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Biochemistry

विधि कल्पना और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली बातचीत प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

चिकित्सा अनुसंधान में, ज्यादा ध्यान झिल्ली प्रोटीन, या तो आंतरिक या बाह्य, लिपिड बातचीत की एक किस्म में शामिल करने पर केंद्रित है। लिपिड बातचीत प्रोटीन के साथ कार्य करना या तो, इस तरह के डिटर्जेंट के रूप में लिपिड, करने के लिए एक विकल्प का चयन 1 amphipols, या छोटे प्रोटीन 2, या एक झिल्ली विकल्प है कि प्रोटीन घुलनशील और सक्रिय रहता है खोजने भी शामिल है। Lipoic झिल्ली के विकल्प liposomes और nanodiscs (एनडी) 3, 4 शामिल हैं।

Nanodiscs के पास देशी झिल्ली प्लेटफार्मों, प्रोटीन हिस्सा है, ApoA -1 इंजीनियरिंग उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) स्वाभाविक रूप से रक्त में होने वाली द्वारा विकसित कर रहे हैं। ApoA-1 कम amphipathic α-सर्पिलों की एक 243 अवशेषों से लंबी श्रृंखला है और एक लिपिड मुक्त घुलनशील रचना है। इन विट्रो में लिपिड की उपस्थिति में, प्रोटीन ApoA -1 की दो प्रतियां अनायास hydr घेरना पुनर्व्यवस्थित जबएक लिपिड bilayer पैच 5 ophobic एसाइल श्रृंखला भाग। ApoA -1 के इंजीनियर संस्करण आम तौर पर झिल्ली मचान प्रोटीन (एमएसपी) कहा जाता है, और एक बढ़ती हुई संख्या plasmids के रूप में या शुद्ध प्रोटीन के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। अब 6 या 7 छोटे झिल्ली मचान प्रोटीन में repetitions या α-सर्पिलों का विलोपन ApoA-1 परिणाम में। बदले में यह संभव 7 एनएम के लिए 17 8 व्यास में 6 एनएम के आसपास डिस्क फार्म के लिए बनाता है। वहाँ nanodiscs 3, 9 के लिए आवेदनों की विभिन्न प्रकार हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल किया आवेदन एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन 8 के स्थिरीकरण के लिए एक के पास देशी झिल्ली पर्यावरण, पहले 3, 9 की समीक्षा प्रदान करना है। एक कम-पता लगाया उपयोग के अध्ययन के लिए एक nanoscale झिल्ली सतह प्रदान करने के लिए हैपरिधीय झिल्ली प्रोटीन 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17। प्रोटोकॉल की धारा 1 नीचे फॉस्फोलिपिड और झिल्ली मचान प्रोटीन से बना nanodiscs बनाने के लिए प्रक्रिया visualizes।

नमूना तैयार सबसे तरीकों में एक अड़चन है। विधि-विशेष के नमूने विशेष जानकारी जोड़ सकते हैं, लेकिन वे भी परिणाम की तुलना कठिन बनाते हैं। इसलिए, यह आसान है जब नमूने बहुविध कर रहे हैं और कई अलग अलग तरीकों में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है। Nanodiscs के उपयोग के साथ एक लाभ यह liposomes (जैसे, नमूने सीधे, दोनों मंदिर और गैर denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता वर्तमान प्रोटोकॉल के रूप में) की तुलना में nanodisc के छोटे आकार के है।

18 है। हालांकि, एक monotopic झिल्ली प्रोटीन का कोई उच्च संकल्प 3 डी संरचना एक liposome झिल्ली पर एम्बेडेड अभी तक प्रकाशित किया गया है, हम जानते हैं के रूप में दूर के रूप में। सोना नैनोकणों या एंटीबॉडी liposomes या पुटिकाओं मंदिर 19 उपयोग करने के लिए बंधनकारी प्रोटीन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि इन जांच बहुत विशिष्ट होते हैं, वे झिल्ली बाध्यकारी साइट परदा द्वारा या लचीला भागों के साथ हित के क्षेत्रों मास्किंग द्वारा झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। गोल्ड लेबल या एंटीबॉडी complexed प्रोटीन शायद एक जेल पर विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन इस प्रयोग की लागत बढ़ जाएगी।

हालांकि liposomes एक उत्कृष्ट मंच हैं, एक है कि पॉप कुछ नहीं हो सकताआबादी liposome प्रति प्रोटीन की एक विशेष अनुपात, एक विशेषता यह है कि nanodiscs 20 के प्रयोग से पता लगाया जा सकता है। एक liposome में, सहकारकों और substrates घुलनशील इंटीरियर में फंस जा सकता है। पदार्थ है कि झिल्ली में घुलनशील हैं झिल्ली mimetics के दोनों प्रकार के लिए एक ही किस्मत का हिस्सा होगा। फिर भी, के रूप में bilayer क्षेत्र nanodiscs में छोटा होता है, पदार्थ की एक छोटी राशि nanodisc झिल्ली तर करने के लिए आवश्यक है।

परमाणु संरचना के निर्धारण के माध्यम से समझ प्रोटीन समारोह अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए आवश्यक हो गया है। प्रोटीन संरचना निर्धारण के लिए तरीके एक्स-रे 21 शामिल हैं; परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), 22, 23; और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) क्रायोजेनिक तापमान पर 24, cryoEM। cryoEM द्वारा संकल्प हाल ही में काफी सुधार किया गया है, मुख्य रूप से प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डी के उपयोग के कारण25 tectors, 26। बड़े अणुओं एक के पास देशी राज्य में पतली, कांच का बर्फ 27 में imaged हैं। 200 केडीए - हालांकि, जैविक अणुओं के विपरीत कम होने की वजह से वे 100 के आकार की सीमा में पता लगाने के लिए मुश्किल हो गया है। उपयुक्त आकार के नमूने लिए, डेटा संग्रह किया जा सकता है और एक कण पुनर्निर्माण की विधि एक संरचना 28 प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है।

हालांकि, मंदिर से प्रोटीन संरचना के निर्धारण के लिए एक multistep प्रक्रिया है। यह आमतौर पर नकारात्मक दाग मंदिर 29 phosphotungsten (पीटी) 30 या 31 यूरेनियम जैसे भारी धातुओं के लवण का उपयोग करके नमूना monodispersity के मूल्यांकन के साथ शुरू होता है। नकारात्मक दाग macromolecule के एक कम संकल्प मॉडल के पुनर्निर्माण आमतौर पर किया जाता है और आणविक संरचना 29 पर महत्वपूर्ण जानकारी उपज हो सकती है। समान्तर में,डेटा संग्रह का उपयोग कर cryoEM शुरू कर सकते हैं। केयर जब नकारात्मक दाग मंदिर डेटा का मूल्यांकन मूर्ति गठन की गलत व्याख्या से बचने के लिए लिया जाना चाहिए। एक विशेष रूप से मूर्ति फॉस्फोलिपिड पर पीटी दाग का प्रभाव है और 32 liposomes, लंबे पक्ष 33 से देखी सिक्के के ढेर जैसी छड़ के गठन में जिसके परिणामस्वरूप। इस तरह के "Rouleau" या "ढेर" (इसके बाद "ढेर" के रूप में चिह्नित) nanodiscs 35 के लिए एचडीएल 34 के लिए जल्दी पर मनाया गया, और बाद में भी।

स्टैकिंग और झिल्ली के reshaping कई कारणों से हो सकता है। उदाहरण के लिए, यह तांबे की तरह सह कारकों, एक अमोनियम molybdate दाग 36 में मंदिर इमेजिंग द्वारा दिखाए गए द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। liposomes में झिल्ली लिपिड का एक अंश EDTA द्वारा धातु complexation नकल उतार एक iminodiacetic एसिड सिर समूह निहित है, इस प्रकार तांबा आयनों के अलावा के बाद liposomes स्टैकिंग 37। पीटी द्वारा फॉस्फोलिपिड के ढेर गठन जल्दी पर मनाया गया; हालांकि, बाद में काम को हटाने या इस विरूपण साक्ष्य गठन 38 को खत्म करने पर ध्यान केंद्रित किया है।

यहाँ, हम NAPT प्रेरित nanodisc मंदिर से झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन के अध्ययन के लिए स्टैकिंग का लाभ लेने के लिए एक विधि का प्रस्ताव। संक्षेप में, प्रोटीन nanodiscs पर बाध्यकारी स्टैकिंग से nanodiscs को रोका जा सके। हालांकि स्टैकिंग के लिए कारण स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, यह 39 प्रस्तावित किया गया था फॉस्फोलिपिड और पीटी का phosphoryl समूह के बीच एक electrostatic बातचीत है कि, एक दूसरे को (चित्रा 1 ए) के लिए छड़ी करने के लिए डिस्क के कारण। हमारे प्रोटोकॉल के पीछे परिकल्पना है कि जब एक प्रोटीन एक nanodisc को बांधता है, फॉस्फोलिपिड सतह के सबसे availa नहीं है प्रोटीन से steric बाधा के कारण पीटी के साथ बातचीत के लिए ble। यह स्टैक गठन (चित्रा 1 बी) को रोका जा सके। दो निष्कर्ष निकाला जा सकता है। सबसे पहले, स्टैकिंग की रोकथाम मतलब यह है कि ब्याज की प्रोटीन झिल्ली के लिए बाध्य किया है। दूसरे, प्रोटीन-एनडी जटिल से जटिल के किसी न किसी आकृति विज्ञान पाने के लिए मानक एकल कण प्रसंस्करण विधियों 24, 40 के साथ इलाज किया जा सकता है। इसके अलावा, गैर अप्राकृतिकरण जेल वैद्युतकणसंचलन या गतिशील प्रकाश बिखरने जैसे तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है।

इस परिकल्पना को प्रदर्शित करने के लिए, हम झिल्ली बाध्यकारी प्रोटीन 5-lipoxygenase (5LO) है, जो कई भड़काऊ रोगों 41, 42 में शामिल है इस्तेमाल किया। यह 78 केडीए प्रोटीन अपनी झिल्ली 43 करने के लिए बाध्य करने के लिए कैल्शियम आयनों की आवश्यकता है। हालांकि इस झिल्ली एसोसिएशन अध्ययन किया गया है बड़े पैमाने पर liposomes का उपयोग करएस = "xref"> 44, 45, 46 और झिल्ली अंशों 47, ये मंदिर विश्लेषण और संरचना निर्धारण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।

nanodiscs की तैयारी डिटर्जेंट सोडियम cholate में resuspended लिपिड के साथ न्यूनतम समर्थन मूल्य के मिश्रण से शुरू होता है। 1 घंटे के लिए बर्फ पर ऊष्मायन के बाद, डिटर्जेंट धीरे-धीरे एक पी लेनेवाला राल का उपयोग पुनर्गठन मिश्रण से निकाल दिया जाता है। सामग्री के इस प्रकार अक्सर छोटे मोती में आकार polystyrene से बना है। वे अपेक्षाकृत हाइड्रोफोबिक हैं और लिपिड 48 की तुलना में डिटर्जेंट बाध्य करने के लिए एक मजबूत पसंद है। हाइड्रोफोबिक मोतियों को दूर करने और centrifugation का उपयोग स्पष्टीकरण प्रदर्शन के बाद, nanodiscs आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा शुद्ध कर रहे हैं। शुद्ध nanodiscs एक equimolar अनुपात (या एक अनुमापन के लिए कई अनुपात) में एक monotopic झिल्ली प्रोटीन (और संभव सहकारकों) के साथ मिश्रित कर रहे हैं और अनुसंधान करने के लिए छोड़ दिया जाता हैeact (15 मिनट)। मंदिर से विश्लेषण चमक छुट्टी दे दी, कार्बन-लेपित ग्रिड पर नमूना की μL-मात्रा में लगाने से और फिर NAPT साथ नकारात्मक धुंधला प्रदर्शन से बाहर किया जाता है। जब aliquots मंदिर ग्रिड के लिए लागू किया गया था से एक ही नमूना गैर अप्राकृतिकरण या एसडीएस पृष्ठ जेल-वैद्युतकणसंचलन, साथ ही द्वारा गतिविधि माप के विभिन्न प्रकार के द्वारा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कोई बड़े बदलाव के साथ।

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Protocol

1. Nanodiscs की तैयारी

  1. अभिव्यक्ति और झिल्ली मचान 8 प्रोटीन की शुद्धि, 35
    1. एक्सप्रेस ई कोलाई BL21 में उनकी टैग MSP1E3D1 (DE3) बोतल में T1R pRARE2 तनाव। लेग माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 माइक्रोग्राम / एमएल Kanamycin के साथ पूरक के साथ एक 50-एमएल रात भर स्टार्टर संस्कृति तैयार करें। कमाल का शोरबा मध्यम 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन के साथ पूरक के 2 एल में रात भर स्टार्टर संस्कृति पतला।
    2. 600 एनएम (600 आयुध डिपो) पर ऑप्टिकल घनत्व तक 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को विकसित लगभग 3. 18 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 0.5 मिमी isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित तक पहुँचता है।
    3. lysis बफर (; 100 मिमी NaCl, और 10% ग्लिसरॉल 100 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0) तैयार करें। उपयोग करने से पहले तुरंत 1 मिमी TCEP जोड़ें।
    4. 18 डिग्री सेल्सियस पर प्रेरण के 3 घंटे के बाद, 4500 XG पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसलऔर 4 डिग्री सेल्सियस। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, काटा कोशिकाओं तौलना, और 2 सेल के एमएल प्रति कोशिकाओं की जी बफर के अनुपात में lysis बफर में उन्हें फिर से निलंबित।
    5. Lyse स्पंदित sonication (पुनरावृत्ति दर: 4 एस पर, 4 एस रवाना) द्वारा कोशिकाओं 80% आयाम पर 3 मिनट के लिए।
    6. 49,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए lysates अपकेंद्रित्र। इस centrifugation से गोली त्यागें।
    7. 5 एमएल नी में सतह पर तैरनेवाला + एक स्वचालित तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली अधिमानतः 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा से जुड़े chelating स्तंभ इंजेक्षन।
    8. उनकी टैग न्यूनतम समर्थन मूल्य के अलावा सभी प्रोटीन को हटाने के लिए 3 से नीचे - क्षालन कदम (कदम 1.1.9) इससे पहले, buffers 1 के साथ स्तंभ धो लें। 280 एनएम शुद्धिकरण की प्रक्रिया का पालन करने में प्रोटीन सामग्री की निगरानी; 280 एनएम पर यूवी रिकॉर्डिंग वापस आधारभूत प्रत्येक धोने के बाद जाना चाहिए।
      1. 40 मिमी Tris एचसीएल, 300 मिमी NaCl, 10 मिमी imidazole, और 1% ट्राइटन, 8.0 पीएच: धो बफर 1 से धो लें।
      2. 40 मिमी Tris एचसीएल, 300 मिमी: धो बफर 2 से धोएंNaCl, 20 मिमी imidazole, और 50 मिमी सोडियम cholate, 8.0 पीएच।
      3. 40 मिमी Tris एचसीएल, 300 मिमी NaCl, और 50 मिमी imidazole, 8.0 पीएच: धो बफर 3 से धो लें।
    9. 40 मिमी Tris एचसीएल, 300 मिमी NaCl, और 500 मिमी imidazole, पीएच 8.0 के साथ न्यूनतम समर्थन मूल्य Elute।
    10. जेल निस्पंदन 8, 35 से मानक बफर (; 100 मिमी NaCl और 0.5 मिमी EDTA 20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5) न्यूनतम समर्थन मूल्य के लिए बफर बदलें; प्रति बैच उपज लगभग 7 मिलीग्राम एल -1 होना चाहिए।
  2. फॉस्फोलिपिड शेयर समाधान की तैयारी
    1. 1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine (POPC) क्लोरोफॉर्म में भंग के 305 μL 25 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता एक गिलास बीकर में जोड़ें और नाइट्रोजन की एक सौम्य धारा के साथ इसे मिटाने से क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना । एक निर्वात desiccator में लिपिड रात भर सूखी। नोट: यह कदम लिपिड, जो कांच बीकर के नीचे लिपिड की एक पतली फिल्म के पत्तों से विलायक दूर करने के लिए किया जाता है।
    2. एमएसपी मानक बफर ट्यूब vortexing जब तक समाधान पारदर्शी हो जाता है तक 100 मिमी सोडियम युक्त cholate के 200 μL में लिपिड केक Resuspend; इस 50 मिमी की एक POPC एकाग्रता के साथ एक समाधान प्रदान करेगा।
      नोट: 2 (लिपिड: डिटर्जेंट) 8 सामान्य तौर पर, इस बिंदु पर डिटर्जेंट के लिए लिपिड की दाढ़ अनुपात 1 होना चाहिए। इस लिपिड डिटर्जेंट मिश्रण लगभग 2 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. डिटर्जेंट हटाने के लिए हाइड्रोफोबिक मोतियों की तैयारी
    1. मोतियों की 5 ग्राम (सूखी वजन) एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें।
    2. ultrapure पानी के 40 एमएल के साथ तो 100% मेथनॉल के 30 एमएल के साथ मोती धो और।
    3. 10 एमएसपी एमएल मानक बफर के साथ मोती धो लें। अंत में, 4 डिग्री सेल्सियस पर एमएसपी मानक बफर के 15 एमएल के साथ मोती की दुकान।
  4. Nanodisc पुनर्गठन
    1. एक microfuge ट्यूब में MSP1E3D1 (0.124 मिमी) के 190 μL बांटना और फॉस्फोलिपिड शेयर समाधान (50 मिमी पी के 61.5 μL जोड़नेओपीसी) एक ही ट्यूब करने के लिए। 1 घंटे के लिए गीला बर्फ पर पुनर्गठन मिश्रण सेते हैं। नोट: 130 (MSP1E3D1: POPC) यह 1 के एक दाढ़ अनुपात बराबर होती है।
    2. आत्म विधानसभा की प्रक्रिया शुरू करने के पुनर्गठन के मिश्रण के एमएल प्रति मोतियों की 0.5 ग्राम की एकाग्रता पर हाइड्रोफोबिक मोती जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए एक रोटरी इनक्यूबेटर में सेते हैं।
    3. ऊष्मायन के बाद, 13,000 XG पर 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेंट्रीफ्यूज अवक्षेप और समुच्चय हटा दें। गोली त्यागें और सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए।
    4. एमएसपी मानक बफर के साथ आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ (एक स्वचालित तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली पर घुड़सवार) संतुलित करना है जब तक 280 एनएम पर absorbance स्थिर है। स्तंभ में सतह पर तैरनेवाला इंजेक्षन और शिखर अंशों इकट्ठा।
    5. 280 एनएम पर चोटी भागों में nanodiscs की सांद्रता उपाय। Nanodisc एकाग्रता की गणना के लिए MSP1E3D1 (ε = 29910 सेमी -1 एम -1) की दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक का प्रयोग करें। ध्यान देंnanodisc प्रति लिपिड की संख्या radiolabeled लिपिड और फॉस्फेट विश्लेषण 4 के संयोजन के द्वारा या फॉस्फेट विश्लेषण द्वारा अकेले मापा जा सकता है।

2. Monotopic प्रोटीन की तैयारी 5-lipoxygenase 35

  1. एक रात में स्टार्टर संस्कृति तैयार करें। 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के साथ लेग माध्यम के 50 एमएल अनुपूरक। ई कोलाई BL21 (DE3) 5-lipoxygenase जीन (ALOX5) की प्लाज्मिड युक्त मध्यम टीका लगाना। अभिव्यक्ति से युक्त 42 मिमी ना 2 HPO 4, 24 मिमी 2 के.एच. पीओ 4, 9 मिमी NaCl, 19 मिमी एनएच 4 सीएल, 1 मिमी MgSO 4, 0.1 मिमी 2 CaCl, 0.2% डी ग्लूकोज, 0.1 माध्यम में रात भर स्टार्टर संस्कृति पतला %, 5 माइक्रोन के FeSO 4, और 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन। आयुध डिपो के 600 ~ 0.5 से कम 25 डिग्री सेल्सियस तक कोशिकाओं को विकसित। 20 डिग्री सेल्सियस 35 पर 16 घंटे के लिए 0.2 मिमी IPTG के साथ प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित।
  2. 7000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा हार्वेस्ट और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। (; 100 मिमी NaCl, 10% ग्लिसरॉल, और 1 मिमी TCEP 100 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 8.0) protease अवरोध और 0.5 युक्त गोली काटा कोशिकाओं और lysis बफर में resuspend काटा कोशिकाओं से युक्त ट्यूब के नीचे पाया वजन मिलीग्राम / एमएल प्रति कोशिकाओं की जी lysis बफर के 2 एमएल के अनुपात में 35 लाइसोजाइम।
  3. 80% आयाम पर 5 एक्स 15 एस के लिए sonication द्वारा कोशिकाओं lyse। 7000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा सेल मलबे को हटाने। समाधान 35 में प्रोटीन वेग से 60% संतृप्ति - 30 के लिए अमोनियम सल्फेट वर्षा प्रदर्शन करना। 16,000 XG पर 15 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। नोट: 5LO गोली तेजी से जमा किया जा सकता है और ऊपर से 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।
  4. 40,000 XG पर 15 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए lysis बफर और सेंट्रीफ्यूज के 20 एमएल के साथ गोली Resuspend।
  5. पर सतह पर तैरनेवाला सेते 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक एटीपी agarose स्तंभ। सेल 0.5 एम NaCl युक्त बफर के एक स्तंभ मात्रा के साथ एक बार स्तंभ धो लें। सेल 10 माइक्रोन FeSO 4 और 20 माइक्रोग्राम / एमएल catalase युक्त बफर में 20 मिमी एटीपी के साथ 5LO Elute। एटीपी 35 को हटाने के लिए जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी प्रदर्शन करना।
    ध्यान दें: 5LO अस्थिर है और तुरंत शुद्धि के बाद किया जाना चाहिए। अन्यथा, यह अमोनियम सल्फेट वर्षा के कदम (कदम 2.1.3 के बाद टिप्पणी देखें) पर रोकने के लिए सिफारिश की है।

3. Nanodisc-प्रोटीन जटिल की तैयारी

  1. परिसर के 100 μL की कुल मात्रा को तैयार है। मिक्स 0.8 माइक्रोन के एन डी और एमएसपी मानक बफर में 1 मिमी सीए 2 वर्तमान के साथ 0.8 माइक्रोन के 5LO (20 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 7.5, 100 मिमी NaCl, 0.5 मिमी EDTA, और 1.5 मिमी CaCl 2) और 10 मिनट के लिए सेते बर्फ पर। नोट: नमूना एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 35 के लिए भंडारित किया जा सकता है।
ove_title "> 4। नमूनों के विश्लेषण

  1. जेल वैद्युतकणसंचलन
    1. गैर denaturing वैद्युतकणसंचलन
      1. लोड हो रहा है बफर के 5 μL (50 मिमी BisTris, 6 एन एचसीएल, 50 मिमी NaCl, 10% (w / v) ग्लिसरॉल, और 0.001% रक्तवर्ण रंग एस, पीएच 7.2) 49 के साथ नमूना के मिश्रण 15 μL और एक 4 पर इसे लोड - 16% बीआईएस Tris जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करने के लिए।
      2. प्रकाश कैथोड कैथोड बफर के साथ टैंक भरें (; 50 मिमी tricine, पीएच 6.8, 50 मिमी बीआईएस Tris और 0.002% Coomassie जी 250) और बफर (50 मिमी बीआईएस Tris और 50 मिमी tricine, पीएच 6.8) के साथ चल रहे एनोड टैंक। 150 वी पर एक निरंतर वोल्टेज का उपयोग करके जुदाई शुरू
      3. electrophoretic जुदाई बंद करो जब Coomassie सामने जेल के अंत तक पहुँचता है।
      4. एक मानक Coomassie नीले प्रोटोकॉल के साथ जेल दाग।
    2. अप्राकृतिकरण वैद्युतकणसंचलन
      1. (लोडिंग एसडीएस युक्त बफर के 10 μL के साथ नमूना के 40 μL मिक्स 0.05% (w / v) Bromophenol नीले, 0.2 एम Tris एचसीएल,पीएच 6.8; 20% (वी / वी) ग्लिसरॉल; 10% (w / v) एसडीएस; और 10 मिमी 2-मर्केप्टोइथेनाल) और एक 4 पर इसे लोड - 20% Tris ग्लाइसिन जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करने के लिए।
      2. बफर चलाने के साथ कैथोड और एनोड टैंक को भरने (25 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 6.8; 200 मिमी ग्लाइसिन, और 0.1% (w / v) एसडीएस)। 150 वी पर एक निरंतर वोल्टेज का उपयोग करके जुदाई शुरू
      3. electrophoretic जुदाई बंद करो जब लोडिंग डाई सामने जेल के अंत तक पहुँचता है।
      4. एक मानक Coomassie नीले प्रोटोकॉल के साथ जेल दाग।
  2. NAPT समाधान की तैयारी
    1. कमरे के तापमान पर आंदोलन से पानी की 50 एमएल में phosphotungstate सोडियम नमक के 1 ग्राम भंग एक 2% (डब्ल्यू / वी) अम्लीय समाधान देने के लिए।
    2. 1 एम NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें। एक 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर कणों को दूर। कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर।
  3. मंदिर के विश्लेषण के लिए नमूने की तैयारी
    1. ग्लो निर्वहन कार्बन-लेपित तांबे ग्रिड (430 मा 00 जाल) 20 S के लिए ग्रिड नमूने की सोखना से पहले हाइड्रोफिलिक प्रस्तुत करना। ग्रिड पर नमूना (nanodiscs के लिए सम्मान के साथ 0.8 माइक्रोन) के 3.5 μL प्लेस और 30 एस के लिए सेते हैं। नोट: मात्रा लागू किया नमूना एकाग्रता के आधार पर 2.5 और 5 के बीच μL भिन्न हो सकते हैं। 1 माइक्रोन - nanodiscs के लिए एक उपयुक्त एकाग्रता रेंज 0.5 है।
    2. फिल्टर पेपर का उपयोग अधिशेष समाधान बंद दाग।
    3. इसके तत्काल बाद 30 एस के लिए 2% NAPT की एक बूंद के साथ ग्रिड दाग। अतिरिक्त समाधान बंद ब्लाट और शुष्क हवा की ग्रिड छोड़ दें।
    4. मंदिर से ग्रिड का मूल्यांकन। 120-200 कीव वोल्टेज में तेजी के साथ एक माइक्रोस्कोप स्टैकिंग की हद तक अनुमान लगाने के लिए काफ़ी है। नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, एक calibrated संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप, इस्तेमाल किया गया था एक 200 कीव क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक से लैस।
    5. रिकॉर्ड मंदिर छवियों। लंबे ढेर दिखा छवियों के लिए, आगे की प्रक्रिया नहीं है; छवियों nanodiscs के जटिल, बाह्य प्रोटीन के साथ कि कुछ भी हो सकते हैं दिखानेलघु ढेर, लेकिन सबसे कणों परिसर में कर रहे हैं। रिकार्ड कई छवियों और प्रक्रिया मानक तरीकों वर्ग की औसत और एक कम संकल्प, परिसर के 3 आयामी मॉडल प्राप्त करने के लिए के अनुसार इन।
      नोट: नकारात्मक दाग डेटा के संग्रह के लिए, ग्रिड कम से कम तीन अलग अलग दिनों पर किए गए थे। प्रत्येक दिन के लिए, ताजा नमूना incubations (3.1 कदम के रूप में) से पहले नकारात्मक दाग लागू किया गया था बनाया गया था।

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Representative Results

विधि हम प्रस्ताव nanodiscs की तैयारी monotopic झिल्ली प्रोटीन बाध्यकारी के लिए झिल्ली सतह प्रदान करने पर निर्भर करता है। कोई transmembrane प्रोटीन nanodisc लिपिड bilayer में एम्बेडेड है के रूप में, nanodiscs यहाँ "खाली nanodiscs" (2A चित्रा) के रूप में चिह्नित हैं। इन दो MSP1E3D1 मचान प्रोटीन और POPC 8 के चारों ओर 260 अणुओं की एक रचना के लिए 256 केडीए के एक गणना की आणविक भार है। इस प्रोटीन का प्रयोग: पुनर्गठन के लिए लिपिड अनुपात, एक प्रमुख शिखर (2A चित्रा) जेल छानने के दौरान eluted था। लगभग 9 एमएल (2A चित्रा) शिखर अंशों नीले देशी जेल वैद्युतकणसंचलन 49 द्वारा जांच की गई, एक बैंड (चित्रा 2 बी, लेन 1) दिखा। हालांकि बैंड एक आकार गणना की 256 केडीए से कुछ बड़ा करने के लिए मेल खाती है, nanodisc व्यास मंदिर छवियों में मापा से मेल खाती है13 एनएम ± 0.5 एनएम की उम्मीद है।

Monotopic झिल्ली प्रोटीन 5-lipoxygenase (5LO) के रूप में पहले 35 (प्रोटोकॉल चरण 2) के ऊपर और अधिक विस्तार में वर्णित शुद्ध किया गया था। 78 केडीए 5LO की एकरूपता एसडीएस पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन (चित्रा -2 सी, लेन 1) द्वारा विश्लेषण किया है और पूरी तरह कार्यात्मक 35 () नहीं दिखाया गया था।

इस प्रोटोकॉल में, की स्थिति जानबूझकर बनाए जाते हैं जो nanodiscs की स्टैकिंग बढ़ावा देने के। हालांकि, यह है कि इस स्टैकिंग विशेष रूप से अंतिम चरण के बाद सभी अन्य उपचार और परिवर्धन किया गया था के रूप में नकारात्मक दाग सोडियम phosphotungstate के अलावा द्वारा, केवल मंदिर इमेजिंग (तथाकथित नमूनों) के लिए किए गए नमूनों में प्रेरित किया है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। वास्तव में, NAPT से सना हुआ nanodiscs की छवियों एचडीएल 34 के लिए उम्मीद स्टैकिंग (चित्रा 3 ए) पर बहुत जल्दी दिखाने 5, 50। के रूप में चित्रा 1 ए में रेखाचित्र के रूप में वर्णित है और झांग एट अल द्वारा प्रस्तावित (चित्रा 3 ए) "की ओर से देखा सिक्के की लंबी ढेर", nanodiscs bilayers के बीच intercalated phosphotungstate साथ एकत्रित कर रहे हैं। 32, 39।

यह जांच करने के लिए बफ़र्स में विभिन्न परिवर्धन को प्रभावित हैं, रोकने, या यहां तक ​​कि स्टैकिंग प्रेरित महत्वपूर्ण है, और नीचे के रूप में स्पष्ट हो जाएगा, कैल्शियम आयनों के प्रभाव के लिए आवश्यक जांच। चित्रा 3 बी में, स्टैकिंग अभी भी एक नमूना जहां कैल्शियम आयनों NAPT साथ धुंधला पहले nanodisc समाधान करने के लिए जोड़ा गया था में मौजूद है।

प्रोटोकॉल में आवश्यक कदम चित्रा 4, जहां झिल्ली-बिन में दिखाया गया हैडिंग प्रोटीन समाधान में मौजूद है। स्टैकिंग NAPT दाग से प्रेरित नहीं किया जा सकता है जब 5LO nanodiscs (चित्रा 4 ए) की झिल्ली की सतह के लिए बाध्य किया गया था। 1, के रूप में रेखाचित्र (सही चित्रा 1 बी नीचे) चित्र 1 में दिखाया गया है: यह नमूना के लिए, nanodiscs को 5LO की दाढ़ अनुपात 1 था। इसके अलावा, के रूप में nanodiscs के लिपिड bilayer दोनों पक्षों से सुलभ है, liposomes के विपरीत, दो 5LO एक करने के लिए nanodisc के अनुपात से तैयार किए गए थे के साथ, नमूनों जबकि मंदिर छवियों और भी कम स्टैकिंग (चित्रा 4 बी) दिखा।

बाइंडिंग के लिए, कुछ बाह्य झिल्ली प्रोटीन झिल्ली में एक विशिष्ट लिपिड की उपस्थिति पर निर्भर हो सकता है, इस तरह के phosphoinositols के रूप में 10, 11, 12 या 10 phosphatidylserine। 5LO के मामले में, सीए 2 की उपस्थिति neces हैSary 43। चित्रा -4 ए और बी, कैल्शियम आयनों nanodiscs और 5LO के साथ समाधान में उपस्थित थे। दूसरे शब्दों में, न केवल स्टैकिंग की कमी से पता चलता है कि monotopic प्रोटीन बाध्य किया गया है, लेकिन यह भी बाध्यकारी सीए 2 आयनों पर निर्भर करता है। आदेश में यह दिखाने के लिए, एक समाधान nanodiscs और 5LO लेकिन कैल्शियम के बिना युक्त NAPT के साथ दाग और मंदिर (चित्रा 4C) से ली गई। जैसी कि उम्मीद थी, 5LO सीए 2 बिना nanodiscs करने के लिए बाध्य नहीं कर सकते, समाधान में मुक्त 5LO छोड़ रहा है, इसलिए nanodiscs ढेर बजाय (चित्रा 4C)।

आकृति 1
चित्रा 1. Nanodisc Stacking और विधि का अवलोकन का सिद्धांत। ए nanodisc स्टैकिंग का सिद्धांत। nanodiscs (बाएं) का एक समाधान करने के लिए नकारात्मक दाग सोडियम phosphotungstate के अलावा वें की ओर जाता है ई nanodiscs (दाएं) फॉस्फोलिपिड bilayer और पीटी अणुओं (मध्यम, काले डॉट्स) के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक बलों (मध्य, तीर) की वजह से स्टैकिंग। प्रोटोकॉल के बी योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। खाली nanodiscs (बाएं) एक बाह्य झिल्ली प्रोटीन (ग्रे) एक जटिल प्रपत्र को बाँध, चार अलग अलग कोण (निम्न मध्य) से दर्शाया। monotopic प्रोटीन की उपस्थिति sterically जब phosphotungstate नमक के साथ दाग स्टैकिंग से nanodiscs रोकता है (कम सही), स्टैकिंग किसी भी बड़ी वस्तुओं (ऊपरी दाएं) के अभाव में प्रेरित करने के लिए इसके विपरीत। ग्रीन और नारंगी रंग के छल्ले फॉस्फोलिपिड कोर, जो हल्के भूरे रंग में प्रतिनिधित्व किया है चारों ओर दो एमएसपी लपेटकर प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2. Nanodiscs और 5LO की एकरूपता विश्लेषण। पुनर्गठन खाली nanodiscs के ए आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी। 9 एमएल nanodiscs चोटियों के क्षालन। बी गैर denaturing एसईसी से चोटी अंश (ए) में दिखाया गया है की जेल electrophoretic विश्लेषण। लेन एम मार्कर होता है। एक एकल बैंड लेन 1, जहां 9 एमएल में चोटी अंश भरी हुई थी में मौजूद है। सी शुद्ध 5LO की जेल electrophoretic विश्लेषण अप्राकृतिकरण। 78 केडीए 5LO चलता लेन 1 में एक गहन बैंड के रूप में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
प्रोटीन की अनुपस्थिति मंदिर से विश्लेषण में Nanodiscs की चित्रा 3. ढेर गठन। ए Nanodisc स्टैकिंग w प्रेरित किया गया थामुर्गी NAPT के साथ दाग। जब तरफ से देखा "सिक्कों के ढेर" nanodiscs के ढेर हैं। प्रत्येक nanodisc एक सफेद बैंड के रूप में प्रकट होता है। जब NAPT के साथ दाग बी Stacking nanodisc समाधान में कैल्शियम आयनों की मौजूदगी से परेशान नहीं किया गया था। स्केल सलाखों 100 एनएम हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एक सहायक कारक मंदिर से विश्लेषण की उपस्थिति में प्रोटीन की बंधन से ढेर गठन को रोकने। 1 (ए) या: 2: 1 (बी) ए और बी कैल्शियम आयनों 1 की दाढ़ अनुपात में 5LO के मिश्रण और nanodiscs में उपस्थित थे। अधिक 5LO nanodiscs के लिए बाध्य है, कम nanodiscs stacking के लिए उपलब्ध है, के रूप में (बी) में दिखाया जाता है। बो में एकल कण परिसरोंवें (ए) और (बी) आगे की प्रक्रिया 35 के लिए उपयुक्त हैं। सी कैल्शियम आयनों के अभाव में, 5LO बाध्य नहीं कर सकते हैं। इस नमूने के NAPT धुंधला हो जाना, nanodiscs की खासियत स्टैकिंग चलता 5LO अपार जा रही है। स्केल सलाखों 100 एनएम हैं। छवियों 69,500x की एक बढ़ाई पर एक 4K एक्स 4K सीसीडी कैमरे द्वारा हासिल किया गया। सीसीडी कैमरे के पिक्सेल आकार 15 माइक्रोन, जो ईएम छवियों के लिए नमूना स्तर पर 2.16 ए के एक इसी मूल्य देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

खाली nanodiscs के पुनर्गठन, प्रोटीन-nanodisc परिसरों की तैयारी है, और इन परिसरों के मंदिर के लिए नकारात्मक धुंधला: विधि को तीन भागों में विभाजित किया जा सकता है। प्रत्येक भाग तकनीक, महत्वपूर्ण कदम है, और उपयोगी संशोधनों की सीमाओं के बारे में अलग से संबोधित किया जाएगा।

खाली nanodiscs का पुनर्गठन। महत्वपूर्ण कदम है और उत्पादन और nanodiscs के उपयोग में सीमाओं।

खाली nanodiscs की तैयारी के लिए यह न्यूनतम समर्थन मूल्य के लिए लिपिड अनुपात अनुकूलन करने के लिए आवश्यक है। सबसे आम एमएसपी और लिपिड (एक साबुन के रूप में cholate का उपयोग) के लिए, इष्टतम अनुपात के लिए सुझाव साहित्य में पाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 125 - MSP1E3D1 8, 51 प्रति 130 POPC वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रयुक्त)। मतभेद प्रकाशित अनुपातों की तुलना में प्राप्त प्रोटीन एकाग्रता दृढ़ संकल्प, एल की दक्षता के लिए विधि पर निर्भर हो सकता हैडिटर्जेंट में ipid solvation, और समाधान से डिटर्जेंट हटाने की विधि।

हम हाइड्रोफोबिक मनकों का उपयोग 48 (1.3 चरण) डिटर्जेंट हटाने प्रदर्शन करने के लिए है, जबकि संभव विकल्पों डायलिसिस या cyclodextrin 52, 53 के अलावा हैं प्रस्ताव। प्रारंभ में, डायलिसिस एचडीएल 5, 34 के पुनर्गठन के लिए इस्तेमाल किया गया था और अब भी पसंद किया जाता है 54। डिटर्जेंट हटाने के लिए विधि के बावजूद, गति आवश्यक है। हटाने की भी तेजी (हाइड्रोफोबिक मोतियों की मात्रा बहुत बड़ी है) है, लिपिड के साथ न्यूनतम समर्थन मूल्य की सहज पुनर्व्यवस्था घटित करने के लिए समय नहीं हो सकता। इसके बजाय, लिपिड और प्रोटीन समुच्चय की बड़ी मात्रा में हो सकता है। आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी से परिणाम शून्य मात्रा में liposomes की बड़ी मात्रा में दिखा सकते हैं पुनर्गठन nanodiscs की एक सबऑप्टिमल शिखर, और अप्रयुक्त की एक बड़ी चोटीएमएसपी 4, 6, 51। हाइड्रोफोबिक मोतियों की भी छोटे एक मात्रा के लिए, डिटर्जेंट हटाने अधूरा हो सकता है, और nanodiscs कि फार्म आकार, जहां सबसे अधिक उम्मीद की तुलना में छोटे होते हैं में एक परिवर्तन दिखा सकते हैं। एक नीचे पुनर्गठन की गति को धीमा करने के लिए एक बड़ी अतिरिक्त बजाय हाइड्रोफोबिक मोतियों की छोटी मात्रा के दो अतिरिक्त परीक्षण कर सकता है।

लिपिड के चुनाव को ध्यान से विचार किया जाना चाहिए 8, 9, 45, 46, 55, nanodisc तैयार करने के लिए उद्देश्य पर निर्भर करता है। सामान्य तौर पर, (के रूप में अच्छी तरह से 2 डी क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए के रूप में, nanodiscs या liposomes के पुनर्गठन) झिल्ली के गठन के उद्देश्य से सभी तरीकों के लिए, लिपिड एक "तरल पदार्थ" राज्य 56 में होना चाहिए। एक निश्चित तापमान के नीचे, वेंई लिपिड कठोर है। इस तथाकथित संक्रमण तापमान (टीएम) के ऊपर, लिपिड तरल पदार्थ है। ध्यान दें कि कुछ सामान्य रूप से प्रयुक्त संतृप्त लिपिड एक टीएम अच्छी तरह से कमरे के तापमान के ऊपर है। इसके अलावा, लिपिड मिश्रण के लिए, लिपिड सरस्वती की miscibility 57 पर विचार किया। Nanodisc गठन के लिए अधिकतम तापमान लिपिड के चरण संक्रमण (टीएम) के आसपास है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में डिटर्जेंट सोडियम cholate 8 है। एक और डिटर्जेंट में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, cholate के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में एक ही सांद्रता सीधे इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। कुछ हल्के डिटर्जेंट लिपिड भंग कम कुशलता, और एक उच्च एकाग्रता की जरूरत हो सकती है। लिपिड केक क्लोरोफॉर्म (प्रोटोकॉल में 1.2.2 कदम) के वाष्पीकरण के बाद प्राप्त डिटर्जेंट द्वारा एक स्पष्ट समाधान में भंग किया जाना चाहिए। Vortexing, फ्रीज विगलन चक्र, अल्ट्रासाउंड स्नान, या sonication solubilization में तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

combinat के लिएलिपिड के आयनों (-mixtures), न्यूनतम समर्थन मूल्य, और यहाँ इस्तेमाल उन लोगों के, बड़े समुच्चय और liposomes या अधिक एमएसपी को कम करने के अनुमापन के अलावा अन्य डिटर्जेंट आवश्यक 4, 6, 51, 58 हैं। एमएसपी और फॉस्फोलिपिड के कुछ संयोजन के लिए, अनुकूलन दूसरों 4, 6, 51 के लिए अधिक से अधिक कठिन हो सकता है, और यह शिखर अंशों की सामग्री का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हो जाता है। Nanodisc संरचना और आकार के विश्लेषण के लिए सबसे सटीक विधि फॉस्फेट विश्लेषण 4 द्वारा न्यूनतम समर्थन मूल्य प्रति फॉस्फोलिपिड की संख्या का निर्धारण और nanodisc आणविक वजन की गणना करने के लिए है। Nanodisc आकार अच्छी तरह से सुलझाया, गैर denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन से अनुमान लगाया जा सकता है; गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) 59; या नकारात्मक दाग मंदिर, केवल कुछ ही नाम के तरीकों के लिए। Nega लिए के रूप मेंसक्रिय दाग प्रेरित स्टैकिंग प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत किया, मंदिर छवियों में मौजूद ढेर की चौड़ाई की माप nanodiscs के व्यास अर्जित करता है।

अभिव्यक्ति और झिल्ली मचान प्रोटीन की शुद्धि के लिए के रूप में, सभी सामान्य सावधानियों और एक घुलनशील प्रोटीन के लिए चिंता लिया जाना चाहिए। plasmids अलग टैग और प्रोटीज दरार साइटों को शामिल कर सकते उपलब्ध मामले में टैग एमएसपी उपयोग करने से पहले हटा दिया जाना चाहिए।

5LO, monotopic प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया प्रोटीन, निष्क्रिय तेजी से जब तक सावधानियों ले रहे हैं कहीं और 35 में वर्णित है और उसमें संदर्भ में। संक्षेप में, उत्प्रेरक लोहे आसानी से खो दिया है, और ऑक्सीकरण की स्थिति 5LO की dimerization का कारण बन सकता है। के रूप में टिप्पणी (प्रोटोकॉल कदम 2.1.3) में कहा गया है, शुद्धि वर्षा कदम और बाद में उपयोग करें जब तक संग्रहित aliquots के बाद रुका जा सकता है। एक विभाज्य की शुद्धि के बाद, प्रोटीन के भीतर कुछ ही घंटों घ इस्तेमाल किया जाना चाहिए तेजी से निष्क्रियता से 35 UE।

प्रोटीन nanodisc परिसरों की तैयारी में महत्वपूर्ण कदम।

monotopic प्रोटीन nanodisc क्षेत्र बनाम के आकार के महत्व का है। MSP1E3D1 प्रोटीन श्रृंखला की लंबाई 10.5 एनएम भीतरी व्यास के साथ एक और 8,900-एक 2 bilayer क्षेत्र 8 के बारे में nanodisc से मेल खाती है। इस क्षेत्र 5LO 45 की झिल्ली एम्बेडेड भाग के लिए रिपोर्ट करने के लिए अच्छी तरह से मेल खाती है। इस प्रकार, हमारी उम्मीद बाध्यकारी अनुपात 1: 1, या ज्यादा से ज्यादा 2: 1 nanodisc प्रति 5LO। के रूप में एक अनुमापन प्रयोग 35 की रिपोर्ट में यह सही साबित हुई। हालांकि, अधिक से अधिक nanodisc प्रति दो 5LO के बंधन प्राप्त नहीं किया गया था, के रूप में कहीं 35 पर चर्चा की। एक कुछ बड़ा nanodisc संभवतः एक पूर्ण 2 के लिए अनुमति दे सकता है: 1 प्रयोगों जहां यह वांछनीय है के लिए बाध्यकारी है, लेकिन इस मामले में, 1: 1 के अनुपात में मुख्य उद्देश्य है।

ove_content "> प्रोटीन nanodisc जटिल गठन के लिए इष्टतम लिपिड के चुनाव पिछले ज्ञान के द्वारा सहायता प्राप्त की जा सकती है। यह वर्तमान प्रोटोकॉल, जहां लिपिड की पसंद सिंथेटिक POPC 35 था में मामला था। लिपिड सिर समूह 46 और रूपों में दोनों रूपों एसाइल चेन 45 की संतृप्ति में liposome-5LO बाध्यकारी अध्ययन में परीक्षण किया गया। 5LO गतिविधि एस.एन. -2 एसाइल श्रृंखला स्थिति 45, 46 में असंतृप्त कोलीन फॉस्फोलिपिड युक्त liposomes पर बाध्यकारी की वृद्धि हुई थी। विशिष्ट आवश्यकताओं लिपिड ज्ञात नहीं कर रहे हैं, लेकिन मूल झिल्ली की पहचान, जाना जाता है प्राकृतिक लिपिड अर्क परीक्षण किया जा सकता पहले 55।

एक सहायक कारक निर्भरता 5LO, जो झिल्ली बाध्यकारी 43 सीए 2 आयनों पर निर्भर करता है के लिए जाना जाता था। यह पूरी तरह से समाधान से कैल्शियम को दूर करने की चुनौती दे रहा है। इधर, complexing एजेंट EDTA मुक्त सीए 2 आयनों की एक नियंत्रित मात्रा में छोड़ने के लिए समायोजित मात्रा में buffers में मौजूद है। बफ़र्स में स्वतंत्र और बाध्य अणुओं की गणना complexing एजेंट 35 के एक से अधिक प्रकार युक्त बफ़र्स के लिए बुरा 60 सॉफ्टवेयर द्वारा किए गए थे। एक सहायक कारक झिल्ली में आंशिक रूप से घुलनशील की एकाग्रता पर प्रभाव इस सॉफ्टवेयर के लिए जिम्मेदार नहीं है।

nanodiscs के नकारात्मक धुंधला में महत्वपूर्ण कदम ढेर गठन को बढ़ावा देने के लिए।

हाथ में प्रोटोकॉल, जहां अधिकतम स्टैकिंग वांछित है के लिए, दाग phosphotungsten की सोडियम नमक होना चाहिए। टंगस्टन के विभिन्न लवण उपलब्ध हैं, और हम ने कहा कि phosphotungstic एसिड स्टैकिंग में कम कुशल था (नहीं दिखाया गया है)। अस्पष्ट कारणों से, यह है कि पीटी धुंधला दौरान सोडियम की उच्च मात्रा स्टैकिंग को बढ़ावा देता रहा है। इसके अलावा, नमूना बफर के लिए, यह दिखाया गया था कि कम सोडियम contईएनटी, कम प्रेरित स्टैकिंग 32 की राशि। उसी कारण से, नमूना के बाद ईएम ग्रिड के लिए लागू किया गया है, धुंधला हो जाना पहले पानी धोने, नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि यह भी स्टैकिंग कम कर देता है। दूसरी ओर, कुछ स्टैकिंग हमेशा प्रेरित किया गया था, हालांकि हद प्रोटोकॉल का सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन के लिए जरूरत के लिए कभी नहीं।

बेशक, सीए 2 आयनों की तरह यहाँ सहकारकों नकारात्मक दाग के साथ या nanodiscs के साथ हस्तक्षेप के लिए जाँच की जानी चाहिए। वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, कैल्शियम आयनों एक फॉस्फेट बफर उपजी होता है, तो एक Tris बफर इस्तेमाल किया गया था। Nanodiscs, सीए 2 आयनों से प्रति द्वारा खड़ी कर रहे थे के रूप में नहीं एक और नकारात्मक दाग, uranyl स्वरूप 35 का उपयोग कर जाँच की, और न ही कैल्शियम किया रोकने NAPT प्रेरित स्टैकिंग (चित्रा 3 बी)।

एक छोटे से monotopic प्रोटीन के लिए, अतिरिक्त आकार एक nanodisc के लिए बाध्य यह cryoEM में detectable प्रदान कर सकते हैं के द्वारा जोड़ा। एबहुत बड़े nanodisc प्रोटीन की तुलना में एक बड़ी nanodisc स्टैकिंग नहीं रोका जा सकता है पर एक छोटा सा प्रोटीन के रूप में इष्टतम नहीं हो सकता। हालांकि, बाह्य प्रोटीन का आकार एक प्रभाव हो सकता है। कोई सटीक अनुपात अब के रूप में प्रदान किया जा सकता है, एक nanodisc bilayer सतह प्रोटीन की अनुमानित बाध्यकारी सतह से थोड़ा ही बड़ा सिफारिश की है। इस प्रतिबंध के साथ, अधिक से अधिक प्रोटीन बाध्यकारी nanodisc के प्रत्येक पक्ष पर एक प्रोटीन होगा।

जनरल सीमाओं और विधि के फायदे।

प्रोटोकॉल एक मंदिर और संबंधित उपकरण, जो सभी प्रयोगशालाओं में उपलब्ध नहीं हैं की उपलब्धता पर निर्भर करता है। हालांकि, एक 120 करने के लिए 200 केवी इलेक्ट्रॉन एक पारंपरिक सीसीडी कैमरा के साथ सुसज्जित खुर्दबीन स्टैकिंग का पता लगाने के लिए काफी पर्याप्त होगा। NAPT नकारात्मक धुंधला कमरे के तापमान पर किया जाता है, और ग्रिड बाद में देखने के लिए इस तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है।

मंदिर imagआईएनजी जल्दी से दिखा सकते हैं कि क्या स्टैकिंग रोका गया है या नहीं। संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रोटीन nanodisc परिसरों (जैसे, चित्रा -4 ए और बी), आगे की प्रक्रिया दिखा छवियों के लिए किया जा सकता है। एक नकारात्मक से सना हुआ नमूना के संरचनात्मक विवरण 1 एनएम तक पहुँच सकते हैं और उपयोगी जानकारी संरचनात्मक 29 प्रदान कर सकते हैं। cryoEM द्वारा दृढ़ संकल्प की संरचना के लिए समर्पित प्रयोगशालाओं में नमूनों की नकारात्मक धुंधला मानक प्रक्रिया है। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग नियमित प्रक्रिया के लिए एक त्वरित और आसान इसके अतिरिक्त होगा।

कुछ monotopic प्रोटीन myristoylation, palmitoylation, या प्रोटीन की सतह पर हाइड्रोफोबिक पैच द्वारा झिल्ली को संचालन कर रहे हैं, यह आवश्यक है nanodiscs 13 में एक transmembrane प्रोटीन के समावेश के लिए के रूप में एक ही प्रक्रिया से nanodisc प्रोटीन जटिल प्रपत्र बना रही है। इधर, प्रोटीन परिसर में सब यूनिटों में से एक हूँ शामिलझिल्ली बाइंडिंग के लिए एक लचीला एन टर्मिनल पूंछ पर yristoylation। uranyl एसीटेट से सना हुआ मंदिर छवियों के लिए, यह कहा गया था कि प्रोटीन जटिल झिल्ली के लंबवत बाध्य किया गया था, और nanodisc के पक्ष में नहीं है। यह और अन्य परिणाम झिल्ली लगाव 13 के लिए एक कठोर संरचना की पुष्टि की। इस बाइंडिंग के लिए, NAPT हमारे प्रस्तावित प्रोटोकॉल एक ही समान रूप से फैला एक कण दिखा सकते हैं के अनुसार धुंधला हो जाना। हालांकि, अगर लगाव एक लचीला श्रृंखला के माध्यम से किया गया था, uranyl एसीटेट धुंधला एक स्पष्ट परिणाम दे दिया है नहीं हो सकता है। हम सोचते हैं कि, लचीला श्रृंखला झिल्ली संलग्न प्रोटीन परिसरों के लिए, NAPT धुंधला ढेर करने के लिए nanodiscs उत्पन्न हो सकता है, प्रदर्शन ठेठ "सिक्कों के ढेर," लेकिन अब पक्षों पर संलग्न प्रोटीन से सजाया।

क्यों nanodiscs का उपयोग liposomes इस्तेमाल किया जा सकता है? लिपिड, सहकारकों, या अन्य मानकों के अनुकूलन बहुत अच्छी तरह से प्रति की बाइंडिंग के लिए liposomes में परीक्षण किया जा सकता हैipheral प्रोटीन (सीएफ। 5LO)। Liposomes की NAPT प्रेरित स्टैकिंग 32 प्रदर्शित किया गया है, तो एक monotopic प्रोटीन liposome स्टैकिंग रोकने सकता है। हालांकि, इसकी तुलना में liposomes के आकार प्रोटीन monotopic करने और nanodiscs को भी खेलने में आता है। जब तक liposome प्रति उच्च संख्या में मौजूद एक बड़े बाह्य प्रोटीन 78 केडीए 5LO की तरह, liposomes की स्टैकिंग को रोकने के लिए एक छोटा सा प्रोटीन, जबकि सक्षम हो सकता है, हो सकता है। छोटे liposomes तैयार किया जा सकता है, अभी तक छोटे पुटिका, मजबूत अपनी झिल्ली की वक्रता। nanodisc bilayer फ्लैट है। nanodiscs का उपयोग कर विभिन्न मापदंडों का परीक्षण कम लागत प्रभावी न्यूनतम समर्थन मूल्य की वजह से हो सकता है। दूसरी ओर, liposomes, कुछ महंगा सहकारकों या substrates कि आंशिक रूप से, झिल्ली में विभाजन और आगे liposomes के इंटीरियर में के लिए, बड़ी मात्रा में आवश्यक हो सकता है। अंत में, nanodisc प्लेटफार्म एक सटीक n बाइंडिंग के लिए एक निर्धारित क्षेत्र को चुनने की संभावना प्रदान करता है प्रोटीन का भूरा रंग। bilayer क्षेत्र दोनों पक्षों से सुलभ है और फ्लैट है।

विधि का महत्व।

प्रोटीन या जटिल अणुओं के 3 डी संरचना के निर्धारण कोशिकाओं की अंदरूनी कामकाज visualizes। इस भीड़ भरे माहौल में, विशिष्ट प्रोटीन झिल्ली सतहों, अकेले या अन्य प्रोटीन के साथ परिसर में है, लेकिन आम तौर पर इतना है कि लिपिड bilayer में घटकों के साथ शारीरिक बातचीत उनके यंत्रवत समारोह का हिस्सा है पर सक्रिय हैं। कुछ प्रोटीन के लिए, समाधान में रचना ट्रिगर के कुछ प्रकार के कारण, झिल्ली एम्बेडिंग पर बदल दिया है, जबकि दूसरों झिल्ली के लिए सीमित कर रहे हैं, लेकिन फिर भी झिल्ली पर रचना या ओरिएंटेशन बदलने है। एक हाइड्रोफोबिक सब्सट्रेट प्रवेश पथ तो खोल सकता है, या एक रचना एक transmembrane प्रोटीन के लिए बाध्य करने की अनुमति देता है कि हो सकता है। संरचना प्राप्त करने के लिए, या कम से कम संरचनात्मक जानकारी में, इस तरह के परिधीय झिल्ली के लिए बाध्य प्रोटीन की चुनौती दे रहा है।

jove_content "> Nanodiscs अभिविन्यास और झिल्ली 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 पर समारोह, 17 के बारे में कुछ अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया। साइटोक्रोम P450, detoxification में केंद्रीय, एक α-हेलिक्स द्वारा झिल्ली के लिए लंगर और शामिल है अपनी गोलाकार हिस्से में एक हीम समूह, रैखिक द्विवर्णता माप 15 के लिए अनुमति देता है। परिणामों बनाया सिमुलेशन के साथ बंद समझौते में झिल्ली के संबंध में हीम की एक अभिविन्यास संकेत दिया है, जिससे झिल्ली एम्बेडेड साइटोक्रोम P450 के सिमुलेशन से तैयार की अन्य निष्कर्ष को मजबूत बनाने। एक GTPase एक छोटे nanodisc में झिल्ली के लिए लंगर के लिए, एनएमआर अध्ययनों से एक झिल्ली के साथ प्रोटीन पर दो अलग-अलग क्षेत्रों की पहचान कर सकता है प्रत्येक इंटरफ़ेस और आगे, कैसे Nucleo ज्वार अन्य 17 करने के लिए एक अंतरफलक से एक स्विच प्रेरित बंधन। म्यूटेशन और प्रेरक बाध्यकारी है, साथ ही जीटीपी बंधन, रास-superfamily कि झिल्ली पर उन्मुखीकरण, जो 16 सिगनल ऑन्कोजेनिक को प्रभावित करती है पर निर्भर गतिविधि पर प्रभाव की एक संख्या खोजने के लिए एक और GTPase में अध्ययन किया गया। 5LO एक घुलनशील रचना 61 है और परमाणु झिल्ली 43 पर बाध्य करने के लिए कैल्शियम की आवश्यकता है। विशाल unilamellar liposomes का प्रयोग, ध्रुवीकृत, तनु, कुल प्रतिबिंब अवरक्त प्रयोगों 46 प्रदर्शन किया गया। परिणाम निहित है कि एन टर्मिनल β बैरल झिल्ली को बांधता है, β बैरल की समरूपता अक्ष झिल्ली सामान्य से लगभग 45 डिग्री झुका हुआ है। 5LO सी टर्मिनल डोमेन लगभग एक बेलनाकार α-पेचदार बंडल है, और इस झिल्ली 45 करने के लिए लंबे अक्ष समानांतर साथ बाँध के लिए प्रस्तावित किया गया था,= "xref"> 46। 5LO पर हमारे पहले काम nanodiscs पर एम्बेडेड में, bilayer के क्षेत्र के ऊपर-सुझाव उन्मुखीकरण 35 के साथ पक्ष के अनुसार एक 5LO अनुमति देने के लिए चुना गया था। मंदिर छवियों, इस रुख की पुष्टि की कम संकल्प 35 पर यद्यपि। अगर, उदाहरण के लिए, केवल एन टर्मिनल β बैरल बाध्य किया गया था लेकिन नहीं सी टर्मिनल डोमेन, nanodisc प्रति 5LO के एक उच्च संख्या प्राप्त किया गया है जाएगा। इसके अलावा, एक और प्रोटीन इस तरह के एक उत्प्रेरक, transmembrane प्रोटीन 5-lipoxygenase सक्रिय प्रोटीन, फ्लैप के रूप में झिल्ली बंधन और 5LO, के उन्मुखीकरण को बदल सकता है। प्रालंब nanodiscs में पुनर्गठन किया गया है, और हम मंदिर और अन्य तरीकों का उपयोग 5LO और प्रालंब के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए। अंतर्जात arachidonic एसिड में उनकी बातचीत के परिणाम ए 4, जो कई भड़काऊ रोगों 41 में शामिल शक्तिशाली chemoattractants के संश्लेषण में पहला कदम है, 42 leukotriene करने के लिए परिवर्तित किया जा रहा 62।

5LO-nanodisc जटिल cryoEM द्वारा संरचनात्मक जांच के लिए लगभग 200 केडीए की सीमा के पास, 334 केडीए के एक आणविक भार है की गणना की है। बहरहाल, के रूप में 5LO की परमाणु संरचना उपलब्ध 61 है, एक मध्यम संकल्प में अपने डॉकिंग, 3-आयामी इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शा जानकारी nanodisc झिल्ली के साथ बातचीत पर उपज होगा।

CryoEM प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में नवाचारों केवल परमाणु स्तर 63 के लिए संकल्प धक्का नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी छोटे प्रोटीन के आकार की सीमा धक्का। एनएमआर 22 से संरचनात्मक निर्धारण के लिए, स्थिति के रूप में लक्ष्य के आकार की सीमा है, जो अब 200 केडीए से आ रहा है बढ़ाने के लिए है, विपरीत है। हाल ही में, झिल्ली छोटे GTPase प्रोटीन के बंधन एनएमआर 16, 17 से जांच की गई। ये प्रोटीन, केवल लगभग 20 केडीए की है, हमएक 7.6 एनएम भीतरी व्यास के छोटे nanodiscs के लिए सीमित, 130 के बारे में केडीए के परिसरों के गठन रहे हैं। भविष्य में, समान आकार परिसरों प्रोटीन झिल्ली बाध्यकारी के विभिन्न पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए दोनों एनएमआर और cryoEM द्वारा जांच की जा सकती है।

प्रोटोकॉल का एक विस्तार nanodisc bilayer में एक transmembrane प्रोटीन (TMP) युक्त nanodiscs जांच करने के लिए हो सकता है। TMP-nanodiscs की NAPT प्रेरित स्टैकिंग ही लिपिड रचना युक्त खाली nanodiscs तुलना में किया जा सकता है। बड़े extramembranous छोरों, स्टैकिंग रोकने जबकि छोटे छोरों 64 स्टैकिंग नहीं रोका जा सकता है जाएगा। यह एक लाभ में तब्दील किया जा सकता है, के रूप में प्रोटोकॉल प्रोटीन विशेष transmembrane प्रोटीन के लिए बाध्य जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस पद्धति का लाभ यह है कि झिल्ली बातचीत तुरंत कल्पना की जा सकती है। खाली nanodiscs की बड़ी मात्रा में बनाने के रिश्तेदार सादगी का तात्पर्य है कि एक विस्तार कर सकते हैंइस विधि पीएच, तापमान, buffers, और monotopic प्रोटीन बाध्यकारी के सहायक कारक निर्भरता की तरह अलग अलग स्थितियों के लिए स्क्रीन करने के लिए। वास्तव में, जबकि nanodisc मंच 9 transmembrane प्रोटीन के स्थिरीकरण के लिए विकसित किया गया था और तेजी से इस उद्देश्य के लिए प्रयोग किया जाता है, अधिक या कम बाह्य प्रोटीन क्षणिक बाध्यकारी की बड़ी संख्या के अध्ययन के लिए अपनी क्षमता को वर्तमान के अंदर की कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से रखा जाना चाहिए दिमाग में।

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Acknowledgments

लेखकों उनके समर्थन के लिए स्वीडिश अनुसंधान परिषद, स्टॉकहोम काउंटी परिषद, और की निधियों धन्यवाद। अभिव्यक्ति और न्यूनतम समर्थन मूल्य की शुद्धि के कारोलिंस्का Institutet / SciLifeLab प्रोटीन विज्ञान कोर सुविधा पर प्रदर्शन किया गया था (http://PSF.ki.se)। लेखकों को भी अपनी तकनीकी विशेषज्ञता को साझा करने के लिए और उनके समय पर सहायता के लिए डॉ पासी Purhonen और डॉ Mathilda Sjöberg का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

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जैव रसायन अंक 121 नकारात्मक धुंधला हो जाना प्रोटीन जटिल मंदिर lipoxygenases दृश्य गैर denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन
विधि कल्पना और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली बातचीत प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए
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B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H.,… More

B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

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