Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

araştırmalarda, çok dikkat lipit etkileşimi, çeşitli yer içsel veya dışsal da zar proteinleri, odaklanmıştır. Lipid etkileşen proteinleri ile çalışma ya deterjanlar gibi lipidler, bir yerine seçilmesi 1 amphipols veya küçük proteinler 2, ya da çözünür ve aktif proteini tutan bir membran yerine bulmak içerir. Lipoik membran yerine lipozomlar ve nanodiscs (ND) 3, 4 içerir.

Nanodiscs doğal kanda meydana gelen, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), proteinin bir parçası, Apo-1 mühendisliği tarafından geliştirilen yakın yerli membran platformudur. Apo A-1 kısa amfipatik α-helikslerin 243 kalıntı uzun zincirli ve bir lipit içermeyen çözünebilir bir biçime sahiptir. İn vitro lipid varlığında, protein Apo-1 iki kopya kendiliğinden hydr çevrelemek için yeniden zamanbir lipid iki katmanlı yamanın 5 ophobic asil zincir bölümü. ApoA-1 Engineered Bunlar genellikle membran iskele proteinleri (MSP) olarak adlandırılır ve artan sayıda plazmid ya da arıtılmış, proteinler gibi ticari olarak temin edilebilir. 6 uzun veya daha kısa 7 membran iskele proteinler Apo AI 1 sonuç tekrarlar veya α-sarmal silmeler. Bu da bu mümkün 7 8 mil 17 çapı 6 nm civarında diskleri izin vermektedir. Nanodiscs 3, 9 başvurularının farklı türleri vardır. En yaygın olarak kullanılan uygulama, daha önce 3, 9 yorumlanan bütünsel zar proteini 8 stabilizasyonu için bir yakın yerel membran ortamı sağlamaktır. Daha az keşfedilen kullanımı çalışma için nano ölçekli zar yüzeyi temin etmektirperiferal membran proteinleri 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Protokolün Bölüm 1 Aşağıdaki fosfolipidler ve membran iskele protein oluşan nanodiscs yapmak için prosedürü görüntüler.

Numune hazırlama çoğu yöntemleri bir darboğaz olduğunu. Yöntem özgü örnekleri belirli bilgileri eklemek olabilir, ama aynı zamanda sonuçların karşılaştırılması zorlaştırmaktadır. örnekler modelli ve çok sayıda farklı yöntem doğrudan kullanılabilir, bu nedenle, daha basit bir. Nanodiscs kullanımı ile bir avantajı, lipozomlar (örneğin, numuneler, doğrudan bu protokolde olduğu gibi, TEM ve denatüre edici olmayan jel elektroforezi her ikisi için de kullanılabilir) ile karşılaştırıldığında nanodisc küçük boyutudur.

18'dir. Ancak, bir lipozom membranı üzerinde yerleştirilmiş monotopic membran proteini herhangi bir yüksek çözünürlüklü 3D yapı bildiğimiz kadarıyla, henüz yayınlanmıştır. Altın nano parçacıklar veya antikorlar TEM 19 kullanılarak lipozomlar veya veziküller bağlayıcı proteinleri görselleştirmek için kullanılabilmektedir. bu problar çok özel olsa da, bunlar membran bağlanma bölgeleri örterek ya da esnek parçalar ile ilgi alanları maskeleyerek-membran birleştirme proteinleri engelleyebilir. Altın etiketli veya antikor-kompleks proteinler muhtemelen jel üzerinde analiz edilebilir, ancak bu deneyde maliyetini arttıracaktır.

lipozomlar mükemmel bir platform olmasına rağmen, bir pop emin olamazulation lipozom başına protein belirli bir oranı, nanodiscs 20 kullanımı ile keşfedilebilir bir özelliği vardır. bir lipozom içinde, kofaktör ve alt tabakalar çözünür iç sıkışıp edilebilir. zar-çözünen maddeler membran taklitlerinin her iki tür için aynı kaderi paylaşacak. iki tabakalı alanı nanodiscs daha küçük olduğu Bununla birlikte, maddenin daha az miktarda nanodisc membranlar doyurulması için gereklidir.

atom yapısı belirlenmesi yoluyla anlama protein işlev araştırmanın pek çok alanında için gerekli olmuştur. Protein yapı tayini için yöntemler röntgen 21 arasında; nükleer manyetik rezonans (NMR) 22, 23; ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) sirojenik sıcaklıkta 24 cryoEM. cryoEM tarafından çözünürlüğü son zamanlarda büyük ölçüde kaynaklanmaktadır doğrudan elektron de kullanımına, geliştirilmiş26, 25 dedektörler. Makromoleküller yakın bir yerli devlet ince, vitreus buz 27 görüntülenmiş. 200 kDa - Bununla birlikte, biyolojik moleküllerin düşük kontrast nedeniyle, bunlar 100 boyut aralığında tespit etmek zor olur. Uygun büyüklükte numuneler için, veri toplama yapılan ve tek parçacık yeniden yöntemi, bir yapı 28 elde etmek üzere uygulanabilir.

Ancak, TEM ile protein yapısının belirlenmesi çok aşamalı bir süreçtir. Genellikle negatif leke TEM 29 phosphotungsten (PT) 30 veya uranyum 31 gibi ağır metallerin tuzları kullanarak örnek monodispersiteye değerlendirilmesi ile başlar. Olumsuz lekeli makromolekülün düşük çözünürlüklü bir modeli İmar genellikle yapılır ve moleküler yapı 29 hakkında önemli bilgiler verebilir. Paralel,cryoEM başlayabilir kullanarak veri toplama. eser oluşum yanlış yorumlanmasından kaçınmak için negatif leke TEM verilerini değerlendirirken dikkatli olunmalıdır. Belirli bir artefakt fosfolipidler PT leke etkisi ve yan 33 bakıldığında jeton yığınları benzeyen, uzun çubukların oluşumu ile sonuçlanan, 32 lipozomlar. Bu tür "rouleau" veya "yığınları" (bundan sonra "yığınları" olarak belirtilir) nanodiscs 35 daha sonra da HDL 34 için erken gözlenen ve bulundu.

membranların istif ve yeniden şekillendirme çeşitli nedenlerle oluşabilir. Örneğin, bir amonyum molibdat leke 36 TEM görüntülemede bakır gibi ko-faktörler tarafından indüklenebilir. lipozomlar membran lipitlerinin bir kısmı böylece bakır iyonlarının eklenmesinden sonra lipozomlar istifleme, EDTA metal kompleks oluşturmayı taklit bir iminodiacetic asit kafa grubu içerdiği 37 (kullanılmış leke söz konusu değildir). PT tarafından fosfolipidlerin yığın oluşumu erken gözlendi; Ancak, daha sonra çalışma kaldırma veya bu eser oluşumu 38 kaldırılmasına odaklanmıştır.

Burada, TEM ile membrana bağlanma proteinlerinin çalışma için istifleme NAPT'yi kaynaklı nanodisc yararlanmak için bir yöntem önerilmektedir. Kısacası, nanodiscs üzerinde bağlayıcı protein istifleme gelen nanodiscs önleyecektir. Istifleme nedenleri açık değildir rağmen, birbirlerine (Şekil 1A) sopa diskleri neden fosfolipid ve PT fosforil grubu arasında bir elektrostatik etkileşim olduğunu 39 önerilmiştir. Protokolde arkasındaki hipotezi, bir protein, bir nanodisc bağlandığında, fosfolipid yüzeyinde en availa olmadığıdır bağlı proteini ile sterik engelleme, PT ile etkileşim için ble. Bu yığın oluşumunu (Şekil 1B) önleyecektir. İki sonuçlar çıkarılabilir. İlk olarak, istifleme önlenmesi ilgili protein ile membrana bağlı olduğu anlamına gelir. İkinci olarak, protein ND kompleksi kompleks kaba morfoloji elde etmek için standart tek parçacık işleme yöntemleri 24, 40 ile muamele edilebilir. Ayrıca, sigara denaturasyon jel elektroforezi ya da dinamik ışık saçılımı gibi yöntemlerle analiz gerçekleştirilebilir.

Bu hipotezi göstermek için, bir çok iltihaplı hastalık 41, 42 yer almaktadır membran bağlayıcı protein 5-lipoksigenaz (5LO) kullanılmıştır. Bu 78-kDa 'lık proteinin zar 43 bağlamak için kalsiyum iyonu gerektirir. Bu zar dernek çalışılmış olmasına rağmen yoğun lipozomlar kullanılaraks = "xref"> 44, 45, 46 ve membran fraksiyonları 47, bu TEM analizi ve yapı belirlenmesi için kullanılamaz.

nanodiscs hazırlanması deterjan ise sodyum kolat içinde yeniden süspansiyon haline lipid ile MSP karıştırılmasıyla başlar. 1 saat boyunca buz üzerinde kuluçkalamadan sonra, deterjan yavaş bir adsorban reçinesi kullanan bir çözme karışımından çıkarılır. Bu tür malzemenin genellikle küçük boncuk halinde şekillendirilir polistiren yapılır. Bunlar nispeten hidrofobik ve lipidler 48 oranla deterjan bağlanması için güçlü bir tercih var. hidrofobik tanelerden ayrılması ve santrifüj kullanılarak açıklık yaptıktan sonra, nanodiscs boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile saflaştırılır. Saflaştırılmış nanodiscs (a titrasyonu için ya da daha fazla oranlarda) eşit molar orandaki bir monotopic membran proteini (ve olası yardımcı faktörler) ile karıştırılır ve r bırakılıreact (15 dakika). TEM ile analiz parlayan taburcu karbon kaplı ızgaralar üzerine numune ul-miktarlarda uygulayarak ve daha sonra NAPT ile negatif boyama yaparak gerçekleştirilir. alikotları TEM ızgaraların uygulandığı zaman, aynı örnek büyük bir değişiklik, denatüre edici olmayan ya da SDS-PAGE jel elektroforezi gibi göre aktivite ölçümleri çeşitli ile analiz için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nanodiscs hazırlanması 1.

  1. Ekspresyon ve membran iskele protein 8 saflaştırılması, 35
    1. E. coli BL21 içinde His-etiketli MSP1E3D1 (DE3) şişelerde T1R pRARE2 gerginlik ifade eder. 37 ° C'de 50 ug / ml kanamisin ile desteklenmiş LB ortam maddesi ile 50 mL'lik bir gece boyunca başlatıcı kültür hazırlayın. 50 ug / ml kanamisin ile takviye edilmiş müthiş bir broth ortamına 2 L gece boyunca başlatıcı kültür ile seyreltilir.
    2. Yaklaşık 3 18 ° C 'de 3 saat boyunca, 0.5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile, protein ifadesini uyarmak ulaştığında 600 nm (OD 600) de optik yoğunluk kadar 37 ° C' de hücreler büyütün.
    3. liziz tamponu (100 mM NaCI,% 10 gliserol, 100 mM Tris-HCI, pH 8.0) içinde hazırlayın. Kullanmadan önce hemen 1 mM TCEP ekleyin.
    4. 18 ° C 'de indüksiyon 3 saat sonra, 4500 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj ile hücreler hasatve 4 ° C'de. Süpernatantı atın hasat hücreleri tartmak ve hücrelerin gramı başına 2 ml lizis tampon oranında lizis tamponu onları yeniden askıya.
    5. Lyse darbeli sonikasyon (tekrarlama oranı: 4 s AÇIK, 4 s KAPALI) tarafından hücreler% 80 genlik 3 dakika boyunca.
    6. 49.000 x g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca lizatları santrifüjleyin. Bu santrifujlemeden elde pelet atılır.
    7. Tercihen 4 ° C'de muhafaza otomatik bir sıvı kromatografi sistemine bağlı bir 5 ml Ni içine süpernatant + kenetleme sütun enjekte edilir.
    8. His-etiketli MSP dışındaki tüm proteinleri kaldırmak için aşağıdaki 3 - elüsyon adım (adım 1.1.9) önce, tamponlar 1 ile sütun yıkayın. arıtma süreci takip etmek 280 nm'de protein içeriği izlemek; 280 nm'de UV kayıt her yıkamadan sonra geri başlangıca gitmeli.
      1. 40 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 10 mM imidazol,% 1 Triton pH 8.0: yıkama tamponu 1 ile yıkayınız.
      2. 40 mM Tris-HCI, 300 mM: yıkama tamponu 2 ile yıkayınNaCl, 20 mM imidazol, ve 50 mM sodyum kolat, pH 8.0.
      3. 40 mM Tris-HCI, 300 mM NaCI, 50 mM imidazol, pH 8.0: yıkama tamponu 3 ile yıkayınız.
    9. 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8.0 ile MSP yıkayın.
    10. Jel filtrasyonu 8, 35, standart tampon (0.5 mM EDTA, 100 mM NaCI, 20 mM Tris-HCI, pH 7.5) MSP tampon değiştirme; parti başına verim yaklaşık 7 mg L-olmalıdır -1.
  2. Fosfolipid stok çözeltisi hazırlanması
    1. Bir cam behere 25 mg / mL'lik bir konsantrasyonda kloroform içinde çözülmüş 1-palmitoil-2-oleoil sn -glisero-3-fosfokolin (POPC) 305 ul ekleyin ve hafif bir nitrojen akımı ile tasfiye ederek kloroform buharlaşması . bir vakum kurutucu içinde yağ gece boyunca kurutun. Not: Bu adım cam kabın altındaki lipid ince bir film bırakır lipid, çözücünün kaldırmak için yapılır.
    2. çözüm şeffaf hale gelinceye kadar tüp vorteks 100 mM sodyum kolat içeren MSP standart tampon 200 uL lipid pasta yeniden süspanse; Bu 50 mM POPC konsantrasyonuna sahip bir çözüm sağlayacaktır.
      Not 2 (lipit: deterjan) 8 Genel olarak, bu noktada, deterjan lipidin mol oranı 1 olmalıdır. Bu lipid, deterjan karışımı yaklaşık 2 ay için -80 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  3. Deterjan çıkarılması için hidrofobik tanelerin hazırlanması
    1. 50 mL'lik bir tüp içinde tanelerin 5 g (kuru ağırlık) yerleştirin.
    2. ultra saf su 40 mL, sonra% 100, 30 mL metanol ile boncuk yıkayın.
    3. 10 ml MSP standart tampon maddesi ile boncuk yıkayın. Son olarak, 4 ° C 'de MSP standart tampon maddesi 15 mL boncuk saklayın.
  4. Nanodisc sulandırma
    1. Bir mikrofüj tüpüne MSP1E3D1 (0.124 mM) 190 ul dağıtmak ve fosfolipid stok çözeltisi (50 mM P 61.5 mcLAynı tüp OPC). 1 saat boyunca ıslak buz üzerinde sulandırma karışımı inkübe edin. Not: 130 (MSP1E3D1: POPC) 1 bir mol oranına eşittir.
    2. Otomatik birleştirme işlemi başlatmak için yeniden oluşturma karışımının mL'si başına boncuk 0.5 g bir konsantrasyonda hidrofobik boncuk ekleyin. 4 ° C sıcaklıkta 16 saat için bir döner bir inkübatörde inkübe edin.
    3. İnkübasyondan sonra, 13.000 x g'de 10 dakika 4 ° C'de santrifüj çökeltilerini ve agrega kaldırma. pelet atın ve süpernatant kaydedin.
    4. 280 nm'de absorbans stabil hale gelene kadar MSP standart tampon maddesi ile (otomatik bir sıvı kromatografi sistemine monte) boyut çıkarım kromatografi kolonuna dengelenmesi. sütuna süpernatan enjekte edilir ve zirve fraksiyonları toplayın.
    5. 280 nm 'de pik fraksiyonlarda nanodiscs konsantrasyonlarını ölçmek. Nanodisc konsantrasyonunun hesaplanması için MSP1E3D1 (ε = 29.910 cm-1 M-1) molar sönüm katsayısı kullanarak. NOT:nanodisc için lipid sayısı radyo-etiketli lipitlerin ve fosfat analizi 4 bir kombinasyonu ile ya da tek başına fosfat analizi ile ölçülebilir.

Monotopic Proteininin 2. 5-lipoksijenaz 35

  1. bir gecede starter kültür hazırlayın. 100 ug / ml ampisilin ile LB ortamında 50 mL Supplement. 5-lipoksijenaz geni (ALOX5) plasmid içeren E. coli BL21 (DE3) 'e sahip ortamı aşılamakta. 42 mM Na-2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, 9 mM NaCI, 19 mM NH4CI, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM CaCl2,% 0.2, D-glikoz, 0.1 ihtiva eden sentezleme ortamı içinde bir gece boyunca starter kültür seyreltilir % 5 uM FeSO 4 ve 100 ug / ml ampisilin. 600 OD ~ 0.5 25 ° C kadar hücreleri büyür. 20 ° C'de 35 16 saat 0.2 mM IPTG ile protein sentezlenmesinin neden.
  2. 7.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika süre ile santrifüjleme ile hasat ve supernatant atın. proteaz inhibitörü ve 0.5 ihtiva eden (ve 1 mM TCEP, 100 mM NaCI,% 10 gliserol, 100 mM Tris-HCI, pH 8.0) içinde liziz tamponu içinde hasat hücreleri ve tekrar süspansiyon hasat hücreleri içeren tüpün alt kısmında bulunan pelet tartılır mg / ml hücre gramı başına liziz tamponunda 2 mL bir oranda 35 lizozim.
  3. % 80 genlik, 5 x 15 sn boyunca sonikasyon ile Hücreleri,. 7.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj ile hücre debrisini uzaklaştırmak. Çözelti 35 proteinleri çökeltmek için% 60 doygunluk - 30 amonyum sülfat çökeltme gerçekleştirin. 16.000 x g'de 15 dakika 4 ° C'de santrifüj. Not: 5LO pelet hızla dondurulmuş ve 6 ay boyunca -80 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  4. 40.000 x g'de 15 dakika 4 ° C'de lisis tamponu ve santrifüj 20 mL pelletini.
  5. üzerinde supernatant inkübe 30 dakika süre ile 4 ° C'de bir ATP agaroz sütunu. 0.5 M NaCl ihtiva eden liziz tampon maddenin bir sütun hacim ile bir kez kolon yıkayın. 10 uM FeSO 4 ve 20 ug / ml katalaz ihtiva eden liziz tamponu içinde 20 mM ATP ile 5LO yıkayın. ATP 35 kaldırmak için jel filtrasyon kromatografisi gerçekleştirin.
    NOT: 5LO kararsız ve ürün arıtıldıktan hemen sonra kullanılmalıdır. Aksi takdirde, amonyum sülfat çökeltmesi aşama (aşama 2.1.3 sonra nota bakınız) durmasına önerilir.

Nanodisc-protein kompleksinin 3. hazırlanması

  1. kompleks, 100 uL toplam hacim hazırlayın. MSP, standart tampon maddesi içinde 1 mM Ca2 + mevcut 0.8 uM, ikinci ve 0.8 uM 5LO karıştırın (20 mM Tris-HCI, pH 7.5; 100 mM NaCI, 0.5 mM EDTA, 1.5 mM CaCl2) ve 10 dakika boyunca inkübe buzda. NOT: Numune bir aya kadar C 35 ° 4 de saklanabilir.
Numune ove_title "> 4. Analiz

  1. Jel elektroforezi
    1. Denatüre edici olmayan elektroforez
      1. 5 yükleme tamponu uL (50 mM BisTris, 6 N HCI, 50 mM NaCI,% 10 (ağırlık / hacim) gliserol ve% 0.001 Ponceau S, pH 7.2) 49 ile numune 15 uL karıştırın ve 4 üzerinde yük -% 16 Bis-Tris jel elektroforezi gerçekleştirmek için.
      2. Işık katod tamponu ile katot tankı doldurun (50 mM Trişin, pH 6.8; 50 mM Bis Tris ve% 0.002 Coomassie G-250) ve tampon (50 mM Bis Tris, 50 mM Trişin, pH 6.8) ile çalışan anot tankı. 150 V sabit bir gerilim kullanılarak ayrımı başlayın
      3. Coomassie ön jel sonuna ulaştığında elektroforetik ayrımı durdurun.
      4. Standart bir Coomassie mavi protokolü ile jel Leke.
    2. denatüre elektroforez
      1. ((SDS içeren yükleme tamponu 10 uL,% 0.05, numunenin 40 uL karışımı / V) bromfenol mavisi a; 0.2 M Tris-HCI,pH 6.8; % 20 (h / h) gliserol; % 10 (ağırlık / hacim) SDS; elektroforez gerçekleştirmek için% 20 Tris glisin jeli - 10 mM 2-merkaptoetanol) ve 4 üzerine yerleştirin.
      2. Çalışan tampon katot ve anot tankları doldurmak (25 mM Tris-HCI, pH 6.8; 200 mM glisin ve% 0.1 (w / v) SDS). 150 V sabit bir gerilim kullanılarak ayrımı başlayın
      3. Yükleme boya ön jel sonuna ulaştığında elektroforetik ayrımı durdurun.
      4. Standart bir Coomassie mavi protokolü ile jel Leke.
  2. NAPT çözeltisinin hazırlanması
    1. (Ağırlık / hacim) asidik çözelti, bir% 2 vermek üzere, oda sıcaklığında çalkalama ile 50 mL su içinde fosfotungstad sodyum tuzu, 1 g çözündürülür.
    2. 1 M NaOH ile 7.4'e pH ayarlayın. 0.22 mikron şırınga filtresi kullanılarak partiküllerini. Oda sıcaklığında ya da 4 ° C'da, çözelti saklayın.
  3. TEM analizi için numune hazırlanması
    1. Glow-deşarj karbon kaplı bakır ızgaralar (430 mA, 20 s için 00 göz) numunenin yüze çekilmesinden önce hidrofilik ızgaraları işlemek için. ızgara örnek (nanodiscs göre 0.8 uM) 3.5 uL yerleştirin ve 30 s için inkübe edilir. Not: uygulanan hacimli bir numunesi konsantrasyonuna bağlı olarak, 2,5 ila 5 uL değişebilir. 1 uM - nanodiscs için uygun konsantrasyon aralığı 0.5 olduğunu.
    2. Filtre kağıdı kullanarak fazla solüsyonu kapalı kurulayın.
    3. Hemen 30 sn için% 2 NAPT bir damla ızgara leke. Fazla solüsyonun kapalı kurulayın ve kuru hava ızgara bırakın.
    4. TEM ile ızgaraları değerlendirin. 120-200 keV gerilimi hızlanan bir mikroskop istifleme boyutlarını tahmin etmeye yeterlidir. NOT: Bu protokolü için, kalibre edilmiş bir transmisyon elektron mikroskobu kullanılmıştır 200 keV alan emisyon tabanca ile donatılmıştır.
    5. TEM görüntüleri kaydetmek. Uzun yığınları gösteren görüntüler için daha fazla işlem yoktur; Fotoğraflar bir kaç içerebilir dışsal proteinle nanodiscs kompleksi göstermektedirkısa yığınlar, ancak çoğu parçacıkların kompleksi bulunmaktadır. Tutanak birkaç görüntü ve süreç sınıf ortalamaları ve düşük çözünürlük, kompleksin 3 boyutlu model elde etmek için standart yöntemlere göre bu.
      NOT: negatif leke verilerinin toplanması için, ızgaralar, en az üç farklı günde yapılmıştır. Negatif boyama işleminden önce her gün için, taze örnek inkübasyonlar (adım 3.1 gibi) yapılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

önerdiğimiz metot olup, bağlama monotopic membran proteini için membran yüzey sağlamak için nanodiscs hazırlanması bağlıdır. Nanodisc çift katlı lipid içine gömülü herhangi bir transmembran proteini olduğu gibi, nanodiscs burada "boş nanodiscs" (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir. Bu iki MSP1E3D1 iskele proteinleri ve POPC 8 yaklaşık 260 molekül bir kompozisyon için 256 kDa bir hesaplanmış molekül ağırlığına sahiptir. Bu protein kullanılarak: sulandırma lipid oranının, tek bir ana pik (Şekil 2A) jel filtrasyonu sırasında elüt edilmiştir. 9 mL (Şekil 2A) çevresinde en tepe kısımları, bir bant (Şekil 2B, şerit 1) gösteren mavi doğal jel elektroforezi 49 ile incelenmiştir. bandı hesaplanan 256 kDa biraz daha büyük bir boyuta karşılık gelen, ancak, TEM görüntüleri ölçülen nanodisc çapma tekabül0.5 nm nm ± 13 bekliyordum.

Daha önce 35 (Protokol Adım 2), yukarıda daha detaylı olarak tarif edildiği gibi monotopic zar proteini 5-lipoksijenaz (5LO) ile saflaştırılmıştır. 78-kDa 'lık 5LO homojenlik SDS PAGE elektroforezi (Şekil 2C, şerit 1) ile analiz edildi ve 35 (şekilde gösterilmemiştir), tam fonksiyonel.

Bu protokolde, koşullar kasten nanodiscs istiflenmesini teşvik ettiğini oluşturulur. Ancak, bu istifleme özellikle tüm diğer tedaviler ve ilave sağlandıktan sonra, son adım olarak negatif bir leke sodyum fosfotungstad eklenerek sadece TEM görüntüleme (sözde örnekleri) yapılan örneklerin indüklenir unutulmamalıdır. Aslında, NAPT'yi lekeli nanodiscs görüntüleri HDL 34 çok erken beklenen döşemesi (Şekil 3A) göstermektedir 5, 50. Şekil 1A şematik açıklanan ve Zhang ve arkadaşları tarafından önerildiği gibi (Şekil 3A) "yandan bakıldığında paraların uzun yığınlar", ikili tabakalar arasındaki ardalanmalı fosfotungstad ile toplanan nanodiscs vardır. 32, 39.

Tamponlar çeşitli eklemeler etkileyip etkilemediğini kontrol etmek, önlemek veya hatta istifleme ikna etmek önemlidir ve aşağıda belirgin hale gibi, kalsiyum iyonlarının etkileri soruşturma gereklidir. Şekil 3B'de, istifleme de kalsiyum iyonlarının NAPT ile boyamadan önce nanodisc çözeltisine ilave edildi, bir örnek içinde mevcut olan.

Protokolde önemli bir adımdır Şekil 4, zar-bin gösterilmiştirDing, protein çözeltileri bulunur. 5LO nanodiscs (Şekil 4A) membran yüzeyine bağlı olan üst üste binme NAPT'yi leke indüklenebilir olabilir. Şematik olarak (sağ, Şekil 1B alt), Şekil 1 'de gösterildiği gibi, 1: Bu örnek için, nanodiscs için 5LO mol oranı 1 olmuştur. Nanodiscs lipid iki katmanlı her iki tarafından erişilebilir TEM görüntüler daha az yığın (Şekil 4B) göstermektedir Dahası, lipozomların aksine, hazırlanan iki 5LO bir ila nanodisc oranı ile numune.

10, 11, 12 veya fosfatidilserin 10 phosphoinositols gibi bağlayıcı, bazı dışsal membran proteinleri, membran belirli bir lipidin varlığı böyle bağlı olabilir. 5LO durumunda, Ca2 + varlığı neces olan43 rekli. Şekil 4A ve B, kalsiyum iyonları, nanodiscs ve 5LO sahip çözeltilerde mevcuttu. Diğer bir deyişle, sadece yığma olmaması monotopic proteine bağlı olduğunu gösterir ama aynı zamanda bağlanma Ca + 2 iyonları bağlıdır. Bunu göstermek amacıyla, nanodiscs ve 5LO ancak kalsiyum olmadan içeren bir çözelti NAPT'yi ile boyanmış ve TEM (Şekil 4C) ile görüntülendi. Beklendiği gibi, 5LO solüsyonda serbest 5LO bırakarak Ca2 + olmadan nanodiscs bağlanmaz, böylece nanodiscs yerine (Şekil 4C) yığını.

Şekil 1
Nanodisc İstifleme ve Yöntem genel bakış Şekil 1. ilkesi. Nanodisc istifleme A. Prensibi. nanodiscs (sol) içindeki bir çözeltisine, negatif bir leke sodyum fosfotungstad eklenmesi th yol açar e bağlı fosfolipid çift tabakaya ve PT molekülleri (orta, siyah noktalar) arasındaki elektrostatik kuvvetler (ortada, oklar) nanodiscs (sağda) istifleme. Protokol B. şematik gösterimi. Dört farklı açılarda (düşük, orta) tasvir bir kompleks oluşturmak için (gri) dışsal membran proteini boş nanodiscs (sol) bağlama. monotopic proteinin varlığı, sterik fosfotungstad tuzu ile boyandığında sıkışmasını nanodiscs engeller (sağ alt), herhangi bir büyük nesneler (üst sağ) yokluğunda indüklenen istifleme aksine. yeşil-turuncu renkli halkalar açık kahverengi temsil edilmektedir fosfolipid çekirdek, yaklaşık iki MSP sarma temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

jpg "/>
Şekil 2. Nanodiscs ve 5LO homojenliği Analizi. Yeniden boş nanodiscs A. boyut çıkarma kromatografisi. 9 mL nanodiscs tepe elüsyon. B. (A) 'da gösterilen SEC zirve fraksiyonunun jel elektroforetik analizi, denatüre edici olmayan. Şerit M işaretleyici içerir. Tek bir bant 9 mL tepe fraksiyonu yüklenen şerit 1 'de mevcuttur. C saflaştınldı 5LO jel elektroforetik analizi Denatüre edici. Şeritte 1. yoğun bir bant olarak 78 kDa 5LO gösteren bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
TEM ile analiz edilen protein Yokluğunda Nanodiscs Şekil 3. yığın oluşumu. C. Nanodisc yığın ağırlık indüklendiTavuk NAPT'yi ile boyanmıştır. yandan bakıldığında "sikke yığınları" nanodiscs yığınları vardır. Her nanodisc beyaz bir bant olarak görünür. NAPT'yi ile boyanmış B. İstifleme nanodisc çözeltide kalsiyum iyonları tarafından rahatsız edilmemiştir. Ölçek çubukları 100 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
TEM tarafından Analiz bir kofaktör Varlığında Protein Bağlanma tarafından Stack oluşumunu engelleyerek Şekil 4.. 1 (A) ya da 2: 1 (b) A ve B Kalsiyum iyonları mol 1 oranlarında 5LO karışımları ve nanodiscs mevcuttu. (B) 'de gösterildiği gibi daha 5LO nanodiscs bağlanma, daha az nanodiscs, istifleme için kullanılabilir. bo tek parçacık kompleksleriTH (A) ve (B) daha sonraki işlemler 35 için uygundur. Kalsiyum iyonları olmadan bir C., 5LO bağlamak olamaz. Bu örnek NAPT boyama ilişkisiz 5LO bırakarak nanodiscs tipik istiflenmesini gösterir. Ölçek çubukları 100 nm. Çıkan 69,500x bir büyütmede bir 4K X 4K CCD kamera ile elde edilmiştir. CCD kamera piksel boyutu EM görüntülerin örnek düzeyinde 2.16 Å karşılık gelen bir değerini verir 15 mikron vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Boş nanodiscs yeniden oluşturulması, protein nanodisc komplekslerinin hazırlanması ve bu komplekslerin TEM için negatif boyama: Yöntem, üç bölüme ayrılabilir. Her bölüm tekniği, kritik adımlar ve kullanışlı değişiklikler sınırlamaları ile ilgili ayrı ayrı ele alınacaktır.

Boş nanodiscs sulandırıldıktan. üretim ve nanodiscs kullanımında kritik adımlar ve sınırlamalar.

Boş nanodiscs hazırlanması için, MSP-to-lipit oranını optimize esastır. En yaygın MSP ve (bir deterjan gibi kolat kullanarak) lipidler için en uygun oranlar için öneriler literatürde bulunabilir (örneğin, 125 - Mevcut protokolde kullanılan MSP1E3D1 8, 51 başına 130 POPC). Farklar protein konsantrasyonunu belirlemek, l verimliliği için bir yöntem de bağlı olabilir geçme oranları ile karşılaştırıldığında elde edilenIPID deterjan solvasyonu ve çözeltiden deterjanın alınması yöntemi.

Biz olası alternatiflerin diyaliz veya siklodekstrin 52, 53 eklenmesi ise, hidrofobik boncuk 48 (adım 1.3) kullanılarak deterjan kaldırma gerçekleştirmek için öneriyoruz. Başlangıçta, diyaliz HDL 5, 34 yeniden oluşturulması için kullanılabilir ve hala 54 tercih edilir. Ne olursa olsun, deterjan giderimi için yöntem, hız esastır. kaldırma (hidrofobik boncuk hacmi çok büyük) çok hızlı ise, lipidler ile MSP kendiliğinden yeniden düzenlenmesi meydana gelmesi zaman olmayabilir. Bunun yerine, lipozomlar ve protein agregatları büyük miktarlarda oluşturabilmektedir. Boyut dışlama kromatografisinden elde edilen sonuçlar, boş hacim içinde yeniden nanodiscs bir optimal tepe ve kullanılmayan daha büyük bir tepe lipozomların büyük miktarlarda gösterirMSP 4, 6, 51. hidrofobik tanelerden çok küçük bir hacmi için, deterjan çıkarılması eksik olabilir ve meydana nanodiscs çok beklenenden daha küçük boyutlarda bir varyasyon gösterebilir. Bir sulandırma hızını yavaşlatmak yerine tek bir büyük ek hidrofobik boncuk küçük hacimlere iki eklemeler test edebilir.

Lipidlerin seçimi dikkatle 8 düşünülmelidir 9, 45, 46, 55, nanodisc hazırlama amacına bağlı olarak değişebilir. Genel olarak, (aynı zamanda 2D kristalleştirme deneylerinde olduğu gibi, nanodiscs veya lipozomlar yeniden oluşturulması) membran oluşumu amaçlı tüm yöntemler için, lipitler bir "sıvı" durumunda 56 olmalıdır. Belirli bir sıcaklığın altında, incie lipit serttir. bu sözde geçiş sıcaklığının (Tm) üzerinde, lipit sıvıdır. Bazı yaygın olarak kullanılan doymuş lipidler oda sıcaklığının üzerinde iyi bir Tm gerektiğini unutmayın. Ayrıca, lipit karışımları için, lipidler perisi karışabilirliği 57 düşünülebilir. Nanodisc oluşumu için optimum sıcaklık, lipid faz geçişi (Tm) civarındadır.

Mevcut protokolde deterjan sodyum kolat 8'dir. Başka bir deterjan kullanılması gerekiyor ise, kolat için kullanılanlarla aynı konsantrasyonlar doğrudan kullanılamaz. Bazı yumuşak deterjanlar daha az etkin bir lipid çözülür ve daha yüksek bir konsantrasyon gerekebilir. Kloroform (protokol aşama 1.2.2) buharlaştırılmasından sonra elde edilen yağ kek deterjan berrak bir çözelti haline çözündürülür gerekir. VorteksleĢme, ​​döngüleri, ultrason banyoları-çözülme dondurmak veya sonikasyon çözünürlüğünü hızlandırmak için kullanılabilir.

combinat içinLipit iyonları (-mixtures), MSP ve burada kullanılan, büyük topaklar ve lipozomlar veya fazla MSP en aza indirmek için titrasyonlar dışında deterjan gerektiğinde, 4, 6, 51, 58 vardır. MSP ve fosfolipidlerin bazı kombinasyonlar için, optimizasyon diğerleri 4, 6, 51 daha zor olabilir ve bu zirve kesirler içeriğini belirlemek için gerekli olur. Nanodisc bileşimi ve boyut analizi için en hassas yöntemdir fosfat analizi 4 ile MSP başına fosfolipidlerin sayısını belirlemek ve nanodisc moleküler ağırlığı hesaplamak için. Nanodisc boyutu iyi bir çözüme, denatüre edici olmayan jel elektroforezi ile tahmin edilebilir; dinamik ışık saçılımı (DLS) 59; veya negatif-leke TEM, adı sadece bir kaç yöntemlerine. Nega gelincetif-leke-kaynaklı istifleme protokolü TEM görüntüleri mevcut yığınlarının genişliğinin ölçümü nanodiscs çapını verir, burada sundu.

Membran iskeleler proteininin ekspresyonu ve saflaştırılması için de, çözünebilir bir protein için her zamanki gibi önlemler ve endişeler alınmalıdır. farklı etiketler ve proteaz bölünme mevkilerini ihtiva edebilir uygun plazmidler durumda etiket MSP kullanılmadan önce uzaklaştırılmalıdır.

5LO, protokolde kullanılan monotopic protein önlemler başka bir yerde 35 tarif ve oradaki referanslar, alınır hızla sürece inaktive eder. Kısaca, katalitik demir kopar ve oksitleyici koşullar 5LO dimerizasyonunu neden olabilir. notu (protokol adım 2.1.3) 'de belirtildiği gibi, arıtma yağış adımı ve sonraki kullanıma kadar saklanan alikotları sonra durduruldu olabilir. Tümbölenin bir saflaştırmadan sonra, protein, bir kaç saat D içinde kullanılmalıdır hızlı inaktivasyonu 35 vi.

protein nanodisc komplekslerinin hazırlanmasında kritik adım.

nanodisc alanına karşılık monotopic proteinin boyutu önem taşımaktadır. MSP1E3D1 protein zincirinin uzunluğu 10,5 nm iç çapı ve 8.900-2 iki tabakalı bölgesi 8 ile ilgili nanodisc karşılık gelir. Bu 5LO 45 membran-gömülü kısmı için bildirilen bölgeye de gelir. Böylece, beklenen bağlanma oranı 1: 1 ya da en fazla 2: nanodisc için 1 5LO. Bir titrasyon deneyi 35 belirtildiği gibi bu, doğru olduğunu kanıtladı. Başka bir yerde 35 tarif edildiği gibi ancak nanodisc başına iki 5LO bağlanması maksimal, sağlanamamıştır. Bir miktar daha büyük bir nanodisc muhtemelen tam 2 izin verebilir: 1, bu tercih edilir deneyler için bağlanma, ancak bu durumda, 1: 1 oranında, ana amacıdır.

"ove_content> protein nanodisc kompleks oluşumu için optimum lipitlerin seçimi önceki bilgi destekli olabilir. Bu lipid seçimi sentetik POPC 35 idi mevcut protokolde, böyleydi. lipit baş grubunun 46 ve varyasyonları Her iki varyasyon asil zincirleri 45 doygunluk belirli lipit şartlar bilinmiyorsa. 5LO aktivitesi 46 sn-2 açil zinciri pozisyon 45, doymamış kolin fosfolipid içeren lipozomlar bağlayıcı artırılmıştır. lipozom 5LO bağlanma çalışmalarında test edilmiş, ancak edildi orijinal membran kimliği, bilinen doğal lipit ekstreleri, ilk olarak 55 test edilebilir.

Bir kofaktör bağımlılığı zar 43 bağlanması için Ca 2+ iyonları bağlıdır 5LO için biliniyordu. Tamamen çözümleri kalsiyumu kaldırmak için zorlu. Burada, kompleks oluşturucu madde EDTA'dır serbest Ca2 + iyonu kontrollü bir miktarda bırakmak için ayarlanmış miktarlarda tampon bulunur. Tamponlar içinde serbest ve bağlı molekülü Hesaplamalar kompleks oluşturma maddesi 35 arasında birden fazla tipte ihtiva eden tampon maddeler için kötü 60 yazılımı ile yapılmıştır. zarında kısmen çözünür bir kofaktör konsantrasyonuna etkisi bu yazılım tarafından hesaba değildir.

nanodiscs negatif boyanma Kritik adımlar yığın oluşumunu teşvik etmek için.

maksimal istifleme istenen eldeki protokole için, leke phosphotungsten sodyum tuzu olmalıdır. tungsten farklı tuzlar kullanılabilir, ve fosfotungstik asit (gösterilmemiş olan) istifleme daha az etkin olduğu görülmüştür. belirsiz nedenlerden dolayı, PT boyama esnasında sodyum yüksek miktarda istifleme teşvik etmektedir görünüyor. Ayrıca, örnek tamponu için, bu gösterilen sodyum devam düşük olduğunuent, düşük kaynaklı 32 istifleme miktarı. Bu da yığın azaltır aynı nedenle, Numune sonra EM ızgara uygulanmış, boyamadan önce su ile yıkama, gerçekleştirilmemelidir. Diğer yandan, bazı istifleme, her zaman, indüklenen hiçbir protokol en iyi performans için gerekli olan ölçüde, ancak.

Tabii ki, burada Ca 2 + iyonları gibi kofaktör negatif leke veya nanodiscs müdahale için kontrol edilmelidir. Mevcut protokol için, kalsiyum iyonları bir fosfat tamponu çöktürülmüş olurdu, bu yüzden bir Tris tamponu kullanıldı. Nanodiscs NAPT kaynaklı istifleme (Şekil 3B) önlemek başka olumsuz leke, uranil format 35 kullanılarak kontrol olarak, Ca 2 + iyonları başına tarafından yığılmış, ne de kalsiyum vermedi bulundu.

Küçük bir monotopic protein için, ekstra bir boyut cryoEM saptanabilir işlemek olabilir nanodisc bağlanarak ilave edildi. birproteine ​​kıyasla çok büyük nanodisc istifleme engel olmayabilir büyük nanodisc küçük bir protein olarak, en uygun olmayabilir. Bununla birlikte, dış protein şekli, bir etkiye sahip olabilir. kesin oranı artık olarak sağlanabilir, ancak proteinin tahmin edilen bağlanma yüzeyinden hafifçe daha büyük bir nanodisc iki tabakalı yüzey önerilir. Bu sınırlama ile, bağlama maksimum protein nanodisc her iki tarafında tek bir protein olacaktır.

Genel sınırlamalar ve yöntemin avantajları.

protokol tüm laboratuarlarda bulunmayan bir TEM ve ilgili ekipmanın bulunmasına bağlıdır. Bununla birlikte, geleneksel bir CCD kamera ile donatılmış bir 120- 200 kV elektron mikroskobu istifleme tespiti için oldukça yeterlidir. NAPT'yi negatif boyama, oda sıcaklığında yapılır ve ızgara daha sonra izlemek için bu sıcaklıkta muhafaza edilebilir.

TEM imaging hızla istifleme önlenebilir veya edilmemiş olup olmadığını gösterecektir. Yapısal bilgi elde etmek için, protein-nanodisc kompleksleri (örneğin, Şekil 4A ve B), daha fazla işlem gösteren görüntüler için gerçekleştirilebilir. Bir olumsuz lekeli örnek yapısal ayrıntıları 1 nm ulaşabilir ve kullanışlı yapısal bilgiler 29 sağlayabilir. cryoEM tarafından belirlenmesini yapısı adanmış laboratuarlarda, numunelerin negatif boyanma standart bir prosedürdür. Bizim protokol kullanımı düzenli prosedürlere hızlı ve basit bir katkı olacaktır.

Bazı monotopic proteinler gerekli nanodiscs 13 bir transmembran proteinin dahil edilmesi için aynı prosedür izlenerek nanodisc-protein kompleksi oluşturmak için yapım miristoilasyon, palmitoilleme veya protein yüzeyi üzerinde hidrofobik lekeler membrana bağlı kalır. Burada, protein kompleksi içinde alt birimden biri am içeriyorMembran bağlanması için esnek bir N-terminal kuyruğu yristoylation. uranil asetat lekeli TEM görüntüleri için, protein kompleksi membrana dik bağlı değil, nanodisc tarafında olduğu ifade edildi. Bu ve diğer sonuçlar zar bağlantısını 13 katı bir yapı teyid edildi. Bu bağlanması için, NAPT aynı yayılır tek parçacıkları gösterir bizim önerilen protokole göre boyama. eki esnek zinciri yoluyla olmuştu Ancak, uranil asetat boyama net bir sonuç vermiş olabilir. Biz ", sikke yığınını" esnek zincir membran bağlı protein kompleksleri için, NAPT boyama tipik gösteren, yığın nanodiscs neden olabilir, spekülasyon ama şimdi yüzüne takılı protein tarafından dekore.

lipozomlar kullanılabilir niye nanodiscs kullanabilir? lipidler, kofaktörler, ve diğer parametrelerin optimizasyonu çok iyi ortalama bağlanması için lipozomlar test edilebiliripheral proteinler (bkz. 5LO). Lipozomların NAPT'yi kaynaklı istifleme 32 gösterilmiştir, bu nedenle, bir monotopic proteini lipozom istiflenmesini engelleyebilir. Bununla birlikte, karşılaştırmalı olarak lipozom boyutlarının proteinleri monotopic ve nanodiscs de devreye girer. Büyük bir dışsal protein 78 kDa 5LO gibi, küçük bir protein ise, lipozom istifleme önlemek mümkün olabilir, belki değil lipozom başına yüksek sayılarda mevcut olmadıkça. Küçük lipozomlar hazırlanmış henüz zarın güçlü vezikül küçük kavis olabilir. nanodisc iki tabakalı düz. nanodiscs kullanarak çeşitli parametreleri test daha az maliyetli MSP nedeniyle olabilir. Öte yandan, lipozomlar, kısmen, lipozomların içine, daha da membrana bölümü ve bazı pahalı kofaktörler ve alt tabakalar için, büyük miktarlarda gerekli olabilir. Sonuç olarak, nanodisc platformu kesin n bağlanması için belirli bir alanı seçme imkanı sağlar Proteinlerin toprak rengi. iki tabakalı alan iki taraftan erişilebilir ve düzdür.

Yöntemin Önemi.

protein veya kompleks moleküller 3D yapısının belirlenmesi hücrelerin iç işleyişini görüntüler. Bu kalabalık bir ortamda, spesifik proteinlerin membran yüzeyleri, tek başına ya da diğer proteinler ile kompleks olarak, ancak genellikle çift katlı lipid bileşenleri fiziksel etkileşimi kendi mekanistik fonksiyonun bir parçası olacak şekilde aktiftir. Diğerleri membran üzerinde konformasyonunu veya yönünü değiştirmek yine zarının gergin ama oysa bazı proteinler için, çözelti içinde konformasyon nedeniyle tetikleyici bir tür, membran gömme üzerine değiştirilir. Bir hidrofobik alt-tabaka bir giriş yolu daha sonra açılabilir veya bir transmembran protein bağlanma sağlayan bir yapı meydana gelebilir. yapı elde, ya da en azından yapısal bilgilere, zara bağlı periferik proteinler zorlu için.

jove_content "> Nanodiscs membranlar 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 yönlendirme ve işlevi, 17 ile ilgili olarak, bazı çalışmalarda kullanılmıştır. detoksifikasyon merkezi sitokrom P450, bir α-heliks ile zarına ve içerir doğrusal dikroizm ölçümlerinde 15 için izin kendi küresel kısmında bir hem grubu. sonuçlar, böylece zar gömülü sitokrom P450 simülasyonları çıkarılan diğer sonuçlar güçlendirilmesi, yapılan simülasyonlar ile yakın anlaşma membranı ile ilgili heme bir yönünü gösterdi. küçük bir nanodisc membranın demirlemiş bir GTPaz için NMR çalışmaları her arayüzü bir zar ile protein iki farklı alanları belirlemek olabilir ve daha fazla, ne Nucleo gelgit diğer 17'ye bir arayüzden bir anahtar kaynaklı bağlayıcı. Mutasyonlar ve efektör bağlayıcı yanı sıra GTP bağlayıcı, Ras-süper ailesi 16 sinyalizasyon onkojenik etkileyecek membran üzerinde yönlendirme, bağlı faaliyet üzerindeki etkileri sayısını bulmak için başka bir GTPaz çalışıldı. 5LO çözünür biçime 61 yer alır ve nükleer membran 43 bağlanması için kalsiyum gerektirir. Dev tek katmanlı lipozomlar kullanılarak, polarize, zayıflatılmış, toplam yansıma kızılötesi deneyler 46 gerçekleştirilmiştir. Sonuç N-terminal β-varil, normal membran yaklaşık 45 derece eğik β-varil simetri ekseni ile, membranların bağlanan olduğunu ima etti. 5LO C-terminal sahası neredeyse silindirik bir α-sarmal demet ve bu membran 45 uzun eksenine paralel bağlandığı önerilmiştir,= "xref"> 46. Nanodiscs gömülü 5LO bizim daha önceki çalışmada, iki katmanlı alanı yukarıda önerilen yönlendirme 35 yan başına bir 5LO izin seçildi. TEM görüntüleri düşük çözünürlükte 35 da olsa, bu yönelimi doğruladı. örneğin, sadece, N-terminal β-barrel bağlı fakat, ise C-terminal alanı, nanodisc başına 5LO daha yüksek bir sayısı elde olurdu. Ayrıca, başka bir protein, bir aktivatör, 5-lipoksigenaz aktive edici protein transmembran protein, kapağı ile 5LO, zar bağlanmasını ve yönünü değiştirebilir. FLAP nanodiscs içine yeniden olmuştur ve biz 5LO ve FLAP arasındaki etkileşimi incelemek için TEM ve diğer yöntemleri kullanabilirsiniz. Endojen arakidonik asit ve aralarındaki etkileşim sonucu bir çok iltihaplı hastalık 41 yer alan güçlü bir kimyasal çekici sentezinde ilk adım A4, 42 lökotrien dönüştürülen sup>, 62.

5LO-nanodisc kompleksi cryoEM yapısal soruşturma için yaklaşık 200 kDa sınırına yakın, 334 kDa bir molekül ağırlığına sahip olduğu hesaplanır. 5LO atom yapısı 61 olarak mevcuttur Bununla birlikte, bir orta çözünürlükte içine yerleştirme, 3-boyutlu elektron yoğunluğu haritası nanodisc membran ile etkileşim hakkında bilgi doğuracak.

CryoEM teknolojisinde yenilikler sadece atomik düzeyde 63 çözünürlüğü iterek değil, aynı zamanda daha küçük proteinlere boyutu sınırını zorlayan değildir. Amaç şimdi 200 kDa yaklaşıyor boyut aralığı artırmak için olduğu gibi NMR 22 tarafından yapısal belirlenmesi için, durum, tersidir. Son zamanlarda, küçük GTPaz proteinlerinin bağlama Membran NMR 16, 17 ile araştırılmıştır. sadece yaklaşık 20 kDa'lık Bu proteinler, biz130 kDa kompleksler oluşturan bir 7,6-nm iç çapı küçük nanodiscs için gergin yeniden. Gelecekte, benzer büyüklükteki kompleksler bağlayıcı protein membranı farklı yönlerini aydınlatmak için NMR ve cryoEM hem tarafından incelenen olabilir.

protokolünün bir uzantısı nanodisc iki tabakalı bir zar proteini (TMP) ihtiva eden nanodiscs araştırmak olabilir. TMP nanodiscs NAPT kaynaklı istifleme Aynı şey lipit bileşimi içeren boş nanodiscs göre olabilir. Kısa döngüler 64 istifleme önlemek olmayabilir süre Büyük extramembranous döngüler, istifleme önleyecektir. protokol özellikle transmembran protein bağlayıcı proteinlerin araştırmak için kullanılan olabilir gibi bu bir avantaj haline olabilir.

Bu yöntemin avantajı, membran etkileşim hemen görsel olmasıdır. Boş nanodiscs büyük miktarda verme nispeten basit bir uzatabilir imaBu yöntem, pH, sıcaklık, tampon ve bağlanma monotopic protein kofaktör bağımlılığı gibi farklı koşullar için taranmaktadır. Nanodisc platformu 9 transmembran protein stabilizasyonu için geliştirilmiş ve artan bu amaç için kullanılır ise, aslında, daha çok ya da daha az dışsal protein geçici bağlayıcı çok sayıda çalışmalar için potansiyel mevcut içindeki hücreleri net bir şekilde tutulmalıdır akılda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar, desteklerinden dolayı İsveç Araştırma Konseyi, Stockholm İl Konseyi ve KI fonları teşekkür ederiz. MSP ifadesi ve saflaştırılması Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Bilim Core Tesisleri'nde (http://PSF.ki.se) yapıldı. Yazarlar ayrıca, teknik uzmanlık paylaşımı için ve onların zamanında yardım için Dr. Pasi Purhonen ve Dr Mathilda Sjöberg teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

Biochemistry Sayı 121 negatif boyama protein kompleksi TEM lipoksijenazlar görselleştirme denatüre edici olmayan jel elektroforezi
Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter