Summary
Este protocolo describe la producción de un anticuerpo terapéutico en un sistema de expresión de mamífero. Los métodos descritos incluyen la preparación del ADN del vector, transfección estable y la adaptación libre de suero de una línea celular de riñón embrionario humano 293, puesta en marcha de cultivos a gran escala y la purificación mediante cromatografía de afinidad.
Introduction
El éxito de anticuerpos terapéuticos continúa impulsando la inversión sustancial en el desarrollo de anticuerpos como comienza una ola de terapias de próxima generación. Se espera que el mercado de anticuerpo que se ha reformado por fragmentos de anticuerpos 1, conjugados de anticuerpo-fármaco 2, anticuerpos biespecíficos 3 y anticuerpos diseñados con propiedades favorables 4. Otra clase ganando interés farmacéutico son bioequivalentes. anticuerpos biosimilares son "muy similares" replicar productos de un anticuerpo terapéutico que ya ha recibido la aprobación regulatoria. A biosimilar propuesto debe ser comparable con el anticuerpo iniciador con respecto a su estructura, la función, la toxicidad animal, la seguridad clínica y eficacia, farmacocinética (PK) humanos, la farmacodinámica (PD) y la inmunogenicidad 5, 6.
La aprobación rAtes de anticuerpos biosimilares han sido lentos debido a las limitaciones estrictas sobre la calidad final del producto. Los procesos de fabricación exactas tales como líneas celulares y condiciones de cultivo específico a través de las etapas de procesamiento finales pueden permanecer propietario. Lo que es más, la fabricación de anticuerpos implica inherentemente un grado de variabilidad que se puede agregar al desafío de producir un producto muy similar. Una caracterización fisicoquímica y biofísica exhaustiva y la comparación es bastante difícil, sin embargo, una serie de estudios que demuestran las características de los anticuerpos biosimilares están surgiendo en la literatura 7, 8, 9.
Generación de un anticuerpo terapéutico comienza con la transfección de células huésped de mamífero con un vector que lleva los genes para el anticuerpo respectivo. diseño del vector, de línea y de cultivo celular condiciones son consideraciones clave para la creación de la exsistema de compresión.
Las secuencias de ADN de anticuerpos pueden ser obtenidos de Banco de Drogas (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) o publicaciones de investigación, incluidas las patentes. Por ejemplo, la secuencia de trastuzumab está disponible a través del Banco de Drogas (DB ID: DB00072). La secuencia de aminoácidos de las regiones variables puede someterse a diseño y optimización de genes para la síntesis en las especies huésped deseadas. Es importante para un anticuerpo biosimilar que ninguna modificación se hace a la secuencia de aminoácidos. Una vez sintetizados, los genes de anticuerpos se pueden subclonar en el vector apropiado de elección.
anticuerpos IgG humanos consisten en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Expresión estrictamente regulados de ambas cadenas es esencial para la producción óptima de la proteína heteróloga IgG en células de mamíferos 10. Intra, así como enlaces disulfuro entre cadenas tienen que ser formado y una serie de modificaciones posteriores a la traducción tiene que estar enintrodujo durante la biosíntesis de proteínas. Una serie de vectores están disponibles que se han diseñado específicamente para expresar genes de anticuerpos (consulte la Tabla de Materiales). Estos vectores en anticuerpos específicos por lo general expresan las regiones constantes de las cadenas tanto pesada y ligera de modo que sólo las regiones variables de cada cadena requieren clonación.
La transfección de células con dos constructos independientes (co-transfección) es el método más común para la entrega de genes pesados y ligeros de la cadena que codifica. Es decir, cada gen es conducido por su propio promotor y transcribe como cadenas de anticuerpo separados antes de ser montado en el retículo endoplásmico. Por otra parte, los vectores de multi-cistrónicos tienen elementos internos sitio de entrada al ribosoma (IRES) incorporados que permiten la expresión de múltiples genes como un único transcrito de ARNm con la traducción permitida de las regiones internas del mRNA 11. En este caso, los genes de cadena pesada y ligera que codifica se acoplan en un arrangement para lograr la co-expresión de ambas cadenas de anticuerpo 10, 12.
Mientras que las células transfectadas transitoriamente rendimiento de proteína suficiente para realizar un número limitado de experimentos, las líneas celulares transfectadas de manera estable que han sido sometidos a selección para la integración del genoma pueden ofrecer rendimientos más altos. Las cantidades de proteína más altos permiten para el desarrollo del ensayo relativo a la caracterización in vitro y pueden proporcionar una indicación de la calidad del anticuerpo en consideración para aplicaciones posteriores tales como la línea celular clonal y la selección de candidatos de plomo.
El objetivo de este artículo es describir la expresión estable y purificación de un anticuerpo terapéutico producido en un sistema de expresión de mamífero. De hecho, este método se puede aplicar a la expresión de un anticuerpo biosimilar. El método puede ser utilizado para la caracterización inicial de los anticuerpos antes de proceder a la crítica, aunque ste tiempops de identificar un clon deseable para la fabricación a mayor escala. Por otra parte, este método se puede utilizar para expresar otras proteínas y no sólo los anticuerpos.
El siguiente protocolo describe la expresión detallada de trastuzumab anticuerpo terapéutico. Esta consiste en la preparación de ADN del vector seguido de transfección estable en la línea celular HEK-293 y la purificación de la proteína de anticuerpo por un método de cromatografía automatizado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Un vector de expresión de mamífero adecuada debe ser utilizado para este protocolo. Aquí, se utiliza una única construcción que contiene dos casetes de expresión (es decir, expresión de la cadena pesada y ligera es impulsado por promotores separados). cadenas pesada y ligera se clonaron Trastuzumab previamente en el vector. Este vector fue un regalo de Andrew Beavil, obtenida a través de una organización sin fines de lucro plásmido repositorio 13.
1. La recuperación y ampliación del ADN del vector
NOTA: El ADN del vector fue recibido como un cultivo de agar blando de arma blanca en la cepa de Escherichia coli XL-1 Blue; vector lleva resistencia a la higromicina.
- Inserte una puñalada inoculación estéril o bucle en el agar suave de la cultura puñalada entonces consecutivas una placa de agar Luria Bertani (LB) preparado con 75 mg / ml de higromicina para colonias aisladas. Incubar la placa a 37 ° C durante 18-24 horas.
- Se inocula una sola colonia en 5 ml de caldo Terrific (TB) que contiene 75 mg / ml de higromicina. Incubate el cultivo a 37 ° C durante 18-24 horas con agitación 225 rpm.
- Utilice el cultivo de una noche para preparar un stock de glicerol de DNA vector mediante la mezcla suavemente a 800 l de cultivo con 200 l 80% de glicerol en un criovial y se congelan a -80 ° C.
- Añadir 100 ml de cultivo de una noche a 100 ml de TB que contenía 75 mg / ml de higromicina en un matraz agitador desconcertado (dilución es decir, 1 / 1.000). Incubar el cultivo a 37 ° C durante 18-24 horas con agitación 225 rpm.
- Después de cultivo durante la noche, extraer y purificar el ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante de kit de preparación de midi / maxi con la siguiente excepción; durante la última etapa del ADN, o volver a suspender eluyen con agua (pH 7,0-8,5).
- Compruebe concentración y pureza del ADN por lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm entonces almacenar ADN a -20 ° C.
NOTA: Opcional (muy recomendable): Secuencia de ADN utilizando cebadores específicos del vector para confirmar la identidad.
2. Transfección estable de células HEK-293
- Crecer y mantener las células HEK-293 (células en suspensión) de acuerdo con protocolos estándar en medio libre de suero suplementado con agente tensioactivo no iónico 0,1% en matraces Erlenmeyer. Mantener a 2 x 10 5 células / ml y subcultivo cada cuatro días. Células de cultivo a 37 ° C con 5% de CO2 y 120 rpm de rotación.
Nota: Las celdas deberían haber estado en cultivo durante no menos de 4 días y no más de 4 semanas antes de la transfección. células HEK-293 que crecen como monocapas en medios que contienen suero también se pueden utilizar para este procedimiento. - En el día antes de la transfección, las células de semillas HEK-293 a 3 x 10 5 células / ml en pocillos de una placa de 12 pocillos en 2 ml de Dulbecco modificado de Eagle Media (DMEM) suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% ( FBS). En el día de la transfección, comprobar que las células han alcanzado el 80-90% de confluencia
- Diluir el ADN y polietilenimina (PEI) por separado en el medio de transfección a continuación, mezclar juntos.
- Diluir 1,25 g vector de ADN por pocillo (15 g de 12 pocillos) en 300 l medio de transfección. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Diluir 2,5 l de 1 mg / ml solución PEI (30 l para 12 pocillos, es decir, proporción de 1: 2 de ADN para PEI) en 300 l medio de transfección. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir DNA diluido para diluida PEI, mezclar suavemente y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
- Añadir 50 l de ADN / PEI mezcla gota a gota a cada pocillo de la placa. Oscilar suavemente la placa para distribuir la mezcla de transfección y posicionar la placa a 37 ° C, 5% de CO2 durante 24 horas.
- Añadir 50 g / ml de higromicina B por pocillo y la placa de volver a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 días.
NOTA: Para el día 10, las células transfectadas-un habrán muerto y separado de la superficie de la placa, mientras que las células transfectadas establemente serán viables y unida a la placa. - Vuelva a colocar los medios de comunicación en los pozos con1/4 medio libre de suero de volumen y 3/4 volumen de DMEM suplementado con FBS al 10% (es decir, 0,5 ml de medio libre de suero + 1,5 ml de DMEM = 7,5% de concentración final de suero) y se incuba durante 4 días.
- Reemplazar los medios de comunicación en los pozos con 1/2 medio libre de suero y de volumen medio DMEM volumen suplementado con 10% FBS (medio libre de suero es decir, 1 ml + 1 ml de DMEM = 5% de concentración final de suero) y se incuba durante 4 días.
- Reemplazar los medios de comunicación en los pozos con 3/4 medio libre de suero de volumen y 1/4 volumen de DMEM suplementado con FBS (+ 0,5 ml de DMEM = concentración sérica es decir, 1,5 ml de medio libre de suero 2,5% final) 10% e incubar durante 4 días.
- Reemplazar los medios de comunicación en los pocillos con 2 ml de medio libre de suero suplementado con 0,1% de tensioactivo no iónico (concentración final de suero es decir, 0%) y se incuba durante 4 días.
NOTA: Mantener 50 mg / presión selectiva ml higromicina B en las células durante la adaptación libre de suero. Las células adaptadas a medios libres de suero se desprenden de la superficie de los pozos y pueden agruparse in suspensión. Consulte el paso 2.1 para las condiciones de cultivo con el suplemento adicional de 50 mg / ml de higromicina B. - Con una pipeta, mezclar suavemente los cultivos en suspensión en las células de la placa y la piscina de 12 pocillos en un tubo separado.
- El uso de un hemocitómetro, enumerar células agrupadas y semilla en 30 ml de medio libre de suero en un matraz Erlenmeyer a 2 x 10 5 células / ml. Células de cultivo a 37 ° C con 5% de CO2 y 120 rpm de rotación. Subcultura y ampliar cada cuatro días.
- Continuar ampliando el tamaño de la cultura a la densidad celular requerida para obtener 10 viales a las células 1 x 10 7 / vial de crioconservación en nitrógeno líquido. Congelar las células en medio libre de suero que contiene 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
NOTA: acondicionado medios que contienen anticuerpos pueden ser cosechadas en cada subcultivo para confirmar la producción de proteínas o se utilizan para optimizar las condiciones de purificación. Para cosechar los medios condicionados y mantener las células de la subcultura, centrifugar el cultivo a300 xg durante 5 min luego filtrar-esterilizar sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras. sobrenadante filtrado puede mantenerse a 4 ° C durante 1-2 semanas o -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
3. Gran Escala Producción de anticuerpos a partir de lotes overgrow Cultura
NOTA: La producción de anticuerpos se puede seguir en el paso de 2.11 donde las células existentes se expanden a la densidad celular requerida sobre la base del volumen de cultivo por lotes overgrow ser de configuración. De lo contrario, las células que han sido descongelados de criopreservación comienzan en esta etapa una vez expandido a una densidad celular apropiada y volumen. Varios suplementos de cultivo se pueden usar para optimizar la producción de anticuerpos; el uso de triptona para aumentar el rendimiento del anticuerpo se demuestra en este protocolo.
- Se siembran las células a 2 x 10 5 células / ml en medio libre de suero de 100 ml en dos matraces Erlenmeyer (para comparar los rendimientos de anticuerpos a partir de cultivos de la ONU-complementado y completado en nutrientes). Cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2
- Después de 24 h, añadir triptona a una concentración final de 0,5% a cultivo nutriente suplementado. Igualar el volumen de la cultura no-suplementado con medio libre de suero.
- De día 8, lleve a cabo los recuentos de células de los cultivos diariamente usando un hemocitómetro para monitorizar la viabilidad celular. Recoger los sobrenadantes de cultivo una vez que la viabilidad celular es menor que 80%.
- Cosecha sobrenadante por centrifugación de los cultivos a 3.000 xg durante 15 min a continuación, filtrar-esterilizar el sobrenadante (que contiene el anticuerpo) a través de un filtro de 0,22 micras. Almacenar los sobrenadantes a 4 ° C (a corto plazo) o se congelan a -20 ° C (a largo plazo).
4. Purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad El uso de una cromatografía de líquidos automatizado de proteínas Fast System (FPLC)
NOTA: El siguiente procedimiento general se puede aplicar a sistemas más automatizados. La purificación se puede realizar a temperatura ambiente o a 4 ° C (si el sistema de FPLC se mantiene en una habitación fresca).Una serie de pruebas de exploración se puede realizar para identificar las condiciones óptimas de purificación incluyendo matriz de columna apropiada, tampón, tampón de elución y pH de unión para asegurar la máxima recuperación de anticuerpo purificado a partir de medio condicionado (consulte la sección Resultados). Las condiciones óptimas dependen del anticuerpo o proteína que se purifican. Las purificaciones se realizaron en un sistema de FPLC automatizado. Las purificaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente usando una proteína de 5 ml una columna.
- Preparar los siguientes tampones usando agua ultrapura y ajustar el pH recomendado para luego filtrar a través de un filtro de 0,22 micras.
- Preparar 1 L de solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 (tampón de unión) mediante la mezcla de los siguientes: M NaCl 0,14, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na 2 HPO 4 y 0,001 M KH 2 PO 4. Ajustar el pH si es necesario antes de filtrar la memoria intermedia.
- Preparar 500 ml de pH 2,7 (tampón de elución) 0,1 M glicina-HCl. Ajustar el pH antes de filtrar la piel de anteer.
- Preparar 50 ml de M Tris pH (tampón de neutralización) 9,0 1.
- Asegurar que todas las conexiones de alimentación y del sistema de comunicación con el ordenador se realizan. Los dispositivos deben ser visibles en el módulo "Control System 'software. Asegúrese de célula UV se fija en 280 nm longitud de onda. Opcional: Calibre metros pH si está conectado y para ser utilizado.
- Sumergir los tubos de entrada de A, B y la bomba de muestra en agua ultrapura para lavar el sistema. Purgar las bombas con una jeringa si hay aire en el tubo o una sospecha de aire en el sistema. Lavar el sistema con agua por la operación manual a través del controlador del sistema o a través de un método automatizado. Observe que la presión, conductividad, pH y rastreo UV280 se mantienen consistentes y que el límite de presión de la columna no se excede según la especificación del fabricante.
NOTA: Las anomalías pueden indicar el aire o el bloqueo en el sistema que debe ser tratada antes de continuar. - En el módulo controlador del sistema, inicie el caudal a 1ml / min de forma manual a través de la bomba A, ya sea en la carga (sin pasar por el loop de muestra) o inyectar (a través de la muestra circular) condiciones de iniciar la conexión de la columna. sistema de tubos de desconexión en la entrada de posición de la columna y retirar el tapón conectado a la entrada de la columna.
- Permitir que el agua fluya desde el tubo de gota a gota sistema en la parte superior de la columna a continuación, conectar el tubo del sistema a la columna. Tener la entrada de la columna y el accesorio de entrada desbordante de gotas de agua asegura una conexión libre de burbujas de aire.
- Una la salida de la columna en la salida de aguas abajo y verifique que todos los accesorios están bien apretados. Con la columna que ahora se atribuye al sistema, no superarán los límites aplicables límite máximo de presión y caudal como se indica en las especificaciones de las columnas.
- Lavar la columna con 5 volúmenes de columna (CV) de agua. Si es necesario, continúe hasta que la columna de lavado UV280 trazado se ha estabilizado.
- Sumergir los tubos de entrada de A en tampón de unión, B en el tampón de elución y la bomba de la muestra en tampón de unión to equilibrar el sistema en tampones correctos. Llenar los tubos de entrada con tampón utilizando PumpWash por la operación manual.
- En el módulo del software del 'Editor de métodos', utilice el asistente método para configurar un método de cromatografía de afinidad por la columna que está destinado a ser utilizado.
NOTA: Los sistemas automatizados de FPLC vienen con métodos pre-llenados con la configuración recomendada (es decir, caudal y presión límite) y ejecutar medidas en base a la columna (fabricante, matriz y tamaño) seleccionada para la purificación.- Utilice los siguientes pasos de ejecución para la proteína A cromatografía de afinidad:
- el sistema se equilibre con 5 VC de tampón de unión y recoger caudal contínuo en un contenedor de residuos.
- Cargar la muestra en la columna (volumen se va a cargar manualmente se especifica en el método) y recoger caudal contínuo en un recipiente separado.
- Sistema de lavado con 5 VC de tampón de unión y recoger caudal contínuo en un recipiente separado.
- la columna se eluye con 5 CV isocratfraccionamiento ic usando tampón de elución y tomar la muestra anticuerpo purificado como fracciones de colector de fracciones.
- el sistema se equilibre con 5 VC de tampón de unión y recoger caudal contínuo en un contenedor de residuos.
- Utilice los siguientes pasos de ejecución para la proteína A cromatografía de afinidad:
- Una vez que el método ha sido configurado, especificar el volumen de medio acondicionado que ha de aplicarse a la columna y guardar el método.
Nota: El volumen especificado en el método debe ser 5 a 10 ml menor que el volumen real para evitar la introducción de aire durante la carrera de la muestra. El volumen específico utilizado en este protocolo es de 90-120 ml. - Sumergir el tubo de la bomba de la muestra en el recipiente que contiene el medio condicionado.
- Preparar un recipiente separado para recoger flujo a través de la muestra a través de la tubería de salida especificado.
NOTA: Es importante recoger el caudal contínuo en el caso de que ocurra un error durante la ejecución o la capacidad de fijación de la columna se supera el caudal contínuo que requiere volver a aplicar a la columna o la purificación repeated. - Preparar los tubos de recogida en el colector de fracciones. Añadir 100 l de tampón de neutralización por 1 ml de volumen de fracción. El sistema FPLC se eluir automáticamente las fracciones en los tubos de recogida.
- En el módulo del software del "Sistema de Control", abra el método que se ejecute.
NOTA: El desarrollo del método se inicia en una serie de páginas que incluyen la comprobación de las variables del método, la configuración de colector de fracciones y la definición de nombre de archivo de resultados y la ubicación de almacenamiento. - Haga clic en Inicio para iniciar la carrera. La carrera se puede controlar en el módulo "Control System '.
- En la terminación de la ejecución de la purificación, comprobar el cromatograma resultante en el módulo "Evaluación" en el software del sistema.
- Combinar todas las fracciones que contienen proteínas en un tubo, intercambio de tampón separar y concentrar en PBS usando un dispositivo de filtración centrífuga con 30 kDa de peso molecular de corte. Realice los pasos de centrifugación de acuerdo con el fabricante delinstrucciones.
- Medir la concentración de anticuerpos usando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) según las instrucciones del fabricante.
- Si otro purificación de ejecución se va a realizar, el primer tubo de la bomba de la muestra en tampón de unión y repita los pasos 4.9 a 4.14.
- En la terminación de carreras de purificación, sumergir tubos de entrada de A, B y la bomba de muestra en agua ultrapura y se lava el sistema y la columna tal como se realizó en el paso 3.
- Sumergir A, B y tubería de la bomba de la muestra en un 20% de etanol y repita el procedimiento de lavado para el almacenamiento del sistema y la columna.
- Desconectar la columna de la toma de corriente abajo y vuelva a colocar el tapón de columna, a continuación, desconecte la columna en la entrada y vuelva a colocar el tapón, vuelva a conectar la tubería al sistema. Almacenar la columna a 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Producción estable de trastuzumab por las células HEK-293 transfectadas se confirmó usando interferometría bio-capa (BLI) tal como se presenta en la Figura 1. Una curva estándar de IgG se generó mediante la medición de la tasa de unión entre un estándar de anticuerpo IgG y proteína A biosensor (Figura 1A). La muestra de sobrenadante crudo se midió de manera similar, a continuación, su concentración interpolada a partir de la curva estándar (Figura 1B). La concentración de sobrenadante se midió que era aproximadamente 25 g / ml (muestras de 50 ml recogidas en subcultivo) dos semanas después de la adaptación libre de suero y antes de la creación de células de cultivos discontinuos crecer demasiado.
Sobrenadante recogido en cada subcultivo después de la adaptación libre de suero se reunió y se utiliza para optimizar las condiciones de purificación; de exploración de tampones de unión y elución se realizó como se muestra en la Figura 2 Figura 2A basado en la señal UV280. Una vez que la columna de Proteína A se equilibra, un aumento de la señal UV280 representa carga de la muestra; este aumento se debe al flujo a través sobrenadante pasar a través de la columna (que contiene las proteínas no unidas que absorben luz UV en esta longitud de onda), mientras que los anticuerpos han sido capturados por la columna. Una vez que la muestra ha terminado de cargar, la señal UV280 regresa a la línea base como cualquier proteínas no unidas restantes son lavados. La elución se produce como pH disminuye con el pH óptimo para liberar los anticuerpos capturados por la columna, se representa por un aumento en la señal UV280 con anticuerpos eluidos fraccionados y recogidos por el colector de fracciones. A través del funcionamiento de la muestra, los cambios de conductividad en función de la concentración de sal en los tampones, mientras que la presión del sistema deben permanecer relativamente constante. Elución óptima, pH y tampón se exploraron primero (figura 2B); se observó que el anticuerpo ELbuido de manera más eficiente de la columna a un pH inferior usando 0,1 M de glicina HCl o ácido cítrico. Sin embargo, por debajo de pH 2,7 no había mejora adicional en el perfil de elución. Además, los picos de elución con HCl 0,1 M glicina parecían menos ampliaron en comparación con ácido cítrico 0,1 M a pH similar (Figura 2B). Posteriormente, se utilizó 0,1 M glicina-HCl pH 2,7 tampón para optimizar las condiciones de tampón de unión (figura 2A). El efecto de diferentes tampones de unión en la elución también se comparó (Figura 2A). Se observó que PBS pH 7,4 y 20 mM de fosfato de sodio pH 7 tenía perfiles de elución comparables, mientras que la adición de 3 M NaCl a tampón de fosfato de sodio (para mejorar la unión del anticuerpo a la columna) no fue favorable. Debido a la facilidad de preparación de tampón PBS, PBS pH 7,4 fue seleccionado como el tampón de unión para futuras purificaciones.
Los cromatogramas de purificación de lotes crecen en exceso cultures se muestran en la Figura 3; cultura triptona suplementado se compara con la cultura no-suplementados. Se observó que la adición de triptona al cultivo suplementado resultó en un aumento de la señal UV280 durante la etapa de carga de muestra, en comparación con la cultura un-suplementado. El cultivo triptona suplementado dio 3,8 mg y la desclasificación complementado cultura 1,7 mg de trastuzumab, basado en proteína recuperada después del intercambio de tampón y la concentración. El control de calidad del anticuerpo purificado se confirmó por electroforesis en gel de poliacrilamida sulfato de dodecil de sodio (SDS-PAGE) tal como se muestra en la Figura 4. Trastuzumab cultiva en un-complementado y las condiciones de triptona suplementado con resultados en los perfiles de anticuerpos similares en condiciones no reductoras y reductoras. Como era de esperar, una banda prominente de aproximadamente 150 kDa confirma anticuerpo correctamente plegado; franjas representan formas fragmentadas del anticuerpo, un resultado de la rotura del enlace disulfuro y un método artefac inducidat. Del mismo modo, dos bandas a 50 y aproximadamente 25 kDa confirman la presencia de anticuerpos cadenas pesada y ligera, respectivamente.
Figura 1: Confirmación de la producción de proteínas por las células HEK-293 transfectadas de forma estable utilizando interferometría bio-capa (BLI). (A) Curva de calibración se generó mediante la medición de la tasa de unión del estándar de anticuerpos IgG a la proteína A biosensor más de 120 segundos (gris), seguido de muestra de sobrenadante crudo de trastuzumab transfectadas-PEI (PEI-TMAb; negro). (B) La concentración de proteína de anticuerpo en el sobrenadante bruto (abrir círculo negro) fue interpolada a partir de la curva estándar (círculos negros cerrados) por el trazado de la concentración de anticuerpos IgG frente a la tasa estándar de unión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta f igura.
Figura 2: cromatogramas de elución de purificación y de unión de los experimentos de exploración de amortiguamiento. (A) Los pasos de purificación se representan de acuerdo con la señal de UV280 (azul, líneas verdes o negras); carga de la muestra en la columna seguido de columna de lavado para lavar las proteínas no unidas después de elución de la proteína unida de la columna. La medición de pH (línea roja), conductividad (línea marrón) y la presión del sistema (línea gris) se vigila durante la carrera. Tres tampones se ensayaron para la unión de trastuzumab a la columna y el lavado de distancia de la proteína no unida para maximizar el rendimiento de elución óptima. (B) 0,1 M glicina-HCl (pH 2.5 a 3.3) y ácido cítrico 0,1 M (pH 2.5 a 3.5) buffers se ensayaron para la elución óptima de trastuzumab de columna de proteína A.target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: cromatogramas purificación de trastuzumab (TMAb) lotes overgrow cultivos desarrollados con ningún suplemento o suplementadas con triptona. Transfectadas de forma estable células HEK-293 eran de configuración a 2 x 10 5 células / ml y se cultivaron durante 8 días, ya sea un-complementado (120 ml; line negro) o complementado con 0,5% de triptona (90 ml; línea verde). Después de la cosecha, los sobrenadantes se purificaron utilizando PBS pH 7,4 (tampón de unión) y glicina-HCl pH (tampón de elución) 2,7 0,1 M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de trastuzumab purificado por SDS-PAGE. Aproximadamente 2 g de trastuzumab purificada a partir de un-suplementado (-) (+) o cultivos de triptona suplementado se tomaron muestras por 10% SDS-PAGE en condiciones no reducidas o reducidos. El gel se tiñó con Coomassie R-250. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo se detalla la transfección, la expresión estable y la purificación de un anticuerpo terapéutico en las células HEK-293. La expresión estable de genes de anticuerpos es el primer paso en la generación de una línea celular productora de anticuerpos para el desarrollo y fabricación de un anticuerpo terapéutico. Mientras ovario de hámster chino (CHO) siguen siendo la plataforma de expresión de elección para proteínas terapéuticas, la línea celular HEK-293 está ganando importancia con la comprensión de que las proteínas producidas en estas células son una aproximación más exacta de proteínas naturales humanos, en términos de la post -translational modificaciones y función 14, 15.
Líneas de células incluyendo mamíferos CHO (por ejemplo, CHO-DG44 y CHO-K1), así como no inmunoglobulina secretora de líneas de células B murinas NS0 y SP2 / 0 se utilizan principalmente en la producción biofarmacéutica. Los sistemas de expresión basados en estas líneas de células se basan en la selección proceses por el que los clones de alta producción son inducidos y se seleccionan a través de adición incremental de una droga selectiva específica 16, 17. El proceso de selección de un clon estable puede por lo tanto ser ardua y requiere mucho tiempo. En comparación con estos métodos existentes, la línea celular HEK-293 transfecta robusta con alta eficiencia. El proceso de selección se simplifica y se adapta muy fácilmente al cultivo en suspensión libre de suero, por lo que es un sistema de expresión ideal para la producción a escala de laboratorio de las proteínas 18.
Una limitación de la transfección estable es el momento en el que una cantidad práctica de la proteína puede ser producida y utilizada en los experimentos. Para tratar de superar esto, el actual protocolo describe una etapa de cultivo que puede alcanzar cantidades sustanciales de proteína dentro de 3-6 semanas de transfección. El lote overgrow cultivos (producción a gran escala) proporcionan la oportunidad de producir cantidades sustanciales deanticuerpo para la configuración de los experimentos in vitro de caracterización en el período previo a la selección de una línea celular clonal y candidatos de plomo. Esto tiene claras ventajas sobre la transfección transitoria, que puede requerir una mayor cantidad de ADN y reactivos. Además, el rendimiento de proteína no es reproducible de un lote a ya que la expresión es sólo temporal y determinada por la eficacia de transfección.
La adición de triptona en este protocolo proporciona un mayor rendimiento en la expresión de la proteína. Además de triptona a las culturas de transfección previamente se ha demostrado que mejora la síntesis de proteínas 19, 20. El cultivo triptona suplementado dio lugar a la mejora de los rendimientos de anticuerpo trastuzumab de 40 mg / L frente a la cultura-un suplementado de 14 mg / L (Figura 3). SDS-PAGE se verifica que: (1) el anticuerpo estaba siendo producido correctamente; y (2) la adición de triptona no alteró estructura basada en comparison de las bandas de anticuerpos en condiciones no reductoras y reductoras (Figura 4). La adición de triptona a los cultivos es opcional y se utiliza particularmente para conseguir rendimientos más altos de proteínas. Otros suplementos se han considerado para mejorar la expresión de proteínas tales como butirato de sodio y ácido valproico 21, 22, 23.
El primer punto de control del protocolo es la confirmación de que la proteína está siendo producido por la línea celular transfectada. Esta etapa se puede realizar en cualquier momento después de que el período de dos semanas de la presión selectiva se utiliza para seleccionar los transformantes estables. Una serie de métodos se puede usar para confirmar la producción de proteínas incluyendo la interferometría bio-capa (Figura 1) o el enfoque similar de un ELISA IgG. Alternativamente, una transferencia Western puede realizarse usando un anticuerpo de detección anti-IgG para identificar proteína de anticuerpo en el sobrenadante crudoo purificado de la muestra.
Otros investigadores han demostrado que el aumento de la eficiencia de transfección se logra utilizando células adherentes en medios que contienen suero-24. La presencia de los suplementos de origen animal no es deseable para la producción biofarmacéutica. Por lo tanto, la adaptación secuencial para medios libres de suero es un paso crítico en el protocolo que requiere paciencia y una cuidadosa monitorización de la viabilidad celular. El período de rotación 4-día sugerido en este protocolo es una guía y por lo que si se encuentran problemas a una cierta concentración en suero, se recomienda que las células se subcultivaron 2-3 veces en la relación anterior de a medio libre de suero que contiene suero antes de continuar con la siguiente relación. Antes de establecer cultivos discontinuos y criopreservación de células, tenga en cuenta que la mayoría de las líneas celulares se pueda entender plenamente adaptados al cabo de tres subcultivos en 100% de medio libre de suero.
Uno de los pasos más importantes en la etapa de purificación es tél de exploración para las condiciones y tampones óptimas para asegurar una unión eficiente del anticuerpo a la columna y luego completa elución de la columna (Figura 2). El medio acondicionado recogido en cada subcultivo es útil para este propósito. En este caso, el tampón de elución de pH ácido cítrico 3,5 recomienda generalmente para la proteína A cromatografía de afinidad no era adecuada para la elución de trastuzumab de la columna. El experimento de exploración utilizando dos tampones de elución diferentes en diversos pH mostró claramente que incluso dentro de un estrecho rango de pH a prueba, el grado de elución se vio afectada (Figura 2B).
En términos de procesamiento aguas abajo de las fracciones de anticuerpos después de la purificación, el anticuerpo puede ser un intercambio de tampón utilizando una columna de desalación, ya sea por la operación manual o automatizado. Alternativamente, la membrana de diálisis también se puede utilizar. concentración final de proteína se puede determinar mediante otros métodos de cuantificación de proteínas incluyendo la mediciónde la señal de absorbancia a 280 nm con la concentración deducida a partir de la ley de Beer Lambert basado en el coeficiente de extinción del anticuerpo.
Este protocolo se ha producido con éxito la proteína de anticuerpo de trastuzumab por transfección estable de células HEK-293. El anticuerpo se purificó y se caracterizó para confirmar la integridad. Los pasos de este protocolo que detalla la preparación de ADN, transfección estable seguido de adaptación libre de suero, la producción a gran escala y purificación automatizada pueden ser transferidos a la producción de otras proteínas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFUSE vector series | InvivoGen | N/A | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). | |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. | |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | Addgene | 61883 | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | Jomar Life Research | fas-hg-s | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | Jomar Life Research | fas-hg-l | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | Sigma-Aldrich | G6279 | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | Astral Scientific | G221020 | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | Life Technologies | R790-07 | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | Life Technologies | 12338-018 | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | Sigma-Aldrich | K4894 | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11995-065 | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082-147 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | Polysciences, Inc. | 23966 | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80 °C until use. |
| OptiPro SFM | Life Technologies | 12309-050 | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | Jomar Life Research | ant-hg-1 | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | AJA2225 | |
| Tryptone (casein peptone) | Thermo Fisher Scientific | LP0042B | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4 °C. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | Astral Scientific | 09-2051-100 | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | Sigma-Aldrich | GE17-0403-01 | |
| AKTApurifier 100 | GE Healthcare | 28406266 | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | Sigma-Aldrich | G2879 | |
| Citric Acid, monohydrate | Astral Scientific | BIOC2123 | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | Astral Scientific | BIOCB0035 | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | Astral Scientific | BIOSD8146 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | Merck Millipore | UFC803008/UFC903008 | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| BLItz System | fortéBIO | 45-5000 | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | fortéBIO | 18-5010 | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | Astral Scientific | 786-502 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Astral Scientific | AM0486 | |
| TEMED | Astral Scientific | AM0761 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Astral Scientific | 786-498 | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | Bio-Rad | 1610374 |
References
- Nelson, A. L., Reichert, J. M. Development trends for therapeutic antibody fragments. Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).
- Drake, P. M., Rabuka, D. An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety. Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).
- Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Bispecific antibodies. Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).
- Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).
- Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).
- European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).
- Lopez-Morales, C. A., et al. Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab. Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).
- Jung, S. K., et al. Physicochemical characterization of Remsima. MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).
- Visser, J., et al. Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab. BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).
- Li, J., et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).
- Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus. Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).
- Ho, S. C., et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).
- Dodev, T. S., et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4, 5885 (2014).
- Walsh, G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).
- Backliwal, G., et al. Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions. Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).
- Bebbington, C. R., et al. High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker. Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).
- Kaufman, R. J., et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells. Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).
- Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).
- Pham, P. L., et al. Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency. Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).
- Yang, W. C., et al. Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers. Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).
- Backliwal, G., et al. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures. Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).
- Jiang, Z., Sharfstein, S. T. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility. Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).
- Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
