Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

במחקר רפואי, תשומת לב רבה מתמקדת חלבונים בממברנה, או פנימיים או חיצוניים, מעורבים במגוון אינטראקציות שומנים. עבודה עם חלבונים אינטראקציה השומנים כולל גם בחירת תחליף ליפידים, כגון חומרי ניקוי, amphipols 1, או חלבונים קטנים 2, או למצוא תחליף קרום שמחזיק את חלבון מסיס ופעיל. תחליפי קרום ליפואית כוללים ליפוזומים nanodiscs (ND) 3, 4.

Nanodiscs הם פלטפורמות הממברנה כמעט טבעיות שפותחה על ידי הנדסה חלק חלבון, ApoA-1, של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) טבעי בדם. ApoA-1 הנו רשת 243 שאריות-ארוכה של סלילים-α amphipathic קצרים ויש לו קונפורמציה מסיס ליפיד חינם. במבחנה כאשר בנוכחות של שומנים, שני עותקים של חלבון ApoA-1 לסדר מחדש באופן ספונטני לכתר את hydrחלק בשרשרת acyl ophobic של תיקון bilayer השומנים 5. גרסאות תכנון הנדסי של ApoA-1 נקראים בדרך כלל חלבונים פיגומים הממברנה (MSP), ואת מספר גדל והולך זמינים מסחרית כמו פלסמידים או חלבונים מטוהרים. חזרות או השמטות של הסלילים-α ב תוצאת ApoA-1 ב 6 ארוכים או קצרים 7 חלבונים בממברנה פיגומים. זה בתורו מאפשר ליצור דיסקים סביב 6 ננומטר 7 עד 17 ננומטר 8 קוטר. ישנם סוגים שונים של יישומים עבור nanodiscs 3, 9. היישום הנפוץ ביותר הוא לספק סביבת קרום כמעט טבעית לייצוב של חלבון ממברנלי אינטגרלי 8, ביקורת בעבר 3, 9. אחד משימושים פחות בחנו הם לספק משטח הממברנה ננו לחקר חלבוני פריפרית קרום 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. סעיף 1 של פרוטוקול להלן ממחיש את ההליך להכנת nanodiscs מורכב פוספוליפידים וחלבונים פיגומים הממברנה.

הכנת מדגם היא צוואר בקבוק ברוב השיטות. דגימות שיטה ספציפית עשויות להוסיף מידע מסוים, אבל הם גם עושים השוואות של תוצאות קשות. לכן, זה פשוט יותר כאשר הדגימות הן multimodal וניתן להשתמש בו ישירות בכמה שיטות שונות. אחד היתרונות עם השימוש nanodiscs הוא גודלו הקטן של nanodisc בהשוואה ליפוזומים (למשל, דגימות יכול לשמש ישירות לשני TEM ו ג'ל אלקטרופורזה הלא denaturing, כמו בפרוטוקול הנוכחי).

s = "jove_content"> שלפוחית ​​ו ליפוזומים כבר מזמן השתמשו להבין את תפקידם של חלבונים אינטראקציה-קרום. עבור מחקרים מבניים להדמיה, דוגמא של הנחישות המבנית של חלבון טראנסממברנלי ב ליפוזומים היא 18 זמין. עם זאת, אין מבנה 3D ברזולוציה גבוהה של חלבון הממברנה monotopic מוטבע על קרום ליפוזום פורסמה עדיין, ככל שאנו יודעים. חלקיקים או נוגדני זהב יכולים לשמש כדי לחזות חלבונים מחייבים ליפוזומים או שלפוחית באמצעות 19 TEM. למרות בדיקות אלה הם מאוד ספציפיים, שהם עלולים להפריע לתהליך חלבונים קושרי הממברנה על ידי מיסוך באתר קרום מחייב או על ידי מיסוך תחומי העניין עם החלקים גמישים. זהב שכותרתו או חלבונים ומורכבי נוגדן בטח יכולים להיות מנותח על ג'ל, אבל זה יגדיל את עלות הניסוי.

למרות ליפוזומים הם פלטפורמה מצוינת, אחד לא יכול להיות בטוח כי פופיש ulation יחס מסוים של חלבון לכל liposome, תכונה שיכולה להיחקר על ידי שימוש nanodiscs 20. בשנת ליפוזום, קו-פקטורי מצעים יכולים להיות לכוד בפנים המסיס. חומרים שהם קרום מסיסים יחלקו את אותו גורל לשני סוגי mimetics הממברנה. אף על פי כן, כמו אזור bilayer קטן ב nanodiscs, כמות קטנה יותר של חומר נדרשה כדי להרוות את קרומי nanodisc.

תפקוד החלבון הבנת דרך קביעת המבנה האטומי כבר חיוני בתחומים רבים של מחקר. שיטות לקביעת מבנה חלבון כוללות רנטגן 21; תהודה מגנטית גרעינית (NMR) 22, 23; במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) 24 בקירור, cryoEM. ההחלטה על ידי cryoEM לאחרונה שופרה מאוד, בעיקר בשל השימוש של דה אלקטרון הישירtectors 25, 26. מקרומולקולות הם צלמו רזה, קרח זגוגי 27 במצב כמעט טבעי. עם זאת, בגלל הקונטרסט הנמוך של מולקולות ביולוגיות, הם הופכים קשים לזהות בטווח הגודל של 100 - 200 kDa. לקבלת דוגמיות בגודל המתאים, איסוף נתונים יכול להתבצע ואת שיטת שחזור חלקיק בודד יכולה להיות מיושמת כדי להשיג מבנה 28.

עם זאת, קביעת מבנה החלבון על ידי TEM הוא תהליך רב שלבי. זה מתחיל בדרך כלל עם ההערכה של מדגם monodispersity ב -29 שלילי כתם TEM באמצעות מלחים של מתכות כבדות כמו phosphotungsten (PT) 30 או אורניום 31. שחזור של מודל ברזולוציה נמוכה של מקרומולקולה המוכתמת שלילי עשוי בדרך כלל ועלול להניב מידע חשוב על המבנה המולקולרי 29. במקביל,איסוף נתונים באמצעות cryoEM יכול להתחיל. יש להקפיד בעת הערכת נתוני TEM השלילית-כתם, כדי למנוע את הפרשנות השגויה של היווצרות artefact. Artefact אחד מסוים הוא ההשפעה של כתם PT על פוספוליפידים ליפוזומים 32, וכתוצאה מכך ההיווצרות של מוטות ארוכות דומות ערימות של מטבעים במבט מהצד 33. "רולו" או "ערימות" כזה (להלן מסומן כמו "ערימות") נצפו בשלב מוקדם עבור HDL 34, ומאוחר יותר גם עבור nanodiscs 35.

ההערמה והעיצוב מחדש של ממברנות עלולות להתרחש מסיבות רבות. לדוגמה, זה יכול להיגרם על ידי שיתוף גורמים כמו נחושת, שמוצג על ידי הדמיה TEM ב כתם אמוניום molybdate 36. שבריר של ליפידים קרום ליפוזומים כלול לקבוצת ראש חומצת iminodiacetic מחק complexation מתכת ידי EDTA, ובכך לערום ליפוזומים לאחר התוספת של יוני נחושת 37. היווצרות ערימה של פוספוליפידים ידי PT נצפתה בשלב מוקדם; עם זאת, עבודה לאחר מכן התמקדה סר או ביטול היווצרות חפץ זה 38.

כאן, אנו מציעים שיטה לנצל את nanodisc NAPT הנגרמת לערום לחקר חלבונים קושרי קרום ידי TEM. בקיצור, חלבון מחייב על nanodiscs שימנע nanodiscs מן הערמה. למרות הסיבות לערום אינן ברורות, הוצע 39 כי קיימת אינטראקציה אלקטרוסטטית בין פוספוליפידים וקבוצת phosphoryl של PT, בגרימת הדיסקים לדבוק כל (איור 1 א) אחר. ההנחה העומדת מאחורי פרוטוקול שלנו היא שכאשר חלבון נקשר nanodisc, רוב השטח פוספוליפידים אינו availa ble לאינטראקציה עם PT עקב הפרעה סטרית ידי החלבון. זה ימנע היווצרות מחסנית (איור 1B). שתי מסקנות אפשר להסיק. ראשית, המניעה לערום כלומר החלבון של העניין הכפיף אותו הקרום. שנית, מורכב החלבון-ND יכול להיות מטופלים עם שיטות עיבוד יחיד חלקיקי תקן 24, 40 לקבל מורפולוגיה מחוספסת של המתחם. יתר על כן, מנתח בשיטות כמו ג'ל אלקטרופורזה הלא denaturing או פיזור אור דינאמי יכול להתבצע.

כדי להדגים את ההשערה הזו, השתמשנו החלבון קושר קרום 5 lipoxygenase (5LO), העוסק במחלות רבות דלקתיות 41, 42. חלבון 78-kDa זה דורש יוני סידן להיקשר הממברנה שלה 43. למרות עמותת קרום זה נחקרה באמצעות בהרחבה ליפוזומיםs = "Xref"> 44, 45, 46 ו שברי קרום 47, אלה לא יכולים לשמש לניתוח TEM ונחישות מבנה.

הכנת nanodiscs מתחיל ידי ערבוב MSP עם השומנים resuspended ב cholate נתרן חומר ניקוי. לאחר דגירה על קרח למשך 1 שעות, אבקת הכביסה מוסרת לאט מתערובת הכינון מחדש תוך שימוש בשרף כושר ספיג. סוג של חומר זה עשוי לעתים קרובות קלקר בצורת לתוך חרוזים קטנים. הם יחסית הידרופובי יש העדפה חזקה מחייב דטרגנט לעומת שומנים 48. לאחר הסרת חרוזים הידרופובי וביצוע בירור באמצעות צנטריפוגה, nanodiscs הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה הדרה גודל (SEC). Nanodiscs מטוהר מעורבב עם חלבון הממברנה monotopic (ורכיבים אפשריים) ב יחס equimolar (או יחסי מספר עבור טיטרציה) והם עזבו כדי react (15 דק '). ניתוח על פי TEM מתבצע על ידי החלת μL-סכומי המדגם על-משוחרר זוהרת, רשתות מצופות הפחם ולאחר מכן על ידי ביצוע מכתים שלילי עם NAPT. מדגם זהה וממתי aliquots הוחלו על רשתות TEM יכול לשמש לניתוח על ידי הלא denaturing או SDS עמוד-ג'ל אלקטרופורזה, כמו גם על ידי סוגים שונים של מדידות פעילות, ללא שינויים משמעותיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת Nanodiscs

  1. ביטוי וטיהור של פיגומי קרום החלבון 8, 35
    1. לבטא את MSP1E3D1 שלו מתויג ב BL21 E. coli (DE3) זן T1R pRARE2 צלוחיות. הכן תרבות המתנע לילה 50 מ"ל עם מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​Kanamycin על 37 מעלות צלזיוס. לדלל את תרבות המתנע לילה 2 ליטר של המדיום מרק נהדר בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​kanamycin.
    2. לגדל את התאים ב 37 ° C עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) ומגיע לכ 3. להשרות את ביטוי חלבון עם 0.5 מ"מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) במשך 3 שעות ב 18 מעלות צלזיוס.
    3. הכן את החיץ תמוגה (100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 100 מ"מ NaCl; ו -10% גליצרול). הוסף 1 מ"מ TCEP מיד לפני השימוש.
    4. אחרי 3 שעות של אינדוקציה על 18 מעלות צלזיוס, לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 4500 XGו -4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant, לשקול את התאים שנקטפו, מחדש להשעות אותם במאגר תמוגה לפי יחס של 2 מ"ל של תמוגה חיץ לכל גרם של תאים.
    5. Lyse את התאים על ידי sonication פעם (שיעור החזרה: 4 של פועל, כבוי סעיף 4) 3 דקות ב משרעת 80%.
    6. צנטריפוגה lysates במשך 20 דקות ב 49,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. וזורק את הכדור מן צנטריפוגה זה.
    7. להזריק את supernatant לתוך עמוד 5 מ"ל Ni + chelating מחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית אוטומטיות שמר רצוי ב 4 ° C..
    8. לפני מדרגת elution (שלב 1.1.9), לשטוף את העמודה עם מאגרי 1 - 3 הבא כדי להסיר כל החלבונים למעט MSP המתויג שלו. לפקח על תכולת החלבון ב 280 ננומטר לבצע את תהליך הטיהור; הקלטת UV ב 280 ננומטר צריכה לחזור בסיס לאחר כל שטיפה.
      1. לשטוף עם חיץ לשטוף 1: 40 מ"מ טריס- HCl, 300 מ"מ NaCl, 10 מ"מ imidazole, ו -1% טריטון, pH 8.0.
      2. לשטוף עם חיץ לשטוף 2: 40 מ"מ טריס- HCl, 300 מ"מNaCl, 20 imidazole מ"מ, 50 מ"מ נתרן cholate, pH 8.0.
      3. לשטוף עם חיץ לשטוף 3: 40 מ"מ טריס- HCl, 300 מ"מ NaCl, ו -50 מ"מ imidazole, pH 8.0.
    9. Elute את MSP עם 40 mM Tris-HCl, 300 מ"מ NaCl, ו -500 imidazole מ"מ, 8.0 pH.
    10. שנה את חיץ MSP בופר סטנדרטיות (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 מ"מ NaCl; ו -0.5 מ"מ EDTA) על ידי סינון ג'ל 8, 35; התשואה לכל אצווה צריכה להיות סביב 7 מ"ג ל -1.
  2. הכנת פתרון מניות פוספוליפידים
    1. להוסיף 305 μL של 1-Palmitoyl-2-oleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (POPC) מומס כלורופורם בריכוז של 25 מ"ג / מ"ל כוס זכוכית ו להתאדות כלורופורם על ידי לטהר אותה עם זרם עדין של חנקן . ייבש את לילה שומני ייבוש ואקום. הערה: שלב זה מתבצע כדי להסיר את ממס השומנים בדם, מה שמשאיר שכבה דקה של שומנים בתחתית של כוס הזכוכית.
    2. Resuspend את העוגה השומנים ב 200 μL של חיץ תקן MSP המכיל 100 cholate נתרן מ"מ על ידי vortexing הצינור עד הפתרון הופך שקוף; זה יספק פתרון עם ריכוז POPC של 50 מ"מ.
      הערה: באופן כללי, היחס הטוחן של שומנים כדי דטרגנט בשלב זה צריך להיות 1: 2 (שומנים בדם: חומר ניקוי) 8. תערובת שומנים חומר ניקוי זה יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמעט 2 חודשים.
  3. הכנת חרוזים הידרופובי להסרת חומר ניקוי
    1. מניחים 5 גרם של חרוזים (יבש-משקל) בצינור 50 מ"ל.
    2. שטפו את החרוזים עם 30 מ"ל של מתנול 100% ולאחר מכן עם 40 מ"ל מים ultrapure.
    3. שטפו את החרוזים עם 10 חיץ תקן מ"ל של MSP. לבסוף, לאחסן את החרוזים עם 15 מ"ל של בופר סטנדרטיות MSP על 4 מעלות צלזיוס.
  4. כינון מחדש Nanodisc
    1. לוותר 190 μL של MSP1E3D1 (0.124 מ"מ) לתוך צינור microfuge ולהוסיף 61.5 μL של פתרון המניות פוספוליפידים (50 מ"מ POPC) לאותו צינור. דגירה את תערובת הכינון מחדש על קרח רטוב במשך 1 שעה. הערה: זה שווה יחס טוחן של 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. להוסיף חרוזים הידרופובי בריכוז של 0.5 גרם של חרוזים לכל מ"ל של תערובת הכינון מחדש ליזום את תהליך ההרכבה העצמית. דגירה באינקובטור רוטרי 16 שעות ב 4 ° C..
    3. לאחר דגירה, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 13,000 XG ו -4 ° C כדי להסיר את המשקעים אגרגטים. וזורק את הכדור ולשמור את supernatant.
    4. לאזן את עמודת כרומטוגרפיה הדרת גודל (רכובה על מערכת כרומטוגרפיה נוזלית אוטומטית) עם חיץ MSP הסטנדרטית עד הספיגה ב 280 ננומטר היא יציבה. להזריק את supernatant לתוך הטור ולאסוף את השברים השיא.
    5. מדדו את ריכוזי nanodiscs את השברים השיא ב 280 ננומטר. השתמש מקדם הכחדה טוחנת של MSP1E3D1 (ε = 29,910 -1 ס"מ M -1) לחישוב ריכוז nanodisc. הערה:מספר שומנים לכל nanodisc ניתן למדוד על ידי שילוב של שומנים radiolabeled וניתוח פוספט 4 או על ידי ניתוח פוספט לבד.

2. הכנת חלבון Monotopic 5 Lipoxygenase 35

  1. הכן תרבות המתנע לילה. מוסף 50 מ"ל של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​אמפיצילין. לחסן המדיום עם E. coli BL21 (DE3) המכיל את הפלסמיד של הגן 5-lipoxygenase (ALOX5). לדלל את תרבות המתנע לילה במדיום ביטוי המכיל 42 מ"מ Na 2 4 HPO, 24 מ"מ KH 2 4 PO, 9 מ"מ NaCl, 19 מ"מ NH 4 Cl, 1 מ"מ MgSO 4, 0.1 מ"מ CaCl 2, 0.2% גלוקוז D, 0.1 %, 5 מיקרומטר FeSO 4, ו אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ"ל. לגדל את התאים עד OD 600 הוא ~ 0.5 של 25 מעלות צלזיוס. להשרות ביטוי החלבון עם 0.2 מ"מ IPTG במשך 16 שעות ב 20 ° C 35.
  2. קציר ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 7000 XG ו -4 ° C ו להתעלמות supernatant. לשקול גלולה נמצא בחלק התחתון של הצינור המכיל את התאים נקצרו resuspend התאים שנקטפו חיץ תמוגה (100 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0; 100 מ"מ NaCl; 10% גליצרול; ו 1 מ"מ TCEP) המכיל מעכבי פרוטאז ו -0.5 מ"ג / מ"ל 35 ליזוזים לפי יחס של 2 מ"ל של חיץ תמוגה לכל גרם של תאים.
  3. Lyse את התאים על ידי sonication עבור 5 x 15 שניות ב משרעת 80%. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 7000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. בצע ממטרי אמוניום סולפט 30 - 60% רוויה כדי לזרז את החלבונים בתמיסה 35. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס. הערה: גלולת 5LO אפשר להקפיא במהירות ומאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  4. Resuspend גלולה עם 20 מ"ל של חיץ תמוגה ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב 40,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס.
  5. דגירת supernatant על טור agarose ATP על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לשטוף את העמודה פעם עם נפח עמודה אחת של חיץ תמוגה המכיל 0.5 M NaCl. Elute את 5LO עם 20 מ"מ ATP חיץ תמוגה המכיל 10 מיקרומטר FeSO 4 ו -20 מיקרוגרם / מ"ל Catalase. בצעו כרומטוגרפיה סינון ג'ל להסרת ATP 35.
    הערה: 5LO אינו יציב יש להשתמש מיד לאחר טיהור. אחרת, מומלץ לעצור ליד המדרגה של משקעים אמוניום סולפט (ראה את הפתק לאחר שלב 2.1.3).

3. הכנה של קומפלקס Nanodisc-חלבון

  1. הכן בנפח כולל של 100 μL של מורכבות. מערבבים 0.8 מיקרומטר ND ו -0.8 מיקרומטר 5LO עם 1 בהווה 2+ מ"מ Ca למאגר תקן MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 100 מ"מ NaCl; 0.5 mM EDTA; ו -1.5 מ"מ CaCl 2) ו דגירה של 10 דקות על קרח. הערה: המדגם ניתן לאחסן עד חודש ב 4 ° C 35.
ניתוח ove_title "> 4. של דוגמאות

  1. ג'ל אלקטרופורזה
    1. אלקטרופורזה ללא denaturing
      1. מערבבים 15 μL של המדגם עם 5 μL של חיץ הטעינה (50 מ"מ BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) גליצרול, ו 0.001% Ponceau S, pH 7.2) 49 ולטעון אותו על 4 - 16% Bis-טריס ג'ל לבצע אלקטרופורזה.
      2. מלאו את מיכל קטודה עם חיץ קטודה אור (50 מ"מ Bis טריס; 50 מ"מ tricine, pH 6.8; ו 0.002% Coomassie G-250) והטנק האנודה עם הפעלת המאגר (50 מ"מ Bis טריס ו -50 מ"מ tricine, pH 6.8). הפעל את ההפרדה באמצעות מתח קבוע של 150 V.
      3. עצור את הפרדת electrophoretic כשהחזית Coomassie מגיעה לסוף של הג'ל.
      4. כתם ג'ל עם פרוטוקול כחול Coomassie סטנדרטי.
    2. אלקטרופורזה denaturing
      1. מערבבים 40 μL של המדגם עם 10 μL של חיץ טעינת המכיל SDS (0.05% (w / v) bromophenol כחול; 0.2 M Tris-HCl,pH 6.8; 20% (v / v) גליצרול; 10% (w / v) SDS; ו 10 מ"מ 2-mercaptoethanol) ולטעון אותו על 4 - ג'ל גליצין 20% טריס לבצע אלקטרופורזה.
      2. מלאו את הטנקים הקתודה לבין האנודה עם הפעלת המאגר (25 mM Tris-HCl, pH 6.8; 200 גליצין מ"מ; ו -0.1% (w / v) SDS). הפעל את ההפרדה באמצעות מתח קבוע של 150 V.
      3. עצור את הפרדת electrophoretic כשהחזית לצבוע טעינה מגיעה לסוף של הג'ל.
      4. כתם ג'ל עם פרוטוקול כחול Coomassie סטנדרטי.
  2. הכנת תמיסת NAPT
    1. ממיסים 1 גרם של מלח נתרן phosphotungstate ב 50 מ"ל של מים על ידי תסיסה בטמפרטורת החדר כדי לתת 2% (w / v) תמיסה חומצית.
    2. התאם את ה- pH ל -7.4 עם 1 M NaOH. הסר את החלקיקים באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר או על 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכנת המדגם עבור ניתוח TEM
    1. זוהר פריקת רשתות נחושת מצופה פחמן (400 רשת) במשך 20 שניות על 30 מילים-אמפר כדי להבהיר את הרשתות הידרופילי לפני הספיחה של המדגם. מניחים 3.5 μL של המדגם (0.8 מיקרומטר ביחס nanodiscs) על הרשת דגירה במשך 30 שניות. הערה: ההיקף המיושם עשוי להשתנות בין 2.5 ל 5 μL, תלוי בריכוז המדגם. מגוון ריכוז מתאים nanodiscs הוא 0.5 - 1 מיקרומטר.
    2. כתם את הפתרון עודף באמצעות נייר סינון.
    3. מיד להכתים את הרשת עם ירידה של 2% NAPT למשך 30 שניות. כתם את הפתרון עודף ולהשאיר את הרשת לייבוש באוויר.
    4. להעריך את הרשתות על ידי TEM. מיקרוסקופ עם 120-200 keV מאיץ מתח די להעריך את היקף לערום. הערה: בשביל הפרוטוקול הנוכחי, מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים מכויל שמש, מצויד באקדח פליטת שדה 200-קאב.
    5. רשום את תמונות TEM. עבור התמונות מראות ערימות ארוכות, לא לעבד יותר; תמונות מראות את מכלול nanodiscs, עם חלבון חיצוני שעשויים להכיל כמהערימות קטנות, אבל רוב החלקיקים נמצאות במתחם. תמונות תהליך שיא כמה אלה על פי שיטות סטנדרטיות להשיג-ממוצעים בכיתה ו ברזולוציה נמוכה, 3 ממדית של המורכבות.
      הערה: עבור איסוף הנתונים שלילי כתמים, רשתות נעשו על לפחות שלושה ימים שונים. עבור כל יום, incubations מדגם הטרי (כמו בשלב 3.1) שנעשה לפני הכתם השלילי יושם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השיטה שאנו מציעים תלויה בהכנת nanodiscs לספק משטח הממברנה עבור monotopic קרום חלבון מחייב. מאחר ואין חלבון טראנסממברנלי מוטבע לתוך bilayer השומנים nanodisc, את nanodiscs הם כאן מסומן כמו "nanodiscs ריק" (איור 2 א). אלה יש משקל מולקולרי מחושב של 256 kDa עבור רכב שני חלבוני פיגומי MSP1E3D1 ומסביב 260 מולקולות של POPC 8. באמצעות חלבון זה: יחס שומנים עבור כינון מחדש, שיא מרכזי אחד (איור 2 א) היה eluted במהלך סינון ג'ל. שברים השיא סביב 9 מ"ל (איור 2 א) נבדקו על ידי ג'ל אלקטרופורזה יליד כחול 49, מראה להקה אחת (איור 2 ב ', מסלול 1). למרות הלהקה מתאימה לגודל קצת יותר גדול 256 kDa מחושב, קוטר nanodisc נמדד תמונות TEM תואם אתצפוי 13 ננומטר ± 0.5 ננומטר.

חלבון קרומי monotopic 5 lipoxygenase (5LO) היה מטוהרים כמתואר לעיל (שלב פרוטוקול 2) ובפירוט יותר מוקדם 35. ההומוגניות של 5LO 78-kDa נותח על ידי אלקטרופורזה עמוד SDS (איור 2 ג, ליין 1) והיה מתפקדת במלואה 35 (לא מוצג).

בפרוטוקול זה, תנאים נוצרים בכוונה המקדמות את הערימה של nanodiscs. עם זאת, יש לציין כי הערמה זו מושרה רק בדגימות שנעשו עבור הדמיה TEM (מה שנקרא דגימות), במיוחד על ידי תוספת של phosphotungstate נתרן כתם שלילי כשלב האחרון אחרי כל הטיפולים ותוספות אחרות נעשו. למעשה, התמונות של nanodiscs מוכתם NAPT להראות את הערמה הצפויה (איור 3 א) בשלב מוקדם מאוד עבור HDL 34 5, 50. את "ערימות ארוכה של מטבעות במבט מהצד" (איור 3 א) הם nanodiscs סכום מצרפי עם phosphotungstate intercalated בין bilayers, כמתואר באופן סכמטי באיור 1A ו המוצעת על ידי ג'אנג et al. 32, 39.

חשוב לבדוק אם תוספות שונות מאגרים להשפיע, למנוע, או אפילו לגרום הערמה, וכפי תתברר בהמשך, את ההשפעות של יוני סידן הדרוש לחקירה. באיור 3 ב, הערמה עדיין קיימת בתוך דגימה שבו יוני סידן נוסף פתרון nanodisc לפני הצביעה עם NAPT.

הצעד החיוני בפרוטוקול מוצג באיור 4, שם הקרום-הסלחלבון דינג שוהה הפתרונות. הערמה לא ניתן הייתה מושרה על ידי כתם NAPT כאשר 5LO היה כבול אל פני שטח הקרום של nanodiscs (איור 4 א). לקבלת העותק הזה, היחס הטוחן של 5LO כדי nanodiscs היה 1: 1, כפי סכמטי שמוצג באיור 1 (איור 1B, מימין למטה). יתר על כן, כפי bilayer השומנים של nanodiscs נגיש משני הצדדים, בניגוד ליפוזומים, דגימות עם יחס של שתי 5LO לאחד nanodisc הוכנו, בעוד תמונות TEM להראות אפילו פחות הערמה (איור 4B).

לכריכה, כמה חלבונים בממברנה חיצוניים יכול לסמוך על הנוכחות של שומנים בדם אופייני בקרום, כגון phosphoinositols 10, 11, 12 או 10 phosphatidylserine. במקרה של 5LO, בנוכחות של Ca 2 + הוא necesSary 43. באיור 4 א 'וב', יוני סידן נכח פתרונות עם nanodiscs ו 5LO. במילים אחרות, חוסר לערום לא רק מראה כי החלבון monotopic יש קשור אבל גם כי הכריכה תלוי יונים Ca 2+. כדי להראות זאת, בתמיסה המכילה nanodiscs ו 5LO אך ללא סידן הוכתם NAPT צילמו ידי TEM (איור 4C). כצפוי, 5LO לא יכול להיקשר nanodiscs ללא Ca 2 +, עוזב את 5LO חופשית הפתרון, כך nanodiscs מחסנית במקום (איור 4C).

איור 1
עקרון איור 1. Nanodisc גדישה סקירה של השיטה. א עקרון לערום nanodisc. התוספת של phosphotungstate נתרן כתם שלילי לפתרון של nanodiscs (משמאל) מוביל th דואר לערום של nanodiscs (מימין) בשל כוחות אלקטרוסטטיים (באמצע, חיצים) בין bilayer פוספוליפידים ואת מולקולות PT (באמצע, נקודות שחורות). ב ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. nanodiscs ריק (שמאל) נקשר לחלבון קרום חיצוני (אפור) להקים קומפלקס, מתואר מארבע זוויות שונות (בינוני נמוך). הנוכחות של חלבון monotopic sterically מונעת nanodiscs מן הערמה כאשר מוכתמים עם מלח phosphotungstate (בפינה ימנית תחתונה), בניגוד לערום מושרה בהעדר עצמים גדולים (ימני עליון). הטבעות בירוק וכתום-הצבעוניות מייצגות את גלישת שני MSP סביב הליבה פוספוליפידים, המיוצגת חום בהיר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

jpg "/>
איור 2. הומוגניות ניתוח Nanodiscs ו 5LO. כרומטוגרפיה הדרת גודל א nanodiscs מחדש ריק. Elution של פסגות nanodiscs בשעה 9 מ"ל. ב Non-denaturing ג'ל ניתוח electrophoretic של שבר השיא מן SEC שמוצג (א). ליין M מכיל את הסמן. להקה אחת שוהה מסלול 1, שבו חלק לשיא 9 מ"ל נטען. ג Denaturing ג'ל ניתוח electrophoretic של 5LO מטוהרים. 78 kDa 5LO תערוכות כהרכב אינטנסיבי בנתיב 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
גיבוש איור 3. סטאק של Nanodiscs בהיעדר החלבון ונותח על ידי TEM. לערום א Nanodisc הושרה wתרנגולת מוכתם NAPT. את "ערימות של מטבעות" הם ערימות של nanodiscs כאשר במבט מהצד. כל nanodisc מופיע כלהקה לבנה. ב Stacking לא היה מוטרד על ידי הנוכחות של יוני סידן בתמיסת nanodisc כאשר מוכתם NAPT. ברי המידה הם 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. מניעת היווצרות סטאק ידי עקידת החלבון בנוכחות גורם-שותף ונותח על ידי TEM. יוני סידן א 'וב' נכח תערובות של 5LO ו nanodiscs על יחסים טוחנים של 1: 1 (א) או 2: 1 (B). ככל 5LO מחייב nanodiscs, את nanodiscs פחות זמין לערום, כפי שמוצג (ב '). מתחמי יחיד חלקיק boה (א) ו- (ב) מתאימה 35 לעיבוד נוסף. ג בהעדר יוני סידן, 5LO לא יכול להיקשר. מכתים NAPT של מדגם זה מראה לערום אופייני nanodiscs, עוזב את 5LO מאוגד. ברי המידה הם 100 ננומטר. התמונות נרכשו על ידי מצלמת 4K x 4K CCD בהגדלה של 69,500x. גודל פיקסל של מצלמת CCD הוא 15 מיקרומטר, אשר נותן ערך מקביל 2.16 Å במישור הדגימה עבור תמונות EM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה ניתן לחלק לשלושה חלקים: הכינון מחדש של nanodiscs ריק, הכנת קומפלקסים חלבונים-nanodisc, ואת מכתים שלילי עבור TEM קומפלקסים אלה. כל חלק יטופל בנפרד בקשר להגבלות על הטכניקה, השלבים קריטיים, ושינויים שימושיים.

כינון של nanodiscs ריק. שלבים ומגבלות קריטיים ייצור ושימוש nanodiscs.

עבור הכנת nanodiscs ריק, זה הכרחי כדי לייעל את יחס MSP-ל-שומנים. עבור MSP ושומנים הנפוצים ביותר (באמצעות cholate בתור חומר ניקוי), הצעות עבור היחסים האופטימליים ניתן למצוא בספרות (למשל, 125 - 130 POPC לכל MSP1E3D1 8, 51 השתמש בפרוטוקול הנוכחי). הבדלים הושגו לעומת היחסים שפורסם יכולים להיות תלויה את השיטה לקביעת ריכוז חלבון, את היעילות של lsolvation ipid הדטרגנטים, ואת שיטת הסרת חומר ניקוי מהפתרון.

אנו מציעים לבצע הסרת חומר ניקוי באמצעות חרוזים הידרופובי 48 (שלב 1.3), ואילו חלופות אפשריות הן דיאליזה או תוספת של cyclodextrin 52, 53. בתחילה, דיאליזה שמשה בריאורגניזציה של HDL 5, 34 ו עדיין עדיף 54. תהא השיטה להסרת חומר ניקוי, המהירות היא חיונית. אם ההסרה מהר מדי (הנפח של חרוזי הידרופובי גדול מדי), ההתארגנות הספונטנית של MSP עם השומנים אולי לא זמן להתרחש. במקום זאת, כמויות גדולות של ליפוזומים אגרגטים חלבון עלול להיווצר. התוצאות של כרומטוגרפיה הדרת גודל נראות כמויות גדולות של ליפוזומים בהיקף החלל, לשיא הכי מוצלח של nanodiscs בנוי מחדש, לשיא גדול של בשימוש4 MSP, 6, 51. עבור נפח קטן מדי של חרוזים הידרופובי, הסרת חומר הניקוי לא תהיה שלמה, ואת nanodiscs יוצרים עשוי להראות וריאציה בגדלים, שבו רוב הם קטנים מצפויים. אפשר לבדוק שתי תוספות של כמויות קטנות יותר של חרוזים הידרופובי במקום בנוסף אחד גדול כדי להאט את המהירות של כינון מחדש.

הבחירה של שומנים יש לשקול בזהירות 8, 9, 45, 46, 55, בהתאם למטרה לעריכת nanodisc. באופן כללי, עבור כל השיטות שמטרתן היווצרות הקרום (כינון מחדש של nanodiscs או ליפוזומים, כמו גם עבור ניסויי התגבשות 2D), ליפידים חייב להיות במצב "נוזל" 56. מתחת לטמפרטורה מסוימת, השומני e הם נוקשים. מעל זה מה שנקרא טמפרטורת מעבר (TM), השומנים הם נוזל. שים לב נפוץ בשימוש כמה שומנים יש רווי Tm הרבה מעל לטמפרטורת החדר. יתר על כן, לתערובות שומנים, את miscibility מוזת שומנים להיחשב 57. הטמפרטורה האופטימלית עבור היווצרות Nanodisc היא סביב המעבר לשלב (TM) של השומנים.

הדטרגנט בפרוטוקול הנוכחי הוא נתרן cholate 8. אם חומר ניקוי אחר חייב לשמש, אותה ריכוזים אלה שימוש cholate לא ניתן להשתמש ישירות. דטרגנטים קלים מסוימים לפזר שומנים בצורה פחות יעילים, וכן ריכוז גבוה יותר עשוי להיות נחוצים. עוגת השומנים המתקבלת לאחר האידוי של כלורופורם (שלב 1.2.2 בפרוטוקול) חייבת להיות מומסת לתוך פתרון ברור על ידי חומר הניקוי. Vortexing, להקפיא הפשרה מחזורים, אמבטיות אולטרסאונד, או sonication יכול לשמש כדי להאיץ את solubilization.

לקבלת הקומבינאטיונים של שומנים בדם (-mixtures), MSP, ודטרגנטים אחרים מאלה ששימשו כאן, titrations כדי למזער אגרגטים גדולים ליפוזומים או MSP עודף הם 4 הדרושים, 6, 51, 58. עבור שילובים מסוימים של MSP פוספוליפידים, אופטימיזציה עשוי להיות קשה יותר מאשר לאחרים 4, 6, 51, וזה הופך להיות חיוני כדי לקבוע את התוכן של שברי השיא. השיטה המדויקת ביותר לניתוח רכב nanodisc והגודל היא לקבוע את מספר פוספוליפידים לכל MSP ידי ניתוח פוספט 4 ולחשב את המשקל המולקולרי nanodisc. גודל Nanodisc יכול להיות מוערך על ידי נפתרה היטב, ג'ל אלקטרופורזה הלא denaturing; פיזור אור דינאמי (DLS) 59; או TEM-כתם שלילי, אם להזכיר רק כמה שיטות. באשר נגהפרוטוקול לערום נגרמת מופרזת כתם שהוצג כאן, מדידת הרוחב של הערימות נוכחות תמונות TEM מניבה קוטר nanodiscs.

באשר לביטוי והטיהור של חלבון פיגומי קרום, כל אמצעי הזהירות הרגילה והחששות עבור חלבון מסיס יש לנקוט. פלסמידים הזמינים עשויים לכלול תגים שונים ואתרי מחשוף פרוטאז במקרה התג יש להסיר לפני באמצעות MSP.

5LO, חלבון monotopic בשימוש בפרוטוקול, מנטרל במהירות אלא אם ננקטים אמצעי זהירות, תארו במקום 35 וב והפניות בו. בקיצור, ברזל קטליטי הולך לאיבוד בקלות, ותנאי חמצון עלול לגרום dimerization של 5LO. כאמור בביאור (שלב פרוטוקול 2.1.3), הטיהור ניתן נעצרה אחרי צעד משקעי aliquots מאוחסן עד לשימוש מאוחר יותר. לאחר הטיהור של aliquot, החלבון חייב לשמש בתוך ד כמה שעות ue אל האיון המהיר 35.

צעדים קריטיים הכנת קומפלקסים חלבונים-nanodisc.

גודלו של החלבון monotopic לעומת באזור nanodisc הוא בעל חשיבות. אורכו של שרשרת חלבון MSP1E3D1 מתאים nanodisc עם קוטר פנימי 10.5 ננומטר וכ אזור bilayer 8,900-2 8. זה מתאים גם לאזור דיווח על החלק מוטבע-הקרום של 5LO 45. לפיכך, יחס המחייב הצפוי שלנו היה 1: 1, או לכל היותר 2: 1 5LO לכל nanodisc. זה התברר כנכון, כפי שדווח ניסוי טיטרציה 35. עם זאת, המקסימאלי שניתן עקדת שני 5LO לכל nanodisc לא הושג, כפי שפורט במקום אחר 35. Nanodisc מעט יותר ואולי יכולים להרשות לעצמנו מלא 2: 1 מחייב בניסויים שבהם זה רצוי, אבל במקרה הזה, ביחס של 1: 1 הוא המטרה העיקרית.

ove_content "> הבחירה של ליפידים אופטימלי ליצירת קומפלקס החלבונים-nanodisc ניתן שנעזרו בידע קודם. זה היה המקרה בפרוטוקול הנוכחי, שבו הבחירה של שומנים הייתה סינטטי POPC 35. הווריאציות הן בקבוצת ראש השומנים 46 וריאציות ב הרוויה של שרשרות acyl 45 נבדקו במחקרים מחייבים ליפוזום-5LO. פעילות 5LO הוגדלה באמצעות קשירה על ליפוזומים המכילים פוספוליפידים כולין רוויים במצב שרשרת acyl SN-2 45, 46. אם דרישות שומנים ספציפיות אינן ידועות, אבל זהותו של הקרום המקורי נקראה, תמציות שומנים טבעיות יכולות להיבדק 55 ראשונים.

תלות-פקטור נודע 5LO, אשר תלוי יוני 2+ Ca עבור קרום מחייב 43. זה מאתגר כדי להסיר סידן לגמרי מפתרונות. הנה, סוכן complexing EDTA שוהה המאגרים בסכומים המותאמים לעזוב כמות מבוקרת של יונים חינם Ca 2 +. חישובים של מולקולות חינם וכרוכות המאגרים נעשו על ידי תוכנת 60 רעי מאגרים המכילים יותר מסוג אחד של סוכן complexing 35. ההשפעה על ריכוז של גורם-שותף בחלקו מסיס הממברנה שאינה מוסברת על ידי תוכנה זו.

צעדים קריטיים המכתים השלילית של nanodiscs לקדם היווצרות ערימה.

בשביל הפרוטוקול שעל פרק, שבו ערימה מקסימלי היא רצויה, את הכתם צריך להיות מלח נתרן של phosphotungsten. מלחים שונים של טונגסטן זמינים, צפינו כי חומצת phosphotungstic הייתה פחות יעילה לערום (לא מוצג). מסיבות לא ברורות, ונראה כי כמויות גבוהות של נתרן במהלך מכתים PT מקדמת לערום. כמו כן, עבור חיץ המדגם, זה היה מראה כי נמוך יותר נתרן ממשיךאף אוזן גרון, כך הסכום נמוך יותר של מושרה לערום 32. מאותה הסיבה, לאחר המדגם מיושם לרשת EM, שטיפת מים לפני המכתים לא צריכה להתבצע, כמו גם זה מפחית ערימה. מצד שני, כמה לערום הושרה תמיד, הגם שמעולם לא במידה הדרושה את הביצועים הטובים ביותר של הפרוטוקול.

כמובן, קו-פקטורים כמו יוני Ca 2+ כאן חייבים להיבדק להפרעה עם הכתם השלילי או עם nanodiscs. בשביל הפרוטוקול הנוכחי, יוני סידן היה זרז חיץ פוספט, כך חיץ טריס היה בשימוש. Nanodiscs לא נערמו על ידי Ca 2 + יונים כשלעצמה, כמו לבדוק באמצעות אחר כתם שלילי, formate uranyl 35, וגם לא סידן למנוע הערמה הנגרמת NAPT (איור 3 ב).

לקבלת חלבון monotopic קטן, בגודל נוסף שנוסף באמצעות קשירת nanodisc עשויה להבהיר את זה לזיהוי cryoEM. אמאוד גדול nanodisc בהשוואה לחלבון לא יכול להיות אופטימלי, כמו חלבון קטן על nanodisc גדול לא יכול למנוע הערמה. עם זאת, את הצורה של החלבון החיצוני יכולה להשפיע. אמנם אין יחס מדויק יכול להינתן נכון לעכשיו, משטח bilayer nanodisc רק מעט גדול יותר משטח המחייב המשוער של החלבון מומלץ. עם מגבלה זו, החלבון המקסימאלי המחייב יהיה חלבון אחד בכל צד של nanodisc.

מגבלות ויתרונות כלליים של השיטה.

הפרוטוקול תלוי בזמינות של TEM ואת והציוד הנלווה, אשר אינן זמינים בכל המעבדות. עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרוני 120 עד 200 קילו וולט מצויד במצלמת CCD מסורתית יהיה די והותר עבור זיהוי של ערימה. המכתים השלילי NAPT מתבצע בטמפרטורת חדר, ואת הרשתות ניתן לאחסן בטמפרטורה זו מאוחר יותר לצפייה.

מתאר לעצמי TEMing נראה במהירות אם הערמה נמנעה או לא. עבור התמונות מראות קומפלקסי חלבונים-nanodisc (למשל, איור 4 א 'וב'), עיבוד נוסף כדי להשיג מידע מבני יכול להתבצע. פרטים מבניים של מדגם מוכתם שלילי יכולים להגיע ננומטר 1 והוא יכול לספק 29 מידע מבני שימושי. במעבדות מוקדשות לבנות קביעת cryoEM, המכתים השלילי של דגימות הוא הליך סטנדרטי. השימוש בפרוטוקול שלנו יהיה תוספת מהירה ופשוטה נהלים קבועים.

חלבונים monotopic חלק מעוגנים קרום ידי myristoylation, palmitoylation, או טלאים הידרופובי על פני החלבון, מה שהופך אותו צורך בטופס במתחם חלבון nanodisc ידי אותו נוהל כמו שילוב של חלבון טראנסממברנלי לתוך nanodiscs 13. הנה, אחד תת היחידות במתחם החלבון מכיל בבוקרyristoylation על זנב N-terminal גמישה עבור קרום מחייב. לקבלת תמונות TEM uranyl מוכתם תצטטנה, נאמר כי מתחם החלבון נכרך בניצב הממברנה, ולא בצד של nanodisc. תוצאה זו, ותוצאות אחרות אשרו מבנה נוקשה עבור מצורף קרום 13. בשביל זה מחייב, NAPT מכתים פי הפרוטוקול המוצע שלנו יראה אותה החלקיקים יחידים להתפשט באופן שווה. עם זאת, אם את הקובץ המצורף היה באמצעות שרשרת גמישה, המכתים יצטט uranyl אולי לא נתן תוצאה ברורה. אנו משערים כי עבור קומפלקסי חלבונים מצורפי קרום שרשרת גמישה, מכתים NAPT עלול לגרום nanodiscs לערום, הוכיח את הטיפוס "הערימה של מטבעות," אבל עכשיו מעוצבים על ידי החלבון המצורף בצדדים.

מדוע להשתמש nanodiscs אם ניתן להשתמש ליפוזומים? אופטימיזציה של שומנים, קו-פקטורים, או פרמטרים אחרים יכולה מאוד להיבדק אצל ליפוזומים עבור עקידה לכלחלבונים ipheral (cf. 5LO). ערימה של ליפוזומים NAPT נגרמות הודגמה 32, כך חלבון monotopic יכול למנוע ערמת liposome. עם זאת, הגדלים של ליפוזומים בהשוואה monotopic חלבונים כדי nanodiscs גם נכנס לשחק. חלבון חיצוני גדול ייתכן שתוכל למנוע את הערמה של ליפוזומים, ואילו חלבון קטן, כמו 5LO 78-kDa, אולי לא, אלא אם כן נוכח מספרים גבוהים לכל liposome. ליפוזומים קטנים יכולים להיות מוכנים, עדיין קטנה השלפוחית, חזקה יותר העקמומיות של הממברנה שלו. את bilayer nanodisc הוא שטוח. בדיקת פרמטרים שונים באמצעות nanodiscs יכול להיות פחות חסכונית בשל MSP. מצד השני, עבור ליפוזומים, קו-פקטורים יקרים מסוימים או מצעים כי לחלק חלקית לתוך הקרום ובהמשך, לתוך הפנים של ליפוזומים, ייתכן שיידרש בכמויות גדולות. לסיכום, פלטפורמת nanodisc מספקת את האפשרות של בחירת אזור מוגדר עבור כריכת n מדויק אדמדם של חלבונים. אזור bilayer נגיש משני צדדים הוא שטוח.

המשמעות של השיטה.

קביעת מבנה 3D של חלבונים או מולקולות מורכבות מדמיינת את הפעילות הפנימית של תאים. בסביבה הצפופה הזו, חלבונים ספציפיים פעילים על משטחי קרום, לבד או מורכב עם חלבונים אחרים, אבל בדרך כלל כך האינטראקציה הפיסית עם רכיבי bilayer השומנים היא חלק פונקצית מכניסטית שלהם. עבור חלבונים מסוימים, הקונפורמציה בתמיסה משתנית על הטבעת קרום, ואילו אחרים הם קשורים אל הממברנה אבל בכל זאת לשנות קונפורמציה או נטייה על הממברנה בשל איזשהו הדק. שביל כניסת מצע הידרופובי עשוי מכן פתח, או קונפורמציה המאפשרת קשירת חלבון הטרנסממברני עלולה להתרחש. כדי להשיג את המבנה, או לפחות מידע מבני, חלבונים היקפיים כגון כבול הממברנה הוא מאתגר.

jove_content "> Nanodiscs שימשו בחלק מהמחקרים לגבי האוריינטציה ותפקוד על ממברנות 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. ציטוכרום P450, מרכזי גמילה, מעוגן בקרום ידי סליל α ומכיל לקבוצת heme בחלקו הכדורי, המאפשרת מדידת dichroism ליניארי 15. התוצאות הצביעו על כיוון של heme ביחס קרום ההסכם קרוב עם סימולציות שנעשו, ובכך לחזק מסקנות אחרות השאובות סימולציות של ציטוכרום P450 מוטבע-הקרום. עבור GTPase מעוגן קרום nanodisc קטן, מחקרי תמ"ג יכולים לזהות שני אזורים שונים על החלבון עם קרום להתממשק לכל ומעבר לכך, כיצד Nucleo גאות כריכת מושרה מתג מממשק אחד אל 17 אחרים. מוטציות מפעיל מחייב, כמו גם GTP מחייב, נלמדו GTPase אחר בשכונת ראס-superfamily למצוא מספר השפעות על פעילות שהיתה תלויה האוריינטציה על הממברנה, שישפיע בשעור איתות 16. יש 5LO קונפורמציה מסיס 61 ודורש סידן לכריכה על ממברנות גרעין 43. באמצעות ליפוזומים unilamellar ענק, מקוטב ומוחלש, ניסויים אינפרא אדום סך-השתקפות בוצעו 46. התוצאה השתמעה N-terminal β-החבית נקשרת ממברנות, עם ציר הסימטריה של β-החבית מוטה כ 45 מעלות מן הקרום הנורמלי. התחום 5LO C- מסוף הוא צרור α-הסליל גלילי כמעט, וזה הוצע להיקשר עם מקביל לציר הארוך קרום 45,= "Xref"> 46. בעבודה הקודמת שלנו על 5LO מוטבע על nanodiscs, באזור של bilayer נבחר כדי לאפשר 5LO אחד לכל צד עם אוריינטציה לעיל הציע 35. תמונות TEM אשרו אורינטציה זו, אם כי ברזולוציה נמוכה 35. אם, למשל, רק את β-חבית N-terminal היה קשור אבל לא התחום C- מסוף, מספר גבוה יותר של 5LO לכל nanodisc שהיה מתקבל. יתר על כן, חלבון אחר יכול לשנות את הממברנה מחייב וכיוון של 5LO, כגון מפעיל, את הטרנסממברני החלבון 5 lipoxygenase הפעיל חלבון, FLAP. FLAP כונן מחדש לתוך nanodiscs, ואנו משתמשים TEM ושיטות אחרות כדי לחקור את האינטראקציה בין 5LO ומנפנף. תוצאות האינטראקציה שלהם החומצה הארכידונית אנדוגני להיות מומר leukotriene A4, המהווה את הצעד הראשון בסינתזה של chemoattractants חזק המעורבים במחלות רבות דלקתית 41, 42 sup>, 62.

מתחם 5LO-nanodisc מחושב יש משקל מולקולרי של 334 kDa, קרוב לגבול של כ -200 kDa לחקירה מבנית ידי cryoEM. אף על פי כן, כמו המבנה האטומי של 5LO זמין 61, העגינה שלו לתוך ברזולוציה בינונית, 3 מימדי מפת צפיפות אלקטרונים תניב מידע על האינטראקציה עם קרום nanodisc.

חידושים בטכנולוגיה cryoEM אינם דוחפים הפיתרון היחיד לרמה האטומית 63 אלא גם דוחף את הגבלת הגודל ל חלבונים קטנים. לקביעת מבניות באמצעות NMR 22, המצב הוא הפוך, כמו המטרה היא להגדיל את טווח הגודל, אשר כעת מתקרב 200 kDa. לאחרונה, קרום המחייב של חלבוני GTPase קטנים נחקרו על ידי תמ"ג 16, 17. חלבונים אלה, רק כ -20 kDa, אנחנומחדש קשור nanodiscs הקטן של קוטר פנימי 7.6 ננומטר, ויצרו קומפלקסים של כ -130 kDa. בעתיד, מתחמים בגודל דומה יכולים להיחקר על ידי שני NMR ו cryoEM להבהיר היבטים שונים של קרום חלבון המחייב.

הארכת תוקפה של פרוטוקול יכול להיות לחקור nanodiscs המכיל חלבון טראנסממברנלי (TMP) ב bilayer nanodisc. לערום הנגרמת NAPT של-nanodiscs TMP יכול להיות לעומת nanodiscs ריק המכיל אותו הרכב השומנים. לולאות extramembranous גדולות תמנענה ערמה, בעוד לולאות קצרות לא בהכרח תמנע לערום 64. זה יכול להפוך יתרון, כפרוטוקול יכול לשמש כדי לחקור חלבונים מחייבים במיוחד לחלבון הטרנסממברני.

היתרון של שיטה זו הוא כי האינטראקציה קרום ניתן דמיינו מיד. הפשטות היחסית של ביצוע כמויות גדולות של nanodiscs ריק מתבקשת המסקנה כי ניתן להאריךבשיטה זו כדי סינון מצבים שונים כמו pH, טמפרטורה, מאגרים, ותלות-פקטור של חלבון monotopic מחייב. למעשה, בעוד פלטפורמת nanodisc 9 פותחה עבור התייצבות החלבון טראנסממברנלי והוא משמש יותר ויותר למטרה זו, הפוטנציאל שלה ללימודים של המספר הגדול של יותר-או-פחות זמני מחייב חלבונים חיצוניים תאים בתוך הווה צריך בבירור להישמר בראש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מודים המחקר השבדי המועצה, מועצת מחוז שטוקהולם, וקרנות KI על תמיכתם. הביטוי וטיהור MSP בוצע במתקן Core קרולינסקה Institutet / SciLifeLab חלבון המדע (http://PSF.ki.se). המחברים גם רוצה להודות לד"ר Pasi Purhonen וד"ר מתילדה סיוברג על שיתוף המומחיות הטכנית שלהם לסיוע בזמן שלהם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleinschmidt, J. H., Popot, J. L. Folding and stability of integral membrane proteins in amphipols. Arch Biochem Biophys. 564, 327-343 (2014).
  2. Frauenfeld, J., et al. A saposin-lipoprotein nanoparticle system for membrane proteins. Nat Methods. 13 (4), 345-351 (2016).
  3. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat Struct Mol Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  4. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  5. Jonas, A., Steinmetz, A., Churgay, L. The number of amphipathic alpha-helical segments of apolipoproteins A-I, E, and A-IV determines the size and functional properties of their reconstituted lipoprotein particles. J Biol Chem. 268 (3), 1596-1602 (1993).
  6. Grinkova, Y. V., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Engineering extended membrane scaffold proteins for self-assembly of soluble nanoscale lipid bilayers. Protein Eng Des Sel. 23 (11), 843-848 (2010).
  7. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized phospholipid bilayer nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J Am Chem Soc. 135 (5), 1919-1925 (2013).
  8. Ritchie, T. K., et al. Methods in Enzymology. Duzgunes, N. ejat 464, Academic Press. 211-231 (2009).
  9. Schuler, M. A., Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs as a new tool to examine lipid-protein interactions. Methods Mol Biol. 974, 415-433 (2013).
  10. Nasr, M. L., et al. Membrane phospholipid bilayer as a determinant of monoacylglycerol lipase kinetic profile and conformational repertoire. Protein Sci. 22 (6), 774-787 (2013).
  11. Yokogawa, M., et al. NMR analyses of the interaction between the FYVE domain of early endosome antigen 1 (EEA1) and phosphoinositide embedded in a lipid bilayer. J Biol Chem. 287 (42), 34936-34945 (2012).
  12. Wan, C., et al. Insights into the molecular recognition of the granuphilin C2A domain with PI(4,5)P2. Chem Phys Lipids. 186, 61-67 (2015).
  13. Zhang, P., et al. An Isoform-Specific Myristylation Switch Targets Type II PKA Holoenzymes to Membranes. Structure. 23 (9), 1563-1572 (2015).
  14. Grushin, K., Miller, J., Dalm, D., Stoilova-McPhie, S. Factor VIII organisation on nanodiscs with different lipid composition. Thromb Haemost. 113 (4), 741-749 (2015).
  15. Baylon, J. L., Lenov, I. L., Sligar, S. G., Tajkhorshid, E. Characterizing the membrane-bound state of cytochrome P450 3A4: structure, depth of insertion, and orientation. J Am Chem Soc. 135 (23), 8542-8551 (2013).
  16. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Oncogenic and RASopathy-associated K-RAS mutations relieve membrane-dependent occlusion of the effector-binding site. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6625-6630 (2015).
  17. Mazhab-Jafari, M. T., et al. Membrane-dependent modulation of the mTOR activator Rheb: NMR observations of a GTPase tethered to a lipid-bilayer nanodisc. J Am Chem Soc. 135 (9), 3367-3370 (2013).
  18. Wang, L., Sigworth, F. J. Structure of the BK potassium channel in a lipid membrane from electron cryomicroscopy. Nature. 461 (7261), 292-295 (2009).
  19. Ackerson, C. J., Powell, R. D., Hainfeld, J. F. Site-specific biomolecule labeling with gold clusters. Methods Enzymol. 481, 195-230 (2010).
  20. Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (31), 11509-11514 (2006).
  21. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. Membrane protein structure determination - the next generation. Biochim Biophys Acta. 1838 (1 Pt A), 78-87 (2014).
  22. Dias, D. M., Ciulli, A. NMR approaches in structure-based lead discovery: recent developments and new frontiers for targeting multi-protein complexes. Prog Biophys Mol Biol. 116 (2-3), 101-112 (2014).
  23. Viegas, A., Viennet, T., Etzkorn, M. The power, pitfalls and potential of the nanodisc system for NMR-based studies. Biol Chem. , (2016).
  24. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A primer to single-particle cryo-electron microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  25. Wu, S., Armache, J. P., Cheng, Y. Single-particle cryo-EM data acquisition by using direct electron detection camera. Microscopy (Oxf). 65 (1), 35-41 (2016).
  26. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  27. De Carlo, S., Adrian, M., Kalin, P., Mayer, J. M., Dubochet, J. Unexpected property of trehalose as observed by cryo-electron microscopy. J Microsc. 196 (1), 40-45 (1999).
  28. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nat Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  29. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  30. Forte, T. M., Nordhausen, R. W. Electron microscopy of negatively stained lipoproteins. Methods Enzymol. 128, 442-457 (1986).
  31. Zhao, F. Q., Craig, R. Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining. J Struct Biol. 141 (1), 43-52 (2003).
  32. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. J Lipid Res. 52 (1), 175-184 (2011).
  33. Zhang, L., et al. An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein. J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).
  34. Matz, C. E., Jonas, A. Micellar complexes of human apolipoprotein A-I with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions. J Biol Chem. 257 (8), 4535-4540 (1982).
  35. Kumar, R. B., et al. Structural and Functional Analysis of Calcium Ion Mediated Binding of 5-Lipoxygenase to Nanodiscs. PLoS One. 11 (3), e0152116 (2016).
  36. Waggoner, T. A., Last, J. A., Kotula, P. G., Sasaki, D. Y. Self-assembled columns of stacked lipid bilayers mediated by metal ion recognition. J Am Chem Soc. 123 (3), 496-497 (2001).
  37. Kovacs, E., et al. Analysis of the Role of the C-Terminal Tail in the Regulation of the Epidermal Growth Factor Receptor. Mol Cell Biol. 35 (17), 3083-3102 (2015).
  38. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  39. Zhang, L., Tong, H., Garewal, M., Ren, G. Optimized negative-staining electron microscopy for lipoprotein studies. Biochim Biophys Acta. 1830 (1), 2150-2159 (2013).
  40. Cong, Y., Ludtke, S. J. Single particle analysis at high resolution. Methods Enzymol. 482, 211-235 (2010).
  41. Radmark, O., Werz, O., Steinhilber, D., Samuelsson, B. 5-Lipoxygenase, a key enzyme for leukotriene biosynthesis in health and disease. Biochim Biophys Acta. 1851 (4), 331-339 (2015).
  42. Anwar, Y., Sabir, J. S., Qureshi, M. I., Saini, K. S. 5-lipoxygenase: a promising drug target against inflammatory diseases-biochemical and pharmacological regulation. Curr Drug Targets. 15 (4), 410-422 (2014).
  43. Radmark, O., Samuelsson, B. Regulation of the activity of 5-lipoxygenase, a key enzyme in leukotriene biosynthesis. Biochem Biophys Res Commun. 396 (1), 105-110 (2010).
  44. Noguchi, M., Miyano, M., Matsumoto, T., Noma, M. Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta. 1215 (3), 300-306 (1994).
  45. Pande, A. H., Qin, S., Tatulian, S. A. Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys J. 88 (6), 4084-4094 (2005).
  46. Pande, A. H., et al. Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry. 43 (46), 14653-14666 (2004).
  47. Wong, A., Hwang, S. M., Cook, M. N., Hogaboom, G. K., Crooke, S. T. Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry. 27 (18), 6763-6769 (1988).
  48. Rigaud, J. L., Levy, D., Mosser, G., Lambert, O. Detergent removal by non-polar polystyrene beads. European Biophysics Journal. 27 (4), 305-319 (1998).
  49. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  50. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. J Vis Exp. (90), e51087 (2014).
  51. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J Am Chem Soc. 126 (11), 3477-3487 (2004).
  52. Hornschemeyer, P., Liss, V., Heermann, R., Jung, K., Hunke, S. Interaction Analysis of a Two-Component System Using Nanodiscs. PLoS One. 11 (2), 0149187 (2016).
  53. Degrip, W. J., Vanoostrum, J., Bovee-Geurts, P. H. Selective detergent-extraction from mixed detergent/lipid/protein micelles, using cyclodextrin inclusion compounds: a novel generic approach for the preparation of proteoliposomes. Biochem J. 330 (Pt 2), 667-674 (1998).
  54. Martin, D. D., Budamagunta, M. S., Ryan, R. O., Voss, J. C., Oda, M. N. Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein. J Biol Chem. 281 (29), 20418-20426 (2006).
  55. Cerione, R. A., Ross, E. M. Reconstitution of receptors and G proteins in phospholipid vesicles. Methods Enzymol. 195, 329-342 (1991).
  56. Shaw, A. W., McLean, M. A., Sligar, S. G. Phospholipid phase transitions in homogeneous nanometer scale bilayer discs. FEBS Lett. 556 (1-3), 260-264 (2004).
  57. Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  58. Civjan, N. R., Bayburt, T. H., Schuler, M. A., Sligar, S. G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques. 35 (3), 553-562 (2003).
  59. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A step-by-step method for the reconstitution of an ABC transporter into nanodisc lipid particles. J Vis Exp. (66), e3910 (2012).
  60. Brooks, S. P., Storey, K. B. Bound and determined: a computer program for making buffers of defined ion concentrations. Anal Biochem. 201 (1), 119-126 (1992).
  61. Gilbert, N. C., et al. The structure of human 5-lipoxygenase. Science. 331 (6014), 217-219 (2011).
  62. Radmark, O. 5-lipoxygenase-derived leukotrienes: mediators also of atherosclerotic inflammation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (7), 1140-1142 (2003).
  63. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. 534 (7607), 347-351 (2016).
  64. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).

Tags

ביוכימיה גיליון 121 מכתים שלילי מורכב חלבון TEM lipoxygenases ויזואליזציה הלא denaturing ג'ל אלקטרופורזה
השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter