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Biochemistry

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55148
Automatic Translation
1, 2, 1,2, 1,2
1Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, 2School of Technology and Health, KTH Royal Institute of Technology

Introduction

Nella ricerca medica, molta attenzione è focalizzata sulle proteine ​​di membrana, sia intrinseci o estrinseci, coinvolti in una varietà di interazioni lipidi. Utilizzo di proteine lipidi interagenti comprende sia selezionando un sostituto dei lipidi, quali detergenti, amphipols 1 o piccole proteine 2, o trovare un sostituto membrana che mantiene la proteina solubile ed attiva. Sostituti membrana lipoico includono liposomi e nanodiscs (ND) 3, 4.

Nanodiscs sono piattaforme membrana vicino native sviluppate progettando la parte proteica, ApoA-1, della lipoproteina ad alta densità (HDL) naturalmente nel sangue. ApoA-1 è un residuo di 243-lunga catena di brevi anfipatiche alfa-eliche e presenta una conformazione solubile privo di lipidi. In vitro quando in presenza di lipidi, due copie della proteina ApoA-1 spontaneamente riorganizzano per circondare il hydrophobic porzione catena acilica di un doppio strato lipidico cerotto 5. versioni Engineered di ApoA-1 sono generalmente chiamati ponteggi proteine ​​di membrana (MSP), e un numero crescente sono disponibili in commercio come plasmidi o proteine ​​purificate. Ripetizioni o cancellazioni delle alfa-eliche in ApoA-1 risultato in più 6 o più brevi ponteggi proteine di membrana 7. Questo a sua volta rende possibile l'ottenimento di dischi circa 6 nm 7 a 17 nm 8 di diametro. Ci sono diversi tipi di applicazioni per il nanodiscs 3, 9. L'applicazione più comunemente usato è quello di fornire un ambiente membrana quasi nativa per la stabilizzazione di una proteina integrale di membrana 8, recensito in precedenza 3, 9. Un uso meno esplorato è quello di realizzare una superficie di membrana nanoscala per lo studioperiferica di membrana proteine 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Sezione 1 del protocollo di sotto visualizza la procedura relativa alle nanodiscs composte da fosfolipidi e proteine ​​di membrana impalcature.

La preparazione del campione è un collo di bottiglia nella maggior parte dei metodi. campioni specifici del metodo può aggiungere informazioni particolari, ma anche fare i confronti dei risultati difficili. Pertanto, è più semplice quando i campioni sono multimodale e possono essere utilizzati direttamente in diversi metodi. Un vantaggio con l'uso di nanodiscs è la piccola dimensione del nanodisc rispetto ai liposomi (ad esempio, i campioni possono essere utilizzati direttamente per entrambi TEM e non denaturante gel elettroforesi, come nel presente protocollo).

18. Tuttavia, nessuna struttura 3D ad alta risoluzione di una proteina di membrana monotopic incorporato in una membrana liposomiale è stato ancora pubblicata, per quanto ne sappiamo. Nanoparticelle d'oro o anticorpi possono essere utilizzati per visualizzare proteine leganti di liposomi o vescicole usando TEM 19. Anche se queste sonde sono molto specifici, potrebbero interferire con proteine ​​di membrana vincolante velando il sito di legame della membrana o mascherando le aree di interesse con le parti flessibili. Gold-etichettato o proteine ​​anticorpi complessato potrebbe probabilmente essere analizzati su un gel, ma ciò aumenterebbe il costo dell'esperimento.

Anche se liposomi sono un'eccellente piattaforma, non si può essere certi che il poplamento ha un rapporto particolare di proteine per liposoma, una caratteristica che può essere esplorato con l'uso di nanodiscs 20. In un liposoma, cofattori e substrati possono essere intrappolati all'interno solubile. Le sostanze che sono membrana-solubili condivideranno lo stesso destino per entrambi i tipi di mimetici di membrana. Tuttavia, come la zona doppio strato è più piccola in nanodiscs, una minore quantità di sostanza è necessaria per saturare le membrane nanodisc.

proteina funzione intesa attraverso la determinazione della struttura atomica è essenziale per molti campi di ricerca. Metodi per la determinazione della struttura proteica comprendono raggi X 21; risonanza magnetica nucleare (NMR) 22, 23; e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) 24 a temperature criogeniche, cryoEM. La risoluzione cryoEM ultimamente è stata notevolmente migliorata, principalmente per l'uso di elettroni de direttatectors 25, 26. Le macromolecole vengono esposte in un sottile, ghiaccio vitreo 27 in uno stato quasi native. Tuttavia, a causa del basso contrasto di molecole biologiche, diventano difficili da individuare nella gamma di dimensioni 100 - 200 kDa. Per i campioni di dimensioni opportune, raccolta dei dati può essere fatta e il metodo di ricostruzione singola particella può essere applicato per ottenere una struttura 28.

Tuttavia, la determinazione della struttura delle proteine ​​mediante TEM è un processo a più fasi. Di solito inizia con la valutazione di monodispersity campione negativo-macchia TEM 29 con sali di metalli pesanti come phosphotungsten (PT) 30 31 o uranio. Ricostruzione di un modello a bassa risoluzione della macromolecola macchiato negativamente è di solito fatta e può fornire informazioni importanti sulla struttura molecolare 29. In parallelo,la raccolta dei dati utilizzando cryoEM può iniziare. Si deve prestare attenzione quando si valutano i dati TEM negativo-macchia per evitare l'errata interpretazione di formazione manufatto. Un particolare manufatto è l'effetto della macchia PT su fosfolipidi e liposomi 32, con conseguente formazione di lunghe aste somiglianti pile di monete viste dal lato 33. Tale "rouleau" o "stack" (di seguito indicato come "stack") sono stati osservati nella fase iniziale per HDL 34, e più tardi anche per nanodiscs 35.

L'accatastamento e rimodellamento delle membrane possono verificarsi per molte ragioni. Ad esempio, può essere indotta da cofattori come il rame, mostrate da immagini TEM in ammonio molibdato macchia 36. Una frazione dei lipidi di membrana in liposomi conteneva un gruppo di testa di acido iminodiacetico imitando metallo complessazione da EDTA, impilamento così liposomi dopo l'aggiunta di ioni rame 37. La formazione pila di fosfolipidi da PT è stato osservato nella fase iniziale; Tuttavia, il lavoro in seguito si è concentrata sulla rimozione o abolire questa formazione artefatto 38.

Qui, vi proponiamo un metodo per sfruttare la nanodisc NAPT indotto accatastamento per lo studio delle proteine ​​di membrana-binding da TEM. In breve, vincolante per le proteine ​​nanodiscs impedirebbe i nanodiscs da accatastamento. Sebbene le ragioni per l'impilamento non sono chiari, è stato proposto 39 che vi è una interazione elettrostatica tra i fosfolipidi e il gruppo fosforile di PT, causando i dischi di aderire l'uno all'altro (Figura 1A). L'ipotesi dietro il nostro protocollo è che quando una proteina si lega ad un nanodisc, la maggior parte della superficie fosfolipide non è dispo BLE per l'interazione con il terminale a causa dell'impedimento sterico dalla proteina. Ciò impedisce la formazione di stack (Figura 1B). Due conclusioni possono essere tratte. In primo luogo, la prevenzione di impilamento significa che la proteina di interesse è legato alla membrana. In secondo luogo, il complesso proteina-ND può essere trattato con metodi di lavorazione singola particella standard di 24, 40 per ottenere una morfologia ruvida del complesso. Inoltre, le analisi con metodi come non-denaturazione elettroforesi su gel o dispersione della luce dinamica può essere eseguita.

Per dimostrare questa ipotesi, abbiamo utilizzato la proteina di membrana-binding 5-lipossigenasi (5LO), che è coinvolto in molte malattie infiammatorie 41, 42. Questa proteina 78-kDa richiede ioni di calcio di legarsi alla sua membrana 43. Anche se questa associazione membrana è stata ampiamente studiata utilizzando liposomis = "xref"> 44, 45, 46 e frazioni di membrana 47, questi non possono essere utilizzati per l'analisi TEM e determinazione della struttura.

La preparazione di nanodiscs inizia MSP con lipidi risospese nel colato di sodio detergente miscelazione. Dopo incubazione in ghiaccio per 1 h, il detersivo viene lentamente rimosso dalla miscela ricostituzione con una resina adsorbente. Questo tipo di materiale è spesso realizzato in polistirene forma in piccole perline. Essi sono relativamente idrofobo e hanno una forte preferenza per il detersivo vincolante rispetto ai lipidi 48. Dopo aver rimosso le perline idrofobiche e l'esecuzione di un chiarimento mediante centrifugazione, i nanodiscs sono purificati mediante cromatografia dimensione esclusione (SEC). I nanodiscs purificati vengono miscelati con una proteina di membrana monotopic (ed eventuali cofattori) in rapporto equimolare (o più rapporti per una titolazione) e sono lasciate rEACT (15 min). Analisi mediante TEM viene effettuata applicando microlitri-quantità di campione attraverso, griglie di carbonio rivestiti bagliore scarica e poi effettuando colorazione negativa con NAPT. Lo stesso campione da cui le aliquote sono state applicate alle griglie TEM può essere utilizzato per l'analisi non-denaturazione o SDS PAGE gel elettroforesi, nonché da vari tipi di misure di attività, con grandi cambiamenti.

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Protocol

1. Preparazione di Nanodiscs

  1. Espressione e purificazione della proteina di membrana ponteggio 8, 35
    1. Esprimere il MSP1E3D1 His-tag nel E. coli BL21 (DE3) ceppo T1R pRARE2 in fiaschi. Preparare una coltura starter durante la notte da 50 ml con terreno LB integrato con 50 mg / ml kanamicina a 37 ° C. Diluire la coltura starter durante la notte in 2 litri di brodo di medio formidabile integrato con 50 mg / ml kanamicina.
    2. Crescere le cellule a 37 ° C fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD 600) raggiunge circa 3. indurre l'espressione di proteine con 0,5 mM isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per 3 ore a 18 ° C.
    3. Preparare il tampone di lisi (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl e 10% glicerolo). Aggiungere 1 mM TCEP immediatamente prima dell'uso.
    4. Dopo 3 h di induzione a 18 ° C, raccogliere le cellule per centrifugazione per 10 min a 4500 xge 4 ° C. Eliminare il supernatante, pesare le cellule raccolte, e risospendere in tampone di lisi con un rapporto di 2 ml di tampone di lisi per g di cellule.
    5. Lyse le cellule mediante ultrasuoni pulsato (frequenza di ripetizione: 4 s ON, 4 s OFF) per 3 minuti a 80% di ampiezza.
    6. Centrifugare i lisati per 20 min a 49.000 xg e 4 ° C. Eliminare il pellet da questo centrifugazione.
    7. Iniettare il surnatante in 5 mL Ni + colonna chelante collegato ad un sistema di cromatografia liquida automatizzato preferibilmente mantenuto a 4 ° C.
    8. Prima della fase di eluizione (fase 1.1.9), lavare la colonna con tamponi 1 - 3 di seguito per rimuovere tutte le proteine ​​tranne il His-tag MSP. Monitorare il contenuto proteico a 280 nm per seguire il processo di purificazione; la registrazione UV a 280 nm dovrebbe tornare ai valori basali dopo ogni lavaggio.
      1. Lavare con tampone di lavaggio 1: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, e l'1% Triton, pH 8,0.
      2. Lavare con tampone di lavaggio 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mmNaCl, 20 mM imidazolo, e 50 mM sodio colato, pH 8,0.
      3. Lavare con tampone di lavaggio 3: 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 50 mM imidazolo, pH 8,0.
    9. Eluire il MSP con 40 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, e 500 mm imidazolo, pH 8,0.
    10. Cambiare il buffer a MSP tampone standard (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl e 0,5 mM EDTA) mediante gel filtrazione 8, 35; la resa per lotto dovrebbe essere intorno a 7 mg L-1.
  2. Preparazione della soluzione madre fosfolipidi
    1. Aggiungere 305 ml di 1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (POPC) sciolto in cloroformio a una concentrazione di 25 mg / mL in un bicchiere di vetro e si evapora il cloroformio eliminandola con una leggera corrente di azoto . Essiccare la notte lipide in un essiccatore sotto vuoto. NOTA: Questo passaggio viene eseguita per rimuovere il solvente dal lipide, che lascia una sottile pellicola di lipidi sul fondo del bicchiere di vetro.
    2. Risospendere la torta di lipidi in 200 ml di MSP tampone standard contenente 100 mM sodio colato vortex il tubo fino a quando la soluzione diventa trasparente; questo fornirà una soluzione con una concentrazione di 50 mM POPC.
      NOTA: In generale, il rapporto molare di lipidi di detersivo a questo punto dovrebbe essere 1: 2 (lipidi: detergente) 8. Questa miscela lipidica detergente può essere conservato a -80 ° C per circa 2 mesi.
  3. Preparazione di perline idrofobici per la rimozione del detersivo
    1. Porre 5 g di perline (peso secco) in una provetta da 50 ml.
    2. Lavare le perline con 30 mL di metanolo 100% e poi con 40 ml di acqua ultrapura.
    3. Lavare le perline con 10 ml di MSP tampone standard. Infine, memorizzare le perline con 15 mL di tampone standard PSM a 4 ° C.
  4. Nanodisc ricostituzione
    1. Dispensare 190 ml di MSP1E3D1 (0,124 mM) in una provetta per microcentrifuga e aggiungere 61,5 ml di soluzione madre fosfolipidi (50 mm POPC) al tubo stesso. Incubare la miscela ricostituzione in ghiaccio per 1 ora. NOTA: Questo corrisponde ad un rapporto molare di 1: 130 (MSP1E3D1: POPC).
    2. Aggiungere perline idrofobi ad una concentrazione di 0,5 g di perline per ml di miscela ricostituzione di avviare il processo di auto-assemblaggio. Incubare in un incubatore rotativo per 16 ore a 4 ° C.
    3. Dopo incubazione, centrifugare per 10 min a 13.000 xg e 4 ° C per rimuovere i precipitati ed aggregati. Eliminare il pellet e salvare il surnatante.
    4. Equilibrare la colonna cromatografia ad esclusione sterica (montato su un sistema di cromatografia liquida automatizzato) con tampone standard MSP finché l'assorbanza a 280 nm è stabile. Iniettare il surnatante nella colonna e raccogliere le frazioni di picco.
    5. Misurare le concentrazioni di nanodiscs nelle frazioni di picco a 280 nm. Utilizzare il coefficiente di estinzione molare MSP1E3D1 (e = 29,91 mila centimetri -1 M -1) per il calcolo della concentrazione nanodisc. Notare lanumero di lipidi per nanodisc può essere misurata con una combinazione di lipidi radiomarcati e analisi dei fosfati 4 o mediante analisi fosfato sola.

2. Preparazione del Protein Monotopic 5 lipossigenasi 35

  1. Preparare una coltura starter durante la notte. Supplemento 50 ml di terreno LB con 100 mg / ml ampicillina. Seminare il terreno con E. coli BL21 (DE3) contenente il plasmide del gene 5-lipossigenasi (ALOX5). Diluire la coltura starter durante la notte in mezzo di espressione contenente 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mm KH 2 PO 4, 9 mm NaCl, 19 mM NH 4 Cl, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM CaCl 2, 0,2% D-glucosio, 0,1 %, 5 mM FeSO 4, e 100 mg / ml di ampicillina. Crescere le cellule fino a quando la OD 600 è ~ 0,5 a 25 ° C. Indurre l'espressione di proteine con 0,2 mM IPTG per 16 ore a 20 ° C 35.
  2. Harvest per centrifugazione per 10 min a 7000 xg e 4 ° C e scartare il surnatante. Pesare il pellet nella parte inferiore del tubo contenente le cellule raccolte e risospendere le cellule raccolte in tampone di lisi (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glicerolo e 1 mM TCEP) contenente inibitori delle proteasi e 0,5 mg / mL 35 lisozima in un rapporto di 2 ml di tampone di lisi per g di cellule.
  3. Lisare le cellule mediante sonicazione per 5 x 15 s a 80% di ampiezza. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione per 10 min a 7000 xg e 4 ° C. Eseguire ammonio solfato precipitazione a 30 - 60% della saturazione per precipitare le proteine nella soluzione 35. Centrifugare per 15 min a 16.000 xg e 4 ° C. NOTA: Il pellet 5LO può essere rapidamente congelato e conservato a -80 ° C per 6 mesi.
  4. Risospendere il pellet con 20 ml di tampone di lisi e centrifugare per 15 min a 40.000 xg e 4 ° C.
  5. Incubare il surnatante su una colonna di agarosio ATP a 4 ° C per 30 min. Lavare la colonna una volta con una colonna volumi di tampone di lisi contenente 0,5 M NaCl. Eluire il 5LO con 20 mM ATP in tampone di lisi contenente 10 mM FeSO 4 e 20 mg / mL catalasi. Eseguire cromatografia su gel filtrazione per rimuovere ATP 35.
    NOTA: Il 5LO è instabile e deve essere utilizzato immediatamente dopo la depurazione. Altrimenti, si raccomanda di fermare nella fase di solfato di ammonio precipitazioni (vedi la nota dopo passo 2.1.3).

3. Preparazione del complesso Nanodisc-proteina

  1. Preparare un volume totale di 100 ml di complesso. Mescolare 0,8 mM ND e 0,8 mM 5LO con 1 mM Ca 2+ presente nel tampone standard MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl; 0,5 mM EDTA e 1,5 mM CaCl 2) e incubare per 10 min sul ghiaccio. NOTA: Il campione può essere conservato per un massimo di un mese a 4 ° C 35.
ove_title "> 4. analisi dei campioni

  1. elettroforesi su gel
    1. Non-denaturazione elettroforesi
      1. Mescolare 15 ml di campione con 5 ml di tampone di caricamento (50 mM BisTris, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w / v) di glicerolo, e 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 e caricarlo su 4 - 16% gel Bis-Tris per eseguire l'elettroforesi.
      2. Riempire il serbatoio catodo con tampone luce catodo (50 mM Bis Tris; 50 mM Tricine, pH 6,8, e 0,002% Coomassie G-250) e il serbatoio anodo con tampone di corsa (50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6,8). Avviare la separazione con una tensione costante a 150 V.
      3. Arrestare la separazione elettroforetica quando il fronte Coomassie raggiunge la fine del gel.
      4. Colorare il gel con un protocollo standard blu Coomassie.
    2. denaturazione elettroforesi
      1. Mescolare 40 ml di campione con 10 ml di tampone di caricamento contenente SDS (0,05% (w / v) blu di bromofenolo, 0,2 M Tris-HCl,pH 6.8; 20% (v / v) di glicerolo; 10% (w / v) di SDS; e 10 mM 2-mercaptoetanolo) e caricarlo su un 4 - gel glicina 20% Tris eseguire elettroforesi.
      2. Riempire i serbatoi catodo e anodo con tampone di corsa (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM glicina, e 0,1% (w / v) di SDS). Avviare la separazione con una tensione costante a 150 V.
      3. Arrestare la separazione elettroforetica quando la carica frontale colorante raggiunge la fine del gel.
      4. Colorare il gel con un protocollo standard blu Coomassie.
  2. Preparazione della soluzione NAPT
    1. Sciogliere 1 g di sale sodico fosfotungstato in 50 mL di acqua mediante agitazione a temperatura ambiente per dare un 2% (w / v) soluzione acida.
    2. Regolare il pH a 7,4 con 1 M NaOH. Rimuovere le particelle utilizzando un filtro a siringa da 0,22 micron. Conservare la soluzione a temperatura ambiente oa 4 ° C.
  3. Preparazione del campione per analisi TEM
    1. Glow-scarico griglie di rame di carbonio rivestita (400 maglie) per 20 s a 30 mA per rendere le griglie idrofile prima l'adsorbimento del campione. Collocare 3,5 ml di campione (0,8 mM rispetto ai nanodiscs) sulla griglia e incubare per 30 s. NOTA: Il volume applicata può variare tra 2,5 e 5 microlitri, a seconda della concentrazione del campione. Un intervallo di concentrazione adatta per nanodiscs è di 0,5 - 1 micron.
    2. Blot off soluzione in eccesso con carta da filtro.
    3. Subito macchiare la griglia con un calo del 2% NAPT per 30 s. Blot off soluzione in eccesso e lasciare la griglia di aria secca.
    4. Valutare le griglie di TEM. Un microscopio con 120-200 keV tensione di accelerazione sufficiente per valutare il grado di impilamento. NOTA: Per la presente protocollo, un microscopio elettronico a trasmissione calibrato è stato usato, equipaggiato con una pistola ad emissione di campo di 200 keV.
    5. Registrare le immagini TEM. Per le immagini che mostrano lunghe pile, non elaborare ulteriormente; immagini mostrano il complesso di nanodiscs, con proteine ​​estrinseca che può contenere alcunishort stacks, ma la maggior parte delle particelle sono nel complesso. Registrare varie immagini e procedimenti questi secondo i metodi standard per ottenere di classe medie e una a bassa risoluzione, 3 modello tridimensionale del complesso.
      NOTA: per la raccolta di dati negativi-macchia, griglie sono state effettuate in almeno tre giorni diversi. Per ogni giorno, sono state fatte incubazione campione fresco (come nel passaggio 3.1) prima che è stata applicata la macchia negativo.

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Representative Results

Il metodo proponiamo dipende dalla preparazione di nanodiscs per fornire la superficie della membrana per il legame monotopic membrana proteine. Poiché non esiste una proteina transmembrana integrato nel doppio strato lipidico nanodisc, i nanodiscs sono qui indicati come "nanodiscs vuoti" (Figura 2A). Questi hanno un peso molecolare calcolato di 256 kDa per una composizione di due proteine MSP1E3D1 ponteggi e circa 260 molecole di POPC 8. Usando questa proteina: rapporto lipide per ricostituzione, una picco principale (Figura 2A) è stato eluito durante la filtrazione di gel. Le frazioni di picco di circa 9 ml (Figura 2A) sono stati esaminati dal blu nativo elettroforesi su gel 49, mostrando una banda (Figura 2B, corsia 1). Sebbene il gruppo corrisponde ad una dimensione leggermente maggiore di quella calcolata 256 kDa, il diametro nanodisc misurata nelle immagini TEM corrispondeatteso 13 nm ± 0,5 nm.

La proteina di membrana monotopic 5-lipossigenasi (5LO) è stato purificato come descritto sopra (Protocollo step 2) e più in dettaglio in precedenza 35. L'omogeneità del 78-kDa 5LO è stata analizzata mediante SDS PAGE elettroforesi (Figura 2C, corsia 1) ed era completamente funzionale 35 (non mostrato).

In questo protocollo, le condizioni sono intenzionalmente create che promuovono l'impilamento dei nanodiscs. Tuttavia, va notato che tale sovrapposizione è indotta solo nei campioni ottenuti per l'imaging TEM (cosiddetti esemplari), in particolare con l'aggiunta del fosfotungstato macchia sodio negativo come ultimo passaggio dopo erano stati eseguiti tutti gli altri trattamenti e aggiunte. Infatti, le immagini di nanodiscs NAPT-colorati mostrano l'impilamento atteso (Figura 3A) molto presto per HDL 34 5, 50. Le "lunghe pile di monete, visto dal lato" (Figura 3A) sono i nanodiscs aggregati con fosfotungstato intercalati tra i doppi strati, come descritto schematicamente nella figura 1A e proposto da Zhang et al. 32, 39.

È importante verificare se varie aggiunte nel buffer influenzano, prevenire o anche indurre impilabili, e come risulterà evidente qui di seguito, gli effetti di ioni calcio necessaria indagine. Nella Figura 3B, l'impilamento è ancora presente in un campione in cui sono stati aggiunti ioni calcio alla soluzione nanodisc prima colorazione con NAPT.

Il passo essenziale nel protocollo è mostrato in figura 4, dove la membrana-binproteine ​​ding è presente nelle soluzioni. L'accatastamento non poteva essere indotta dalla macchia NAPT quando 5LO era legato alla superficie della membrana delle nanodiscs (figura 4a). Per questo esemplare, il rapporto molare di 5LO al nanodiscs era 1: 1, come schematicamente illustrato in Figura 1 (Figura 1B, in basso a destra). Inoltre, come il doppio strato lipidico dei nanodiscs è accessibile da entrambi i lati, a differenza di liposomi, i campioni con il rapporto di due a uno 5LO nanodisc sono stati preparati, mentre le immagini TEM mostrano anche meno impilamento (Figura 4B).

Per la rilegatura, alcune proteine di membrana estrinseci possono dipendere dalla presenza di un lipide specifico nella membrana, come fosfoinositoli 10, 11, 12 o 10 fosfatidilserina. Nel caso della 5LO, la presenza di Ca 2+ è necessario 43. In Figura 4A e B, ioni calcio sono presenti nelle soluzioni con nanodiscs e 5LO. In altre parole, la mancanza di impilamento non solo mostra che la proteina monotopic è legato, ma anche che il legame dipende ioni Ca 2+. Al fine di mostrare questo, una soluzione contenente nanodiscs e 5LO ma senza calcio era macchiato di NAPT e ripreso da TEM (Figura 4C). Come previsto, 5LO non può legarsi alle nanodiscs senza Ca 2+, lasciando il 5LO libera nella soluzione, in modo che i nanodiscs impilare invece (Figura 4C).

Figura 1
Figura 1. Principio di Nanodisc Stacking e Panoramica del metodo. A. Principio di nanodisc impilamento. L'aggiunta del fosfotungstato macchia sodio negativo ad una soluzione di nanodiscs (sinistra) conduce th e accatastamento dei nanodiscs (a destra) a causa di forze elettrostatiche (metà, frecce) tra il doppio strato di fosfolipidi e le molecole PT (al centro, punti neri). B. Rappresentazione schematica del protocollo. nanodiscs vuoti (a sinistra) si legano ad una proteina di membrana estrinseca (grigio) per formare un complesso, rappresentato da quattro diverse angolazioni (media inferiore). La presenza della proteina monotopic impedisce stericamente le nanodiscs da impilamento quando colorati con il sale fosfotungstato (in basso a destra), in contrasto con l'impilamento indotti in assenza di oggetti di grandi dimensioni (destra). Gli anelli serra e di colore arancione rappresentano due MSP avvolgimento intorno al nucleo fosfolipide, che è rappresentato in marrone chiaro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Analisi Omogeneità di Nanodiscs e 5LO. A. Dimensioni esclusione cromatografia di nanodiscs vuoti ricostituiti. L'eluizione dei picchi nanodiscs a 9 ml. B. Non-gel denaturante analisi elettroforetica della frazione di picco dalla SEC mostrato in (A). Corsia M contiene il marcatore. Un solo gruppo è presente in corsia 1, in cui è stato caricato la frazione picco a 9 mL. C. denaturazione gel elettroforesi analisi di purificato 5LO. Il 78 kDa 5LO mostra come una band intenso in corsia 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Pila Formazione di Nanodiscs in assenza di proteine Analizzato da TEM. A. Nanodisc accatastamento è stata indotta wgallina macchiata di NAPT. Le "pile di monete", sono le pile di nanodiscs se visto di lato. Ogni nanodisc appare come una banda bianca. B. avvolgimento non è disturbato dalla presenza di ioni calcio nella soluzione nanodisc quando colorati con NAPT. Le barre di scala sono 100 nm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Prevenire Stack rosa per il legame di proteine in presenza di un cofattore Analizzato da TEM. A. e B. ioni calcio sono presenti in miscele di 5LO e nanodiscs in rapporti molari 1: 1 (A) o 2: 1 (B). Più 5LO vincolante ai nanodiscs, meno nanodiscs sono disponibili per l'impilamento, come illustrato in (B). I complessi single-particelle in bo° (A) e (B) sono adatti per l'ulteriore elaborazione 35. C. In assenza di ioni calcio, 5LO non può legarsi. NAPT colorazione di questo campione mostra impilamento tipico di nanodiscs, lasciando la 5LO non legato. Le barre di scala sono 100 nm. Le immagini sono state acquisite da una telecamera 4K x 4K CCD con un ingrandimento di 69,500x. La dimensione dei pixel della camera CCD è di 15 micron, che dà un corrispondente valore di 2,16 Å al livello del campione per le immagini EM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il metodo può essere suddiviso in tre parti: la ricostituzione di nanodiscs vuoti, la preparazione di complessi proteina-nanodisc, e la colorazione negativa per il TEM di questi complessi. Ogni parte sarà affrontata separatamente per quanto riguarda i limiti della tecnica, passaggi critici, e le modifiche utili.

Ricostituzione di nanodiscs vuote. passaggi critici e limitazioni nella produzione e l'uso di nanodiscs.

Per la preparazione dei nanodiscs vuoti, è essenziale ottimizzare il rapporto MSP-to-lipidico. Per la MSP più comune e lipidi (utilizzando colato come detergente), suggerimenti per i rapporti ottimali possono essere trovati in letteratura (ad esempio 125 - 130 POPC per MSP1E3D1 8, 51 utilizzato nella presente protocollo). Differenze ottenuti rispetto ai rapporti pubblicati può dipendere dal metodo per la determinazione della concentrazione di proteine, l'efficienza di lsolvatazione IPID il detersivo, e il metodo di rimozione del detersivo dalla soluzione.

Si propone di eseguire la rimozione detergente utilizzando perline idrofobiche 48 (passo 1.3), mentre le possibili alternative sono dialisi o l'aggiunta di ciclodestrina 52, 53. Inizialmente, la dialisi è stata usata per la ricostituzione di HDL 5, 34 ed è ancora preferito 54. Indipendentemente dal metodo di rimozione del detersivo, la velocità è essenziale. Se la rimozione è troppo veloce (il volume di perline idrofobici è troppo grande), il riarrangiamento spontanea di MSP con i lipidi potrebbe non avere il tempo di verificarsi. Invece, grandi quantità di liposomi e aggregati proteici possono formare. I risultati di cromatografia ad esclusione sterica mostrerebbero grandi quantità di liposomi in volume vuoto, un picco subottimale di nanodiscs ricostituito, e un grande picco inutilizzatoMSP 4, 6, 51. Per troppo piccolo volume di perline idrofobe, la rimozione del detersivo può essere incompleta, e le nanodiscs che formano può mostrare una variazione nelle dimensioni, dove la maggior parte sono più piccolo del previsto. Si potrebbe provare due aggiunte di piccoli volumi di perline idrofobiche invece di un'unica grande oltre a rallentare la velocità di ricostituzione.

La scelta dei lipidi deve essere attentamente valutata 8, 9, 45, 46, 55, a seconda dello scopo per la preparazione nanodisc. In generale, per tutti i metodi volti alla formazione delle membrane (ricostituzione nanodiscs o liposomi, così come per esperimenti di cristallizzazione 2D), i lipidi devono essere in uno stato "fluido" 56. Sotto di una certa temperatura, the lipidi è rigido. Sopra questa cosiddetta temperatura di transizione (Tm), il lipide è fluido. Si noti che alcuni lipidi saturi di uso comune hanno una Tm ben al di sopra della temperatura ambiente. Inoltre, per le miscele di lipidi, la miscibilità dei lipidi musa essere presa in considerazione 57. La temperatura ottimale per la formazione Nanodisc è intorno alla transizione di fase (Tm) del lipide.

Il detersivo nel presente protocollo è colato di sodio 8. Se deve essere utilizzato un altro detersivo, le stesse concentrazioni come quelle utilizzate per cholate non possono essere utilizzati direttamente. Alcuni detergenti delicati sciolgono lipidi meno efficiente, e una concentrazione più elevata possono essere necessari. La torta lipidico ottenuto dopo evaporazione del cloroformio (1.2.2 passo nel protocollo) deve essere sciolto in una soluzione limpida dal detergente. Vortex, cicli, bagni ultrasuoni scongelamento congelare-, o sonicazione potrebbe essere utilizzata per accelerare la solubilizzazione.

per combinationi di lipidi (-Miscugli), MSP, e detergenti diversi da quelli qui utilizzato, titolazioni per minimizzare grandi aggregati e liposomi o eccesso MSP sono necessari 4, 6, 51, 58. Per alcune combinazioni di MSP e fosfolipidi, l'ottimizzazione può essere più difficile che per altri 4, 6, 51, e diventa essenziale per determinare il contenuto delle frazioni di picco. Il metodo più preciso per l'analisi della composizione e dimensioni nanodisc è determinare il numero di fosfolipidi per MSP mediante analisi fosfato 4 e calcolare il peso molecolare nanodisc. dimensione Nanodisc può essere stimata ben risolto-, non denaturante elettroforesi su gel; dispersione della luce dinamica (DLS) 59; o negativo-macchia TEM, solo per citarne alcuni metodi. Per quanto riguarda la negaprotocollo impilamento tivo-macchia indotta presentato qui, la misurazione della larghezza delle pile presenti nelle immagini TEM fornisce il diametro dei nanodiscs.

Per quanto riguarda l'espressione e la purificazione della proteina di membrana ponteggi, devono essere prese tutte le precauzioni usuali e le preoccupazioni per una proteina solubile. I plasmidi disponibili possono contenere diversi tag e siti proteasi scissione nel caso in cui il tag devono essere rimossi prima di usare l'MSP.

5LO, la proteina monotopic utilizzato nel protocollo, inattiva rapidamente se non si prendono precauzioni, descritto altrove 35 e riferimenti ivi. In breve, il ferro catalitico si perde facilmente, e condizioni ossidanti può causare dimerizzazione del 5LO. Come indicato nella nota (passo protocollo 2.1.3), la purificazione può essere interrotta dopo la fase di precipitazione e aliquote memorizzate fino a quando un uso successivo. Dopo la purificazione di una aliquota, la proteina deve essere utilizzato entro alcune ore d ue alla rapida inattivazione 35.

passaggi critici nella preparazione dei complessi proteina-nanodisc.

La dimensione della proteina monotopic rispetto all'area nanodisc è di importanza. La lunghezza della catena proteica MSP1E3D1 corrisponde ad un nanodisc con un diametro interno di 10,5 nm e circa 8.900 Å-2 zona doppio strato 8. Questo corrisponde bene alla zona segnalata per la parte membrana integrata di 5LO 45. Così, il rapporto vincolante previsto era 1: 1, o al massimo 2: 1 5LO per nanodisc. Questo si è rivelato corretto, come riportato in un esperimento di titolazione 35. Tuttavia, il legame di due 5LO per nanodisc massima non è stato ottenuto, come discusso altrove 35. Un nanodisc leggermente più grande potrebbe consentire una completa 2: 1 vincolante per esperimenti in cui ciò sia desiderabile, ma in questo caso, il rapporto 1: 1 è l'obiettivo principale.

ove_content "> La scelta dei lipidi ottimali per la proteina-nanodisc formazione del complesso può essere aiutata da conoscenze precedenti. Questo è stato il caso nel presente protocollo, dove la scelta di lipidi era POPC sintetica 35. Entrambe le variazioni nel gruppo di testa dei lipidi 46 e variazioni nella saturazione della catena acil 45 sono stati testati in liposomi 5LO studi di legame. attività 5LO è stato aumentato del impegna liposomi contenenti fosfolipidi colina insaturi nella sn-2 acile posizione della catena 45, 46. Se i requisiti lipidi specifici non sono noti, ma l'identità della membrana originale è noto, estratti lipidi naturali potrebbe essere testato prima 55.

Una dipendenza cofattore era noto per 5LO, che dipende dal Ca 2+ ioni per il legame della membrana 43. E 'difficile da rimuovere completamente il calcio da soluzioni. Qui, l'agente complessante EDTA è presente nel buffer di valori rettificati di lasciare una quantità controllata di liberi ioni Ca 2+. I calcoli di molecole libere e legate nel buffer sono state effettuate dal software BAD 60 per tamponi contenenti più di un tipo di agente complessante 35. L'effetto sulla concentrazione di un cofattore parzialmente solubile nella membrana non è rappresentato da questo software.

passaggi critici nella colorazione negativa di nanodiscs per promuovere la formazione di stack.

Per il protocollo in questione, in cui si desidera la massima sovrapposizione, la macchia dovrebbe essere il sale sodico di phosphotungsten. Differenti sali di tungsteno sono disponibili, e abbiamo osservato che l'acido fosfotungstico era meno efficiente a impilaggio (non mostrato). Per motivi non chiari, sembra che elevate quantità di sodio durante PT colorazione promuove accatastamento. Inoltre, per il buffer di esempio, è stato dimostrato che minore è il cont sodioent, minore è la quantità di impilamento indotti 32. Per lo stesso motivo, dopo che il campione è stato applicato alla griglia EM, lavaggio con acqua prima della colorazione non deve essere eseguita, in quanto ciò riduce anche impilamento. D'altra parte, alcuni impilamento era sempre indotta, anche se non nella misura necessaria per la migliore esecuzione del protocollo.

Naturalmente, cofattori, come gli ioni Ca 2+ qui devono essere controllati per interferenza con la macchia negativo o con le nanodiscs. Per la presente protocollo, ioni calcio avrebbero precipitato tampone fosfato, quindi un tampone Tris è stato utilizzato. Le nanodiscs non sono stati divisi per Ca 2+ ioni di per sé, in quanto controllato utilizzando un altro macchia negativo, uranile formiato 35, né il calcio impediscono impilamento NAPT-indotta (Figura 3B).

Per una piccola proteina monotopic, la dimensione in più aggiunto legandosi a un nanodisc può renderlo rilevabile in cryoEM. UNmolto grande nanodisc rispetto alla proteina può non essere ottimale, come una piccola proteina su larga nanodisc non può impedire impilamento. Tuttavia, la forma della proteina estrinseca potrebbe avere un'influenza. Sebbene nessun rapporto preciso può essere fornito fin d'ora, si raccomanda una superficie bistrato nanodisc solo leggermente più grande della superficie di legame stimato della proteina. Con questa limitazione, la proteina legante massima sarebbe una proteina su ciascun lato del nanodisc.

limitazioni generali e vantaggi del metodo.

Il protocollo è subordinata alla disponibilità di un TEM e le relative attrezzature, che non sono disponibili in tutti i laboratori. Tuttavia, un microscopio elettronico a 120- 200 kV dotato di una fotocamera CCD tradizionale sarebbe più che sufficiente per la rivelazione di impilamento. La colorazione negativa NAPT viene eseguita a temperatura ambiente, e le griglie può essere conservata a questa temperatura per la successiva visualizzazione.

TEM imagING avrebbe mostrato rapidamente se l'accatastamento è stato impedito o meno. Per le immagini che mostrano complessi proteici-nanodisc (ad esempio, la Figura 4A e B), l'ulteriore elaborazione per ottenere informazioni strutturali potrebbe essere eseguita. Dettagli strutturali di un campione negativo macchiato possono raggiungere 1 nm e possono fornire utili informazioni strutturali 29. Nei laboratori dedicati a strutturare determinazione cryoEM, la colorazione negativa dei campioni è una procedura standard. L'uso del nostro protocollo sarebbe un'aggiunta semplice e veloce per procedure regolare.

Alcune proteine monotopic sono ancorate alla membrana da myristoylation, palmitoylation o patch idrofobi sulla superficie della proteina, rendendo necessario per formare il complesso nanodisc-proteina mediante la stessa procedura per la costituzione di una proteina transmembrana in nanodiscs 13. Qui, una delle subunità del complesso proteina contiene amyristoylation su una coda N-terminale flessibile per il legame di membrana. Per uranile immagini TEM acetato macchiate, è stato affermato che il complesso proteina era legato perpendicolarmente alla membrana, e non sul lato della nanodisc. Questo ed altri risultati hanno confermato una struttura rigida per il fissaggio della membrana 13. Per questa associazione, NAPT colorazione secondo il nostro protocollo proposto avrebbe mostrato le stesse singole particelle uniformemente distribuite. Tuttavia, se l'allegato fosse stato tramite un flessibile a catena, la colorazione acetato di uranile potrebbe non hanno dato un risultato chiaro. Noi ipotizziamo che, per la catena flessibile membrana-attached complessi proteici, la colorazione NAPT può indurre i nanodiscs per impilare, dimostrando la tipica "pila di monete", ma ora decorato dalla proteina collegata ai lati.

Perché usare nanodiscs se possono essere utilizzati liposomi? L'ottimizzazione dei lipidi, cofattori, o altri parametri potrebbe benissimo essere testato in liposomi per il legame di ogniproteine ipheral (cfr. 5LO). Impilamento NAPT indotta dei liposomi è stata dimostrata 32, quindi una proteina monotopic potrebbe impedire liposomi impilamento. Tuttavia, la dimensione dei liposomi in confronto monotopic proteine ​​e nanodiscs entra in gioco. Un grande proteina estrinseca può essere in grado di prevenire l'impilamento di liposomi, mentre una piccola proteina, come il 78-kDa 5LO, non potrebbe a meno presenti in numero elevato per liposomi. Piccoli liposomi possono essere preparati, ma la più piccola vescicola, più forte è la curvatura della sua membrana. Il doppio strato nanodisc è piatta. Test vari parametri utilizzando nanodiscs potrebbe essere meno conveniente a causa del MSP. D'altra parte, per liposomi, alcuni cofattori costosi o substrati che parzialmente partizione nella membrana e in seguito, nell'interno dei liposomi, può essere richiesto in quantità maggiori. In conclusione, la piattaforma nanodisc fornisce la possibilità di scegliere un'area definita per legare una precisa n umero di proteine. L'area di doppio strato è accessibile da due lati ed è piatta.

Importanza del metodo.

Determinazione della struttura 3D di proteine ​​o macromolecole complesse visualizza il funzionamento interno delle cellule. In questo ambiente affollato, proteine ​​specifiche sono attivi sulle superfici di membrana, da soli o in complesso con altre proteine, ma di solito in modo che l'interazione fisica con componenti nel doppio strato lipidico è parte della loro funzione meccanicistica. Per alcune proteine, la conformazione in soluzione viene cambiata su incorporamento membrana, mentre altri sono tenuti legati alla membrana, ma comunque cambiare conformazione o l'orientamento sulla membrana a causa di un qualche tipo di trigger. Un percorso di ingresso substrato idrofobico può quindi aprire, oppure potrebbe verificarsi una conformazione che consente di legame ad una proteina transmembrana. Per ottenere la struttura, o almeno informazioni strutturali, di tali proteine ​​periferiche legate alla membrana è impegnativo.

jove_content "> Nanodiscs sono stati utilizzati in alcuni studi sull'orientamento e funzione membrane 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. citocromo P450, centrale nella detossificazione, è ancorata alla membrana da un α-elica e contiene un gruppo eme nella sua parte globulare, consentendo dicroismo lineare 15. I risultati hanno indicato un orientamento del eme rispetto alla membrana in stretto accordo con le simulazioni effettuate, rafforzando altre conclusioni tratte da simulazioni del citocromo P450 membrana incorporato. per una GTPasi ancorata alla membrana in un piccolo nanodisc, studi NMR potrebbero identificare due zone differenti sulla proteina con una membrana interfacciare ciascuna e in seguito, come nucleo marea legame indotto un interruttore da un'interfaccia all'altra 17. Le mutazioni e vincolante effettori, così come vincolante GTP, sono stati studiati in un altro GTPasi nelle Ras-superfamiglia di trovare un certo numero di effetti sulle attività che dipendevano l'orientamento sulla membrana, che interesserebbe oncogenico segnalazione 16. 5LO ha una conformazione solubile 61 e richiede il calcio per il legame sulle membrane nucleari 43. Utilizzando giganti liposomi unilamellari, polarizzata, attenuato, a riflessione totale esperimenti a raggi infrarossi sono stati eseguiti 46. Il risultato implicava che la N-terminale β-barile si lega alle membrane, con l'asse di simmetria della β-barilotto inclinato di circa 45 gradi dalla membrana normale. Il dominio 5LO C-terminale è un fascio quasi cilindrica α-elica, e questo è stato proposto di legarsi con l'asse parallelo alla membrana 45,= "xref"> 46. Nel nostro precedente lavoro sul 5LO incorporato nanodiscs, l'area del doppio strato è stato scelto per consentire uno 5LO per lato con la sopra suggerito orientamento 35. Le immagini TEM hanno confermato questo orientamento, anche se a bassa risoluzione 35. Se, per esempio, solo l'N-terminale β-canna era legato ma non il dominio C-terminale, sarebbe stato ottenuto un numero maggiore di 5LO per nanodisc. Inoltre, un'altra proteina potrebbe cambiare il legame di membrana e l'orientamento di 5LO, come un attivatore, la proteina transmembrana 5-lipossigenasi attivando proteine, FLAP. FLAP è stato ricostituito in nanodiscs, e usiamo TEM e altri metodi per studiare l'interazione tra 5LO e FLAP. I loro risultati di interazione in acido arachidonico endogena essere convertiti in leucotriene A4, che è il primo passo nella sintesi di fattori chemiotattici potenti coinvolto in molte malattie infiammatorie 41, 42 sup>, 62.

Il complesso 5LO-nanodisc è calcolata in modo da avere un peso molecolare di 334 kDa, vicino al limite di circa 200 kDa di indagine strutturale di cryoEM. Tuttavia, come la struttura atomica 5LO è disponibile 61, il suo ancoraggio in media risoluzione, 3-dimensional map densità elettronica forniscano informazioni sull'interazione con la membrana nanodisc.

Le innovazioni nella tecnologia cryoEM non solo spingendo risoluzione al livello atomico 63, ma anche spingere il limite di dimensione di proteine più piccole. Per la determinazione strutturale mediante NMR 22, la situazione è l'opposto, come lo scopo è quello di aumentare la gamma di dimensioni, che si sta avvicinando 200 kDa. Recentemente, la membrana legame di piccole proteine GTPasi sono stati studiati mediante NMR 16, 17. Queste proteine, di solo circa 20 kDa, abbiamore legato a piccole nanodiscs di un diametro interno 7,6 nm, formando complessi di circa 130 kDa. In futuro, i complessi di dimensioni simili potrebbero essere indagati sia da NMR e cryoEM per chiarire diversi aspetti della membrana proteina legante.

Un'estensione del protocollo potrebbe essere quello di indagare nanodiscs contenenti una proteina transmembrana (TMP) nel doppio strato nanodisc. impilamento NAPT-indotta del TMP-nanodiscs potrebbe essere paragonato a nanodiscs vuoti contenenti la stessa composizione lipidica. Grandi anse extramembranous impedirebbero impilamento, mentre brevi cicli non può impedire accatastamento 64. Ciò può essere trasformato in un vantaggio, come il protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare proteine ​​specificamente di legame alla proteina transmembrana.

Il vantaggio di questo metodo è che l'interazione membrana può essere visualizzato immediatamente. La relativa semplicità di fare grandi quantità di nanodiscs vuoti implica che si può estenderequesto metodo per lo screening per condizioni diverse, come il pH, la temperatura, i buffer, e la dipendenza cofattore di legame con le proteine ​​monotopic. Infatti, mentre la piattaforma nanodisc 9 è stato sviluppato per la stabilizzazione di proteine transmembrana ed è sempre utilizzato per questo scopo, il suo potenziale per gli studi dei grandi numeri di più o meno transitoriamente-binding proteins estrinseci presenti all'interno delle cellule dovrebbe chiaramente essere mantenuto in mente.

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Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Consiglio di ricerca svedese, Stoccolma County Council, e fondi KI per il loro sostegno. L'espressione e la purificazione di MSP è stato eseguito presso il Karolinska Institutet / SciLifeLab Proteina Scienza Nucleo Facility (http://PSF.ki.se). Gli autori desiderano inoltre ringraziare il dottor Pasi Purhonen e il Dr. Mathilda Sjöberg per condividere la loro competenza tecnica e per la loro assistenza tempestiva.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transmission electron microscope: JEOL2100F JEOL
CCD camera Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger Baltec
TEM grid: 400 mesh TAAB GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 Agilent Technologies 5190-2526
Superdex 200 HR 10/300 GE Healthcare Life Sciences 17-5172-01
Plasmid: MSP1E3D1 Addgene 20066
Bacteria: BL21DE3 NEB C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose Sigma Aldrich A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL GE Healthcare Life Sciences 17-5247-01
Lipid: POPC Avanti polar lipids 850457C 25 mg/mL in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin Bio-Rad 1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm Pall life sciences PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate Sigma Aldrich 31648
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Bio-Rad 161-0301
Protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001
TCEP Sigma Aldrich 646547
Detergent: Sodium cholate hydrate Sigma Aldrich C6445-10G
Sodium Cholate 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C.
Lipid Stock 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store at 4 °C for a week; or
Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen.
MSP standard buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA.
Store at 4 °C.
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2001 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer Thermo Fisher Scientific BN2002 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250
Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer Thermo Fisher Scientific BN2003 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol
Terrific broth Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL.
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium.

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B. Kumar, R., Zhu, L., Hebert, H., Jegerschöld, C. Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (121), e55148, doi:10.3791/55148 (2017).

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