM. A. y B. Los iones de calcio están presentes en las mezclas de 5LO y nanodiscos en relaciones molares de 1: 1 (A) o 2: 1 (B). El más 5LO unión a los nanodiscos, menos nanodiscos están disponibles para el apilamiento, como se muestra en (B). Los complejos de una sola partícula en boTH (A) y (B) son adecuados para su procesamiento posterior 35. C. En ausencia de iones de calcio, 5LO no se puede enlazar. NAPT marcaje con este ejemplo muestra típica de apilamiento nanodiscos, dejando el 5LO no unido. Las barras de escala son 100 nm. Las imágenes fueron adquiridas con una cámara 4K x 4K CCD con una ampliación de 69,500x. El tamaño de píxel de la cámara CCD es 15 m, lo que da un valor correspondiente de 2,16 Å en el nivel de la muestra de las imágenes de EM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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El método se puede separar en tres partes: la reconstitución de nanodiscos vacíos, la preparación de complejos de proteína-nanodisc, y de la tinción negativa para el TEM de estos complejos. Cada parte se trata de forma independiente con respecto a las limitaciones de la técnica, los pasos críticos, y las modificaciones útiles.

La reconstitución de nanodiscos vacías. Los pasos críticos y limitaciones en la producción y uso de nanodiscos.

Para la preparación de los nanodiscos vacías, es esencial para optimizar la relación de MSP a lípido. Para el MSP más común y lípidos (utilizando colato como un detergente), sugerencias de las proporciones óptimas se pueden encontrar en la literatura (por ejemplo, 125 a 130 POPC por MSP1E3D1 8, 51 utilizada en la presente protocolo). Diferencias obtenidas en comparación con las relaciones publicadas puede depender del método para la determinación de la concentración de proteína, la eficacia de lsolvatación IPID en el detergente, y el método de eliminación del detergente de la solución.

Proponemos para llevar a cabo la eliminación del detergente usando perlas hidrófobas 48 (etapa 1.3), mientras que las posibles alternativas son la diálisis o la adición de ciclodextrina 52, 53. Inicialmente, se utilizó la diálisis para la reconstitución de HDL 5, 34 y aún se prefiere 54. Independientemente del método para la eliminación del detergente, la velocidad es esencial. Si la suspensión es demasiado rápido (el volumen de perlas hidrofóbicas es demasiado grande), la reordenación espontánea de MSP con los lípidos puede no tener tiempo para producirse. En lugar de ello, grandes cantidades de liposomas y agregados de proteínas pueden formar. Los resultados de cromatografía de exclusión por tamaño mostrarían grandes cantidades de liposomas en el volumen vacío, un pico subóptima de nanodiscos reconstituidas, y un pico más grande de no utilizadoMSP 4, 6, 51. Para un volumen demasiado pequeño de perlas hidrofóbicas, la eliminación del detergente puede ser incompleta, y los que forman nanodiscos puede mostrar una variación en el tamaño, donde la mayoría son más pequeños de lo esperado. Uno podría probar dos adiciones de volúmenes más pequeños de perlas hidrofóbicas en lugar de una adición grande como para reducir la velocidad de la reconstitución.

La elección de los lípidos se debe considerar cuidadosamente 8, 9, 45, 46, 55, dependiendo de la finalidad para la preparación nanodisc. En general, para todos los métodos destinados a la formación de membranas (reconstitución de nanodiscos o liposomas, así como para los experimentos de cristalización 2D), los lípidos deben estar en un estado "fluido" 56. Por debajo de una cierta temperatura, THe lípido es rígido. Por encima de esta llamada temperatura de transición (Tm), el lípido es fluido. Tenga en cuenta que algunos lípidos saturados de uso común tienen una Tm muy por encima de la temperatura ambiente. Además, para las mezclas de lípidos, la miscibilidad de los lípidos musa considerarse 57. La temperatura óptima para la formación de Nanodisc es de alrededor de la transición de fase (Tm) del lípido.

El detergente en el presente protocolo es colato de sodio al 8. Si se debe utilizar otro detergente, las mismas concentraciones que las utilizadas para colato no se pueden utilizar directamente. Ciertos detergentes suaves disuelven los lípidos con menos eficiencia, y pueden necesitar una mayor concentración. La torta de lípidos obtenido después de la evaporación del cloroformo (paso 1.2.2 en el protocolo) debe ser disuelto en una solución clara por el detergente. Agitación, congelación-descongelación ciclos, baños de ultrasonidos, o tratamiento con ultrasonidos se podría utilizar para acelerar la solubilización.

para combinationes de lípidos (-mezclas), MSP, y detergentes distintos de los utilizados aquí, titulaciones para minimizar grandes agregados y liposomas o exceso de MSP son necesarios 4, 6, 51, 58. Para algunas combinaciones de MSP y fosfolípidos, la optimización puede ser más difícil que para otros 4, 6, 51, y llega a ser esencial para determinar el contenido de las fracciones de los picos. El método más preciso para el análisis de la composición y tamaño nanodisc es determinar el número de fosfolípidos por MSP por análisis de fosfato de 4 y calcular el peso molecular nanodisc. tamaño Nanodisc puede ser estimado por electroforesis en gel bien resuelto, no desnaturalizante; dispersión dinámica de luz (DLS) 59; o de tinción negativa TEM, por nombrar sólo unos pocos métodos. En cuanto a la negaprotocolo de apilamiento inducida tiva-mancha presenta aquí, la medición de la anchura de las pilas presentes en las imágenes de TEM se obtiene el diámetro de los nanodiscos.

En cuanto a la expresión y purificación de la proteína de andamiaje de la membrana, todas las precauciones habituales y preocupaciones para una proteína soluble se deben tomar. Los plásmidos disponibles pueden contener diferentes etiquetas y sitios de escisión de la proteasa en caso de que la etiqueta se deben retirar antes de utilizar el MSP.

5LO, la proteína monotópico utilizado en el protocolo, inactiva rápidamente a menos que se tomen precauciones, descrito en otra parte 35 y en las referencias en él. En resumen, el hierro catalítico se pierde fácilmente, y condiciones de oxidación puede causar la dimerización de la 5LO. Como se indica en la nota (paso protocolo 2.1.3), la purificación puede ser detenido después de la etapa de precipitación y las alícuotas almacenados hasta su uso posterior. Después de la purificación de una alícuota, la proteína debe ser utilizado dentro de una pocas horas d ue a la rápida inactivación 35.

Los pasos críticos en la preparación de los complejos de proteínas de nanodisc.

El tamaño de la proteína monotópico frente a la zona nanodisc es de importancia. La longitud de la cadena de proteína MSP1E3D1 corresponde a una nanodisc con un diámetro interior de 10,5 nm y alrededor de un área de bicapa 8900 Å-2 8. Esto se corresponde bien con el área informada durante la parte de membrana integrado de 5LO 45. Por lo tanto, nuestra relación de unión esperado era 1: 1, o como máximo 2: 1 5LO por nanodisc. Esto resultó ser correcta, como se informa en un experimento de valoración 35. Sin embargo, no se obtuvo la unión de dos 5LO por nanodisc máxima, como se discutió en otra parte 35. A nanodisc algo mayor, posiblemente, podría permitir un completo 2: 1 de unión para los experimentos en los que sea deseable, pero en este caso, la proporción de 1: 1 es el objetivo principal.

ove_content "> La elección de los lípidos óptimas para la formación de complejos proteína-nanodisc puede ser ayudado por el conocimiento anterior. Este fue el caso en el presente protocolo, donde la elección de lípidos era POPC sintética 35. Ambas variaciones en el grupo de cabeza de lípidos 46 y las variaciones en la saturación de las cadenas de acilo 45 fueron probados en estudios de unión de liposomas-5LO. actividad 5LO se incrementó mediante la unión en liposomas que contienen fosfolípidos de colina insaturados en la posición sn-2 de la cadena de acilo 45, 46. Si no se conocen los requisitos de lípidos específicos, pero la identidad de la membrana original se sabe, los extractos de lípidos naturales puede ser probado primero 55.

Una dependencia cofactor era conocido por 5LO, que depende de los iones Ca 2+ para membrana de unión 43. Es un reto para eliminar por completo el calcio de soluciones. Aquí, el agente complejante EDTA está presente en los tampones en cantidades adaptadas para dejar una cantidad controlada de iones Ca2 + libre. Los cálculos de las moléculas libres y ligados en los tampones fueron hechas por el software BAD 60 para tampones que contienen más de un tipo de agente complejante 35. El efecto sobre la concentración de un cofactor parcialmente soluble en la membrana no se explica por este software.

Los pasos críticos en la tinción negativa de nanodiscos para promover la formación de pila.

Para el protocolo a la mano, cuando se desea apilamiento máxima, la mancha debe ser la sal de sodio de phosphotungsten. Diferentes sales de tungsteno están disponibles, y se observó que el ácido fosfotúngstico fue menos eficiente en el apilamiento (no mostrado). Por razones poco claras, parece que las altas cantidades de sodio durante la tinción PT promueve el apilamiento. También, para el tampón de muestra, se demostró que la más baja es la cont sodioent, menor es la cantidad de apilamiento inducido 32. Por la misma razón, después que la muestra se ha aplicado a la red EM, lavado con agua antes de la tinción no debe realizarse, ya que esto también reduce de apilamiento. Por otra parte, siempre se indujo algunos de apilamiento, aunque nunca en la medida necesaria para el mejor rendimiento del protocolo.

Por supuesto, cofactores como los iones Ca2 + aquí debe comprobar la interferencia con la tinción negativa o con los nanodiscos. Para el presente protocolo, los iones de calcio se han precipitado un tampón de fosfato, por lo que se utilizó un tampón Tris. Los nanodiscos no estaban apilados por iones Ca2 + per se, como se comprobó utilizando otro tinción negativa, formiato de uranilo 35, ni tampoco impiden que el calcio inducida por apilamiento NAPT (Figura 3B).

Para una pequeña proteína monotópico, el tamaño extra añadido por la unión a un nanodisc puede hacerla detectable en cryoEM. UNmuy grande nanodisc comparación con la proteína puede no ser óptima, como una pequeña proteína a gran nanodisc puede no prevenir el apilamiento. Sin embargo, la forma de la proteína extrínseca podría tener una influencia. Aunque no hay relación precisa puede ser proporcionada a partir de ahora, se recomienda una superficie bicapa nanodisc sólo ligeramente mayor que la superficie de unión de la proteína estimado. Con esta restricción, la proteína de unión máxima sería una proteína en cada lado de la nanodisc.

Limitaciones generales y ventajas del método.

El protocolo depende de la disponibilidad de un TEM y el equipo relacionado, que no están disponibles en todos los laboratorios. Sin embargo, un microscopio electrónico de 120 a 200 kV equipado con una cámara CCD tradicional sería más que suficiente para la detección de apilamiento. La tinción negativa NAPT se lleva a cabo a temperatura ambiente, y las rejillas se puede almacenar a esta temperatura para su posterior visualización.

imag TEMING mostraría rápidamente si el apilamiento se ha impedido o no. Para las imágenes que muestran los complejos de proteína-nanodisc (por ejemplo, la Figura 4A y B), procesamiento adicional para obtener información estructural podría ser realizado. Detalles estructurales de una muestra teñida negativamente pueden llegar a 1 nm y pueden proporcionar información estructural útil 29. En los laboratorios dedicados a estructurar la determinación por cryoEM, la tinción negativa de las muestras es un procedimiento estándar. El uso de nuestro protocolo sería una adición rápida y simple de los procedimientos habituales.

Algunas proteínas monotopic se anclan a la membrana mediante miristoilación, palmitoilación, o parches hidrófobos sobre la superficie de la proteína, por lo que es necesario para formar el complejo nanodisc-proteína mediante el mismo procedimiento que para la incorporación de una proteína transmembrana en nanodiscos 13. Aquí, una de las subunidades en el complejo de proteína contiene amyristoylation en una cola N-terminal flexible para la unión a la membrana. Para las imágenes de TEM-acetato de uranilo manchado, se afirmó que el complejo de proteína se une perpendicularmente a la membrana, y no en el lado de la nanodisc. Este y otros resultados confirmaron una estructura rígida para la unión a la membrana 13. Por esta unión, NAPT tinción según nuestro protocolo propuesto mostraría las mismas partículas individuales repartidas uniformemente. Sin embargo, si el archivo adjunto había sido a través de una cadena flexible, la tinción con acetato de uranilo podría no haber dado un resultado claro. Creemos que, para los complejos de membrana de la proteína unida cadena flexible, la tinción NAPT puede inducir a los nanodiscos para apilar, lo que demuestra el típico "pila de monedas," pero ahora decorado por la proteína unida a los lados.

¿Por qué utilizar nanodiscos si se pueden usar liposomas? La optimización de los lípidos, cofactores, u otros parámetros podría muy bien ser probado en liposomas para la unión de porproteínas ipheral (cf. 5LO). Apilamiento inducida por NAPT de liposomas ha sido demostrada 32, por lo que una proteína monotópico podría prevenir el apilamiento de liposomas. Sin embargo, los tamaños de liposomas en comparación con monotópico proteínas y para nanodiscos también entra en juego. Una proteína extrínseca de gran tamaño puede ser capaz de prevenir el apilamiento de los liposomas, mientras que una pequeña proteína, como el 78-kDa 5LO, podría no a menos presente en altas números por liposoma. liposomas pequeños se pueden preparar, sin embargo, el más pequeño de la vesícula, mayor es la curvatura de su membrana. La bicapa nanodisc es plana. Probar varios parámetros utilizando nanodiscos podría ser menos rentable debido a la MSP. Por otra parte, para los liposomas, ciertos cofactores caros o sustratos que partición parcialmente en la membrana y, además, en el interior de los liposomas, puede ser necesaria en cantidades mayores. En conclusión, la plataforma nanodisc ofrece la posibilidad de elegir un área definida por la unión a n precisa úmero de proteínas. La zona de bicapa es accesible desde dos lados y es plana.

Importancia del método.

La determinación de la estructura 3D de las proteínas o macromoléculas complejas visualiza el funcionamiento interno de las células. En este entorno lleno de gente, proteínas específicas son activos sobre superficies de la membrana, solos o en complejo con otras proteínas, pero por lo general de modo que la interacción física con los componentes en la bicapa lipídica es parte de su función mecánica. Para algunas proteínas, la conformación en disolución se cambia a la incrustación de la membrana, mientras que otros están atados a la membrana pero sin embargo cambiar conformación u orientación en la membrana debido a algún tipo de gatillo. Una trayectoria de entrada sustrato hidrófobo puede entonces abrir, o puede presentar una conformación que permite la unión a una proteína de transmembrana. Para obtener la estructura, o al menos la información estructural, de tales proteínas periféricas unidas a la membrana es un reto.

jove_content "> nanodiscos se utiliza en algunos estudios con respecto a la orientación y la función en las membranas 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. citocromo P450, en el centro en la desintoxicación, se ancla a la membrana por una α-hélice y contiene un grupo hemo en su parte globular, lo que permite mediciones de dicroísmo lineales 15. los resultados indicaron una orientación de la hemo con respecto a la membrana en estrecho acuerdo con las simulaciones realizadas, fortaleciendo con ello otras conclusiones extraídas de simulaciones del citocromo P450 membrana incrustado. para una GTPasa anclado a la membrana en un pequeño nanodisc, estudios de RMN pudieron identificar dos áreas diferentes de la proteína con una membrana de interfaz cada y, además, cómo nucleo La unión marea indujo un interruptor de una interfaz a la otra 17. Las mutaciones y la unión efector, así como la unión de GTP, se estudiaron en otra GTPasa en el barrio de Ras-superfamilia de encontrar una serie de efectos sobre la actividad que dependen de la orientación en la membrana, lo que afectaría oncogénico de señalización 16. 5LO tiene una conformación soluble 61 y requiere calcio para la unión de las membranas nucleares 43. El uso de liposomas unilamelares gigantes, polarizado, atenuados, de reflexión de infrarrojos total de los experimentos se llevaron a cabo 46. El resultado implica que el N-terminal β-barril se une a las membranas, con el eje de simetría del β-barril inclinadas aproximadamente 45 grados respecto a la normal de la membrana. El dominio 5LO C-terminal es un haz casi cilíndrico α-helicoidal, y esto se propuso para unirse con el eje largo paralelo a la membrana 45,= "xref"> 46. En nuestro trabajo anterior sobre 5LO incrustado en nanodiscos, el área de la bicapa fue elegido para permitir una 5LO por lado con la orientación 35 anteriormente sugerido. Las imágenes de TEM confirmaron esta orientación, aunque a baja resolución 35. Si, por ejemplo, sólo el N-terminal β-barril estaba obligado pero no el dominio C-terminal, se habría obtenido un mayor número de 5LO por nanodisc. Además, otra proteína podría cambiar la unión a la membrana y la orientación de 5LO, tal como un activador, la proteína transmembrana de 5-lipoxigenasa activación de la proteína, FLAP. FLAP se ha reconstituido en nanodiscos, y utilizar TEM y otros métodos para estudiar la interacción entre 5LO y FLAP. Sus resultados de interacción en ácido araquidónico endógeno que se convierten en leucotrienos A4, que es el primer paso en la síntesis de quimioatrayentes potentes implicado en muchas enfermedades inflamatorias 41, 42 sup>, de 62 años.

El complejo 5LO-nanodisc se calcula que tiene un peso molecular de 334 kDa, cerca del límite de alrededor de 200 kDa para la investigación estructural por cryoEM. Sin embargo, como la estructura atómica de 5LO está disponible 61, su acoplamiento en un medio de resolución, 3-dimensional mapa de densidad de electrones sería dió información sobre la interacción con la membrana nanodisc.

Las innovaciones en la tecnología cryoEM no sólo están empujando resolución al nivel atómico 63, sino también empujando el límite de tamaño de las proteínas más pequeñas. Para la determinación estructural por RMN 22, la situación es la opuesta, ya que el objetivo es aumentar el rango de tamaño, que ahora se está acercando a 200 kDa. Recientemente, la membrana de las proteínas de unión a GTPasa pequeños fueron investigados por RMN 16, 17. Estas proteínas, de sólo alrededor del 20 kDa, quere atados a pequeños nanodiscos de un diámetro interno de 7,6 nm, la formación de complejos de aproximadamente 130 kDa. En el futuro, los complejos de tamaño similar podrían ser investigados por tanto RMN y cryoEM para dilucidar diferentes aspectos de la unión a la membrana de proteínas.

Una extensión del protocolo podría ser investigar nanodiscos que contienen una proteína transmembrana (TMP) en la bicapa nanodisc. apilamiento inducida por NAPT de los TMP-nanodiscos podría compararse con nanodiscos vacías que contienen la misma composición lipídica. Los bucles grandes extramembranosos impedirían apilamiento, mientras que los bucles cortos no pueden impedir el apilamiento 64. Este podría convertirse en una ventaja, ya que el protocolo se podría utilizar para investigar las proteínas de unión específicamente a la proteína transmembrana.

La ventaja de este método es que la interacción de la membrana puede ser visualizado inmediatamente. La relativa sencillez de hacer grandes cantidades de nanodiscos vacíos implica que se puede extendereste método a la pantalla para diferentes condiciones como pH, temperatura, tampones, y la dependencia de cofactor de la proteína de unión monotópico. De hecho, mientras que se desarrolló la plataforma nanodisc 9 para la estabilización de proteínas transmembrana y se utiliza cada vez más para este propósito, su potencial para los estudios de la gran cantidad de más o menos proteínas extrínsecas transitoriamente de unión presentes dentro de las células debe claramente mantenerse en mente.

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Acknowledgments

Los autores agradecen el Consejo Sueco de Investigación, Consejo del Condado de Estocolmo, y los fondos de KI por su apoyo. La expresión y purificación de MSP se llevó a cabo en el Instituto Karolinska de proteína / SciLifeLab Fondo para la Ciencia Core (http://PSF.ki.se). Los autores también desean agradecer al Dr. Pasi Purhonen Mathilda y el Dr. Sjöberg por compartir sus conocimientos técnicos y su ayuda oportuna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

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Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión
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B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

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