Лабораторные весы Получение и очистка терапевтического антитела

Summary

Этот протокол описывает получение терапевтического антитела в системе экспрессии млекопитающих. Описанные методы включают приготовление векторной ДНК, стабильной трансфекции и адаптации эмбриона человека линии клеток почки 293 без сыворотки, набор из крупных культур и очистки с использованием аффинной хроматографии.

Introduction

Успех терапевтических антител продолжает стимулировать значительные инвестиции в развитие антител, как начинается волна терапии следующего поколения. Рынок антител , как ожидается, будет переработанная фрагментами антител ^1, антитело-лекарственное средство конъюгатов ^2, биспецифические антитела ³ и сконструированных антител с благоприятными свойствами ^4. Другой класс приобретает фармацевтический интерес являются биоподобий. Биоподобие антитела являются "очень похожи" реплицировать продукты терапевтического антитела, которое уже получил одобрение регулирующих органов. Предлагаемая биоподобие должна быть сравнима с отправителе антитела по отношению к его структуре, функции животных токсичности, клиническая эффективность и безопасность, человека фармакокинетики (PK), фармакодинамики (PD) и иммуногенности ^{5, 6.}

Утверждение гАтеш из биоподобных антител медленно из-за строгих ограничений на качество конечного продукта. Точные производственные процессы, такие как специфические клеточные линии и условия культивирования до финальных стадий обработки может оставаться частной собственностью. Более того, производство антител, по своей сути предполагает определенную степень изменчивости, которая может добавить к проблеме получения весьма аналогичный продукт. Комплексный физико - химическая и биофизических характеристика и сравнение довольно сложно, но ряд исследований , демонстрирующих характеристики биоподобных антител появляются в литературе ^{7, 8, 9.}

Генерирование терапевтическое антитело начинается с трансфекции клеток-хозяев млекопитающих вектором, несущим гены, для соответствующего антитела. Вектор дизайн, линия клеток и условия культивирования являются ключевыми факторами для создания эксприжимное система.

ДНК-последовательности антител могут быть получены из банка медикаментов (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) или научных публикаций, включая патенты. Например, последовательность трастузумаба доступна через банк лекарственных средств (DB ID: DB00072). Аминокислотная последовательность вариабельных областей могут пройти проектирование и оптимизацию генов для синтеза в желаемых видов хозяев. Это важно для биоподобие антитела, никакие модификации не сделано в аминокислотной последовательности. После того, как синтезирован, гены антител могут быть субклонировали в соответствующий вектор выбора.

Человеческие антитела IgG состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей. Плотно регулируемую экспрессию обеих цепей имеет важное значение для оптимального производства гетерологичного белка IgG в клетках млекопитающих ^10. Внутри- а также дисульфидные связи между цепями должны быть сформированы и ряд посттрансляционных модификаций должны быть вtroduced в процессе биосинтеза белка. Ряд векторов доступны, которые были разработаны специально, чтобы выразить гены антител (см табл материалов). Эти векторы антитела специфичные обычно выражают постоянные области как для тяжелых и легких цепей, так только Вариабельные области каждой цепи требуют клонирования.

Трансфекция клеток с двумя независимыми конструкциями (Котрансфекция) является наиболее распространенным подходом для доставки тяжелых и легких цепей генов, кодирующих. То есть, каждый ген приводится в движение своего собственного промотора и транскрибируется в виде отдельных цепей антитела перед сборкой в ​​эндоплазматический ретикулум. С другой стороны, мульти-cistronic векторы имеют внутренние рибосомы сайте вступления (IRES) элементы , включенные , которые делают возможной экспрессию множественных генов как одного транскрипта мРНК с переводом разрешенной из внутренних областей мРНК ^11. В этом случае, тяжелые и легкие цепи гены, кодирующие соединены в Arrangement достичь коэкспрессии обоих цепей антитела ^{10, 12.}

В то время как трансфицированы клетки дают достаточное количество белка, чтобы выполнить ограниченное число экспериментов, стабильно трансфецированные клеточные линии, которые претерпели выбор для интеграции генома может обеспечить более высокие урожаи. Более высокие количества белка позволяют для развития анализа , относящейся к характеристике в пробирке и может обеспечивать индикацию качества антител в рассмотрении для последующих применений , таких как клональной клеточной линии и свинцового отбора кандидатов.

Цель данной статьи состоит в том, чтобы описать стабильную экспрессию и очистку терапевтического антитела, продуцируемого в системе экспрессии млекопитающих. В самом деле, этот метод может быть применен к экспрессии биоподобие антитела. Метод может быть использован для начальной характеризации антител, прежде чем перейти к критическим, хотя и трудоемкого STEпс идентификации желаемого клона для увеличения производства масштаба. Более того, этот метод может быть использован, чтобы выразить другие белки, а не только антитела.

Следующее подробное протокол описывает экспрессию терапевтического антитело трастузумаб. Она состоит из подготовки векторной ДНК с последующей стабильной трансфекции в клеточной линии и очистки белка антитела НЕК-293 с помощью автоматизированного метода хроматографического.

Protocol

Примечание: Подходящий экспрессирующий вектор млекопитающих необходимо использовать для этого протокола. Здесь одна конструкция , содержащая две кассеты экспрессии используется (т.е. тяжелой и легкой цепи выражение приводится в движение отдельными промоутеров). Трастузумаб тяжелые и легкие цепи были ранее клонировали в вектор. Этот вектор был подарок от Andrew Beavil, полученные через не некоммерческий плазмиды хранилище ^13.

1. Восстановление и Расширение масштабов векторной ДНК

Примечание: Вектор ДНК была получена в качестве мягкого агаре колотой в кишечной палочки XL-1 синий штамм; вектор несет резистентность к гигромицину.

1. Вставьте стерильный прививка укол или петлю в мягком агаре из колотой культуры, то полоса Лурия Бертани (LB) агар пластины, приготовленной с 75 мкг / мл гигромицину для изолированных колоний. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 18-24 ч.
2. Привить одну колонию в 5 мл бульона Потрясающе (ТБ), содержащей 75 мкг / мл гигромицин. INCUBATE культуры при 37 ° С в течение 18-24 ч при 225 оборотов в минуту встряхивая.
3. С помощью Ночную культуру, чтобы подготовить глицерине векторной ДНК путем осторожного перемешивания 800 мкл культуры с 200 мкл 80% глицерина в криопробирку и замораживают при температуре -80 ° С.
   1. Добавьте 100 мкл ночной культуры до 100 мл , содержащей 75 ТБ мкг / мл гигромицину в разделительными перегородками шейкер колбу (т.е. 1/1000 разведение). Инкубируйте культуру при 37 ° С в течение 18-24 ч при 225 оборотов в минуту встряхивая.
4. После культивирования в течение ночи, извлечения и очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя миди / макси подготовки комплекта со следующим исключением; во время финальной стадии, элюирования или Ресуспендируют ДНК с водой (рН 7,0-8,5).
5. Проверка концентрации и чистоты ДНК с помощью значений оптической плотности при 260 и 280 нм, а затем хранить ДНК при -20 ° С.
   Примечание: Необязательно (настоятельно рекомендуется): Последовательность ДНК с использованием векторной специфических праймеров для подтверждения личности.

2, Стабильное Трансфекция НЕК-293 клеток

1. Grow и поддерживать НЕК-293 клеток (клеток суспензии) в соответствии со стандартными протоколами в бессывороточной среде с добавлением 0,1% неионогенного поверхностно-активного вещества в колбах Эрленмейера. Поддерживать в 2 × 10 ⁵ клеток / мл и субкультуры каждый четвертый день. Культуры клеток при 37 ° С с 5% СО ₂ и вращения 120 оборотов в минуту.
   Примечание: Клетки должны быть в культуре в течение не менее 4 дней и не более чем за 4 недели до трансфекции. НЕК-293 клеток, выращенных в виде монослоев в содержащей сыворотку средах также могут быть использованы для этой процедуры.
2. В день до трансфекции, семена НЕК-293 , в 3 × 10 ⁵ клеток / мл в лунки 12-луночного планшета в 2 мл Дульбекко Modified Eagle медиа (DMEM) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки ( ФБС). В день трансфекции, убедитесь, что клетки достигли 80-90% слитности
3. Развести ДНК и полиэтиленимина (PEI) отдельно в средствах массовой трансфекции затем смешать вместе.
   1. Развести 1,25 мкг векторной ДНК на лунку (15 мкг на 12 лунок) в 300 мкл трансфекции средах. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
   2. Развести 2,5 мкл 1 мг раствора / мл PEI (30 мкл на 12 лунок, то есть соотношение 1: 2 ДНК к PEI) в 300 мкл трансфекционного сред. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
   3. Добавить разбавленный ДНК в разбавленном PEI, осторожно перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
4. Добавляют 50 мкл смеси по каплям ДНК / PEI в каждую лунку планшета. Rock пластину осторожно , чтобы распределить трансфекцию смесь затем поместить планшет при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 24 часов.
5. Добавить 50 мкг / мл гигромицину B на лунку и вернуть пластину до 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 10 дней.
   Примечание: В 10-й день, ООН-трансфецированные клетки погибли и отделяться от поверхности пластины, в то время как стабильно трансфицированные клетки будут жизнеспособны и прикреплены к пластине.
6. Заменить СМИ в скважинах с1/4 объема сыворотки среды и 3/4 объема DMEM с добавлением 10% FBS (т.е. 0,5 мл сыворотки среды + 1,5 мл DMEM = 7,5% конечной концентрации в сыворотке крови) и инкубировать в течение 4 -х дней.
7. Заменить носитель в скважинах с 1/2 объема не содержащей сыворотки среды и 1/2 объема DMEM , дополненной 10% FBS (т.е. 1 мл не содержащей сыворотки среды + 1 мл DMEM , = 5% конечная концентрация сыворотки) и инкубируют в течение 4 -х дней.
8. Заменить СМИ в скважинах с 3/4 объема сыворотки среды и 1/4 объема DMEM с добавлением 10% FBS (т.е. 1,5 мл сыворотки среды + 0,5 мл DMEM = 2,5% конечной концентрации в сыворотке крови) и инкубировать в течение 4 -х дней.
9. Заменить носитель в скважинах с 2 мл не содержащей сыворотки среды, дополненной 0,1% неионогенных поверхностно-активных веществ (т.е. 0% конечной концентрации в сыворотке крови) и инкубируют в течение 4-х дней.
   Примечание: Поддержание 50 мкг / мл гигромицина селективное давление на клетки, во время адаптации без сыворотки. Клетки, адаптированные к бессывороточной среде отрываются от поверхности скважин и может Группа Iп подвеска. Обратитесь к шагу 2.1 для условий культивирования с дополнительной добавки 50 мкг / мл гигромицина B.
10. С помощью пипетки, аккуратно перемешать суспензионных культур в планшете и бассейн ячеек 12-луночных в отдельную пробирку.
    1. С помощью гемоцитометра, перечислить объединенные клетки и семена в 30 мл не содержащей сыворотки среды в колбе Эрленмейера на 2 - х 10 ⁵ клеток / мл. Культуры клеток при 37 ° С с 5% СО ₂ и вращения 120 оборотов в минуту. Субкультура и расширить каждый четвертый день.
11. Продолжать расширять размер культуры до требуемой плотности клеток , чтобы получить 10 ампул в количестве 1 х 10 ⁷ клеток / флакон для криоконсервации в жидком азоте. Замораживание клеток в бессывороточной среде, содержащей 10% диметилсульфоксид (ДМСО).
    Примечание: Кондиционированные среды, содержащие антитела, могут быть собраны в каждой субкультуры, чтобы подтвердить производство белка или использованы для оптимизации условий очистки. Для сбора кондиционированной среды и поддержания клеток для субкультуры, центрифугировать культуру в300 мкг в течение 5 мин, затем фильтруют стерилизовать супернатанта через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Отфильтрованный супернатант может храниться при температуре 4 ° С в течение 1-2 недель или при -20 ° С в течение более длительного срока хранения.

3. Антитело Производство Крупномасштабное от партии зарастают культуры

Примечание: Получение антител можно проследить на этапе из 2.11, где существующие клетки разлагаются до требуемой плотности клеток на основе пакетного зарастают объема культуры, чтобы быть установлен. В противном случае, клетки, которые были размороженные из криоконсервации начинают на этом этапе Вспененные до соответствующей плотности клеток и объема. Различные добавки культура может быть использована для оптимизации производства антител; использование триптона увеличить выход антител демонстрируется в этом протоколе.

1. Семенной клеток в 2 х 10 ⁵ клеток / мл в 100 мл не содержащей сыворотки среды в двух колбах Эрленмейера (для сравнения урожайности антитела из без карнозина и питательными веществами , дополненной культур). Культура при 37 ° С, 5% СО ₂
2. Через 24 часа добавляют триптона до конечной концентрации от 0,5% до питательными веществами, дополненной культуры. Уравнивание объем ун-добавляемой культуры с бессывороточной СМИ.
3. С 8-й день, выполняют кровяных клеток из культур ежедневно с использованием гемоцитометра для мониторинга жизнеспособности клеток. Урожай супернатантов культуры, как только жизнеспособность клеток меньше, чем 80%.
   1. Урожай супернатант центрифугированием культур при 3000 х г в течение 15 мин, затем фильтруют стерилизовать супернатант (содержащий антитела), через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Храните супернатантов при 4 ° С (кратковременно) или заморозить при -20 ° C (в долгосрочной перспективе).

4. Антитело После очистки с помощью аффинной хроматографии с использованием автоматизированной быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) Система

Примечание: Следующая процедура в общем случае может быть применен к наиболее автоматизированных систем. Очистка может быть проведена при комнатной температуре или при температуре 4 ° С (если система FPLC хранится в прохладном помещении).Серия скаутских испытаний могут быть выполнены, чтобы определить оптимальные условия очистки, включая соответствующую матрицу-столбец, связывающего буфера, буфера для элюции и рН, чтобы обеспечить максимальное извлечение очищенного антитела из кондиционированной среды (см Результаты разделе). Оптимальные условия зависят от антитела или белок очищается. Очисток были выполнены на автоматизированной системе FPLC. Очисток были выполнены при комнатной температуре с помощью 5 мл белка колонну.

1. Подготовьте следующие буферы с использованием сверхчистой воды и отрегулировать до рекомендованного рН затем фильтруют через фильтр 0,22 мкм.
   1. Готовят 1 л фосфатного буферного солевого раствора (PBS) , рН 7,4 (буфер) связывание путем смешивания следующих: 0,14 М NaCl, 0,0027 М КСl, 0,01 М Na ₂ HPO ₄ и 0,001 М KH ₂ PO _4. Отрегулируйте рН, если это необходимо перед фильтрацией буфера.
   2. Приготовьте 500 мл 0,1 М глицин-HCl рН 2,7 (буфер для элюции). Отрегулируйте рН до фильтрации баффэ.
   3. Приготовьте 50 мл 1 М Трис, рН 9,0 (буфер нейтрализации).
2. Убедитесь, что все электрические и коммуникационные соединения системы с компьютером сделаны. Устройства должны быть видны в программном обеспечении модуля 'Control System'. Обеспечить ультрафиолетовый датчик установлен на 280 нм, длина волны. Дополнительно: Калибровка рН-метр, если он подключен и будет использоваться.
3. Погрузитесь впускные трубы A, B и насос для отбора проб в сверхчистой воды для промывки системы. Чистки наработку с помощью шприца при наличии воздуха в трубопроводе или подозрение воздуха в системе. Промыть систему водой с помощью ручного управления с помощью системного контроллера или с помощью автоматизированного метода. Заметим, что давление, проводимость, UV280 трассировка и рН остаются неизменными и что предельное значение давления для столбца не превышается в соответствии со спецификацией производителя.
   Примечание: Аномалии может указывать на воздух или закупорки в системе, которые должны быть решены, прежде чем продолжить.
4. В модуле системного контроллера, запустите скорость потока на 1мл / мин вручную с помощью насоса А в любой нагрузки (в обход цикла выборки) или инъекции (через петлю образца) положение, чтобы начать подключение колонки. Отключение системы трубопроводов на входе в положение колонки и удалите фиксатор, соединенный с впускным отверстием колонны.
   1. Дайте воде вытекать из каплям системы насосно-компрессорных труб в верхней части колонны, а затем прикрепить трубку к системной колонки. Имея входное отверстие колонки и входной патрубок перелива с каплями воды обеспечивает соединение без пузырьков воздуха.
5. Прикрепите выход колонки на выходной розетке и проверьте все соединения плотно закреплены. С колонкой, присоединенное к системе, не превышают пределы для максимального предела давления и расхода, как указано в спецификации столбца.
6. Промыть колонку с 5 объемами колонки (CV) воды. При необходимости, продолжайте мыть колонки, пока трассировка UV280 не стабилизируется.
7. Погрузитесь впускных трубок в связывающем буфере, B в элюирующего буфера и насос для отбора проб в связывающем буфере тO уравновесить систему в правильных буферами. Заполните впускной трубы с использованием буфера PumpWash в ручном режиме.
8. В модуле "Редактор метода" программного обеспечения, с помощью мастера настройки метода для метода аффинной хроматографии на колонке, который предназначен для использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированные FPLC системы поставляются с методами предварительно заполненных с рекомендованными настройками (т.е. скорость потока и предельное значение давления) и выполняются действия , основанные на колонке (производитель, матрицы и размер) , выбранной для очистки.
   1. Используйте следующие шаги выполнения для протеина А для аффинной хроматографии:
      1. Равновесие системы с 5 CV буфера для связывания и сбора flowthrough в контейнер для отходов.
      2. Образец Нагрузка на колонку (объем должен быть загружен задается вручную в методе) и собирают flowthrough в отдельный контейнер.
      3. Система Wash с 5 CV буфера для связывания и сбора flowthrough в отдельный контейнер.
      4. колонка Элюировать с 5 CV isocratIC фракционирования с использованием буфера для элюции и собирают очищенный образец антител в качестве фракций с помощью коллектора фракций.
      5. Равновесие системы с 5 CV буфера для связывания и сбора flowthrough в контейнер для отходов.
9. После того, как метод был установки, указать объем кондиционированной среды, которые будут применены к колонке и сохраните метод.
   Примечание: Указанный объем в методе должен быть на 5-10 мл меньше, чем фактический объем, чтобы избежать попадание воздуха во время выборки прогона. Указанный объем используется в данном протоколе является 90-120 мл.
10. Погрузить образец насоса трубки в емкость, содержащую кондиционированной среды.
11. Подготовьте отдельный контейнер для сбора образца flowthrough через указанный выпускной трубы.
    Примечание: Важно, чтобы собрать flowthrough в случае возникновения ошибки во время бега или связывающей способности колонны превышено требующих flowthrough быть повторно в колонну или очистки гepeated.
12. Приготовьте сбор труб в коллектор фракций. Добавляют 100 мкл нейтрализующего буфера на 1 мл объема фракции. Система FPLC автоматически элюции фракции в приборке.
13. В модуле "Control System 'программного обеспечения, откройте метод для запуска.
    Примечание: Метод запуска инициируется в серии страниц, которые включают проверку переменных метода, фракции установки коллектора и определение имени файла результата и место хранения.
14. Нажмите START, чтобы начать бег. Прогон можно контролировать в модуле «контроля системы».
15. По завершении прогона очистки, проверить полученную хроматограмму в модуле «Оценка» в системном программном обеспечении.
16. Смешайте все белковые фракции, содержащие в отдельную пробирку, обмена буфера и концентрируют в PBS с использованием центробежного устройства фильтра с 30 кДа молекулярной массой отрезан. Выполните шаги центрифугирования в соответствии с производителеминструкции.
17. Измерение концентрации антител с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) в соответствии с инструкциями изготовителя.
18. Если другой очистки перспективе должна быть выполнена, премьер трубки образца насоса в связывающем буфере и повторите шаги 4.9-4.14.
19. По завершении очистки трасс, погрузить впускные трубы A, B и насос для отбора проб в сверхчистой воде и промыть систему и колонку, как выполняется на шаге 3.
20. Погрузитесь A, B и насос для отбора проб трубки в 20% этанола и повторить процедуру промывки для хранения системы и колонки.
21. Отсоедините колонку от нижнего выпускного отверстия и заменить колонки пробку, затем отключить колонку на входе и заменить пробку, подсоедините шланг к системе. Хранить колонку при температуре 4 ° С.

Representative Results

Стабильное производство трастузумаб путем трансфекции клеток НЕК-293 , была подтверждена с использованием био-слойный интерферометрии (BLI) , как представлено на рисунке 1. Стандартной кривой IgG был сгенерирован путем измерения связывания скорости между стандартом антител IgG и белок А биосенсора (рис 1А). Образец сырой супернатант аналогичным образом измерено, а затем его концентрация интерполированное из стандартной кривой (рис 1б). Концентрация надосадочную измеряли, составляет приблизительно 25 мкг / мл (образцы от 50 мл, собранных в субкультуры) через две недели после адаптации без сыворотки и до создания клеток для зарастают периодических культурах.

Супернатант собирали в каждой субкультуры после адаптации не содержащей сыворотки, объединяли и использовали для оптимизации условий очистки; скаутинг из связывания и элюирования буферами проводили , как показано на рисунке 2 рисунке 2А на основе сигнала UV280. После того, как белка Колонна уравновешивает, увеличение сигнала UV280 представляет загрузки образца; это увеличение обусловлено супернатанту flowthrough прохождения через колонку (содержащую несвязанных белков, которые поглощают УФ-излучение на этой длине волны), в то время как антитела были захвачены колонке. После того, как образец по окончании загрузки, сигнал UV280 возвращается к исходному уровню, как все оставшиеся несвязанные белки смыты. Элюирование происходит некоторое падение рН до оптимального рН для высвобождения антител, захваченных в колонке, изображенном увеличением сигнала UV280 с элюированных антител фракционированных и собранных коллектора фракций. На протяжении всего образца перспективе, изменения проводимости, основанные на концентрации соли в буфере, тогда как давление в системе должно оставаться относительно постоянной. Оптимальное элюции, рН и буфер первой Неисследован (Фигура 2В); было отмечено, что антитело эльделены более эффективно с колонки при более низком рН, используя либо 0,1 М глицин HCl или лимонной кислоты. Тем не менее, ниже рН 2,7 не было дальнейшее улучшение в профиле элюции. Кроме того, элюирование пики с 0,1 М глицин HCl были менее расширен по сравнению с 0,1 М раствором лимонной кислоты при рН аналогичной (Фигура 2В). Впоследствии, 0,1 М глицин-HCl , рН 2,7 буфер был использован для оптимизации связывания буферных условий (фиг.2А). Влияние различных связывания буферов на элюции также сравнивали (фиг.2А). Было отмечено, что PBS, рН 7,4 и 20 мМ фосфат натрия, рН 7, имели сопоставимые профили элюции, в то время как добавление 3 М NaCl в натрий-фосфатном буфере (для усиления связывания антител с колонкой) не было благоприятным. Из-за легкости подготовки буфера PBS, PBS, рН 7,4 был выбран в качестве буфера для связывания для будущих очисток.

Очистку хроматограммы партии зарастают cultuРез показаны на рисунке 3; триптон-добавляемой культура по сравнению с не-дополненной культуры. Было отмечено, что добавление триптона к дополненной культуре привело к увеличению сигнала UV280 во время стадии загрузки образца, по сравнению с без карнозина культуры. Триптон-добавляемой культуры получали 3,8 мг и ООН-добавляемой культуры 1,7 мг трастузумаба, на основе белка восстановился после замены буфера и концентрации. Контроль качества очищенных антител была подтверждена с помощью электрофореза в додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) , как показано на рисунке 4. Трастузумаб вырос в без карнозина и триптон-добавляемой условиях приводит аналогичные профили антител в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях. Как и следовало ожидать, видным полоса приблизительно 150 кДа подтверждает правильно сложенную антитела; другие группы представляют собой фрагментарные формы антитела, в результате обрыва дисульфидных связей и метод индуцированной artefacт. Аналогично, две полосы 50 и примерно 25 кДа, подтверждают наличие антител тяжелых и легких цепей, соответственно.

Рисунок 1: Подтверждение производства белка с помощью стабильно трансфецированных клеток НЕК-293 с использованием био-слойный интерферометрии (BLI). (A) Стандартная кривая была сгенерирована путем измерения связывания скорости стандарта антител IgG к белку биосенсора в течение 120 секунд (серый) с последующим сырой пробы супернатанта PEI-трансфицировали трастузумаба (PEI-TMAB; черный). (B) Концентрация белка антитела в супернатанте сырой (открытый черный круг) интерполировалась из стандартной кривой (закрытые черные кружки) путем построения стандартной концентрации IgG антител в зависимости от скорости связывания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого F igure.

Рисунок 2: Очистка хроматограммы элюирования и экспериментов по связыванию скаутских буфера. (A) Этапы очистки изображены в соответствии с UV280 сигнала (синий, зеленый или черные линии); загрузки образца на колонку с последующей промывной колонны, чтобы смыть несвязанных белков затем элюирование связанного белка из колонки. Измерение рН (красная линия), проводимости (коричневая линия) и давления в системе (серая линия) контролируется в течение пробега. Три буферы были протестированы на связывание трастузумаба в колонну и вымывания несвязанного белка, чтобы максимизировать выход элюции оптимальной. (В) 0,1 М глицин-HCl (рН 2.5-3.3) и 0,1 М лимонной кислоты (рН 2,5-3,5) , буферы были испытаны для оптимальной элюции трастузумаба из белка колонки.целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Очистка хроматограммы трастузумаб (TMAB) партия зарастают культур , выращенных без каких - либо добавок или с добавкой триптона. Стабильно трансфицированные клетки НЕК-293 установка в 2 х 10 ⁵ клеток / мл и культивировали в течение 8 дней либо без карнозина (120 мл; черные линии) , или с добавлением 0,5% триптон (90 мл, зеленая линия). После сбора супернатанта очищали с использованием PBS, рН 7,4 (буфер связывания) и 0,1 М глицин-HCl, рН 2,7 (элюирование буфера). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4Анализ очищенного трастузумаба с помощью SDS-PAGE. Приблизительно 2 мкг трастузумаб очищенного из без карнозина (-) или триптон-добавляемой (+) культур отбирали на 10% SDS-PAGE при нередуцированными или восстановительных условиях. Гель окрашивали кумасси R-250. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Этот протокол подробно трансфекцией стабильной экспрессии и очистки терапевтического антитела в клетках НЕК-293. Стабильная экспрессия генов антител является первым шагом в генерации антител, производящих клеточную линию для разработки и производства терапевтического антитела. В то время как клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки остаются выражение платформой для терапевтических белков, клеточную линию НЕК-293 приобретает известность с осознанием того, что белки, продуцируемые в этих клеток более точное соответствие к встречающимся в природе белки человека, с точки зрения пост -translational модификации и функции ^{14, 15.}

Линии клеток млекопитающих , включая CHO (например, CHO-DG44 и CHO-K1), а также не-иммуноглобулин секретирующих линии мышиных B клеток ns0 и SP2 / 0 преимущественно используются в биофармацевтической продукции. системы экспрессии на основе этих клеточных линий основаны на выборе Procцессы в результате чего высокопродуктивные клоны индуцированные и выбраны путем добавления дополнительных конкретного селективного лекарственного средства ^{16, 17.} Таким образом, процесс отбора для стабильного клона может быть трудным и требует много времени. По сравнению с этими существующими методами, клеточная линия НЕК-293 робастно transfects с высокой эффективностью. Процесс выбора упрощается и очень легко адаптируется к бессывороточной суспензионной культуре, что делает его идеальной системой выражение для лабораторного масштаба производства белков ^18.

Ограничением стабильной трансфекции время, в котором практическое количество белка может быть получен и использован в опытах. Для того, чтобы попытаться преодолеть это, текущий протокол описывает стадию культивирования, который может достичь значительных количеств белка в течение 3-6 недель трансфекции. Партия зарастают культур (Крупномасштабное производство) дают возможность производить значительные объемыантитела для установки в пробирке экспериментов по характеристике в счете до выбора клонального линии клеток и свинца кандидатов. Это имеет четкие преимущества по сравнению с временной трансфекции, которые могут потребовать более высокие количества ДНК и реагентов. Кроме того, выход белка не воспроизводимы от партии к партии, так как выражение является лишь временным и определяется эффективность трансфекции.

Добавление триптона в этом протоколе при условии, повышенный выход в экспрессии белка. Добавление триптона трансфекцией культур Ранее было показано , улучшить синтез белка ^{19, 20.} Триптон дополненной культуры привело к повышению урожайности антител трастузумаба 40 мг / л по сравнению с не-дополненной культуры 14 мг / л (рисунок 3). SDS-PAGE подтвердили, что: (1) антитело производится правильно; и (2) добавление триптона не изменяло структуру, основанную на комЗаготовку полос антител в невосстанавливающих и восстанавливающих условиях (Рисунок 4). Добавление триптона к культурам не является обязательным, и, в частности, используется для достижения более высоких урожаев белка. Другие добавки , которые были рассмотрены с целью усиления экспрессии белка , такие как бутират натрия и вальпроевой кислоты ^{21, 22, 23.}

Первая контрольная точка протокола является подтверждением того, что белок вырабатывается на трансфицированных клеточной линии. Этот этап может быть выполнен в любое время после двухнедельного периода селективного давления, используемого для выбора стабильных трансформантов. Ряд методов могут быть использованы для подтверждения продуцирования белка , включая био-интерферометрии слоя (рисунок 1) или аналогичного подхода к IgG ELISA. В качестве альтернативы, вестерн-блот, может быть выполнена с использованием анти-IgG-антитела обнаружения для выявления антител белка в неочищенном супернатантаили очищенный образец.

Другие исследователи показали , что более высокая эффективность трансфекции достигается с помощью адгезивных клеток в содержащей сыворотку средах ^24. Присутствие добавок животного происхождения является нежелательным для биофармацевтической производства. Таким образом, последовательная адаптация к сыворотки среде является важным шагом в протоколе, требующей терпения и тщательного контроля жизнеспособности клеток. Период оборота 4 дня предложенный в данном протоколе является руководством и поэтому, если проблемы возникают при определенной концентрации в сыворотке крови, рекомендуется, чтобы клетки быть пересевали 2-3 раза в предыдущем соотношении сыворотки, содержащей в бессывороточной среде перед продолжением следующего соотношения. До создания пакетных культур и криоконсервации клеток, считают, что большинство клеточных линий, которые считаются полностью адаптированы после трех субкультур в 100% сыворотки среды.

Одним из наиболее важных этапов на стадии очистки является тон скаутинг для оптимальных условий и буферов для обеспечения эффективного связывания антитела с колонки , а затем полное элюирование с колонки (рисунок 2). Кондиционированную среду собирали в каждой субкультуры полезно для этой цели. В этом случае элюции буфер лимонной кислоты, рН 3,5, как правило рекомендуется для белка аффинной хроматографии, является неподходящим для элюирования трастузумаба из колонки. Скаутинг эксперимент с использованием двух различных буферов элюирования при различных рН ясно показали , что даже в узком диапазоне значений рН испытания, степень вымывания была затронута (Фигура 2В).

С точки зрения глубокой переработки фракций антител после очистки, антитело может быть буфер обменом с использованием колонки обессоливания либо вручную или автоматическом режиме. В качестве альтернативы, диализ мембрана также может быть использован. Конечная концентрация белка может быть определена другими способами, в том числе белков количественного измерениясигнала поглощения при длине волны 280 нм с концентрацией, выведенной из законом Beer Ламберта на основании коэффициента экстинкции антитела.

Этот протокол успешно произвел белок антитела трастузумаб путем стабильной трансфекции клеток НЕК-293. Антитело очищали и характеризовали для подтверждения целостности. Действия, описанные в этом протоколе детализацией препарат ДНК, стабильной трансфекции с последующей адаптации без сыворотки, крупномасштабного производства и автоматизированной очистки могут быть переданы на производство других белков.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pFUSE vector series	InvivoGen	N/A	Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.
mAbXpress vector series	ACYTE Biotech Pty Ltd.		Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vector	N/A	N/A	Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.  Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vector series	Lonza		Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.
Multi-cistronic vector series 1	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Multi-cistronic vector series 2	N/A	N/A	Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	Addgene	61883	Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil.
Fast-Media Hygro Agar	Jomar Life Research	fas-hg-s	Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin.
Fast-Media Hygro TB	Jomar Life Research	fas-hg-l	Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin.
Glycerol, BioXtra, ≥99%	Sigma-Aldrich	G6279	Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.
Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit	Astral Scientific	G221020	Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Cells	Life Technologies	R790-07	HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.
FreeStyle 293 Expression Medium	Life Technologies	12338-018	Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.
Kolliphor P188	Sigma-Aldrich	K4894	Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
DMEM, high glucose	Life Technologies	11995-065
Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum	Life Technologies	10082-147
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000	Polysciences, Inc.	23966	Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use.
OptiPro SFM	Life Technologies	12309-050	Transfection formulated serum-free media
Hygromycin B Solution	Jomar Life Research	ant-hg-1
Dimethylsulphoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	AJA2225
Tryptone (casein peptone)	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml	Astral Scientific	09-2051-100
HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column	Sigma-Aldrich	GE17-0403-01
AKTApurifier 100	GE Healthcare	28406266	Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.
Glycine-HCl	Sigma-Aldrich	G2879
Citric Acid, monohydrate	Astral Scientific	BIOC2123
Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate	Astral Scientific	BIOCB0035
1 M Tris-HCl solution pH 9.0	Astral Scientific	BIOSD8146
Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)	Merck Millipore	UFC803008/UFC903008	Used to buffer exchange and concentrate purified protein.
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
BLItz System	fortéBIO	45-5000	Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.
Protein A biosensors	fortéBIO	18-5010
Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution	Astral Scientific	786-502
Ammonium Persulfate (APS)	Astral Scientific	AM0486
TEMED	Astral Scientific	AM0761
Coomassie Brilliant Blue R-250	Astral Scientific	786-498
Precision Plus Dual-Color Protein Standard	Bio-Rad	1610374