Laboratorieskala Produksjon og rensing av et terapeutisk antistoff

Summary

Denne protokollen beskriver fremstillingen av et terapeutisk antistoff i et pattedyr ekspresjonssystem. Metodene som beskrives omfatter fremstilling av vektor-DNA, stabil transfeksjon og serumfritt tilpasning av en human embryonisk nyrecellelinje 293, setter opp av store kulturer og rensing ved hjelp av affinitetskromatografi.

Introduction

Suksessen av terapeutiske antistoffer fortsetter å drive betydelig investering i antistoffutvikling som en bølge av neste generasjons therapeutics begynner. Antistoffet markedet forventes å bli omformet av antistoff-fragmenter ^1, antistoff-stoffet konjugater ^2, bispesifikke antistoffer ³ og utviklet antistoffer med gunstige egenskaper ^4. En annen klasse få farmasøytisk interesse er biosimilars. Biosimilar antistoffer er "svært lik 'replikere produkter av en terapeutisk antistoff som allerede har fått regulatorisk godkjenning. En foreslått biosimilar må være sammenlignbare med opphavs antistoff med hensyn til sin struktur, funksjon, dyr toksisitet, kliniske sikkerheten og effektiviteten, humane farmakokinetikk (PK), farmakodynamikken (PD) og immunogenisitet ^{5, 6.}

Godkjenningen rAtes av biosimilar antistoffer har vært treg på grunn av de strenge begrensninger på den endelige kvaliteten på produktet. De nøyaktige produksjonsprosesser som bestemt cellelinjer og dyrkingsforhold gjennom til den endelige behandlingstrinn kan forbli fortrolig. Hva mer er, produksjon av antistoffer i seg selv innebærer en grad av variasjon som kan legge til utfordringen med å produsere en svært lignende produkt. En omfattende fysio og biofysiske karakterisering og sammenligningen er ganske vanskelig, men en rekke studier som viser egenskapene til biosimilar antistoffer dukker opp i litteraturen ^{7, 8, 9.}

Generering av et terapeutisk antistoff begynner med transfeksjon av mammalske vertsceller med en vektor som bærer gener for de respektive antistoff. Vektor design, cellelinje og kultur forholdene er viktige hensyn for å sette opp expression system.

DNA-sekvenser av antistoffer kan være hentet fra Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) eller forskningspublikasjoner inkludert patenter. For eksempel sekvensen av trastuzumab er tilgjengelig gjennom Drug Bank (DB ID: DB00072). Aminosyresekvensen til de variable regionene kan gjennomgå genet utforming og optimalisering for syntese i de ønskede vertsart. Det er viktig for en biosimilar antistoff som ingen modifikasjon er laget for å aminosyresekvensen. Når syntetisert, kan antistoffgener blir subklonet inn i passende vektor for valg.

Humane IgG antistoffer består av to identiske tungkjeder og to identiske lette kjeder. Strengt regulert ekspresjon av begge kjedene er avgjørende for optimal produksjon av heterologe IgG-protein i pattedyrceller ^10. Intra- og inter-kjede-disulfidbindinger måtte bli dannet og en rekke post-translasjonelle modifikasjoner må være iinnført i løpet av proteinsyntese. En rekke vektorer er tilgjengelige som har blitt designet spesielt for å uttrykke antistoffgener (se tabell for material). Disse antistoff-spesifikke vektorer som vanligvis uttrykker de konstante områder for både tunge og lette kjeder slik at bare de variable områder i hver kjede krever kloning.

Transfeksjon av celler med to uavhengige konstrukter (co-transfeksjon) er den mest vanlige metode for tilførsel av tung og lett kjede-kodende gener. Det er, er hvert gen drives av sin egen promoter og transkribert som separate antistoffkjeder før de blir satt sammen i det endoplasmatiske retikulum. På den annen side, multi-cistronisk vektorer har interne ribosom innføringsstedet (IRES) elementer som inngår som tillater ekspresjon av multiple gener som et enkelt mRNA-transkript med oversettelse tillates fra interne regioner av mRNA ^11. I dette tilfelle blir de tunge og lette kjede-kodende gener koblet i en Arrangeement å oppnå co-uttrykk for begge antistoff kjedene ^{10, 12.}

Mens forbigående transfekterte celler, hvilket ga tilstrekkelig protein for å utføre et begrenset antall forsøk, kan stabilt transfekterte cellelinjer som har gjennomgått seleksjon for integrasjon genomet gir høyere utbytter. Høyere mengder protein tillate assay utvikling i forbindelse med in vitro karakterisering og kan gi en indikasjon av antistoff kvalitet i betraktning for nedstrøms applikasjoner som klonal cellelinje og bly kandidat valg.

Målet med denne artikkelen er å beskrive den stabile uttrykk og rensing av et terapeutisk antistoff produsert i en pattedyr uttrykk system. Faktisk kan denne metoden anvendes for ekspresjon av et biosimilar antistoff. Fremgangsmåten kan anvendes for den innledende karakterisering av antistoffer før fortsetter videre til den kritiske, enskjønt tidkrevende steps for å identifisere en ønskelig klone for større skala produksjon. Videre kan denne fremgangsmåte anvendes for å uttrykke andre proteiner og ikke bare antistoffer.

Den følgende detaljerte protokollen beskriver ekspresjon av terapeutiske antistoff trastuzumab. Denne består av fremstilling av vektor-DNA, etterfulgt av stabil transfeksjon i HEK-293 cellelinje og rensing av antistoff-protein ved en automatisert kromatografisk metode.

Protocol

MERK: En egnet pattedyr-ekspresjonsvektor som må brukes for denne protokollen. Her blir en enkel konstruksjon inneholdende to ekspresjonskassetter brukt (dvs. tung og lettkjede-ekspresjon drives av separate promotere). Trastuzumab tunge og lette kjeder ble tidligere klonet inn i vektoren. Denne vektoren var en gave fra Andrew Beavil, innhentet gjennom en ikke-for-profit plasmid depot ^13.

1. Recovery og oppskalering av Vector DNA

MERK: Vektor DNA ble mottatt som en myk agar stikk-kultur i Escherichia coli XL-1 Blue-stamme; vektor bærer hygromycin motstand.

1. Sett inn en steril inokulasjon stab eller sløyfe i bløt agar av stikk kultur deretter strek en Luria Bertani (LB) agarskål utarbeidet med 75 mikrogram / ml hygromycin for isolerte kolonier. Inkuber platen ved 37 ° C i 18-24 timer.
2. Inokulere en enkelt koloni i 5 ml Terrific buljong (TB) som inneholdt 75 ug / ml hygromycin. Incubate kulturen ved 37 ° C i 18-24 timer med 225 rpm risting.
3. Bruk natten kultur for å fremstille en glyserol lager av vektor-DNA ved forsiktig å blande 800 pl av kulturen med 200 pl 80% glycerol i en kryoampulle og fryse ved -80 ° C.
   1. Tilsett 100 ul av over natten-kulturen til 100 ml TB inneholdende 75 ug / ml hygromycin i en forvirret rystekolbe (dvs. 1/1000-fortynning). Inkuber kulturen ved 37 ° C i 18-24 timer med 225 rpm risting.
4. Etter natten kultur, trekke ut og rense DNA i henhold til produsentens instruksjoner av midi / maxi forberedelse kit med følgende unntak; i løpet av det siste trinnet, eller elute resuspender DNA med vann (pH 7,0 til 8,5).
5. Sjekk konsentrasjon og renhet av DNA ved hjelp av avlesninger ved 260 og 280 nm deretter lagre DNA ved -20 ° C.
   MERK: Valgfri (anbefales): Sekvens DNA ved hjelp av vektorspesifikke primere for å bekrefte identitet.

2. Stabil Transfeksjon av HEK-293 celler

1. Vokse og vedlikeholde HEK-293-celler (suspensjonsceller) i henhold til standard protokoller i serumfritt medium supplert med 0,1% ikke-ionisk overflateaktivt middel i Erlenmeyer-kolber. Oppretthold på 2 x 10 ⁵ celler / ml og subkultur hver fjerde dag. Kultur celler ved 37 ° C med _5% CO2 og 120 rpm rotasjon.
   MERK: Cells skulle ha vært i kultur for ikke mindre enn fire dager, og ikke mer enn 4 uker før transfeksjon. HEK-293-celler dyrket som monolag i serum-inneholdende medium kan også brukes for denne prosedyren.
2. På dagen før transfeksjon, frø HEK-293-celler ved 3 x 10 ⁵ celler / ml i brønner på en 12-brønns plate i 2 ml av Dulbeccos modifiserte Eagle media (DMEM) supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum ( FBS). På dagen for transfeksjon, sjekk at cellene har nådd 80-90% konfluens
3. Fortynn DNA og polyetylenimin (PEI) separat i transfeksjonsandeler media og bland sammen.
   1. Fortynn 1,25 mikrogram vektor-DNA per brønn (15 mikrogram for 12 brønner) i 300 mL transfeksjon medier. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
   2. Fortynne 2,5 ul av 1 mg / ml PEI-løsning (30 mL i 12 brønner, dvs. 1: 2-forhold av DNA til PEI) i 300 ul transfeksjon media. Inkuber ved romtemperatur i 5 min.
   3. Legg fortynnet DNA til fortynnet PEI, forsiktig blandes og inkuberes ved romtemperatur i 15 min.
4. Tilsett 50 ul av DNA / PEI blanding tilsatt til hver brønn på platen. Rock platen forsiktig for å fordele transfeksjon blandingen deretter plassere platen ved 37 ° C, _5% CO2 i 24 timer.
5. Tilsett 50 ug / ml hygromycin B per brønn og returnere platen til 37 ° C, _5% CO2 i 10 dager.
   MERK: På dag 10, vil un-transfekterte celler er døde, og løsnet fra overflaten av platen, mens stabilt-transfekterte celler vil være levedyktig og festet til platen.
6. Bytt ut media i brønner med1/4 volum serum-frie media og 3/4 volum DMEM supplert med 10% FBS (dvs. 0,5 ml serumfritt medium + 1,5 ml DMEM = 7,5% sluttkonsentrasjon i serum) og inkuber i 4 dager.
7. Sett på media i brønner med 1/2 volum serum-frie medier og 1/2 volum DMEM supplert med 10% FBS (dvs. 1 ml serumfritt medium + 1 ml DMEM = 5% endelig serumkonsentrasjon) og inkuberes i 4 dager.
8. Sett på media i brønner med 3/4 volum serum-frie medier og 1/4 volum DMEM supplert med 10% FBS (dvs. 1,5 ml serumfritt medium + 0,5 ml DMEM = 2,5% endelig serumkonsentrasjon) og inkuberes i 4 dager.
9. Erstatte mediet i brønner med 2 ml serumfritt medium supplert med 0,1% ikke-ionisk overflateaktivt middel (dvs. 0% sluttkonsentrasjon i serum) og inkuberes i 4 dager.
   MERK: Opprettholde 50 mikrogram / ml hygromycin B seleksjonspress på celler under serumfrie tilpasning. Celler som er tilpasset til serumfritt medium løsner fra overflaten av brønner, og kan cluster jegn suspensjon. Se trinn 2.1 for dyrkningsforhold med ekstra tilskudd på 50 mikrogram / ml hygromycin B.
10. Ved hjelp av en pipette, forsiktig blande suspensjonskulturer i 12-brønners plate og basseng celler inn i et separat rør.
    1. Ved hjelp av et hemocytometer, nummerere sammenslåtte celler og frø i 30 ml serumfritt medium i en Erlenmeyer-kolbe på 2 x 10 ⁵ celler / ml. Kultur celler ved 37 ° C med _5% CO2 og 120 rpm rotasjon. Subkultur og utvide hver fjerde dag.
11. Fortsett å utvide kultur størrelse til ønsket celletetthet for å oppnå 10 hetteglass 1 x 10 ⁷ celler / hetteglass for nedfrysing i flytende nitrogen. Fryses cellene i serum-fritt medium inneholdende 10% dimetylsulfoksyd (DMSO).
    MERK: Betinget media som inneholder antistoff kan høstes ved hver subkultur å bekrefte proteinproduksjon eller brukes til å optimalisere rense forhold. Å høste klimaanlegg media og vedlikeholde celler for subkultur, sentrifuger kulturen på300 xg i 5 minutter deretter filtrere-sterilisere supernatanten gjennom et 0,22 mikrometer filter. Filtrert supernatant kan oppbevares ved 4 ° C i 1-2 uker eller -20 ° C i lengre tids lagring.

3. Large Scale antistoffproduksjon fra Batch overgrow Culture

MERK: antistoffproduksjon kan følges videre fra trinn 2.11 hvor eksisterende celler er utvidet til ønsket celletetthet basert på sats overgrow kultur volum til å være setup. Ellers, celler som har blitt tint fra nedfrysing begynne på dette trinn en gang utvidet til en passende celletetthet og volum. Forskjellige kultur tilskudd kan brukes til å optimalisere antistoffproduksjon; bruken av trypton for å øke antistoff-utbyttet er demonstrert i denne protokollen.

1. Seed celler på 2 x 10 ⁵ celler / ml i 100 ml serum-frie medier i to Erlendmeyerkolber (for å sammenligne antistoff utbytter fra un-supplert og nærings supplert kulturer). Kultur på 37 ° C, 5% CO ₂
2. Etter 24 timer, tilsett trypton til en endelig konsentrasjon på 0,5% til nærings supplert kultur. Utjevne volumet av un-supplert kultur med serum-frie medier.
3. Fra dag 8, utføre legemer på kulturene daglig ved hjelp av en hemocytometer å overvåke celle levedyktighet. Høste kultursupernatantene når cellenes levedyktighet er mindre enn 80%.
   1. Høste supernatanten ved sentrifugering av kulturene ved 3000 xg i 15 minutter og deretter filtrere-sterilisere supernatanten (inneholdende antistoff) gjennom et 0,22 um filter. Oppbevar supernatantene ved 4 ° C (kortsiktig) eller fryses ved -20 ° C (langsiktig).

4. Antistoff Rensing ved affinitetskromatografi hjelp av en automatisert Fast Protein væskekromatografi (FPLC) System

MERK: Fremgangsmåten kan generelt anvendes på de automatiserte systemer. Rensing kan utføres ved romtemperatur eller ved 4 ° C (hvis FPLC system er holdt på et kjølig rom).En serie av rekognoserings tester kan bli utført for å identifisere de optimale rense tilstander, inkludert passende spaltematrise, bindingsbuffer, og eluering buffer pH for å sikre maksimal utvinning av renset antistoff fra kondisjonert medium (se resultater avsnitt). De optimale forhold er avhengig av antistoffet eller proteinet som blir renset. Rensinger ble utført på en automatisert FPLC-system. Rensinger ble utført ved romtemperatur ved anvendelse av en 5 ml protein A-kolonne.

1. Forbered følgende buffere ved hjelp av ultrarent vann og tilpasse seg den anbefalte pH deretter filtrere gjennom et 0,22 mikrometer filter.
   1. Fremstille 1 liter av fosfat-bufret saltoppløsning (PBS), pH 7,4 (bindingsbuffer) ved å blande følgende: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na HPO _{2 4} og 0,001 M KH _{2PO 4.} Juster pH-verdien hvis nødvendig før filtrering bufferen.
   2. Fremstille 500 ml 0,1 M glycin-HCl, pH 2,7 (elueringsbuffer). Juster pH før filtrering av buffer.
   3. Fremstille 50 ml 1 M Tris pH 9,0 (buffer nøytralisering).
2. Sørg for at alle system kraft- og kommunikasjonstilkoblinger med maskinen er laget. Enheter skal være synlig i programvaren "System Control" modulen. Sørge for UV-celle er satt ved 280 nm bølgelengde. Valgfritt: Kalibrer pH-meter hvis den er tilkoblet og som skal brukes.
3. Dyppe innløps- rør av A, B og prøvetakingspumpen i ultrarent vann for å vaske-systemet. Spyl pumpene med en sprøyte hvis det er luft i røret eller en mistanke av luft i systemet. Vask systemet med vann ved manuell drift via systemstyreren eller via en automatisert metode. Observer at trykket, konduktivitet, UV280 sporing og pH være konsekvent og at trykkgrensen for kolonnen ikke overskrides som per produsentens spesifikasjoner.
   MERK: Unormalt kan tyde på luft eller blokkering i systemet som skal tas opp før du fortsetter.
4. I systemet kontrollermodul, starter strømningshastighet på 1ml / min manuelt via pumpe A i enten belastning (utenom prøven loop) eller injisere (gjennom prøvesløyfen) posisjon for å begynne å forbinde kolonnen. Frakoppling tubing på kolonne posisjon innløpet til og fjerne proppen koblet til kolonnen innløpet den.
   1. Tillate vann å strømme fra hovedrøret dråpevis på toppen av søylen og deretter feste systemet slangen til kolonnen. Å ha kolonnen innløp og innløpet montering fylte med dråper vann sikrer en tilkobling uten luftbobler.
5. Fest kolonne utløp den på nedstrøms utløp og verifisere alle beslag er godt festet. Med kolonnen nå koblet til systemet, ikke overskrider grensene for maksimal trykkgrense og strømningshastigheten som angitt i kolonne spesifikasjonene.
6. Vask kolonnen med 5 kolonnevolumer (CV) vann. Hvis det er nødvendig, fortsetter kolonnen vask før UV280 tracing har stabilisert seg.
7. Fordyp nyanlegg av A i bindingsbuffer, B i elusjonsbuffer og prøvetakingspumpen i bindingsbuffer to likevekt av systemet i korrekt buffere. Fyll på nyanlegg med buffer ved hjelp PumpWash ved manuell betjening.
8. I "Method Editor 'modul av programvaren, bruke metoden veiviseren for å sette opp en affinitetskromatografi metode for kolonnen som er beregnet på å bli brukt.
   MERK: Automatisert FPLC systemer leveres med metoder pre-fylt med de anbefalte innstillingene (dvs. strømningshastighet og trykkgrensen) og kjøre trinn basert på kolonnen (produsent, matrix og størrelse) som er valgt for rensing.
   1. Bruk følgende run trinn for Protein A affinitetskromatografi:
      1. Stabilisere system med 5 CV bindingsbuffer og samle gjennomstrømning i avfallsbeholder.
      2. Belastning prøven på kolonnen (volum som skal lastes er angitt manuelt i fremgangsmåten) og samles gjennomstrømning i en separat beholder.
      3. Vask system med 5 CV bindingsbuffer og samle gjennomstrømning i en egen beholder.
      4. Eluer kolonnen med 5 CV isocratic fraksjonering ved hjelp av elueringsbuffer og samle renset antistoff prøven som brøker av fraksjonssamler.
      5. Stabilisere system med 5 CV bindingsbuffer og samle gjennomstrømning i avfallsbeholder.
9. Når metoden har blitt satt opp, angir volumet av kondisjonerte medier som skal påføres på kolonnen, og lagre fremgangsmåten.
   MERK: Den angitte volumet i metoden bør være 5-10 ml mindre enn den faktiske volum for å unngå innføring av luft under prøven løp. Angitt volum som brukes i denne protokollen er 90-120 ml.
10. Senk prøvetakingspumpen slangen inn i karet som inneholder det kondisjonerte mediet.
11. Forbered en egen beholder for å samle prøven gjennomstrømning via den spesifiserte utløp slangen.
    MERK: Det er viktig å samle gjennomstrømning i tilfelle det oppstår en feil under kjøring eller bindingskapasitet av kolonnen overskrides krever gjennomstrømning gjøres på nytt i kolonnen eller rensing repeated.
12. Forbered samling rør i fraksjonssamleren. Tilsett 100 ul av nøytralisering buffer per 1 ml fraksjon volum. Den FPLC system vil automatisk eluere fraksjonene i innsamlingsrørene.
13. I "System Control" modul av programvaren, åpner metoden som skal kjøres.
    MERK: Metoden løp er initiert i en rekke sider som omfatte kontroll av variabler av metoden, fraksjonssamler oppsett og definere resultat filnavn og lagringssted.
14. Klikk START for å starte kjøringen. Kjøringen kan overvåkes i "System Control" modulen.
15. Ved ferdigstillelse av rensing løp, sjekk den resulterende kromatogrammet i 'Evaluering' modul i systemprogramvaren.
16. Kombiner alle proteinholdige fraksjoner i et eget rør, bufferbytte og konsentrer i PBS ved anvendelse av en sentrifugal filteranordning med 30 kDa molekylvekt cut off. Utfør sentrifugeringstrinn i henhold til produsentensbruksanvisning.
17. Mål antistoffkonsentrasjonen ved hjelp bicinchoninic syre analysen (BCA) i henhold til produsentens instruksjoner.
18. Hvis en annen rensing løp skal utføres, prime prøven pumpeslangen i bindingsbuffer og gjenta trinn 04.09 til 04.14.
19. Ved ferdigstillelse av rense løyper, fordype nyanlegg av A, B og prøvetakingspumpen i ultrarent vann og vaske system og kolonne som utføres i trinn 3.
20. Senk A, B og prøvetakingspumpen rør i 20% etanol og gjenta vaskeprosedyren for lagring av systemet og kolonnen.
21. Koble fra kolonnen fra det nedstrøms utløps og erstatte kolonne proppen, og koble kolonne ved innløpet og skifte ut proppen, koble slangen til systemet. Oppbevar kolonnen ved 4 ° C.

Representative Results

Stabil produksjon av trastuzumab ved transfekterte HEK-293 celler ble bekreftet ved hjelp av bio-lag interferometri (BLI) som presentert i figur 1. En IgG standardkurve ble generert ved å måle bindingshastigheten mellom et IgG-antistoff standard og Protein A biosensor (figur 1A). Det urene supernatant Prøven ble på lignende måte målt, og dens konsentrasjon interpoleres fra standardkurven (figur 1B). Supernatanten konsentrasjonen ble målt til å være ca. 25 ug / ml (samplet fra 50 ml samlet ved subkultur) to uker etter at serumfritt tilpasning og forut for å sette opp celler for overvokse satskulturer.

Supernatanten oppsamlet ved hvert subkultur etter serumfrie tilpasning ble slått sammen og anvendt for å optimalisere rensing betingelser; rekognosering av bindings- og elueringsbuffere ble utført som vist i Figur 2 figur 2A basert på UV280 signal. Når Protein A kolonne likevekt, er en økning i UV280 signalsampel lasting; denne økningen skyldes supernatanten gjennomstrømning som passerer gjennom kolonnen (inneholdende ikke-bundne proteiner som absorberer UV-lys på denne bølgelengde), mens antistoffer har blitt fanget opp av kolonnen. Når prøven er ferdig lastet, returnerer UV280 signal til utgangspunktet som eventuelle gjenværende bundne proteiner blir vasket bort. Eluering skjer som pH synker til den optimale pH-verdi for å løsne antistoffene tatt av kolonnen, er vist ved en økning i UV280 signal med eluerte antistoffer fraksjonerte og samlet inn av fraksjonssamleren. Gjennom prøven løp, bør endringer ledningsevne basert på saltkonsentrasjonen i bufferne mens systemtrykket holder seg relativt konstant. Optimal eluering, pH og buffer ble speidet først (figur 2B); Det ble observert at antistoffet elUted mer effektivt ut av kolonnen ved lavere pH-verdi ved bruk av enten 0,1 M glycin-HCl eller sitronsyre. Imidlertid, under pH 2,7 var det ingen ytterligere forbedring i elueringsprofilen. Dessuten opptrådte eluering topper med 0,1 M glycin-HCl mindre utvidet sammenlignet med 0,1 M sitronsyre ved pH lik (figur 2B). Deretter ble 0,1 M glycin-HCl pH 2,7-buffer som brukes for å optimalisere bindingsbuffer betingelser (figur 2A). Effekten av forskjellige bindingsbuffere på elueringen ble også sammenlignet (figur 2A). Det ble observert at PBS pH 7,4 og 20 mM natriumfosfat, pH 7 hadde sammenlign elueringsprofiler, mens tilsetning av 3 M NaCl i natriumfosfatbuffer (for å forbedre antistoffbinding til kolonnen) var ikke gunstig. På grunn av den enkle PBS-buffer preparat, ble PBS pH 7,4 valgt som bindingsbuffer for fremtidige rensinger.

Rense kromatogrammer av batch overgrow Cultures er vist i figur 3; trypton-supplert kultur er i forhold til un-supplert kultur. Det ble bemerket at tilsetningen av trypton til den supplert kultur resulterte i en økt UV280 signal under prøven lasting trinnet, sammenlignet med den ikke-supplert kultur. Den trypton-supplert kultur ga 3,8 mg og un-supplert kultur 1,7 mg trastuzumab, basert på protein gjenvunnet etter buffer utveksling og konsentrasjon. Kvalitetskontroll av det rensede antistoff ble bekreftet ved natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) som vist i figur 4. Trastuzumab dyrket i ikke-supplert og trypton-supplert betingelser resulterer i tilsvarende antistoff-profiler under ikke-reduserende og reduserende betingelser. Som forventet, et fremtredende bånd ved tilnærmet 150 kDa bekrefter korrekt foldet antistoff; andre bånd representerer fragmenterte former av antistoffet, et resultat av disulfidbinding brudd og en fremgangsmåte-indusert artefact. Likeledes, to bånd på 50 og tilnærmet 25 kDa bekrefte tilstedeværelse av antistoff tunge og lette kjeder, henholdsvis.

Figur 1: Bekreftelse av protein produksjon av stabilt transfekterte HEK-293 celler ved hjelp av bio-lag interferometri (BLI). (A) Standard kurve ble generert ved å måle binding frekvensen av IgG antistoff standard til protein A biosensor over 120 sekunder (grå) etterfulgt av råolje supernatant prøve av PEI-transfektert trastuzumab (PEI-Tmab, svart). (B) Konsentrasjon av antistoff protein i rå supernatant (åpne svart sirkel) ble interpolert fra standardkurven (lukket svarte sirkler) ved å plotte IgG antistoff standard konsentrasjon mot bindende rate. Klikk her for å se en større versjon av denne f igur.

Figur 2: Rensing kromatogrammer av eluering og bindingsbuffer speider eksperimenter. (A) Trinnene for rengjøring er avbildet i henhold til UV280 signal (blå, grønne eller svarte linjer); Prøven blir lastet på kolonnen, etterfulgt av kolonnen vaskes for å vaske bort ikke-bundne proteiner deretter eluering av bundet protein fra kolonnen. Måling av pH (rød linje), konduktivitet (brun linje) og systemtrykk (grå linje) overvåkes gjennom hele kjøringen. Tre buffere ble testet for optimal binding av trastuzumab til kolonnen og bortvasking av ubundet protein for å maksimere eluering utbytte. (B) 0,1 M glycin-HCl (pH 2,5 til 3,3) og 0,1 M sitronsyre (pH 2,5-3,5) buffere ble testet for optimal eluering av trastuzumab fra protein A-kolonne.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Rensing kromatogrammer av trastuzumab (TmAb) batch overgrow kulturer dyrket uten supplement eller supplert med trypton. Stabilt transfekterte HEK-293 celler ble oppsettet på 2 x 10 ⁵ celler / ml og dyrket i 8 dager enten un-supplert (120 ml, svart linje) eller supplert med 0,5% trypton (90 ml, grønn linje). Etter høsting, ble supernatanter renset ved anvendelse av PBS pH 7,4 (bindingsbuffer) og 0,1 M glycin-HCl, pH 2,7 (elueringsbuffer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Analyse av renset trastuzumab ved hjelp av SDS-PAGE. Omtrent 2 pg av trastuzumab renset fra ikke-supplert (-) eller trypton-supplementert (+) kulturer ble tatt prøve av 10% SDS-PAGE under ikke-reduserte eller reduserte betingelser. Gelen er farget med Coomassie R-250. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver transfeksjon stabil ekspresjon og rensing av et terapeutisk antistoff i HEK-293-celler. Stabil ekspresjon av antistoffgener er det første trinnet i å generere en antistoffproduserende cellelinje for utvikling og fremstilling av et terapeutisk antistoff. Mens kinesiske hamsterovarie (CHO) celler forblir uttrykket plattformen for terapeutiske proteiner, er HEK-293 cellelinje få prominence med realisering at proteiner som produseres i disse cellene er en tettere match til naturlig forekommende humane proteiner, i form av post -translational modifikasjoner og funksjon ^{14, 15.}

Pattedyrcellelinjer inkludert CHO (for eksempel CHO-DG44 og CHO-K1) så vel som ikke-immunoglobulin-utskillende murin B-cellelinjer NS0 og SP2 / 0 blir hovedsakelig brukt i biofarmasøytisk produksjon. Expression systemer basert på disse cellelinjene er basert på utvalg processes hvorved høyt produserende kloner blir indusert og valgt ved inkrementell tilsetning av en spesifikk selektiv medikament ^{16, 17.} Utvelgelsesprosessen for en stabil klon kan derfor være vanskelige og tidkrevende. I forhold til eksisterende fremgangsmåter, den HEK-293 cellelinjen robust transfects med høy effektivitet. Utvelgelsesprosessen er forenklet og veldig lett tilpasser seg serumfrie suspensjonskultur, noe som gjør det til et ideelt uttrykk system for laboratorieskala produksjon av proteiner ^18.

En begrensning av stabil transfeksjon er tid i hvilken en praktisk mengde av protein kan bli produsert og brukt i eksperimenter. For å prøve å overvinne dette, beskriver dagens protokollen en dyrking skritt som kan oppnå betydelige mengder protein i løpet av 3-6 uker etter transfeksjon. Porsjonen overvokse kulturer (stor skala produksjon) gir mulighet til å produsere betydelige mengderantistoff for oppsett av in vitro karakterisering eksperimenter i forarbeidet til valg av en klonal cellelinje og bly kandidater. Dette har klare fordeler sammenlignet med transient transfeksjon, noe som kan kreve høyere mengder av DNA og reagenser. I tillegg er det proteinutbytte ikke reproduserbare fra sats til sats, siden ekspresjon er bare midlertidig, og bestemmes av transfeksjonseffektivitet.

Tilsetningen av trypton i denne protokollen gitt en økt utbytte i proteinekspresjon. Tilsetning av trypton transfeksjon kulturer har tidligere vist seg å forbedre proteinsyntese ^{19, 20.} Den trypton supplert kultur resultert i forbedrede trastuzumab antistoff utbytter av 40 mg / l sammenlignet med den ikke-supplert kultur av 14 mg / l (figur 3). SDS-PAGE verifisert at: (1) antistoffet ble produsert på riktig måte; og (2) tilsetning av trypton endret ikke struktur basert på comblåseemne av antistoff bånd under ikke-reduserende og reduserende betingelser (figur 4). Tilsetningen av trypton til kulturene er valgfri, og er særlig brukt for å oppnå høyere proteinutbytter. Andre kosttilskudd har vært ansett for å forbedre protein uttrykk slik som natriumbutyrat og valproinsyre ^{21, 22, 23.}

Den første kontrollpost i protokollen er en bekreftelse på at proteinet blir produsert av den transfekterte cellelinjen. Dette trinn kan utføres når som helst etter at de to-ukers periode av selektivt trykk som brukes for å velge stabile transformanter. En rekke fremgangsmåter kan benyttes for å bekrefte proteinproduksjon med bio-lag interferometri (figur 1) eller den tilsvarende tilnærming av et IgG ELISA. Alternativt kan en western blot utføres ved å bruke et anti-IgG-antistoff deteksjon for å identifisere antistoffprotein i den urene supernatanteller renset prøve.

Andre forskere har vist at høyere transfeksjonseffektivitet oppnås ved hjelp av adherente celler i seruminneholdende medium ^24. Tilstedeværelsen av kosttilskudd fra animalsk opprinnelse er uønsket for biofarmasøytisk produksjon. Derfor sekvensiell tilpasning til serum-frie medier er et kritisk punkt i protokollen krever tålmodighet og nøye overvåking av celle levedyktighet. 4-dagers periode omsetningen foreslått i denne protokollen er en veiledning, og slik at hvis det oppstår problemer ved en viss serumkonsentrasjon, anbefales det at cellene blir subdyrket 2-3 ganger i det foregående forholdet mellom serumholdig til serumfritt medium før du fortsetter med neste forhold. Før du sette opp batch kulturer og nedfrysing av celler, mener at de fleste cellelinjer anses fullt tilpasset etter tre subkulturer i 100% serum-frie medier.

En av de mest avgjørende skritt på rensetrinnet er than speidingen for optimale forhold og buffere for å sikre effektiv binding av antistoffet til kolonnen og deretter fullstendig eluering av kolonnen (Figur 2). Det kondisjonerte medium samles ved hver subkultur er nyttig for dette formål. I dette tilfelle elueringsbufferen av sitronsyre pH 3.5 vanligvis anbefalt for protein A affinitetskromatografi var uegnet for eluering av trastuzumab fra kolonnen. Speider eksperiment ved bruk av to forskjellige elueringsbuffere ved forskjellige pH-verdier viser klart at selv innenfor det smale området pH ble testet, ble graden av eluering påvirket (figur 2B).

I forhold til nedstrøms prosessering av de antistoff-fraksjonene etter rensing ble det antistoffet kan buffer-utveksles ved hjelp av en avsaltingskolonne enten ved manuell eller automatisk drift. Alternativt kan dialysemembran også anvendes. Endelig proteinkonsentrasjon kan bestemmes av andre protein kvantifisering metoder, inkludert måleav absorbansen signal ved 280 nm med konsentrasjon utledet fra Beer Lamberts lov basert på den ekstinksjonskoeffisient av antistoffet.

Denne protokollen har fått produsert antistoff protein av trastuzumab ved stabil transfeksjon av HEK-293 celler. Antistoffet ble renset og karakterisert for å bekrefte integriteten. Trinnene i denne protokollen detaljering DNA forberedelse, kan stabil transfeksjon fulgt av serum-fri bearbeidelse, storskala produksjon og automatisert rensing overføres til produksjon av andre proteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFUSE vector series	InvivoGen	N/A	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	Lonza		Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Addgene	61883	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	Sigma-Aldrich	G6279	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose	Life Technologies	11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	Life Technologies	10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	Polysciences, Inc.	23966	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (casein peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Citric Acid, monohydrate	Astral Scientific	BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	fortéBIO	45-5000	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	fortéBIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	Astral Scientific	786-502
Ammonium Persulfate (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	Bio-Rad	1610374