Summary
このプロトコルは、哺乳動物発現系における治療抗体の産生を記載しています。記載されている方法は、ベクターDNAの調製、安定なトランスフェクションおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いた大規模な文化や精製の設定ヒト胚性腎臓293細胞株の無血清適応を含みます。
Introduction
治療用抗体の成功は、次世代の治療薬の波が開始されるように、抗体の開発に多額の投資を駆動し続けます。抗体市場は良好な特性4を有する抗体断片1、抗体-薬剤コンジュゲート2、二重特異性抗体3と操作された抗体により再形成されることが期待されます。医薬品の関心を集めて別のクラスは、バイオシミラーです。バイオシミラーの抗体は、すでに規制当局の承認を受けている治療用抗体の製品を複製する「高度に類似」しています。提案されたバイオシミラーは、その構造、機能、動物の毒性、臨床安全性と有効性、人間の薬物動態（PK）、薬力学（PD）および免疫原性5、6に関して創始抗体と同等でなければなりません。
承認rをバイオシミラーの抗体のATEは、製品の最終品質に厳しい制約のために遅れています。このような最終処理工程に至る細胞株及び培養条件の特定等の正確な製造プロセスは、独自のままであり得ます。詳細は何ですか、抗体の製造は、本質的に非常に類似した製品を製造するの挑戦に追加できる変動率を伴います。総合的な物理化学的および生物物理学的特徴との比較は非常に困難である、まだバイオシミラー抗体の特性を実証する多くの研究が文献7、8、9に浮上しています。
治療用抗体の生成は、それぞれの抗体のための遺伝子を保持するベクターを哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションから始まります。ベクター設計、細胞株および培養条件は、元の設定に重要な考慮事項でありますPRESSIONシステム。
抗体のDNA配列は、特許を含む医薬品銀行（www.drugbank.ca）、IMGT（www.igmt.org）や研究出版物から供給することができます。例えば、トラスツズマブのシーケンスは、医薬品銀行（：DB00072 DB ID）を介して利用可能です。可変領域のアミノ酸配列は、所望の宿主種における合成のための遺伝子の設計及び最適化を行うことができます。それは修飾アミノ酸配列に対して行われていないバイオシミラー抗体のために重要です。合成された後、抗体遺伝子を選択した適当なベクターにサブクローニングすることができます。
ヒトIgG抗体は、2つの同一の重鎖と2つの同一の軽鎖からなります。両鎖の密調節された発現は、哺乳動物細胞10における異種IgGタンパク質の最適な生産に不可欠です。鎖間ジスルフィド結合を形成する必要があり、翻訳後修飾の数であることを持っているだけでなく、イントラタンパク質生合成の間にtroduced。ベクトルの数は、抗体遺伝子を（材料の表を参照）を発現するように設計されていますが利用可能です。これらの抗体に特異的ベクターは、通常、それぞれの鎖のように可変領域のみがクローニングを必要とする重鎖及び軽鎖の双方のための定常領域を発現します。
二つの独立した構築物（コトランスフェクション）を用いた細胞のトランスフェクションは、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を送達するための最も一般的なアプローチです。すなわち、各遺伝子は、それ自身のプロモーターにより駆動され、小胞体に組み立てられる前に、別個の抗体鎖として転写されます。一方、多シストロン性ベクターは、mRNA 11の内部領域から許可翻訳有する単一のmRNA転写物として複数の遺伝子の発現を可能に組み込まれた内部リボソーム侵入部位（IRES）要素を有します。この例では、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子はARRANGに接続されています両方の抗体鎖10、12の同時発現を達成するement。
一過性にトランスフェクトされた細胞は、実験の限られた数を実行するのに十分なタンパク質を得ながら、ゲノム組込みのための選択を受けた安定にトランスフェクトされた細胞株は、高い収率を提供できます。より高いタンパク質の量は、in vitroでの特徴付けに関連するアッセイ開発を可能にし、そのようなクローン細胞株とリード候補の選択などの下流の用途を考慮して、抗体の質の指標を提供することができます。
この記事の目的は、哺乳動物発現系において産生さ治療抗体の安定な発現および精製を記載することです。実際、この方法は、バイオシミラーの抗体の発現に適用することができます。この方法は、時間がかかりSTEいえ、重要へ進む前に、抗体の最初の特徴付けのために使用することができますより大規模な製造のための望ましいクローンを同定するPS。また、この方法は、他のタンパク質だけでなく、抗体を発現するために使用することができます。
以下の詳細なプロトコルは、治療用抗体トラスツズマブの発現を記載します。これは、自動化されたクロマトグラフィー法によってHEK-293細胞株と抗体タンパク質の精製における安定なトランスフェクションに続いてベクターDNAの調製から成ります。
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Protocol
注：適切な哺乳動物発現ベクターは、このプロトコルを使用する必要があります。ここでは、2つの発現カセットを含有する単一の構築物が使用される（ すなわち、重鎖および軽鎖の発現は別個のプロモーターによって駆動されます）。トラスツズマブ重鎖および軽鎖は、以前にベクターにクローニングしました。このベクターは、非営利のプラスミドリポジトリ13を経て得られたアンドリューBeavilからの贈り物でした。
1.回復とベクターDNAのスケールアップ
注：ベクターDNAは、 大腸菌 XL-1ブルー株における軟寒天穿刺培養として受信されました。ベクターは、ハイグロマイシン耐性を運びます。
- ストリーク単離コロニー/ mlのハイグロマイシン75μgので調製したルリア・ベルターニ（LB）寒天プレートその後、穿刺培養のソフト寒天に、無菌接種刺しやループを挿入します。 18-24時間、37℃でプレートをインキュベートします。
- 75 / mlのハイグロマイシンを含む5ミリリットルのTerrificブロス（TB）にシングルコロニーを接種します。 Incu225rpmで振盪しながら18-24時間、37℃でお譲り文化。
- 優しくクライオバイアルに200μlの80％グリセロールで文化の800μLを混合することにより、ベクターDNAのグリセロールストックを準備し、-80℃で凍結する一晩培養を使用してください。
- バッフル振とうフラスコ（ すなわち、1 /千希釈）で75 / mlのハイグロマイシンを含む100 mlのTBの一晩培養物100μlを加えます。 225rpmで振盪しながら18-24時間、37℃で培養をインキュベートします。
- 一晩培養した後、抽出し、以下の例外を除いて、MIDI /マキシ調製キットの製造業者の説明書に従ってDNAを精製。水（pHは7.0〜8.5）で最終工程、溶出または再懸濁DNA中。
- その後、-20℃でDNAを保存260および280nmでの濃度と吸光度の測定値によるDNAの純度を確認してください。
注：オプション（推奨）：身元を確認するために、ベクター特異的プライマーを用いて配列DNA。
2。 HEK-293細胞の安定なトランスフェクション
- エルレンマイヤーフラスコ中の0.1％の非イオン性界面活性剤を補充した無血清培地中で標準的なプロトコールに従ってHEK-293細胞（浮遊細胞）の成長、維持。 2×10 5細胞/ mlとサブカルチャー4日毎に維持します。 5％CO 2および120rpmで回転しながら37℃で培養細胞。
注：トランスフェクション前に細胞なし4未満日間培養されている必要がありますし、これ以上の4週間。血清含有培地中で単層として増殖させたHEK-293細胞は、この手順のために使用することができます。 - トランスフェクション前の日に、種子HEK-293 10％の熱不活性化ウシ胎児血清（を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）2mlの12ウェルプレートのウェル中に3×10 5細胞/ mlの細胞FBS）。トランスフェクションの日に、細胞が80〜90％の密集度に達したことを確認してください
- その後、一緒に混ぜてトランスフェクション培地で別々にDNAおよびポリエチレンイミン（PEI）を希釈します。
- 300μlのトランスフェクション培地にウェルあたり1.25μgのベクターDNA（12ウェルについては15μg）を希釈します。 5分間、室温でインキュベートします。
- 300μlのトランスフェクション培地中：; 1mg / mlのPEI溶液2.5μlの（PEIへのDNAの2比すなわち 1 12ウェルについての30μl）を希釈します。 5分間、室温でインキュベートします。
- 穏やかに混合し、15分間室温でインキュベートし、希釈したPEIに希釈されたDNAを追加します。
- プレートの各ウェルにDNA / PEI混合物の滴下の50μLを加えます。 24時間37℃、5％CO 2でのトランスフェクション混合物は、次いで、プレートを置く配布する優しく板岩。
- ウェルBハイグロマイシン、10日間、37℃、5％CO 2にプレートを戻すML /50μgのを追加。
注：10日目では、非トランスフェクトされた細胞は死んだと切り離さプレートの表面から、安定的にトランスフェクト細胞が生存可能となり、一方、プレートに取り付けられています。 - を含むウェル内のメディアを交換します1/4体積の無血清培地と3/4の体積のDMEM 10％FBSを補充した（ すなわち 0.5ミリリットルの無血清培地+ 1.5ミリリットルDMEM = 7.5％の最終血清濃度）と4日間インキュベートします。
- 10％FBS（+ 1ミリリットルDMEM = 5％の最終血清濃度すなわち 1ミリリットルの無血清培地）を補充した1/2容量の無血清培地および1/2容量のDMEMでウェル中の培地を交換し、4日間インキュベートします。
- 10％FBS（ すなわち 1.5ミリリットルの無血清培地+ 0.5ミリリットルDMEM = 2.5％の最終血清濃度）を補充した3/4の体積の無血清培地と1/4の体積DMEMでウェル中の培地を交換し、4日間インキュベートします。
- 0.1％の非イオン性界面活性剤（すなわち、0％の最終血清濃度）を補充した無血清培地の2ミリリットルでウェル中の培地を交換し、4日間インキュベートします。
注：無血清適応の間に細胞に50μg/ mlのハイグロマイシンB選択圧を維持します。無血清培地に適応した細胞をウェルの表面から切り離し、私をクラスタ化することができますn個のサスペンション。 50μgの追加のサプリメントと培養条件のために2.1をステップを参照してください/ Bをmlハイグロマイシン - ピペットを用いて、静かに別のチューブに12ウェルプレート、プール細胞中の懸濁培養物を混ぜます。
- 血球計数器を用いて、2×10 5細胞/ mlの三角フラスコ中で30 mlの無血清培地にプールの細胞および種子を列挙する。 5％CO 2および120rpmで回転しながら37℃で培養細胞。 4日ごとに継代培養し、展開します。
- 液体窒素中で凍結保存のための1×10 7細胞/バイアルで10バイアルを得るために必要な細胞密度まで培養サイズを拡大し続けます。 10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有する無血清培地中の細胞を凍結します。
注：抗体を含有する馴化培地は、タンパク質産生を確認するために、それぞれの継代培養で回収または精製条件を最適化するために使用することができます。馴化培地を収穫し、継代培養のための細胞を維持、で培養物を遠心分離します5分間300×gでは、その後のフィルター滅菌上清を0.22μmのフィルターを通して。濾過した上清を、1〜2週間、または長期保存のために-20℃、4℃に保持することができます。
バッチ生い茂る文化から3.大規模抗体産生
注：抗体産生は、既存のセルがセットアップされるために、バッチ過剰に増殖培養容量に基づいて、必要な細胞密度に展開されているステップ2.11からに追跡することができます。そうでない場合は、凍結保存から解凍された細胞は、一旦、適切な細胞密度および体積に膨張し、この段階で始まります。様々な培養サプリメントは、抗体産生を最適化するために使用されてもよいです。抗体の収量を増加させるトリプトンの使用は、このプロトコルで示されています。
- 種子細胞は、2つの三角フラスコ中の100mlの無血清培地中で2×10 5細胞/ mlで（補充-未及び栄養補充した培養物からの抗体の収率を比較します）。 37での文化 °C、5％CO 2
- 24時間後、栄養添加した培養に最終濃度0.5％にトリプトンを追加します。無血清培地で未添加した培養の音量を均等化。
- 8日目から、細胞生存率を監視するために、血球計数器を用いて毎日培養物の細胞数を実行します。細胞生存率が80％未満になると、培養上清を収穫。
- 15分間、3000×gでの培養物の遠心分離により収穫上清その後のフィルター滅菌（抗体を含む）上清を0.22μmのフィルターを通して。 4°C（短期）で上清を保存したり、-20℃（長期）で凍結。
自動化された高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システムを用いたアフィニティークロマトグラフィー4.抗体精製
注：以下の手順は、一般に、ほとんどの自動化システムにも適用することができます。精製は、室温または4℃（FPLCシステムを冷却室に保管されている場合）で行うことができます。スカウト一連の試験は（結果の項を参照）馴化培地から精製した抗体の最大の回収を確実にするために、バッファ、溶出緩衝液及びpH結合、適切なカラムマトリックスなどの最適な精製条件を同定することができます。最適な条件は、精製された抗体またはタンパク質に依存しています。精製は、自動化されたFPLCシステムで行いました。精製を、5mlのプロテインAカラムを用いて室温で行いました。
- 超純水を使用して、以下の緩衝液を準備した後、0.22μmのフィルターでろ過推奨pHに調整します。
- 0.14 MのNaCl、0.0027 MのKCl、0.01 MのNa 2 HPO 4および0.001 M KH 2 PO 4：以下を混合することにより、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4（結合緩衝液）の1 Lを用意。必要に応じてバッファをフィルタリングする前にpHを調整します。
- 0.1Mグリシン - 塩酸pHは2.7（溶出バッファー）の500ミリリットルを準備します。バフをフィルタリングする前にpHを調整しますえー。
- 1 MトリスpHは9.0（中和緩衝液）の50ミリリットルを準備します。
- コンピュータとすべてのシステム電源と通信接続が行われていることを確認します。デバイスは、ソフトウェア「システムコントロール」モジュールで表示されるはずです。確保UVセルは、280 nmの波長に設定されています。オプション：接続して使用する場合にはpH計を校正。
- システムを洗浄するために超純水でA、B及び試料ポンプの入口管を浸します。チューブ内の空気またはシステム内の空気の疑いがある場合、注射器でポンプをパージします。システムコントローラを介して、または自動化された方法を介して手動操作により水を使用してシステムを洗ってください。その圧力、導電率、UV 280トレースとpHは一貫性を維持し、カラムの圧力限界は、メーカーの仕様通りに超えていないことを確認します。
注：異常が先に進む前に対処する必要があり、システム内の空気や閉塞を示すことができます。 - システムコントローラモジュールでは、1で流量を開始ml /分を手動でいずれかの負荷のポンプAを経由して（サンプルループをバイパスして）または列を接続を開始する位置（サンプルループを介して）注入します。外し、システムの列位置の入口のチューブとカラム入口に接続されたストッパーを外します。
- 水は、列にシステムのチューブを取り付ける柱の上にシステム・チューブ滴下から流れることを可能にします。カラム入口を有し、水の滴で溢れフィッティング入口は、気泡のない接続を保証します。
- 下流の出口でカラムの出口を取り付け、すべてのフィッティングがしっかりと固定されていることを確認します。列仕様で概説されるようになりましたシステムに接続されている列で、最大圧力限界と流量の制限を超えないようにしてください。
- 水の5カラム容量（CV）でカラムを洗浄します。必要に応じてUV 280トレースが安定するまで、カラム洗浄を続けます。
- バッファトンの結合に溶出緩衝液とサンプルポンプ内のバッファ、Bの結合でAの入口チューブを浸しO正しいバッファにシステムを平衡化。手動操作によってPumpWashを使用してバッファに入口管を埋めます。
- ソフトウェアの「メソッドエディタ」モジュールでは、セットアップに使用されることが意図されているカラムのアフィニティークロマトグラフィー法をメソッドウィザードを使用します。
注：自動化されたFPLCシステムは、方法の推奨設定（ すなわち流量と圧力限界）で予め充填し、精製のために選択した列（メーカー、マトリックスおよびサイズ）に基づいてステップを実行しています。- プロテインAアフィニティークロマトグラフィーのための次の実行の手順を実行します。
- 結合緩衝液の5 CVでシステムを平衡化し、廃棄物容器にフロースルーを収集します。
- カラムにロードしたサンプルと別々の容器にフロースルーを収集する（ボリュームがメソッドに手動で指定されてロードされます）。
- 結合緩衝液の5 CVで洗浄システムと別の容器にフロースルーを収集します。
- 5 CVのisocratでカラムを溶出溶出を使用したIC分別はフラクションコレクターによって画分として精製された抗体のサンプルをバッファリングし、収集します。
- 結合緩衝液の5 CVでシステムを平衡化し、廃棄物容器にフロースルーを収集します。
- プロテインAアフィニティークロマトグラフィーのための次の実行の手順を実行します。
- この方法は、設定された後、馴化培地の体積がカラムに適用されるように指定して、メソッドを保存します。
注：メソッドで指定されたボリュームは、サンプルの実行中に空気の導入を回避するために、実際の量よりも5〜10ミリリットル以下でなければなりません。このプロトコルで使用される指定されたボリューム90〜120 mlです。 - 馴化培地を含む容器にサンプルポンプチューブを水没。
- 指定された出口チューブを介して、サンプルフロースルーを収集するために別の容器を準備します。
注：エラーが実行中に発生したり、列の結合能が列または精製rに再適用するフロースルーを必要とする超過した場合に、フロースルーを収集することが重要ですepeated。 - フラクションコレクターに収集チューブを準備します。 1ミリリットルの画分体積あたりの中和バッファー100μlを加えます。 FPLCシステムが自動的に収集チューブに分画を溶出します。
- ソフトウェアの「システムコントロール」モジュールでは、この方法を実行するために開きます。
注：メソッドの実行は、メソッドの変数をチェックするフラクションコレクターのセットアップと結果のファイル名と保存場所を定義含む一連のページで開始されます。 - 実行を開始するためにSTARTをクリックしてください。ランは、「システムコントロール」モジュールで監視することができます。
- 精製実行の完了時に、システムソフトウェアの「評価」モジュールで得られたクロマトグラムを確認してください。
- 別のチューブ、緩衝液交換にすべてのタンパク質含有画分を合わせ、カットオフ30kDaの分子量を有する遠心分離フィルター装置を用いて、PBS中で濃縮しました。メーカーのに従って遠心分離ステップを実行します指示。
- 製造業者の指示に従ってビシンコニン酸アッセイ（BCA）を用いて抗体の濃度を測定します。
- 別の精製ランが実行される場合、結合バッファーとリピートの一等地のサンプルポンプチューブは、4.9から4.14を繰り返します。
- 精製の実行が完了した時点で、超純水にA、Bおよびサンプルポンプの入口管を浸漬し、ステップ3で実行されるようなシステムとカラムを洗浄。
- システム及び列を格納するために20％エタノールで繰り返し洗浄手順でA、B、サンプルポンプチューブを浸します。
- 下流の出口からカラムを外し、カラムストッパーを交換し、その後、入口でカラムを切断し、ストッパーを交換して、システムにチューブを再接続します。 4℃で列を保管してください。
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Representative Results
図1に示すようにトランスフェクトされたHEK-293細胞によるトラスツズマブの安定生産は、バイオレイヤー干渉法（BLI）を用いて確認しました。 IgGの標準曲線は、IgG抗体標準及びタンパク質バイオセンサー（ 図1A）との間の結合速度を測定することによって作製しました。粗上清のサンプルを同様に測定し、その濃度を、標準曲線（ 図1B）から補間します。上清濃度は、二週間の無血清適応後前過剰増殖バッチ培養のための細胞をセットアップする（継代培養で回収50ミリリットルからサンプリング）は、約25μgの/ mlであると測定されました。
無血清適応をプールし、精製条件を最適化するために使用された後、各継代において回収した上清。 図2に示すように、結合および溶出緩衝液のスカウトを行いました図2Aに示されています。カラムを平衡化タンパク質と、UV 280シグナルの増加は、サンプルのローディングを表しますこの増加は、抗体がカラムに捕捉されているが、（この波長のUV光を吸収し、未結合のタンパク質を含む）カラムを通過するフロースルー上清に起因します。サンプルのロードが完了したら、UV 280信号は、任意の残りの非結合タンパク質が洗い流されるようにベースラインに戻ります。 pHは分画し、フラクションコレクターが収集し、溶出した抗体を用いたUV 280信号の増加によって示されるカラムによって捕捉抗体を解放するために最適なpHに減少すると溶出が発生します。サンプル実行を通して、システム圧力に対し、緩衝液中の塩濃度に基づいて、導電率の変化は、比較的一定のままであるべきです。最適な溶出、pHおよびバッファが（ 図2B）最初にスカウトされました。その抗体エルを観察しました0.1MグリシンHClまたはクエン酸のいずれかを使用して、より低いpHでカラムからより効率的にuted。しかし、pHが2.7未満に溶出プロフィールにはさらなる改善は見られませんでした。また、0.1 MグリシンHClで溶出ピークは、同様のpH（ 図2B）で0.1 Mのクエン酸と比較してより少ない広がり登場しました。その後、0.1 Mグリシン-HCl pH2.7の緩衝液を結合緩衝液条件（ 図2A）を最適化するために使用しました。溶出の異なる結合緩衝液の効果は、（ 図2A）と比較しました。これは、リン酸ナトリウム緩衝液に3MのNaClの添加は、（カラムに結合する抗体を増強するために）良くないあったPBS pHが7.4の20mMリン酸ナトリウムpH7には、同等の溶出プロファイルを有していることが観察されました。 PBSバッファー製剤の容易さ、PBS pH7.4のは、将来の精製のための結合緩衝液として選択しました。
バッチの精製クロマトグラムはcultuを過増殖しますRESは、 図3に示されています。トリプトン補充文化が未添加した培養と比較されます。これは、添加した培養にリプトンの添加が未添加した培養と比較して、サンプルローディングステップの間に増加UV 280信号が得られたことが注目されました。トリプトン-添加した培養緩衝液交換および濃縮した後、回収されたタンパク質に基づいて、3.8ミリグラムとトラスツズマブの未添加した培養1.7ミリグラムを得ました。 図4に示すように、精製された抗体の品質管理は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって確認しました。トラスツズマブは、非還元および還元条件下で同様の抗体プロファイルの未補充しトリプトン補充条件の結果で成長させました。予想されたように、顕著なバンドは約150 kDaのは、正しく折り畳まれた抗体を確認します。他のバンドは、抗体の断片化された形態の、ジスルフィド結合の切断の結果と方法によって誘発されるartefacを表しますトン。同様に、50および約25kDaの2つのバンドは、それぞれ、抗体の重鎖と軽鎖の存在を確認します。
図1：バイオレイヤー干渉法（BLI）を使用して、安定にトランスフェクトされたHEK-293細胞によるタンパク質生産の確認。 （;黒PEI-TMAB）（A）標準曲線をPEIトランスフェクトトラスツズマブの粗製上清サンプル続い120秒（灰色）でタンパク質にバイオセンサーをIgG抗体標準の結合速度を測定することによって作製しました。この粗上清中の抗体タンパク質の（B）濃度（オープン黒丸）が結合率に対するIgG抗体標準濃度をプロットすることにより標準曲線（閉じ黒丸）から補間しました。 このFの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 igure。
図2：溶出の精製クロマトグラムと結合バッファスカウト実験。 （A）精製のステップはUV 280信号（青、緑、黒の線）に応じて描かれています。その後、離れてカラムから結合したタンパク質の溶出を非結合タンパク質を洗浄するためにカラム洗浄に続いてカラムにサンプルをロード。 pH値（赤線）、導電率（茶色の線）とシステム圧力（灰色の線）の測定は、実行を通してモニターされています。 3つのバッファをカラムにトラスツズマブの結合および溶出の収率を最大にするために非結合タンパク質の洗浄最適について試験しました。 （B）0.1 Mグリシン-HCl（pHは2.5から3.3）、0.1 Mクエン酸（pHを2.5〜3.5）の緩衝液は、タンパク質からのトラスツズマブの最適な溶出カラムについて試験しました。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：トラスツズマブの精製クロマトグラム（TMAB）バッチが無いサプリメントで成長又はトリプトンを補充した培養物を過剰に増殖。または0.5％トリプトン（90ミリリットル;緑線）を補充し、安定にトランスフェクトされたHEK-293細胞を、2×10 5 8日間/ mlの培養細胞のいずれかの非補足（黒線120ミリリットル）で設定しました。収穫後、上清をpH7.4のPBS（結合緩衝液）および0.1 Mグリシン-HCl pHを2.7（溶出緩衝液）を用いて精製しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：SDS-PAGEによる精製トラスツズマブの分析。約2μgの未補充から精製したトラスツズマブの（ - ）またはトリプトン補充（+）培養物は、非還元または還元条件下の10％SDS-PAGEでサンプリングしました。ゲルをクーマシーR-250で染色されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、HEK-293細胞にトランスフェクションは、安定な発現および治療用抗体の精製を詳細に説明します。抗体遺伝子の安定な発現は、治療用抗体の開発および製造のための抗体産生細胞株を生成するための最初のステップです。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、治療用タンパク質のための最適な発現プラットフォームまま、HEK-293細胞株は、これらの細胞中で産生されたタンパク質は、近いマッチが自然ポストの点で、ヒトタンパク質を生じるためにされていることを実現して隆起を得ています-translationalの修正および機能14、15。
CHO（ 例えば 、CHO-DG44およびCHO-K1）、ならびに非免疫グロブリン分泌性マウスB細胞株としてNS0およびSP2 / 0などの哺乳動物細胞株は、主にバイオ医薬品製造に使用されます。これらの細胞株に基づく発現系は、選択PROCに基づいています高生産クローンを誘導し、特定の選択的な薬剤16、17の増分添加により選択させるesses。安定なクローンの選択方法は、したがって、困難で時間のかかることができます。これらの既存の方法と比較して、HEK-293細胞株は確実に高効率でトランスフェクトします。選択プロセスを簡略化し、非常に簡単にタンパク質18の実験室規模の生産のための理想的な発現系製造、無血清懸濁培養に適応されます。
安定なトランスフェクションの制限は、タンパク質の実際の量は、実験で生成され、利用可能な時間です。試してみて、これを克服するために、現在のプロトコルは、トランスフェクションの3〜6週間以内にタンパク質の実質的な量を達成することができる培養工程を説明します。バッチ培養（大量生産）の実質的な量を生産するための機会を提供する過増殖しますクローン細胞株とリード候補の選択までのリードインビトロ特性評価実験のセットアップのための抗体。これは、DNAおよび試薬のより高い量を必要とすることが一過性トランスフェクション、以上の明らかな利点があります。発現は、一時的なトランスフェクション効率によって決定されるので、また、タンパク質収量は、バッチ間で再現性がありません。
このプロトコルでトリプトンの添加はタンパク質発現の増加した収率を提供しました。トランスフェクション培地にトリプトンを添加すると、以前にタンパク質合成19,20を改善することが示されています。トリプトン添加した培養は、40ミリグラム/ 14 mg / Lでの未添加した培養対L（ 図3）の改善されたトラスツズマブ抗体の収量が得られました。 SDS-PAGEは、それを検証し、（1）抗体が正しく生成されていました。及び（2）トリプトンの添加は、COMに基づいて構造を変化させませんでした非還元および還元条件下での抗体のバンドのパリソン（ 図4）。培養のトリプトンの添加は任意であり、特により高いタンパク質収量を達成するために使用されます。他の補助剤は、酪酸ナトリウムとバルプロ酸21、22、23のタンパク質の発現を増強すると考えられてきました。
プロトコルの最初のチェックポイントは、タンパク質は、トランスフェクトされた細胞株によって生産されている確認です。このステップでは、安定な形質転換体を選択するために使用される選択圧の2週間後にいつでも実行することができます。多くの方法は、生体層干渉法（ 図1）またはIgG ELISAの同様のアプローチを含む、タンパク質産生を確認するために使用されてもよいです。あるいは、ウェスタンブロット、粗上清中の抗体タンパク質を同定するために抗IgG検出抗体を用いて行ってもよいですまたはサンプルを精製しました。
他の研究者は、より高いトランスフェクション効率は、血清含有培地24中で接着細胞を用いて達成されることが示されています。動物由来のサプリメントの存在は、バイオ医薬品製造のために好ましくない。したがって、無血清培地への順次適応は忍耐と細胞生存率の注意深い監視が必要なプロトコルにおける重要なステップです。 4日の離職期間は、このプロトコルで提案されているガイドであり、問題は特定の血清濃度で検出されたそうである場合、細胞を無血清培地への血清含有の前回比で2〜3回継代培養することをお勧めします次の比率を続行する前に。バッチ培養および細胞の凍結保存を設定する前に、ほとんどの細胞株は完全に100％の無血清培地三回の継代培養の後適合と見なされることを考えます。
精製段階で最も重要な段階の一つをt彼は、カラムへの抗体の効率的な結合を確実にするために最適な条件とバッファのために偵察した後、カラムから完全に溶出（ 図2）。各継代培養で収集された馴化培地は、この目的のために有用です。この場合には、一般に、タンパク質に対する親和性クロマトグラフィーを推奨クエン酸pH 3.5の溶出緩衝液は、カラムからのトラスツズマブの溶出には不向きでした。種々のpHにおける2つの異なる溶出バッファーを用いてスカウト実験は、明らかに（ 図2B）の影響を受けたにもpH値の狭い範囲内で、溶出の程度を試験したことを示しました。
精製後、抗体画分の下流の処理に関しては、抗体は、手動または自動操作によって脱塩カラムを用いて緩衝液交換することができます。代替として、透析膜を使用することもできます。最終タンパク質濃度は、測定を含む他のタンパク質定量法により決定することができます抗体の吸光係数に基づいて、ランベルト・ベールの法則から推定濃度は280nmの吸光度信号。
このプロトコルは、成功したHEK-293細胞の安定なトランスフェクションにより、トラスツズマブの抗体タンパク質を生産しています。抗体を精製し、整合性を確認するために特徴付けられました。 DNA調製を詳述このプロトコールでの手順は、無血清適合、大規模生産及び自動精製に続いて安定なトランスフェクションは、他のタンパク質を産生するに転送することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFUSE vector series | InvivoGen | N/A | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). | |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. | |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | Addgene | 61883 | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | Jomar Life Research | fas-hg-s | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | Jomar Life Research | fas-hg-l | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | Sigma-Aldrich | G6279 | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | Astral Scientific | G221020 | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | Life Technologies | R790-07 | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | Sigma-Aldrich | K4894 | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11995-065 | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082-147 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | Polysciences, Inc. | 23966 | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use. |
| OptiPro SFM | Life Technologies | 12309-050 | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | Jomar Life Research | ant-hg-1 | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | AJA2225 | |
| Tryptone (casein peptone) | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | Astral Scientific | 09-2051-100 | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | Sigma-Aldrich | GE17-0403-01 | |
| AKTApurifier 100 | GE Healthcare | 28406266 | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | Sigma-Aldrich | G2879 | |
| Citric Acid, monohydrate | Astral Scientific | BIOC2123 | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | Astral Scientific | BIOCB0035 | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | Astral Scientific | BIOSD8146 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | Merck Millipore | UFC803008/UFC903008 | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| BLItz System | fortéBIO | 45-5000 | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | fortéBIO | 18-5010 | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | Astral Scientific | 786-502 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Astral Scientific | AM0486 | |
| TEMED | Astral Scientific | AM0761 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Astral Scientific | 786-498 | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | Bio-Rad | 1610374 |
References
- Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
- Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
- Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
- Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
- Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
- European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
- Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
- Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
- Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
- Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
- Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
- Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
- Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
- Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
- Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
- Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
- Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
- Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
