Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

In medisch onderzoek wordt veel aandacht besteed aan membraaneiwitten, intrinsiek of extrinsiek betrokken bij diverse lipide interacties. Werken met lipide-interagerende eiwitten omvat hetzij het selecteren van een alternatief voor de lipiden, zoals detergenten, amphipols 1 of 2 kleine eiwitten, of het vinden van een alternatief membraan dat het eiwit oplosbaar en actief houdt. Lipoic membraan substituten omvatten liposomen en nanodiscs (ND) 3, 4.

Nanodiscs zijn near-native membraan platforms ontwikkeld door engineering van het eiwit gedeelte, ApoA-1, van de high-density lipoproteïne (HDL) die van nature in het bloed. ApoA-1 is een 243 residu-lange keten korte amfipathische α-helices en een lipide-oplosbaar vrij conformatie. In vitro als in aanwezigheid van lipiden, twee kopieën van het eiwit ApoA-1 spontaan herschikken de hydr omcirkelenophobic acylketen gedeelte van een lipide bilaag patch 5. Gemanipuleerde versies van ApoA-1 worden over het algemeen genoemd membraan scaffolding eiwitten (MSP) en steeds zijn in de handel verkrijgbaar als plasmiden of gezuiverde eiwitten. Herhalingen of deleties van de α-helices in ApoA-1 resulteren in een langere of kortere 6 7 membraan steigers eiwitten. Dit maakt het weer mogelijk om schijven te vormen ongeveer 6 nm 7-17 nm 8 in diameter. Er zijn verschillende soorten van de aanvragen voor de nanodiscs 3, 9. De meest gebruikte toepassing is het een bijna-natieve membraan omgeving voor het stabiliseren van een integraal membraaneiwit 8, voorheen 3, 9 beoordeeld verschaffen. Een minder onderzocht gebruik een nanoschaal membraanoppervlak te verschaffen voor de studie vanperifere membraaneiwitten 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Deel 1 van het protocol hieronder visualiseert de procedure voor het maken van nanodiscs samengesteld uit fosfolipiden en membraan steigers eiwit.

Monstervoorbereiding is een knelpunt in de meeste methoden. Methode-specifieke monsters kunnen bepaalde informatie toe te voegen, maar ze ook vergelijkingen van de resultaten bemoeilijken. Daarom is het eenvoudiger wanneer monsters multimodale en kan direct worden gebruikt in verschillende methoden. Een voordeel van het gebruik van nanodiscs is de geringe omvang van de nanodisc vergeleken met liposomen (bijvoorbeeld kunnen de monsters direct worden gebruikt voor zowel TEM en niet-denaturerende gelelektroforese, zoals in het onderhavige protocol).

18. Echter geen hoge-resolutie 3D-structuur van een monotopic membraaneiwit ingesloten in een liposoom membraan nog niet gepubliceerd, voor zover wij weten. Goud nanodeeltjes of antilichamen kunnen worden gebruikt om eiwitten binden aan liposomen of blaasjes via TEM 19 visualiseren. Hoewel deze probes zeer specifiek zijn, kunnen ze interfereren met membraan-bindende eiwitten door veiling het membraan bindingsplaats of maskeren gebieden van belang met de flexibele onderdelen. Goud-gemerkte antilichaam gecomplexeerd of eiwitten kan waarschijnlijk worden geanalyseerd op een gel, maar dit zou de kosten van het experiment te verhogen.

Hoewel liposomen zijn een uitstekend platform, kan men niet zeker dat de pop te zijnning een bepaalde verhouding eiwit per liposoom, een eigenschap die kan worden onderzocht door het gebruik van nanodiscs 20. In een liposoom, kan cofactoren en substraten worden gevangen in de oplosbare interieur. Stoffen die oplosbaar membraan zal hetzelfde lot beide typen membraan mimetica delen. Daar de bilaag kleiner is in nanodiscs, een kleinere hoeveelheid stof nodig is om de membranen nanodisc verzadigen.

Begrip eiwitfunctie door het bepalen van de atomaire structuur is essentieel geweest voor vele vakgebieden. Methoden voor eiwitstructuur bepaling onder X-ray 21; kernmagnetische resonantie (NMR) 22, 23; en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) 24 bij cryogene temperaturen, cryoEM. De resolutie van cryoEM is de laatste tijd sterk verbeterd, voornamelijk als gevolg van het gebruik van directe electron detectors 25, 26. De macromoleculen worden afgebeeld in dunne, glasvocht ijs 27 in een near-native staat. Vanwege het lage contrast van biologische moleculen, worden ze moeilijk te detecteren met afmetingen van 100-200 kDa. Voor voldoende grote monsters kan gegevensverzameling gedaan en de methode van afzonderlijke deeltjes reconstructie kan worden toegepast op een structuur 28 te verkrijgen.

De bepaling van de eiwitstructuur door TEM is een meerdere stappen. Het begint meestal met de evaluatie van monster monodispersiteit door negatieve vlek TEM 29 met behulp van zouten van zware metalen zoals phosphotungsten (PT) 30 of 31 uranium. Reconstructie van een lage resolutie model van de negatief gekleurde macromolecuul wordt meestal gemaakt en kunnen belangrijke informatie opleveren over de moleculaire structuur 29. Tegelijkertijdhet verzamelen van gegevens met behulp van cryoEM kan beginnen. Voorzichtigheid is geboden bij de beoordeling van negatieve vlek TEM gegevens naar de verkeerde interpretatie van artefact vorming te voorkomen. Eén specifiek artefact is het effect van de PT vlek op fosfolipiden en liposomen 32, resulterend in de vorming van lange staven gelijkend stapels muntstukken van de zijkant 33. Dergelijke "rouleau" of "stacks" (hierna aangeduid als "stacks") werden vroeg waargenomen voor HDL 34, en later ook nanodiscs 35.

Het stapelen en herziening van membranen kunnen optreden om vele redenen. Zo kan worden geïnduceerd door co-factoren zoals koper, getoond door TEM beeldvorming in een ammoniummolybdaat vlek 36. Een fractie van de membraanlipiden in liposomen bevatte een iminodiazijnzuur kopgroep nabootsen metaal complexatie met EDTA, waardoor stapelen liposomen na de toevoeging van koperionen 37. De vorming stack van fosfolipiden door PT werd al vroeg waargenomen; echter, heeft later werkzaamheden gericht op het verwijderen of afschaffing van deze formatie artefact 38.

Hier stellen we een werkwijze om te profiteren van de NAPT-geïnduceerde nanodisc stapelen voor de studie van membraan-bindende eiwitten door TEM. In het kort, zou eiwit bindend voor de nanodiscs voorkomen dat de nanodiscs van het stapelen. Hoewel de redenen voor het stapelen niet duidelijk is voorgesteld 39 dat er een elektrostatische interactie tussen de fosfolipiden en de fosforylgroep van PT, waardoor de schijven aan elkaar kleven (Figuur 1A). De hypothese achter ons protocol is dat wanneer een eiwit bindt aan een nanodisc meeste fosfolipidenoppervlak niet beschik woordelijk voor de interactie met de PT als gevolg van sterische hindering door het eiwit. Dit zou stack vorming (figuur 1B) te voorkomen. kunnen twee conclusies worden getrokken. Ten eerste, het voorkomen van stapeling betekent dat het eiwit van belang gebonden is aan het membraan. Ten tweede kan het eiwit-ND complex worden behandeld met standaard single-deeltje verwerkingsmethoden 24, 40 een ruwe morfologie van het complex te krijgen. Bovendien analyseert door methoden zoals niet-denaturerende gelelektroforese of dynamische lichtverstrooiing kan worden uitgevoerd.

Om deze hypothese te tonen gebruikten we de membraan bindingseiwit 5-lipoxygenase (5LO), dat betrokken is bij vele ontstekingsziekten 41, 42. Het 78-kDa eiwit vereist calciumionen te binden aan het membraan 43. Hoewel dit membraan vereniging is onderzocht veelvuldig gebruik van liposomens = "xref"> 44, 45, 46 en membraanfracties 47, deze kan niet worden gebruikt voor TEM analyse en structuurbepaling.

De bereiding van nanodiscs begint door het mengen van MSP met lipide gesuspendeerd in het wasmiddel natriumcholaat. Na incubatie op ijs gedurende 1 uur, wordt het detergens langzaam uit de reconstitutie mengsel met een adsorbens hars. Dit soort materiaal wordt vaak gemaakt van polystyreen gevormd tot kleine kralen. Ze zijn relatief hydrofoob en hebben een sterke voorkeur voor binding detergent ten opzichte van lipiden 48. Na verwijdering van het hydrofobe kralen en uitvoeren klaring door middel van centrifugatie worden de nanodiscs gezuiverd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). De gezuiverde nanodiscs worden gemengd met een monotopic membraaneiwit (en eventuele cofactoren) in een equimolaire ratio (ratio of meerdere voor een titratie) en worden overgelaten aan rEACT (15 min). Analyse door TEM wordt uitgevoerd door het toepassen van ul-hoeveelheden van het monster op glow-ontladen, koolstof beklede roosters en vervolgens door het uitvoeren van negatieve kleuring met NAPT uitgevoerd. Hetzelfde monster uit als de hoeveelheden werden toegepast op de TEM roosters kan worden gebruikt voor analyse door niet-denaturerende of SDS PAGE-gel-elektroforese, en door verschillende soorten activiteitsmetingen, zonder grote veranderingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van nanodiscs

  1. Expressie en zuivering van het membraan eiwit steigers 8, 35
    1. De His-tag MSP1E3D1 in de E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 stam in kolven te uiten. Bereid een 50 ml overnacht starterkweek met LB medium aangevuld met 50 ug / ml kanamycine bij 37 ° C. Verdun de nacht startercultuur in 2 L van geweldige kweekmedium gesupplementeerd met 50 ug / ml kanamycine.
    2. Groeien de cellen bij 37 ° C totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600) er ongeveer 3. induceren de eiwitexpressie met 0,5 mM isopropyl-β-D-1 (IPTG) gedurende 3 uur bij 18 ° C.
    3. Bereid de lysisbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl en 10% glycerol). Voeg 1 mM TCEP onmiddellijk voor gebruik.
    4. Na 3 uur van inductie bij 18 ° C, verzamel de cellen door centrifugatie gedurende 10 min bij 4500 xgen 4 ° C. Verwijder het supernatant, wegen de geoogste cellen en hersuspenderen ze in lysisbuffer in een verhouding van 2 ml lysisbuffer per gram cellen.
    5. Lyse van de cellen door gepulste geluidsgolven (herhalingsfrequentie: 4 s ON, 4 s OFF) gedurende 3 minuten bij 80% amplitude.
    6. Centrifugeer de lysaten gedurende 20 minuten bij 49.000 xg en 4 ° C. Gooi de pellet uit deze centrifugatie.
    7. Injecteer de supernatant in een 5 ml Ni + chelerende kolom verbonden met een geautomatiseerd Vloeistofchromatografiesysteem voorkeur bewaard bij 4 ° C.
    8. Voordat de elutie (stap 1.1.9), was de kolom met buffers 1 - onder de 3 om alle eiwitten te verwijderen met uitzondering van de His-tag MSP. Monitor het eiwitgehalte bij 280 nm om de zuivering te volgen; de UV-opname bij 280 nm moet terug naar de baseline gaan na elke wasbeurt.
      1. Wassen met wasbuffer 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, en 1% Triton, pH 8,0.
      2. Wassen met wasbuffer 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, 20 mM imidazool en 50 mM natriumcholaat, pH 8,0.
      3. Wassen met wasbuffer 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl en 50 mM imidazool, pH 8,0.
    9. Elueer het MSP met 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCI en 500 mM imidazol, pH 8,0.
    10. Verander de buffer standaard buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl en 0,5 mM EDTA) MSP met gelfiltratie 8, 35; de opbrengst per batch duurt ongeveer 7 mg L -1.
  2. Bereiding van fosfolipiden stockoplossing
    1. Voeg 305 ul van 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) opgelost in chloroform bij een concentratie van 25 mg / mL aan een glazen beker en verdampen van het chloroform door spoelen met een zachte stikstofstroom . Droog het lipide overnacht in een vacuümexsiccator. Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd om het oplosmiddel uit het lipide, dat een dunne film van lipide bladeren onderaan een bekerglas verwijderd.
    2. Resuspendeer het lipide cake in 200 pl MSP standaard buffer die 100 mM natriumcholaat door vortexen de buis tot de oplossing transparant; Dit zal een oplossing met een POPC concentratie van 50 mM te verschaffen.
      OPMERKING: 2 (lipide: detergent) 8 In het algemeen is de molaire verhouding van lipide detergentia op dit moment moet 1 zijn. Deze lipide-detergens mengsel kan bijna 2 maanden worden bewaard bij -80 ° C.
  3. Bereiding van hydrofobe kralen voor detergensverwijdering
    1. Plaats 5 g kralen (droog gewicht) in een 50 ml buis.
    2. Was de kralen met 30 ml 100% methanol en vervolgens met 40 ml ultrazuiver water.
    3. Was de kralen met 10 ml MSP standaard buffer. Tenslotte worden opgeslagen kralen met 15 ml MSP standaard buffer bij 4 ° C.
  4. nanodisc reconstructie
    1. Doseer 190 ul van MSP1E3D1 (0,124 mm) in een microfugebuis en voeg 61,5 ul van fosfolipiden voorraad-oplossing (50 mM POPC) dezelfde buis. Incubeer de reconstitutie mengsel op nat ijs gedurende 1 uur. LET OP: Dit komt overeen met een molaire verhouding van 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. Voeg hydrofobe kralen aan een concentratie van 0,5 g korrels per ml reconstitutie mengsel aan de zelfassemblage te starten. Incubeer in een roterende incubator gedurende 16 uur bij 4 ° C.
    3. Na incubatie, centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 xg en 4 ° C om de precipitaten en aggregaten te verwijderen. Gooi de pellet en sla het supernatant.
    4. Equilibreren de size exclusion chromatografie kolom (gemonteerd op een geautomatiseerd Vloeistofchromatografiesysteem) met MSP standaard buffer totdat de absorptie bij 280 nm stabiel. Spuit de bovenstaande vloeistof in de kolom en het verzamelen van de piek fracties.
    5. Meet de concentratie van nanodiscs in de piekfracties bij 280 nm. Gebruik de molaire extinctiecoëfficiënt van MSP1E3D1 (ε = 29.910 cm -1 -1 M) voor het berekenen van de concentratie nanodisc. Merk opaantal lipiden per nanodisc kan worden gemeten door een combinatie van radioactief gemerkte lipiden en fosfaatanalyse 4 of fosfaatanalyse alleen.

2. Bereiding van de Monotopic Protein 5-Lipoxygenase 35

  1. Bereid een overnachting starter cultuur. Supplement 50 ml LB medium met 100 ug / ml ampicilline. Beënten medium met E. coli BL21 (DE3) die het plasmide van de 5-lipoxygenase gen (ALOX5). Verdun de nacht startercultuur in expressie medium dat 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mM KH 2PO 4, 9 mM NaCl, 19 mM NH4 Cl, 1 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, 0,2% D-glucose, 0,1 %, 5 pM FeSO 4 en 100 gg / ml ampicilline. Groeien de cellen tot de OD 600 is ~ 0,5 bij 25 ° C. Induceren van eiwitexpressie met 0,2 mM IPTG gedurende 16 uur bij 20 ° C 35.
  2. Oogst door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 7000 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant. Weeg de pellet onderaan van de buis met het geoogste cellen en resuspendeer de geoogste cellen in lysisbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glycerol en 1 mM TCEP) met proteaseremmer en 0,5 mg / ml lysozym 35 in een verhouding van 2 ml lysisbuffer per gram cellen.
  3. Lyseren de cellen door sonicatie gedurende 5 x 15 s bij 80% amplitude. Verwijder de celresten door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 7000 xg en 4 ° C. Voer ammoniumsulfaatprecipitatie tot 30-60% verzadiging om de eiwitten neer te slaan in de oplossing 35. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 16.000 xg en 4 ° C. OPMERKING: De 5LO korrel kan snel worden ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C maximaal 6 maanden.
  4. Resuspendeer de pellet met 20 ml lysisbuffer en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 40.000 xg en 4 ° C.
  5. Incubeer de supernatant op een ATP-agarose-kolom bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was de kolom eenmaal met één kolom volume lysis buffer die 0,5 M NaCl. Elueer het 5LO met 20 mM ATP in lysis buffer die 10 uM FeSO 4 en 20 ug / ml catalase. Voer gelfiltratiechromatografie de ATP 35 verwijderen.
    NB: De 5LO is instabiel en moet onmiddellijk worden gebruikt na zuivering. Anders is het raadzaam om te stoppen bij de stap van het ammoniumsulfaat neerslag (zie de opmerking na stap 2.1.3).

3. Bereiding van de nanodisc-eiwit Complex

  1. Bereid een totaal volume van 100 ui complex. Meng 0,8 uM en 0,8 uM ND 5LO met 1 mM Ca2 + in de MSP standaard buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA en 1,5 mM CaCl2) en incubeer gedurende 10 min op ijs. Opmerking: Het monster kan worden opgeslagen gedurende één maand bij 4 ° C 35.
ove_title "> 4. Analyse van de monsters

  1. gelelektroforese
    1. Niet-denaturerende elektroforese
      1. Mix 15 pi van het monster met 5 gl laadbuffer (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) glycerol en 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 en laad een 4 - 16% Bis-Tris gel aan elektroforese voeren.
      2. Vul de kathode tank met licht kathode buffer (50 mM Bis Tris, 50 mM Tricine, pH 6,8 en 0,002% Coomassie G-250) en de anode tank met loopbuffer (50 mM Bis Tris en 50 mM Tricine, pH 6,8). Start de scheiding met behulp van een constante spanning bij 150 V.
      3. Stop de elektroforetische scheiding wanneer de Coomassie achterkant einde van de gel bereikt.
      4. Vlekken op de gel met een standaard Coomassie blauw protocol.
    2. denaturerende elektroforese
      1. Meng 40 pl monster met 10 gl laadbuffer bevattende SDS (0,05% (w / v) broomfenolblauw; 0,2 M Tris-HCl,pH 6,8; 20% (v / v) glycerol; 10% (w / v) SDS; en 10 mM 2-mercaptoethanol) en plaats het op een 4-20% Tris-glycine gel elektroforese voeren.
      2. Vul de kathode en anode tanks met loopbuffer (25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM glycine en 0,1% (w / v) SDS). Start de scheiding met behulp van een constante spanning bij 150 V.
      3. Stop de elektroforetische scheiding wanneer het laden kleurstof achterkant einde van de gel bereikt.
      4. Vlekken op de gel met een standaard Coomassie blauw protocol.
  2. Voorbereiding van de NAPT oplossing
    1. Los 1 g fosfowolframaat natriumzout in 50 ml water door roeren bij kamertemperatuur tot een 2% (w / v) zure oplossing.
    2. Breng de pH op 7,4 met 1 M NaOH. Verwijder de deeltjes onder toepassing van een 0,22 urn spuitfilter. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur of bij 4 ° C.
  3. Voorbereiding van het monster voor TEM analyse
    1. Glow-ontlading koolstof beklede koperen roosters (400 mesh) gedurende 20 s bij 30 mA tot de netwerken hydrofiele vóór de adsorptie van het monster maken. Plaats 3,5 pi van het monster (0,8 uM opzichte van de nanodiscs) op het net en incubeer gedurende 30 s. OPMERKING: De toegepaste hoeveelheid kan variëren tussen 2,5 en 5 pl, afhankelijk van de monsterconcentratie. Een geschikt concentratiegebied voor nanodiscs is 0,5-1 uM.
    2. Blot off overtollige oplossing met behulp van papieren filter.
    3. Onmiddellijk vlek het raster met een druppel van 2% NAPT gedurende 30 s. Dep het overtollige oplossing en laat het rooster aan de lucht drogen.
    4. Evalueer de roosters met TEM. Een microscoop met 120-200 keV versnellende spanning is voldoende om een ​​schatting van de omvang van het stapelen. LET OP: Voor het huidige protocol, werd een geijkt transmissie-elektronenmicroscoop gebruikt, uitgerust met een 200-keV veldemissie pistool.
    5. Noteer de TEM beelden. Voor de beelden die lange stapels, niet verder te verwerken; beelden tonen het complex van nanodiscs met extrinsieke eiwit dat een paar bevattenshortstacks, maar de meeste deeltjes in het complex. Opnemen verschillende beelden en deze werkwijze volgens standaardmethoden klasse-gemiddelden en een lage resolutie, 3 dimensionaal model van het complex te verkrijgen.
      LET OP: Voor het verzamelen van negatieve vlek data, werden roosters op minstens drie verschillende dagen. Voor elke dag, werden vers monster incubaties (zoals in stap 3.1) vóór de negatieve vlek werd toegepast.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De werkwijze die we voorstellen is afhankelijk van de opstelling van nanodiscs op het membraanoppervlak voor monotopic membraan-eiwitbinding verschaffen. Aangezien er geen transmembraaneiwit ingebed in de nanodisc lipide bilaag, worden de nanodiscs hier aangeduid als "lege nanodiscs" (Figuur 2A). Deze hebben een berekend molecuulgewicht van 256 kDa voor een samenstelling van twee MSP1E3D1 steigers eiwitten en ongeveer 260 moleculen van POPC 8. Gebruik van deze eiwitten: lipideverhouding voor reconstitutie, één grote piek (figuur 2A) werd geëlueerd tijdens gelfiltratie. De piek fracties rond 9 ml (Figuur 2A) werden onderzocht door blauwe inheemse gelelektroforese 49, die één band (Figuur 2B, baan 1). Hoewel de band overeenkomt met een afmeting enigszins groter dan de berekende 256 kDa, de nanodisc diameter gemeten in de TEM beelden overeenkomt met deverwachte 13 nm ± 0,5 nm.

De monotopic membraaneiwit 5-lipoxygenase (5LO) werd gezuiverd zoals hierboven (Protocol stap 2) en verder beschreven eerder 35. De homogeniteit van het 78-kDa 5LO werd geanalyseerd door SDS PAGE elektroforese (Figuur 2C, baan 1) en was volledig functionele 35 (niet getoond).

In dit protocol worden voorwaarden opzettelijk gecreëerd dat de stapeling van de nanodiscs promoten. Er moet echter worden opgemerkt dat deze stapeling geïnduceerd enkel de Bij TEM beeldvorming (zogenaamde monsters) monsters, met name door de toevoeging van de negatieve vlek natrium fosfowolframaat als laatste stap nadat alle andere behandelingen en toevoegingen waren gemaakt. In feite, de afbeeldingen NAPT-gekleurde nanodiscs tonen de verwachte stapeling (Figuur 3A) zeer vroeg HDL 34 5, 50. De "lange stapels munten van de zijkant" (Figuur 3A) zijn de nanodiscs samengevoegd met fosfowolframaat geïntercaleerd tussen de dubbellagen, zoals schematisch weergegeven in figuur 1A en Zhang et al voorgesteld. 32, 39.

Het is belangrijk na te gaan of verschillende toevoegingen in de buffers beïnvloeden, voorkomen, of zelfs stapelen induceren, en zoals hierna zal blijken, de effecten van calciumionen vereist onderzoek. In figuur 3B, de stapeling nog aanwezig in een monster waarin calciumionen de nanodisc oplossing werd vóór kleuring met NAPT.

De essentiële stap in het protocol wordt getoond in figuur 4, waarbij de membraan-binding eiwit is aanwezig in de oplossing. De stapeling kan niet worden veroorzaakt door de NAPT vlek toen 5LO werd gebonden aan het membraanoppervlak van het nanodiscs (Figuur 4A). Voor dit exemplaar, de molverhouding van 5LO tot nanodiscs was 1: 1, zoals schematisch (rechts Figuur 1B, onder) weergegeven in figuur 1. Zoals de lipide bilaag van het nanodiscs is vanuit beide kanten, anders dan liposomen, exemplaren met de verhouding van twee 5LO een nanodisc bereid, terwijl de TEM beelden tonen nog minder stapeling (figuur 4B).

Voor binding zou extrinsieke membraaneiwitten afhankelijk van de aanwezigheid van een specifieke lipide in het membraan, zoals phosphoinositols 10, 11, 12 of 10 fosfatidylserine. Bij 5LO, de aanwezigheid van Ca2 + is noodzakelijk 43. In figuur 4A en B waren calciumionen aanwezig in de oplossingen nanodiscs en 5LO. Met andere woorden, het ontbreken van het stapelen niet alleen aantoont dat de monotopic eiwit gebonden, maar ook dat de binding afhankelijk van Ca2 + -ionen. Om dit aan te tonen werd een oplossing die nanodiscs en 5LO zonder calcium werd gekleurd met NAPT en afgebeeld door TEM (Figuur 4C). Zoals verwacht, kan 5LO niet binden aan de nanodiscs zonder Ca2 +, waardoor de 5LO vrij in de oplossing, zodat de stapel nanodiscs plaats (Figuur 4C).

Figuur 1
Figuur 1. Principe van nanodisc Stapelen en Overzicht van de methode. A. Principe van nanodisc stapelen. De toevoeging van de negatieve vlek natrium fosfowolframaat aan een oplossing van nanodiscs (links) tot th e stapelen van de nanodiscs (rechts) als gevolg van elektrostatische krachten (midden, pijlen) tussen de fosfolipiden dubbellaag en de PT-moleculen (midden, zwarte stippen). B. Schematische weergave van het protocol. Lege nanodiscs (links) binden aan een membraaneiwit extrinsieke (grijs) om een ​​complex te vormen, afgebeeld vanuit vier hoeken (onderste midden). De aanwezigheid van de monotopic eiwit voorkomt sterisch de nanodiscs van stapelen na kleuring met de fosfowolframaat zout (rechtsonder), in tegenstelling tot het stapelen ontstane bij afwezigheid van grote objecten (rechtsboven). De groen- en oranje ringen vertegenwoordigen de twee MSP wikkelen rond de fosfolipide kern, die is weergegeven in lichtbruin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

jpg "/>
Figuur 2. De homogeniteit Analyse van nanodiscs en 5LO. A. Grootte uitsluitingschromatografie van opgeloste lege nanodiscs. De elutie van de nanodiscs pieken bij 9 ml. B. Niet-denaturerende gel elektroforetische analyse van de piekfractie van de SEC getoond in (A). Lane M bevat de markering. Een enkele band is aanwezig in baan 1, waarbij de piek fractie op 9 ml werd geladen. C. Denaturing gel elektroforetische analyse van gezuiverd 5LO. De 78 kDa 5LO toont als een intense band in baan 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Vorming van de Stapel van nanodiscs in de afwezigheid van eiwit geanalyseerd door TEM. A. nanodisc stapelen werd geïnduceerd wduivin gekleurd met NAPT. De "stapels muntstukken" zijn de stapels nanodiscs wanneer bekeken vanaf de zijkant. Elke nanodisc verschijnt als een witte band. B. Stapelen niet gestoord door de aanwezigheid van calciumionen in de oplossing nanodisc na kleuring met NAPT. De omvang bars zijn 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Het voorkomen Stack Vorming door de binding van proteïne in aanwezigheid van een cofactor Geanalyseerd met TEM. A. en B. calciumionen aanwezig in mengsels van 5LO en nanodiscs bij molaire verhoudingen van 1: 1 (A) of 2: 1 (B). Hoe meer 5LO binding aan de nanodiscs, hoe minder nanodiscs zijn gestapeld, zoals in (B). De single-deeltje complexen in both (A) en (B) zijn geschikt voor verdere verwerking 35. C. Bij afwezigheid van calciumionen, kan 5LO binden. NAPT kleuring van deze steekproef toont typische stapelen van nanodiscs, het verlaten van de 5LO ongebonden. De omvang bars zijn 100 nm. De beelden werden verworven door een 4K x 4K CCD-camera bij een vergroting van 69,500x. De pixelgrootte van de CCD camera 15 urn, waarbij een overeenkomstige waarde van 2,16 Å geeft op het specimen niveau de EM beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De werkwijze kan worden onderverdeeld in drie delen: de reconstructie van lege nanodiscs, de bereiding van eiwit-complexen nanodisc en de negatieve kleuring voor de TEM van deze complexen. Elk onderdeel zal afzonderlijk worden behandeld met betrekking tot beperkingen van de techniek, kritische stappen en nuttige wijzigingen.

Reconstructie van lege nanodiscs. Kritische stappen en beperkingen in de productie en het gebruik van nanodiscs.

Voor de bereiding van de lege nanodiscs, is het essentieel om de MSP-to-lipideverhouding optimaliseren. Voor de meest voorkomende MSP en lipiden (met cholaat als detergens) kan voorstellen voor de optimale verhoudingen te vinden in de literatuur (bijvoorbeeld, 125-130 POPC per MSP1E3D1 8, 51 in de onderhavige protocol). Verschillen verkregen in vergelijking met de gepubliceerde verhouding kan afhangen van de werkwijze voor eiwitconcentratie bepalen het rendement van lIPID solvatatie in het wasmiddel en de wijze van detergens verwijderd uit de oplossing.

Wij stellen detergensverwijdering voeren met hydrofobe kralen 48 (stap 1,3), terwijl mogelijke alternatieven dialyse of de toevoeging van cyclodextrine 52, 53. Aanvankelijk werd dialyse gebruikt voor de reconstitutie van HDL 5, 34 en nog liever 54. Ongeacht de werkwijze voor het verwijderen detergens, snelheid essentieel. Indien de overbrenging te snel (de hoeveelheid hydrofobe kralen te groot is), kan de spontane omlegging van MSP met de lipiden niet tijd optreden hebben. In plaats daarvan, kunnen grote hoeveelheden liposomen en eiwit aggregaten. De resultaten van grootte-uitsluitingschromatografie zou grote hoeveelheden liposomen tonen in het lege volume, een suboptimale piek van bereide nanodiscs, en een grotere piek van ongebruikteMSP 4, 6, 51. Voor een te kleine hoeveelheid hydrofobe kralen, kan het detergens verwijderd onvolledig zijn en de nanodiscs die vorm kan een variatie in grootte, waar de meeste zijn kleiner dan verwacht tonen. Men kan twee toevoegingen van kleinere hoeveelheden hydrofobe kralen in plaats van één grote toevoeging testen te vertragen de snelheid van de reconstructie.

De keuze van lipiden moet zorgvuldig overwogen 8, 9, 45, 46, 55, afhankelijk van het doel voor de bereiding nanodisc. In het algemeen, alle werkwijzen gericht op de vorming van membranen (reconstitutie van nanodiscs of liposomen, alsmede voor 2D kristallisatie-experimenten), moeten de lipiden in een "fluïdum" toestand 56. Beneden een bepaalde temperatuur, the lipide stijf. Boven dit zogenaamde overgangstemperatuur (Tm), de lipide vloeibaar. Merk op dat sommige veelgebruikte verzadigde vetten hebben een Tm ruim boven kamertemperatuur. Verder is het voor lipidemengsels, de mengbaarheid van lipiden muze worden beschouwd 57. De optimale temperatuur voor nanodisc vorming rond de faseovergang (Tm) van het lipide.

Het wasmiddel in het huidige protocol is natriumcholaat 8. Als een product moet worden gebruikt, dezelfde concentraties als die toegepast voor cholaat kunnen niet direct worden gebruikt. Bepaalde milde detergentia oplossen lipiden minder efficiënt, en een hogere concentratie nodig zijn. De lipide koek verkregen na het verdampen van de chloroform (stap 1.2.2 in het protocol) worden opgelost in een heldere oplossing van het detergens. Vortex, vries-dooi cycli, ultrasone baden of sonicatie kan worden gebruikt om het oplossen te versnellen.

voor combinationen van lipide (-mengsels), MSP, en andere dan de hier gebruikte titraties om grote aggregaten en liposomen of overtollige MSP minimaliseren wasmiddelen nodig 4, 6, 51, 58. Voor sommige combinaties van MSP en fosfolipiden, kan de optimalisatie moeilijker dan voor andere 4, 6, 51, en wordt het essentieel om de inhoud van de piekfracties bepalen. De meest nauwkeurige werkwijze voor de analyse van nanodisc samenstelling en grootte is het aantal fosfolipiden per MSP bepalen fosfaatanalyse 4 en bereken de nanodisc molecuulgewicht. Nanodisc grootte kan worden geschat door goed opgelost, niet-denaturerende gelelektroforese; dynamische lichtverstrooiing (DLS) 59; of negatief-vlek TEM, om er maar een paar methodes. Wat betreft de negatieve vlek geïnduceerde stapelen gepresenteerde protocol hier, het meten van de breedte van de in de TEM beelden stacks geeft de diameter van de nanodiscs.

Wat betreft de expressie en zuivering van het membraan steiger eiwit zouden alle normale voorzorgen en zorgen voor een oplosbaar eiwit worden. De plasmiden beschikbaar kunnen verschillende labels en protease-splitsingsplaatsen bevatten indien het label moet worden verwijderd alvorens het MSP.

5LO, de monotopic eiwit gebruikt in het protocol, inactiveert snel tenzij voorzorgsmaatregelen worden genomen, elders 35 beschreven en in de referenties daarin. Kortom, de katalytische ijzer gemakkelijk verloren, en oxiderende omstandigheden kan dimerisatie van de 5LO veroorzaken. Zoals vermeld in de notitie (protocol stap 2.1.3), kan de zuivering worden stopgezet na het neerslaan stap en hoeveelheden opgeslagen totdat later gebruik. Na de zuivering van een monster, moet het eiwit worden gebruikt binnen enkele uren d UE de snelle inactivering 35.

Kritische stappen bij de bereiding van de proteïne-nanodisc complexen.

De grootte van de monotopic eiwit versus de nanodisc gebied van belang. De lengte van de MSP1E3D1 eiwitketen overeenkomt met een nanodisc met een 10,5 nm binnendiameter en ongeveer 8900-A 2 bilaag gebied 8. Dit komt goed overeen met de gerapporteerde het membraan embedded met 5LO 45 gebied. Aldus onze verwachte bindende verhouding 1: 1 of ten hoogste 2: 1 5LO per nanodisc. Dit bleek juist te zijn, zoals gerapporteerd in een titratie experiment 35. Echter, de maximale binding van twee 5LO per nanodisc verkregen, zoals elders 35 besproken. Een iets grotere nanodisc zou kunnen zorgen voor een volledige 2: 1 binden experimenten waarbij dit gewenst is, maar in dit geval is de 1: 1 verhouding is het hoofddoel.

ove_content "> De keuze van de optimale lipiden voor eiwit-nanodisc complexvorming kan worden geholpen door voorkennis. Dit was het geval in het huidige protocol, waar de keuze van lipide was synthetische POPC 35. Beide variaties in de lipide hoofdgroep 46 en variaties in de verzadiging van de acylketens 45 werden getest in liposoom-5LO bindingsstudies. 5LO activiteit werd verhoogd bindend liposomen die choline fosfolipiden onverzadigd in de sn-2 acylketens positie 45, 46. Als specifieke lipide niet bekend, maar de identiteit van de oorspronkelijke membraan bekend, natuurlijke lipide extracten kan worden eerst getest 55.

Een cofactor afhankelijkheid is bekend 5LO, die afhankelijk is van Ca2 + ionen membraanbinding 43. Het is een uitdaging om calcium volledig te verwijderen uit oplossingen. Hier, de complexvormer EDTA aanwezig in de buffers in hoeveelheden aangepast om een gecontroleerde hoeveelheid vrij Ca2 + -ionen verlaten. Berekeningen van vrije en gebonden moleculen in de buffers die door de slechte 60 software voor buffers die meer dan één type complexvormer 35. Het effect van de concentratie van een cofactor gedeeltelijk oplosbaar in het membraan niet te verklaard door deze software.

Kritische stappen in de negatieve kleuring van nanodiscs tot stack vorming te promoten.

Voor het protocol bij de hand, waarbij maximale stapelen gewenst is, dient de vlek het natriumzout van phosphotungsten zijn. Verschillende zouten van wolfraam zijn, en we geconstateerd dat fosfowolfraamzuur minder efficiënt stapelen (niet getoond). Om onduidelijke redenen, lijkt het erop dat grote hoeveelheden natrium tijdens PT vlekken bevordert stapelen. Ook de monsterbuffer werd aangetoond dat hoe lager de natrium- content, hoe lager de hoeveelheid van geïnduceerde stapelen 32. Om dezelfde reden, nadat het monster is aangebracht op de EM rooster moet water wassen vóór kleuring niet worden uitgevoerd, omdat dit vermindert ook stapelen. Aan de andere kant werd een aantal stapelen altijd opgewekt, hoewel niet in de mate die nodig is voor de beste prestaties van het protocol.

Natuurlijk moet cofactoren zoals Ca2 + -ionen hier gecontroleerd interferentie met de negatieve beits of het nanodiscs. Voor het huidige protocol, zou calciumionen hebben neergeslagen een fosfaatbuffer, zodat een Tris buffer werd gebruikt. De nanodiscs waren niet gestapeld door Ca 2+ -ionen per se, zoals gecontroleerd met behulp van een ander negatief vlek, uranyl formiaat 35, noch calcium voorkomen NAPT-geïnduceerde stapelen (Figuur 3B).

Voor een kleine monotopic eiwit, de extra grootte toegevoegd door te binden aan een nanodisc kan dit aantoonbaar in cryoEM maken. EENnanodisc zeer groot in vergelijking met het eiwit niet optimaal zijn, als een klein eiwit op grote nanodisc Mogelijk voorkomt stapelen. Echter, de vorm van de extrinsieke eiwitten invloed hebben. Hoewel er geen exacte gegevens kunnen worden verstrekt vanaf nu, is een nanodisc bilaag oppervlak slechts iets groter dan de geschatte binding oppervlak van het eiwit aan te bevelen. Met deze beperking, zou de maximale eiwitbinding één eiwit aan weerszijden van de nanodisc zijn.

Algemene beperkingen en voordelen van de werkwijze.

Het protocol is afhankelijk van de beschikbaarheid van een TEM en de bijbehorende apparatuur, die niet in alle laboratoria. Echter, een 120- tot 200-kV elektronenmicroscoop uitgerust met een traditionele CCD camera ruim voldoende voor de detectie van stapelen zijn. De NAPT negatieve kleuring wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur en de roosters bij deze temperatuur om later te bekijken worden opgeslagen.

TEM imagING zou al snel blijken of de stapeling niet is verhinderd of. Voor de beelden die eiwit-nanodisc complexen (bijvoorbeeld figuur 4A en B), zodanig aan structurele informatie te verkrijgen kan worden uitgevoerd. Structurele details van een negatief gekleurd monster kan 1 nm bereiken en kan nuttig zijn structurele informatie 29 verschaffen. In laboratoria gewijd aan de bepaling te structureren door cryoEM, de negatieve kleuring van monsters is standaard procedure. Het gebruik van ons protocol zou een snelle en eenvoudige Naast normale procedures.

Sommige monotopic eiwitten zijn verankerd aan het membraan door myristoylatie, palmitoylatie, of hydrofobe vlekken op het proteïne oppervlak, waardoor het noodzakelijk is de nanodisc-eiwitcomplex volgens dezelfde procedure als bij de opname van een transmembraan eiwit in nanodiscs 13 vormen. Hier, één van de subeenheden in het eiwitcomplex bevat amyristoylation op een flexibele N-terminale staart voor membraan bindend. Voor uranyl-acetaat gekleurd TEM beelden werd gesteld dat het eiwitcomplex loodrecht is gebonden aan het membraan, en niet aan de kant van de nanodisc. Dit en andere resultaten bevestigden een rigide structuur van het membraan 13 bevestiging. Voor deze binding, NAPT kleuring volgens onze voorgenomen protocol zou hetzelfde gelijkmatig verspreid enkele deeltjes laten zien. Indien de bevestiging via een flexibele keten was, de uranyl acetaat kleuring mogelijk geen duidelijk resultaat opgeleverd. We speculeren dat flexibele ketting membraan- gebonden eiwit complexen, kan de kleuring NAPT de nanodiscs induceren te stapelen, waaruit de typische "stapel muntstukken," maar nu ingericht door de bijgevoegde eiwit aan de zijkanten.

Waarom gebruiken nanodiscs als liposomen kunnen worden gebruikt? Het optimaliseren van lipiden, cofactoren of andere parameters kunnen goed worden getest in liposomen voor de binding van peripheral eiwitten (cf. 5LO). NAPT-geïnduceerde stapeling van liposomen is aangetoond 32, zodat een monotopic eiwit kan liposoom stapelen voorkomen. De afmetingen van liposomen in vergelijking met eiwitten monotopic en nanodiscs komt ook in het spel. Een grote extrinsieke eiwitten in staat zijn om het stapelen van liposomen te voorkomen dat een klein eiwit, zoals de 78-kDa 5LO, misschien niet indien aanwezig in hoge aantallen per liposoom. Kleine liposomen kunnen worden bereid, maar hoe kleiner het blaasje, hoe sterker de kromming van het membraan. De nanodisc dubbellaag is plat. Testen van diverse parameters met nanodiscs lopen minder rendabel vanwege de MSP. Anderzijds, voor liposomen, bepaalde duur cofactoren of substraten die gedeeltelijk verdelen in het membraan en verder, in het inwendige van de liposomen kunnen worden in grotere hoeveelheden nodig. Concluderend, de nanodisc platform verschaft de mogelijkheid van het kiezen van een bepaald gebied voor binding nauwkeurig n omber van eiwitten. De dubbellaag is toegankelijk vanaf beide zijden vlak.

Betekenis van de werkwijze.

Het bepalen van de 3D-structuur van eiwitten of complexe macromoleculen visualiseert de werking van cellen. In deze drukke omgeving, specifieke eiwitten zijn actief op membraanoppervlakken, alleen of in complex met andere eiwitten, maar meestal zo dat de fysieke interactie met componenten in de lipide bilaag van de mechanistische functies. Voor sommige eiwitten, wordt de conformatie in oplossing veranderde na inbedding membraan, terwijl andere zijn vastgebonden aan het membraan maar niettemin veranderen conformatie en oriëntatie op het membraan door een of trekker. Een hydrofoob substraat intredebaan kan open of een conformatie die het mogelijk maakt binding aan een transmembraaneiwit optreden. Om de structuur te verkrijgen, of althans structuurinformatie van deze perifere eiwitten gebonden aan het membraan is een uitdaging.

jove_content "> nanodiscs werden gebruikt in enkele studies inzake oriëntatie en functie membranen 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Cytochroom P450, centraal ontgifting, is verankerd aan het membraan door een α-helix en bevat een heemgroep in het bolvormige deel, waardoor lineair dichroïsme metingen 15. de resultaten gaven een oriëntatie van het heem ten opzichte van het membraan nauw overleg met simulaties gemaakt, waardoor andere conclusies van simulaties van het membraan ingebedde cytochroom P450 versterken. een GTPase verankerd aan het membraan een kleine nanodisc zou NMR studies twee te inventariseren op eiwit met een membraan-interface en verder elke hoe nucleo getijde binding induceerde een overgang van één interface naar de andere 17. Mutaties en effector binden, en GTP binding bestudeerd in een GTPase van de Ras-superfamilie met een aantal effecten op activiteit die afhangt van de oriëntatie op het membraan, dat oncogene signalering 16 zou beïnvloeden vinden. 5LO heeft een oplosbare conformatie 61 en vereist calcium voor de binding op nucleaire membranen 43. Gebruik reus unilamellaire liposomen werden gepolariseerd, verzwakte totale reflectie-infrarood experimenten uitgevoerd 46. Het resultaat impliceert dat de N-terminale β-barrel bindt aan membranen met de symmetrieas van de β-barrel gekanteld ongeveer 45 graden van de normale membraan. 5LO het C-terminale domein is een nagenoeg cilindrisch α-helix bundel en dit werd voorgesteld om te binden met de lange as evenwijdig aan het membraan 45,= "xref"> 46. In ons eerdere werk op 5LO ingesloten op nanodiscs, het gebied van de bilaag werd besloten één 5LO per zijde mogelijk maken met de hierboven voorgestelde oriëntatie 35. De TEM beelden bevestigden deze oriëntatie, zij het op lage resolutie 35. Indien, bijvoorbeeld, werd alleen de N-terminale β-barrel gebonden maar het C-terminale domein, een hoger aantal 5LO per nanodisc zou zijn verkregen. Bovendien kan een ander eiwit de membraanbinding en oriëntatie van 5LO wijzigen, zoals een activator, het transmembraaneiwit 5-lipoxygenase activerend eiwit, FLAP. FLAP is opgelost in nanodiscs, en we gebruiken TEM en andere methoden om de interactie tussen FLAP en 5LO bestuderen. Hun interactie resulteert in endogene arachidonzuur wordt omgezet in leukotriene A4, die de eerste stap in de synthese van krachtige chemoattractanten betrokken bij vele ontstekingsziekten 41, 42 sup>, 62.

De 5LO-nanodisc complex is berekend dat een molecuulgewicht van 334 kDa, bij de grens van ongeveer 200 kDa structurele onderzoek door cryoEM. Niettemin, als de atoomstructuur van 5LO beschikbaar is 61, zijn docking in een middelgrote resolutie, 3-dimensionale elektronendichtheid kaart zou ook informatie over de interactie met de nanodisc membraan.

Innovaties in cryoEM technologie niet alleen duwen besluit tot atomair niveau 63, maar ook het duwen van de limiet tot kleinere eiwitten. Voor structuurbepaling met behulp van NMR 22, de situatie is het tegenovergestelde, omdat het doel is om de orde van grootte, die nu nadert 200 kDa verhogen. Onlangs heeft het membraan binding van kleine GTPase eiwitten werden onderzocht met NMR 16, 17. Deze eiwitten, slechts ongeveer 20 kDa, were gebonden aan kleine nanodiscs van 7,6 nm binnendiameter, vormen complexen van ongeveer 130 kDa. In de toekomst zou even grote complexen worden onderzocht met zowel NMR en cryoEM verschillende aspecten van membraananker binding helderen.

Een uitbreiding van het protocol zou kunnen zijn nanodiscs die een transmembraaneiwit (TMP) in nanodisc bilaag onderzoeken. NAPT-geïnduceerde stapelen van de TMP-nanodiscs kan worden vergeleken met lege nanodiscs die dezelfde lipidesamenstelling. Grote extramembranous loops zou stapelen te voorkomen, terwijl de korte loops kan niet voorkomen dat het stapelen van 64. Dit kan worden omgezet in een voordeel, aangezien het protocol kan worden gebruikt om eiwitten specifiek te binden aan de transmembraan eiwit te onderzoeken.

Het voordeel van deze methode is dat het membraan interactie direct kan worden gevisualiseerd. De relatieve eenvoud van het maken van grote hoeveelheden lege nanodiscs impliceert dat men zich kan uitstrekkenDeze werkwijze voor het screenen op verschillende omstandigheden zoals pH, temperatuur, buffers en cofactor afhankelijkheid van monotopic eiwitbinding. In feite, terwijl de nanodisc platform 9 is ontwikkeld voor de stabilisatie van transmembraan eiwitten en ook gebruikt voor dit doel, zijn potentieel voor studies van het grote aantal min of meer tijdelijk-bindende extrinsieke eiwitten aanwezig in cellen duidelijk worden bewaard in gedachten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs danken de Zweedse Research Council, Stockholm County Council, en KI fondsen voor hun steun. De expressie en zuivering van MSP werd uitgevoerd bij het Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Science Core Facility (http://PSF.ki.se). De auteurs willen ook graag bedanken Dr. Pasi Purhonen en Dr. Mathilda Sjöberg voor het delen van hun technische expertise en voor de tijdige hulp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

Biochemistry negatieve kleuring eiwitcomplex TEM lipoxygenasen visualisatie niet-denaturerende gelelektroforese
Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter