Introduction
医学研究では、多くの注意が脂質相互作用の様々な関与、内因性または外因性のいずれかの、膜タンパク質に焦点を当てています。脂質相互作用タンパク質を操作するような洗剤、amphipols 1、または小さいタンパク質2などの脂質への代替を選択する、または可溶性および活性タンパク質を保持する膜の代用品を見つけるのいずれかが含まれます。リポ膜代替物は、リポソームおよびナノディスク（ND）3、4を含みます。
ナノディスクは、天然に血液中に発生する高密度リポタンパク質（HDL）のタンパク質部分、アポA-1を操作することによって開発され、ネイティブに近い膜のプラットフォームです。アポA-1は、短い両親媒性αヘリックスの243残基長鎖状であり、無脂質可溶性コンホメーションを持っています。 in vitroでの脂質の存在下で、タンパク質アポA-1の2つのコピーが自発的にhydrを取り囲むように並べ替えるとき脂質二重層のパッチ5のophobicアシル鎖部分。アポA-1の操作されたバージョンは、一般的に、膜足場タンパク質（MSP）と呼ばれ、数は増加し、プラスミドとして、または精製されたタンパク質として市販されています。 6長いか短い7膜足場タンパク質中のアポA-1、結果の繰り返しまたはαヘリックスの欠失を有します。これにより、直径が17ナノメートル〜8 6nmで7の周りにディスクを形成することができます。ナノディスク3,9のためのアプリケーションの種類があります。最も一般的に使用されるアプリケーションは、以前に3,9レビュー内在性膜タンパク質8の安定化のために、ネイティブに近い膜環境を提供することです。あまり探求使用は、研究のためのナノスケールの膜表面を提供することを目的とします周辺膜タンパク質10、11、12、13、14、15、16、17。プロトコルの第1節は、以下のリン脂質や膜骨格タンパク質から構成されるナノディスクを作成するための手順を可視化します。
サンプル調製は、ほとんどのメソッドのボトルネックです。メソッド固有のサンプルは、特定の情報を追加することができ、彼らはまた、結果の比較が困難になります。試料がマルチモーダルであり、いくつかの異なる方法で直接使用することができる場合したがって、簡単です。ナノディスクを用いて一つの利点は、リポソーム（ 例えば、サンプルは直接本プロトコルのように、TEMおよび非変性ゲル電気泳動の両方のために使用することができる）と比較して、ナノディスクの小さいサイズです。
、18利用可能です。しかし、リポソーム膜に埋め込まれたmonotopic膜タンパク質のない高解像度の3D構造は、我々の知る限りでは、まだ公開されていません。金ナノ粒子または抗体は、TEM 19を用いてリポソームまたは小胞に結合するタンパク質を可視化するために使用することができます。これらのプローブは、非常に特異的であるにもかかわらず、彼らは膜結合部位をベーリングしたり、柔軟な部品で関心のある分野をマスキングすることにより、膜結合タンパク質を妨害する可能性があります。金標識又は抗体複合体を形成するタンパク質は、おそらくゲル上で分析することができ、これは実験のコストを増加させます。
リポソームは優れたプラットフォームであるが、一つはポップと確信することはできませんピュレーションは、リポソームあたりのタンパク質の特定の比率、ナノディスク20を使用することによって探索することができるという特徴を持っています。リポソームでは、補因子および基質は可溶性の内部に捕捉することができます。膜溶解性である物質は、膜模倣体の両方のタイプのための同じ運命を共有します。二重層領域がナノディスクに小さくなるようにもかかわらず、物質の少量を、ナノディスクの膜を飽和させるのに必要とされます。
原子構造の決意を介してタンパク質の機能を理解することは、研究の多くの分野のために不可欠となっています。タンパク質構造決意するための方法は、X線21を含みます。核磁気共鳴（NMR）22、23。透過型電子顕微鏡（TEM）極低温で24、cryoEM。 cryoEMによって解像度が最近大幅に主に起因する直接電子デの使用に、改善されました26、25 tectors。巨大分子は、ネイティブに近い状態で薄く、ガラス質氷27に結像されます。 200 kDaの - しかし、生体分子の低コントラストのために、彼らは100のサイズ範囲で検出が困難になります。適切なサイズのサンプルについては、データ収集を行うことができ、単一粒子の再構成の方法は、構造体28を得るために適用することができます。
しかし、TEMによるタンパク質構造の決意は、多段階プロセスです。これは通常phosphotungstenのような重金属の塩を使用して負染色TEM 29（PT）30やウラン31によるサンプル単分散性の評価から始まります。ネガティブ染色高分子の低解像度モデルの再構築は、通常行われ、分子構造29に関する重要な情報をもたらすことができます。並行して、cryoEMを使用してデータ収集を開始してもよいです。アーチファクト形成の誤解を避けるために、ネガティブ染色TEMデータを評価する際には注意が必要です。一つの特定のアーチファクトは、側面33から見たコインのスタックに似た長い棒の形成をもたらし、リン脂質およびリポソーム32にPTの汚れの影響です。 （以下、「スタック」と表記）は、このような「連銭」または「スタック」は、HDL 34早期に観察し、それ以降もナノディスク35のためにしました。
膜の積層と整形は多くの理由で発生することがあります。例えば、モリブデン酸アンモニウム染色36でTEM画像で示される銅のような補因子によって誘導することができます。リポソーム中の膜脂質の割合は、このように銅イオンを添加した後、リポソームを積層し、EDTAによって金属錯体を模倣イミノジ酢酸頭部基を含有しました
ここでは、TEMによる膜結合タンパク質の研究のために積み重ねNAPTによって誘発されるナノディスクを利用する方法を提案します。要するに、ナノディスクに結合タンパク質が積み重ねからナノディスクを防止するであろう。スタッキングの理由は明らかではないが、それはお互いに（ 図1A）に固執するディスクを引き起こし、リン脂質およびPTのホスホリル基との間の静電相互作用があることが39提案されました。私たちのプロトコルの背後にある仮説は、タンパク質は、ナノディスクに結合すると、リン脂質表面の大部分はご利用できないということですタンパク質による立体障害によりPTとの相互作用についてBLE。これは、スタックの形成（ 図1B）を防止するであろう。二つの結論を引き出すことができます。まず、積層の予防は、対象のタンパク質が膜に結合したことを意味します。第二に、タンパク質ND複合体は、複合体の大まかな形態を得るために、標準的な単一粒子処理方法24、40で処理することができます。また、非変性ゲル電気泳動または動的光散乱のような方法によって分析を行うことができます。
この仮説を実証するために、我々は、多くの炎症性疾患41,42に関与する膜結合タンパク質5-リポキシゲナーゼ（5LO）を使用しました。この78-kDaのタンパク質は、その膜43にバインドするためにカルシウムイオンを必要とします。この膜結合は、リポソームを用いて広く研究されているもののS = "外部参照"> 44、45、46、膜画分47、これらは、TEM分析および構造決意するために使用することができません。
ナノディスクの調製は、界面活性剤コール酸ナトリウムに再懸濁脂質とMSPを混合することによって開始されます。 1時間氷上でインキュベートした後、界面活性剤をゆっくりと吸着樹脂を使用して再構成混合物から除去されます。この種の材料は、しばしば小さなビーズに成形ポリスチレンで作られています。彼らは比較的疎水性であり、脂質の48に比べて洗剤を結合するための強力な好みを持っています。疎水性ビーズを除去し、遠心分離を用いて説明を行った後、ナノディスクは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により精製します。精製されたナノディスクは、（滴定用またはいくつかの比率）等モル比でmonotopic膜タンパク質（および可能な補因子）と混合されているとrに残っていますEACT（15分）。 TEMによる分析は、グロー放電、炭素被覆グリッド上に試料をμL-量を適用することによって、その後、NAPTでネガティブ染色を行うことによって行われます。アリコートをTEMグリッドに適用した場合の同じサンプルは大きな変化で、非変性またはSDS PAGEゲル電気泳動によって、並びに活性測定の各種による分析のために使用することができます。
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Protocol
ナノディスクの調製
- 膜足場タンパク質8、35の発現および精製
- フラスコ中の大腸菌 BL21（DE3）T1R pRARE2株にHisタグMSP1E3D1を発現します。 37℃で50μg/ mlのカナマイシンを補充したLB培地で50 mLの一晩スターター培養を準備します。 50μg/ mLのカナマイシンを補充した素晴らしいブロス培地の2 Lで一晩スターター培養物を希釈します。
- 600ナノメートル（OD 600）での光学密度が約3 18℃で3時間、0.5 mmのタンパク質発現イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を誘導に達するまで37℃で細胞を増殖させます。
- 溶解バッファー（; 100mMのNaCl、10％グリセロール、100mMのトリス-HCl、pH8.0）に調製します。使用直前に1 mMのTCEPを追加します。
- 18℃での誘導の3時間後、4,500×gで10分間の遠心分離により細胞を回収4°C。 、上清を捨て採取した細胞を比較検討し、細胞のグラム当たりの溶解緩衝液を2mLの割合で溶解緩衝液中で再懸濁それら。
- 80％の振幅で3分間（ON 4秒、4秒OFF繰り返し率）、パルス超音波処理によって溶解細胞。
- 49,000×gで、4℃で20分間溶解物を遠心分離します。この遠心分離からのペレットを捨てます。
- 好ましくは4℃に保っ自動液体クロマトグラフィーシステムに接続された5ミリリットルのNi +キレートカラムに上清を注入します。
- Hisタグ化MSP以外のすべてのタンパク質を除去するために、次の3 - 溶出工程（ステップ1.1.9）の前に、バッファ1でカラムを洗浄します。精製プロセスを追跡する280 nmでのタンパク質含有量を監視します。 280nmでのUV記録は、各洗浄後にベースラインに戻る行く必要があります。
- 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール、1％トリトン、pHが8.0：洗浄緩衝液1で洗浄しました。
- 40mMのトリス-HCl、300mMの：洗浄バッファー2で洗浄NaCl、20mMイミダゾール、及び50mMコール酸ナトリウム、pHは8.0。
- 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、および50 mMイミダゾール、pHは8.0：洗浄緩衝液3で洗浄します。
- 40mMのトリス-HCl、300mMのNaCl、および500mMイミダゾール、pH8.0でMSPを溶出します。
- ゲルろ過8、35、標準緩衝液（0.5 mMのEDTA; 100mMのNaCl、20mMのトリス-HCl、pHが7.5）MSPするバッファを変更します。バッチあたりの収量は約7ミリグラムLであるべき-1。
- リン脂質原液の調製
- 1-パルミトイル-2- oleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリン（POPC）の305μLをガラスビーカーに25ミリグラム/ mLの濃度でクロロホルムに溶解し、窒素の穏やかな流れでそれをパージすることにより、クロロホルムを蒸発させる追加。真空デシケーター中で一晩脂質を乾燥させます。注：このステップは、ガラスビーカーの底部に脂質の薄膜を残す脂質から溶媒を除去します。
- 溶液が透明になるまでチューブをボルテックスすることによって100mMのコール酸ナトリウムを含むMSP標準緩衝液200μL中の脂質ケーキを再懸濁し、これを50mMのPOPC濃度を有する溶液を提供します。
注：2（脂質：洗剤）8一般的には、この時点で洗剤に対する脂質のモル比は1でなければなりません。この脂質 - 界面活性剤混合物は、ほぼ2ヶ月間-80℃で保存することができます。
- 界面活性剤除去のための疎水性ビーズの作製
- 50 mLチューブにビーズの5グラム（乾燥重量）を配置します。
- 超純水40mLで、次に100％メタノール30mLでビーズを洗浄し。
- 10 mLのMSPの標準緩衝液でビーズを洗浄します。最後に、4℃でMSP標準緩衝液15mLでビーズを格納します。
- ナノディスクの再構成
- マイクロチューブにMSP1E3D1（0.124ミリモル）の190μLを分注し、リン脂質のストック溶液（50mMのPの61.5μLを追加同じチューブにOPC）。 1時間氷上で再構成混合物をインキュベートします。注：130（MSP1E3D1：POPC）これは1のモル比に等しいです。
- 自己組織化プロセスを開始するために再構成液1mL当たりのビーズ0.5gの濃度で疎水性ビーズを加えます。 4℃で16時間、ロータリーインキュベーターでインキュベートします。
- インキュベーションの後、沈殿物や凝集物を除去するために13,000×gで、4℃で10分間遠心操作します。ペレットを捨て、上清を保存します。
- 280 nmでの吸光度が安定するまでMSP標準緩衝液（自動液体クロマトグラフィーシステムに搭載された）サイズ排除クロマトグラフィーカラムを平衡化します。カラムに上清を注入し、ピーク画分を集めます。
- 280nmでのピーク画分にナノディスクの濃度を測定します。ナノディスク濃度の計算のためにMSP1E3D1のモル吸光係数（ε= 29910センチメートル-1 M -1）を使用します。注記：ナノディスクあたりの脂質の数は、放射標識脂質およびリン分析4の組み合わせによって単独リン酸分析によって測定することができます。
Monotopicタンパク質の調製5-リポキシゲナーゼ35
- 一晩スターター培養物を準備します。 100μg/ mLのアンピシリンを含むLB培地50mlを補います。 5-リポキシゲナーゼ遺伝子（ALOX5）のプラスミドを含む大腸菌 BL21（DE3）で培地に接種。 42ミリモルのNa 2 HPO 4、24 mMのKH 2 PO 4、9のNaCl、19 mMのNH 4 Cl を 、1mMの硫酸マグネシウム、0.1ミリモルのCaCl 2、0.2％D-グルコース、0.1を含有する発現培地中で一晩スターター培養物を希釈％、5μMのFeSO 4、および100μg/ mLアンピシリン。 OD 600が 〜25℃で0.5になるまで細胞を増殖させます。 C 35 20℃で16時間、0.2mMのIPTGでタンパク質発現を誘導します。
- 7,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により収穫し、上清を捨てます。採取した細胞を含むチューブの下部にあるペレットを秤量し、溶解緩衝液中に回収した細胞を再懸濁（100mMのトリス-HCl、pH8.0の、100mMのNaCl、10％グリセロール、及び1mMのTCEP）、プロテアーゼ阻害剤および0.5を含みますmg / mlで細胞の1gあたりの溶解緩衝液を2mLの割合で35リゾチーム。
- 溶解80％の振幅で5×15秒間超音波処理により細胞。 7,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により細胞破片を除去します。ソリューション35中のタンパク質を沈殿させるために60％飽和- 30に硫酸アンモニウム沈殿を実行します。 16,000×gで4℃で15分間遠心分離します。注：5LOペレットを急速凍結し、最長6ヶ月間-80℃で保存することができます。
- 40,000×gで4℃で15分間、溶解緩衝液および遠心20mLでペレットを再懸濁します。
- 上の上澄み液をインキュベート 30分間、4℃でATPアガロースカラム。 0.5 M NaClを含む溶解緩衝液の1カラム容量で一回カラムを洗浄。 10μMのFeSO 4および20μg/ mLのカタラーゼを含有する溶解緩衝液中20mMのATPと5LOを溶出します。 ATP 35を除去するために、ゲルろ過クロマトグラフィーを行います。
注：5LOが不安定で、すぐに精製した後に使用する必要があります。それ以外の場合は、硫酸アンモニウム沈殿の段階（ステップ2.1.3の後の注を参照）で停止することをお勧めします。
ナノディスク - タンパク質複合体の調製
- 複合体の100μLの総容量を準備します。 MSP標準緩衝液中の1mM の Ca 2+存在と0.8μMNDと0.8μM5LOミックス（20 mMトリス-塩酸、pHが7.5; 100mMのNaCl; 0.5mMのEDTA、および1.5 mMのCaCl 2を）とは、10分間インキュベート冷やして。注：サンプルは、C 35 4℃で1ヶ月まで保存することができます。
- ゲル電気泳動
- 非変性電気泳動
- ローディングバッファーの5μL（50mMのビストリス、6NのHCl、50mMのNaCl、10％（w / v）のグリセロール、および0.001％ポンソーS、pH7.2）で49でサンプルの15μLを混合し、4にそれを読み込みます - 16％のBis-Trisゲルで電気泳動を行います。
- 光陰極バッファと陰極タンクを埋める（50mMのビストリス、50mMのトリシン、pHが6.8、および0.002％クマシーG-250）及び緩衝液（50mMビストリスおよび50mMのトリシン、pHは6.8）を実行すると、アノードタンク。 150 Vで一定の電圧を使用して分離を開始します
- クマシーフロントがゲルの終わりに到達した電気泳動分離を停止します。
- 標準クマシーブループロトコルを用いてゲルを染色。
- 変性電気泳動
- （（SDSを含むローディング緩衝液の10μLで0.05パーセントを、サンプルの40μLのミックス/ v）のブロモフェノールブルーワット; 0.2 Mトリス塩酸、pHが6.8; 20％（v / v）グリセロール。 10％（W / V）SDS。電気泳動を行うために20％トリスグリシンゲル - 及び10mM 2-メルカプトエタノール）とは4でそれをロードします。
- ランニング緩衝液で陰極と陽極とタンクを記入（25 mMトリス - 塩酸、pHが6.8; 200 mMグリシン、および0.1％（w / vで）SDS）。 150 Vで一定の電圧を使用して分離を開始します
- ローディング色素フロントがゲルの終わりに到達した電気泳動分離を停止します。
- 標準クマシーブループロトコルを用いてゲルを染色。
- 非変性電気泳動
- NAPT溶液の調製
- 酸性溶液（w / v）の2％を与えるように、室温で攪拌することにより水50mL中のリンタングステン酸ナトリウム塩1gを溶解します。
- 1 M NaOHでpHを7.4に調整します。 0.22μmのシリンジフィルターを使用して粒子を除去します。室温または4℃で溶液を保管してください。
- TEM分析用のサンプルの調製
- グロー放電炭素被覆銅グリッド（430ミリアンペアで20秒間の00メッシュ）は、試料の吸着前親水性グリッドをレンダリングします。グリッド上のサンプル（ナノディスクに対して0.8μM）の3.5μLを置き、30秒間インキュベートします。注：適用量は、サンプル濃度に応じて、2.5〜5μLを変えることができます。 1μM - ナノディスクに適した濃度範囲は0.5です。
- 濾紙を用いて余分な溶液をオフブロット。
- すぐに30秒間2％NAPTの低下にグリッドを染色します。過剰の溶液をオフにブロットし、空気乾燥さグリッドを残します。
- TEMによるグリッドを評価します。 120-200 keVの加速電圧を持つ顕微鏡は、スタッキングの度合いを推定するのに十分です。注：本プロトコルでは、較正透過型電子顕微鏡を用いた、200 keVの電界放出銃を備えました。
- TEM画像を記録します。長いスタックを示す画像については、さらに処理されません。画像は、いくつかを含有することができる外因性タンパク質と、ナノディスクの複合体を示しますショートスタックが、ほとんどの粒子が複雑です。録音複数の画像処理クラス平均と低解像度、複合体の3次元モデルを得るための標準的な方法に従って、これらの。
注：ネガティブ染色データの収集のために、グリッドが少なくとも三つの異なる日に行きました。ネガティブ染色が適用される前、毎日のために、新鮮なサンプルのインキュベーション（ステップ3.1のように）が行われました。
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Representative Results
私たちが提案する方法はmonotopic膜タンパク質が結合するための膜表面を提供するために、ナノディスクの作成に依存します。ナノディスクの脂質二重層に埋め込まない膜貫通タンパク質が存在しないように、ナノディスクは、ここでは「空のナノディスク」（ 図2A）と表記されています。これらは、2 MSP1E3D1の足場タンパク質とPOPC 8の約260分子の組成物のために256キロダルトンの計算分子量を有します。このタンパク質の使用：再構成のための脂質比、一つの大きなピーク（ 図2A）は、ゲルろ過中に溶出しました。 9mLの（ 図2A）付近のピーク画分を一つのバンド（ 図2B、レーン1）を示す、青ネイティブゲル電気泳動49により検査しました。バンドが計算された256 kDaのよりもやや大きいサイズに対応するが、TEM像で測定されたナノディスクの直径はに対応します0.5 nmの±13 nmのを期待しました。
以前の35（プロトコルステップ2）以上、より詳細に記載されるようにmonotopic膜タンパク質5-リポキシゲナーゼ（5LO）を精製しました。 78-kDaの5LOの均一性をSDS PAGE電気泳動（ 図2C、レーン1）によって分析し、35（図示せず） が完全に機能しました。
このプロトコルでは、条件は、意図的にナノディスクの積み重ねを促進する作成されます。しかし、この積層は、特に、すべての他の治療と追加が行われた後、最後のステップとしてネガティブ染色リンタングステン酸ナトリウムを添加することにより、唯一のTEM画像（いわゆる片）のために作られたサンプルにおいて誘導されることに留意すべきです。実際には、NAPT-染色されたナノディスクのイメージは、HDL 34のための非常に早い段階で予想されるスタッキング（ 図3A）を示します5、50。 図1Aに概略的に説明し、Zhang らによって提案されているような「側から見た硬貨の長いスタック」（ 図3A）は 、二重層の間に挿入リンタングステン酸と凝集ナノディスクです。 32、39。
緩衝液中の様々な添加が影響するかどうかをチェック防止、あるいは積み重ねを誘導するために重要であり、以下に明らかになるように、カルシウムイオンの効果は、調査を必要としました。 図3Bでは、積み重ねは、カルシウムイオンがNAPTで染色する前に、ナノディスクの溶液に添加した検体中に依然として存在しています。
プロトコルにおける必須のステップは、膜ビン図4に示されています鼎タンパク質は、溶液中に存在します。 5LOは、ナノディスク（ 図4A）の膜表面に結合させたとき、スタッキングはNAPT染色によって誘導されることができませんでした。概略的に図1（ 図1B、右下 ）に示すように、1：この試料のために、ナノディスクに5LOのモル比は1でした。 TEM画像はさらに少ない積層（ 図4B）を示しながらさらに、ナノディスクの脂質二重層は、両側からアクセス可能であるように、リポソームは対照的に二5LO一方にナノディスクの比率で標本を調製しました。
結合のために、いくつかの外因性の膜タンパク質は、phosphoinositols 10、11、12又はホスファチジルセリン10のような膜における特定の脂質の存在に依存する可能性があります。 5LOの場合、 の Ca 2+の存在はnecesあります43要な。 図4AおよびBには、カルシウムイオンは、ナノディスクと5LOの溶液中に存在しました。換言すれば、だけでなく、積層の欠如はmonotopicタンパク質が結合したことを示しているだけでなく、結合は、Ca 2+イオンに依存すること。これを示すために、ナノディスクおよび5LOが、カルシウムなしを含む溶液をNAPTで染色し、TEM（ 図4C）によって画像化。予想通り、5LOは、溶液中で自由5LOを残し、のCa 2+なしでナノディスクに結合することができないので、ナノディスクの代わりに（ 図4C）スタック。
ナノディスクスタッキング及び方法の概要図1.原理。ナノディスクスタッキングのA.原理。ナノディスクの溶液に負の染色リンタングステン酸ナトリウムの添加は、（左）番目につながりリン脂質二重層とPT分子（中、黒丸）との間に静電気力（中、矢印）へのナノディスクの電子スタッキング（右）。 B.プロトコルの概略図。空のナノディスク（左）4異なる角度（中央下）から示されている複合体を形成するための外因性の膜タンパク質（灰色）に結合します。 monotopicタンパク質の存在は、立体的に任意のラージオブジェクト（右上）の非存在下で誘導された積層とは対照的に、リンタングステン酸塩（右下）で染色した場合に積み重ねからナノディスクを防止します。緑色とオレンジ色のリングは淡褐色で表されるリン脂質コア、約2 MSPラッピングを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2.ナノディスクと5LOの均一性分析。再構成された空のナノディスクのA.サイズ排除クロマトグラフィー。 9 mLのナノディスクピークの溶出。 B.（A）に示すSECのピーク画分の非変性ゲル電気泳動分析。レーンMはマーカーが含まれています。単一バンドが9 mLのピーク画分をロードしたレーン1で存在します。 C.精製 5LOのゲル電気泳動分析を変性。 78 kDaの5LOはレーン1に強いバンドとして示している。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
TEMで分析タンパク質の非存在下におけるナノディスクの図3.スタックの形成。 A.ナノディスクスタッキングはwが誘導されました鶏はNAPTで染色しました。側面から見たときに「コインのスタックが「ナノディスクのスタックです。各ナノディスクは、ホワイトバンドとして表示されます。 NAPTで染色したときB.スタッキングは、ナノディスク溶液中のカルシウムイオンの存在によって妨害されませんでした。スケールバーは100nmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
TEMで分析補因子の存在下でのタンパク質の結合により、スタックの形成を防止する。図4。図1（A）または2：1（B）A.およびB.カルシウムイオンは1のモル比で5LO及びナノディスクの混合物中に存在していました。 （B）に示すように、より5LOは、ナノディスクに結合し、より少ないナノディスクは、スタッキングのために利用可能です。 BOにおける単一粒子複合体目（A）及び（B）は、更なる処理35に適しています。カルシウムイオンの非存在下でC.は 、5LOはバインドできません。このサンプルのNAPT染色は結合していない5LOを残して、ナノディスクの典型的な積み重ねを示しています。スケールバーは100nmです。画像は、69,500x倍率で4K X 4K CCDカメラで取得しました。 CCDカメラの画素サイズは、EM画像の検体レベルに2.16Åの対応する値を与える15μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
空のナノディスクの再構成、タンパク質ナノディスク複合体の調製、およびこれらの複合体のTEMについて陰性染色：この方法は、3つの部分に分離することができます。各部分は技術の限界、重要なステップ、および有用な修飾に関する個別に対処されることになります。
空のナノディスクの再構成。ナノディスクの製造と使用における重要なステップと制限。
空のナノディスクの製造のためには、MSP対脂質比を最適化することが必須です。最も一般的なMSP及び（洗剤としてコール酸を使用して）、脂質については、最適な比率のための提案が文献に見出すことができる（ 例えば、125 -現在のプロトコルで使用されるMSP1E3D1 8、51あたり130 POPC）。公開された比と比較して得られた差異は、タンパク質濃度の決意、Lの効率のための方法に依存してもよいですIPID洗剤で溶媒和、および溶液からの界面活性剤除去の方法。
我々は、可能な選択肢は、透析またはシクロデキストリン52、53の添加であるが、疎水性のビード48（ステップ1.3）を使用して、界面活性剤の除去を行うことを提案します。最初に、透析はHDL 5、34の再構成のために使用され、まだ54が好ましいです。かかわらず、界面活性剤を除去するための方法の、速度が不可欠です。除去が（疎水性ビーズの量が多すぎる）速すぎる場合は、脂質とMSPの自発的な転位が発生する時間がないかもしれません。その代わりに、リポソームおよびタンパク質凝集体の大量形成することができます。サイズ排除クロマトグラフィーの結果は、空隙容量で再構成ナノディスクの次善のピーク、及び未使用の大きなピークをリポソームの大量示すであろうMSP 4、6、51。疎水性ビーズの小さすぎるボリュームの場合、界面活性剤の除去が不完全であってもよく、形成ナノディスクは、ほとんどが予想よりも小さいサイズのばらつきを示すことができます。一つは、再構成の速度を遅くする代わりに、一つの大きな加算の疎水性ビーズの小さい方のボリュームの2つの加算をテストすることができます。
脂質の選択は慎重にナノディスクを調製するための目的に応じて、8、9、45、46、55を考慮すべきです。一般的には、（同様に2次元結晶化実験用として、ナノディスクまたはリポソームの再構成）膜の形成を目的としたすべてのメソッドのために、脂質は「流体」状態56でなければなりません。一定の温度以下では、第電子脂質は、硬質です。このいわゆる転移温度（Tm）以上、脂質は流体です。いくつかの一般的に使用される飽和脂質は室温よりもTmを有することに注意してください。また、脂質混合物のために、脂質ミューズの混和性が57とみなされます。ナノディスクの形成のための最適な温度は、脂質の相転移（Tm）を周りです。
本プロトコルにおける界面活性剤は、コール酸ナトリウム8です。別の洗剤を使用する必要がある場合は、コール酸のために使用されるものと同じ濃度を直接使用することはできません。特定の穏やかな界面活性剤は、より効果的に脂質を溶解し、そしてより高い濃度が必要とされ得ます。クロロホルム（プロトコールのステップ1.2.2）の蒸発後に得られた脂質ケーキは、洗剤によって透明な溶液に溶解されなければなりません。ボルテックスは、凍結融解サイクル、超音波浴または超音波処理は、可溶化を促進するために使用することができます。
combinatのため脂質のイオン（-mixtures）、MSP、ここで使用されるもの、大きな凝集体及びリポソームまたは過剰なMSPを最小限にする滴定以外の界面活性剤が必要4、6、51、58です。 MSPおよびリン脂質のいくつかの組み合わせのために、最適化は、他の4、6、51の場合よりも困難であり、それは、ピーク画分の含有量を測定することが必須となります。ナノディスクの組成およびサイズを分析するための最も正確な方法は、リン酸分析4によってMSP当たりリン脂質の数を決定し、ナノディスク、分子量を計算することです。ナノディスクのサイズは十分に分解、非変性ゲル電気泳動により推定することができます。動的光散乱（DLS）59。または負染色TEM、名前だけでいくつかのメソッドに。ネガについてここで提示的染色により誘導されるスタッキングプロトコル、TEM像に存在するスタックの幅の測定は、ナノディスクの直径が得られます。
膜足場タンパク質の発現および精製に関しては、可溶性タンパク質のためのすべての通常の注意事項との懸念が取られるべきです。異なるタグおよびプロテアーゼ切断部位を含有することができる利用可能なプラスミドは、ケースにタグはMSPを使用する前に削除する必要があります。
予防措置がとられない限り5LO、プロトコルで使用されるmonotopicタンパク質は、他の場所35およびそこに参考文献に記載されて、急速に不活性化します。要するに、触媒鉄は簡単に失われ、酸化条件は5LOの二量体化を引き起こす可能性があります。ノート（プロトコルステップ2.1.3）で述べたように、精製後の使用まで保存沈殿工程、アリコートの後に停止することができます。一定分量の精製後、タンパク質は数時間D内で使用する必要があります急速な不活性化35のUE。
タンパク質 - ナノディスク錯体の製造における重要なステップ。
ナノディスク領域に対するmonotopicタンパク質の大きさは重要です。 MSP1E3D1タンパク質鎖の長さは10.5 nmの内径および8900-Å2二重層面積約8ナノディスクに対応しています。これは5LO 45の膜に埋め込まれた部分について報告領域にも対応しています。したがって、私たちの予想結合比は1：1、または最大で2：ナノディスクあたり1 5LO。滴定実験35に報告されているように、これは、正確であることが判明しました。他の場所で35説明したようにしかし、ナノディスクあたり2 5LOの最大結合は、得られませんでした。幾分大きなナノディスクは、おそらく完全な2のために可能性があります：1は、これが望ましいの実験のために結合するが、この場合には、1：1の比率が主な目的です。
ove_contentは">タンパク質-ナノディスク複合体形成のための最適な脂質の選択は、以前の知識によって支援することができる。これは、脂質の選択は、合成POPC 35だった現在のプロトコルであった場合。脂質頭部基46とバリエーションで両方のバリエーションアシル鎖の飽和45は、リポソーム5LO結合研究において試験した。5LOアクティビティ固有の脂質要件が知られていない場合のsn-2アシル鎖の位置45、46不飽和コリンリン脂質を含有するリポソームに結合することにより増加したが元の膜の同一性は、知られている天然の脂質抽出物は、最初に55を試験することができます。補因子依存性は、膜43を結合するためのCa 2+イオンに依存5LO、のために知られていました。完全に溶液からカルシウムを除去するために挑戦されています。ここでは、錯化剤EDTAは遊離Ca 2+イオンの制御された量を残すように調整した量の緩衝液中に存在しています。バッファ内の遊離および結合分子の計算は、錯化剤35の複数のタイプを含むバッファーのBAD 60ソフトウェアによって作られました。膜中に部分的に可溶性の補因子の濃度に与える影響は、このソフトウェアによって占めされていません。
スタックの形成を促進するためのナノディスクのネガティブ染色での重要なステップ。
最大のスタッキングが所望される手近プロトコルについては、汚れがphosphotungstenのナトリウム塩である必要があります。タングステンの異なる塩が使用可能であり、我々は、リンタングステン酸（図示せず）スタッキングではあまり効率的であったことを観察しました。不明な理由のために、PT染色中のナトリウムの量が多いとスタッキングを促進しているようです。また、サンプルバッファには、より低いナトリウム続きことが示されました耳鼻咽喉科、32誘起積層より少ない量の。これはまた、スタッキングを低減するのと同じ理由で、試料後EMグリッドに適用されている、染色前に水洗が行われるべきではありません。程度のプロトコルの最適なパフォーマンスを実現するために必要なことはありませんが、一方で、いくつかのスタックは常に、誘導されました。
もちろん、ここでのCa 2+イオンのような補因子は陰性染色で、またはナノディスクとの干渉をチェックする必要があります。本プロトコルの場合、カルシウムイオンは、リン酸緩衝液を沈殿させたであろうので、トリス緩衝液を使用しました。別のネガティブ染色、ウラニルギ35を使用してチェックし、またカルシウムはNAPTによって誘発されるスタッキング（ 図3B）を防止なかったとしてナノディスクは、それ自体のCa 2+イオンによって積み重ねられていませんでした。
小さなmonotopicタンパク質のために、余分なサイズはcryoEMで検出可能な、それをレンダリングすることができるナノディスクに結合することによって追加されました。 Aタンパク質と比較して非常に大きなナノディスクは積み重ね防ぐものではありません大きなナノディスク上の小さなタンパク質として、最適ではないかもしれません。しかし、外因性タンパク質の形状が影響を与える可能性があります。何の正確な比率は、現在のように提供することはできませんが、タンパク質の推定結合表面よりもわずかに大きいだけナノディスク二重層面が推奨されます。この制限により、最大結合タンパク質は、ナノディスクの各側に1つのタンパク質であろう。
一般的な制限及び方法の利点。
プロトコルは、すべての研究室では使用できませんTEMおよび関連機器の可用性に依存します。しかしながら、従来のCCDカメラを装備した120〜200-kVの電子顕微鏡は、スタッキングの検出のために非常に十分であろう。 NAPTネガティブ染色は、室温で行われ、グリッドは、後で見るためにこの温度で保存することができます。
TEMのIMAGingがすぐにスタッキングが防止されているか否かを示すであろう。構造情報を得るためにタンパク質ナノディスク複合体（ 例えば、 図4AおよびB）、さらなる処理を示す画像に対して実行することができます。負染色したサンプルの構造の詳細は、1ナノメートルに達することができると便利な構造情報29を提供することができます。 cryoEMによって決意を構築するために専用の研究室では、試料のネガティブ染色は、標準的な手順です。私たちのプロトコルの使用は、通常の手順に迅速かつ単純な加算となります。
一部monotopicタンパク質は、それが必要なナノディスク13に貫通タンパク質の取り込みと同じ手順によりナノディスク-タンパク質複合体を形成すること、ミリストイル化、パルミトイル化、またはタンパク質表面上の疎水性パッチによって膜に固定されています。ここでは、タンパク質複合体中のサブユニットの一つは、AMが含まれ膜結合のための柔軟なN末端尾部にyristoylation。酢酸ウラニル染色TEM像のためには、タンパク質複合体は、膜にではなく、ナノディスクの面に垂直に結合されたと述べました。この及び他の結果は、膜付着13を剛性構造を確認しました。この結合のために、私たちの提案されたプロトコルに従って染色NAPTは、同じ均一に広げ、単一の粒子を示すであろう。添付ファイルは、柔軟な鎖を介していた場合には、酢酸ウラニル染色は明確な結果を与えていない可能性があります。私たちは "、コインのスタック「柔軟な連鎖膜結合型タンパク質複合体のために、NAPT染色は典型的に実証し、スタックするナノディスクを誘導する可能性がある、と推測しているが、今の側面に取り付けられたタンパク質によって装飾が施されています。
リポソームを使用することができれば、なぜナノディスクを使うのか？脂質、補因子、または他のパラメータの最適化は非常にウェルあたりの結合のためにリポソーム中に試験することができますipheralタンパク質（CF。5LO）。リポソームのNAPT誘発性積層のでmonotopicタンパク質がリポソームスタッキングを防止することができ、32実証されています。しかし、monotopicタンパク質へとナノディスクと比較してリポソームのサイズも戦場に出ます。大きな外因性タンパク質は、小さなタンパク質のに対し、78-kDaの5LO様、かもしれないリポソームあたりの高い数で存在しない限り、リポソームのスタッキングを防止することができる場合があります。小さなリポソームを調製し、まだその膜の曲率より強く、小胞小さくすることができます。ナノディスク二重層は平坦です。ナノディスクを使用して様々なパラメータをテストすることはあまり費用対効果の高いMSPが原因である可能性があります。一方、リポソーム、部分的に、リポソームの内部に、さらに膜に分割し、特定の高価な補因子または基質のために、大量に必要とされ得ます。結論として、ナノディスクのプラットフォームは、正確なN結合に定義された領域を選択する可能性を提供しますタンパク質のアンバー。二重層領域が両側からアクセス可能であり、平坦です。
法の意義。
タンパク質または複合巨大分子の三次元構造を決定することは、細胞の内部構造を可視化します。脂質二重層中の成分との物理的相互作用は、それらのメカニズムの機能の一部であるように、この混雑した環境では、特定のタンパク質は通常、単独で、または他のタンパク質との複合体で、膜表面上でアクティブであるが、。他の人が膜に係留されているが、それにもかかわらず、トリガのいくつかの種類に起因する膜上の立体構造や向きを変更するのに対し、いくつかのタンパク質は、溶液中のコンホメーションは、膜の埋め込み時に変更されます。疎水性基板のエントリー・パスは、次に開くことができる、または膜貫通タンパク質への結合を可能にするコンホメーションが発生することがあります。膜に結合し、周辺タンパク質の構造、または少なくとも構成情報を取得するには困難です。
jove_content ">ナノディスクは、 図11に示すように 、膜10の配向および機能に関するいくつかの研究で使用され12、13、14、15、16、17れた。解毒における中央のシトクロムP450、αヘリックスにより膜に固定し、含まれています直線偏光二色性の測定15を可能にする、その球状部分のヘム基は、。結果は、それによって膜に埋め込まれたチトクロームP450のシミュレーションから引き出された他の結論を強化し、作られたシミュレーションと密接に一致した膜に対するヘムの向きを示しました。小さなナノディスクに膜に固定GTPアーゼは、NMR研究は、それぞれのインタフェース膜を有するタンパク質上の2つの異なる領域を特定することができ、さらに、どのようヌクレオ潮結合は、他の17に1のインタフェースからスイッチを誘導しました。突然変異とエフェクター結合、ならびにGTP結合は、16シグナリング発癌性に影響を与える膜上の向きに依存する活動への影響、数を見つけるためのRasスーパーファミリー内の別のGTPaseで検討しました。 5LOは、可溶性の立体配座61を有しており、核膜43上に結合するためにカルシウムを必要とします。巨大な単層リポソームを用いて、偏光、減衰全反射赤外実験は、46を行いました。その結果、N末端βバレルは、通常、膜から約45度傾いたβバレルの対称軸と、膜に結合することを暗示しました。 5LO C末端ドメインは、ほぼ円筒状のαヘリックス束である、これは、膜45を長軸と平行に結合することが提案されました= "外部参照"> 46。ナノディスクに組み込まれ5LOに関する我々の以前の研究では、二重層の面積は、上記に示唆した向き35と側につき1 5LOを可能にするために選ばれました。 TEM画像は、低解像度35であるが、この向きを確認しました。例えば、唯一のN末端βバレルが結合していたが、ない場合はC末端ドメインは、ナノディスクあたり5LOの高い数が得られたであろう。また、別のタンパク質は、活性化因子、膜貫通タンパク質5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質、FLAPとして、膜結合および5LOの向きを変更することができます。 FLAPは、ナノディスクに再構成された、と私たちは5LOとFLAPの間の相互作用を研究するために、TEMおよび他の方法を使用します。多くの炎症性疾患41に関与する強力な化学誘引物質の合成の最初のステップであるA4をロイコトリエンに変換され、内因性アラキドン酸、42でそれらの相互作用の結果SUP>、62。5LO-ナノディスク複合体はcryoEMによる構造調査のための約200キロダルトンの限界に近い、334キロダルトンの分子量を有すると計算されます。 5LOの原子構造が61入手可能であるようにそれにもかかわらず、中解像度へのドッキングは、3次元電子密度マップは、ナノディスクの膜との相互作用についての情報をもたらすであろう。
cryoEM技術の革新は唯一の原子レベル63に解像度をプッシュするだけでなく、より小さなタンパク質にサイズ制限をプッシュされていません。 NMR 22による構造決意の場合、状況は目的が今200キロダルトンに近づいている大きさの範囲を、増加させることであるとして、反対です。最近、小GTPアーゼタンパク質の結合膜をNMR 16,17により調べました。わずか約20キロダルトンのこれらのタンパク質、我々約130キロダルトンの複合体を形成する、7.6-nmの内径の小さいナノディスクにつながリ。将来的には、同様のサイズの複合体は、結合タンパク質膜のさまざまな側面を解明するためにNMRおよびcryoEM両方によって調査することができました。
プロトコルの拡張は、ナノディスク二重層に貫通タンパク質（TMP）を含むナノディスクを調査することである可能性があります。 TMP-ナノディスクのNAPTによって誘導される積層は、同一の脂質組成を含む空のナノディスクと比較することができます。短いループが64を積み重ねる防ぐものではありませんしながら、大extramembranousループは、スタッキングを防止するであろう。プロトコルは、特に膜貫通タンパク質に結合するタンパク質を研究するために使用することができ、これは、有利に変えることができました。
この方法の利点は、膜相互作用を直ちに可視化することができるということです。空のナノディスクを大量に製造する比較的簡単一が延びることを意味しますこの方法は、pH、温度、緩衝剤、および結合monotopicタンパク質の補因子依存性などのさまざまな条件をスクリーニングするため。ナノディスクプラットフォーム9は、膜貫通タンパク質の安定化のために開発され、ますます、この目的のために使用されるのに対し、実際には、多かれ少なかれ、外因性タンパク質を一過性結合の多数の研究のための電位が存在する内部細胞が明らかに保たれるべきです念頭に置いて。
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Acknowledgments
著者は彼らのサポートのためにスウェーデンの研究評議会、ストックホルム郡評議会、およびKI資金に感謝します。 MSPの発現および精製は、カロリンスカ研究所/ SciLifeLabタンパク質科学基盤施設（http://PSF.ki.se）で行いました。また、作者は彼らの技術的な専門知識を共有するため、それらのタイムリーな支援のために博士パシPurhonen博士マチルダスエルバーグに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transmission electron microscope: JEOL2100F | JEOL | ||
| CCD camera | Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany | ||
| Glow discharger | Baltec | ||
| TEM grid: 400 mesh | TAAB | GM016/C | |
| Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 | Agilent Technologies | 5190-2526 | |
| Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Plasmid: MSP1E3D1 | Addgene | 20066 | |
| Bacteria: BL21DE3 | NEB | C2527H | |
| Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 | Protein Science Facility, KI, Solna | ||
| Purification Matrix: ATP agarose | Sigma Aldrich | A2767 | |
| Purification Matrix: HisTrap HP-5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17-5247-01 | |
| Lipid: POPC | Avanti polar lipids | 850457C | 25 mg/mL in chloroform |
| Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin | Bio-Rad | 1523920 | |
| 13 mm syringe filter: 0.2 μm | Pall life sciences | PN 4554T | |
| Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate | Sigma Aldrich | 31648 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | |
| TCEP | Sigma Aldrich | 646547 | |
| Detergent: Sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445-10G | |
| Sodium Cholate | 500 mM Sodium cholate. Resuspend in miliQ water and store at -20 °C. | ||
| Lipid Stock | 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. Store -80 °C for a month, after purging the solution with nitrogen. |
||
| MSP standard buffer | 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA. Store at 4 °C. |
||
| Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer | Thermo Fisher Scientific | BN2001 | 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8 |
| Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer | Thermo Fisher Scientific | BN2002 | 50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250 |
| Non-Denaturaing Electrophoresis 4x Sample loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | BN2003 | 50 mM Bis-Tris, pH 7.2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S |
| Denaturaing Electrophoresis Running Buffer | In-house recipe: 25 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS | ||
| Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer | In-house recipe: 0.05% (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl, pH 6.8, 20% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 10 mM 2-mercaptoethanol | ||
| Terrific broth | Tryptone - 12.0 g, Yeast Extract - 24.0 g, 100 mL 0.17 M KH2PO4 and 0.72 M K2HPO4, Glycerol - 4 mL. Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 mL and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium. |
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